CN101294193A - 一种检测土壤脱氢酶活性的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测土壤中脱氢酶活性的分析方法：1)称取过筛的土壤风干样品n份于离心管中；先用TTX溶液，后用水，将混合物饱和至土壤最大持水量，将离心管塞紧，放入恒温培养箱中培养；2)培养结束后，离心，弃除土壤上清液；3)用丙酮处理土壤，将上清液倒入容量瓶中；4)用丙酮洗涤沉淀2－4次，至获得无色提取液，将提取液全部转移到容量瓶中，并用丙酮定容；5)立刻在分光光度计上于485nm处比色测定吸光度；6)计算提取液中的甲月替含量，进而计算脱氢酶活性。本发明优点为：1)简化了操作步骤，易操作，方法准确度高；2)减少对设备要求的依赖性；3)结果稳定可靠，重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及土壤中脱氢酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中脱氢酶活性的分析方法。
背景技术
土壤中的脱氢酶能酶促脱氢反应，即酶促有机物质的脱氢作用。它起着氢的中间传递体的作用。因此，土壤中脱氢酶活性的强弱影响到土壤中有机物质的降解，间接影响土壤肥力的高低。土壤中脱氢酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中脱氢酶活性的检验有很重要的意义。为了测定脱氢酶的活性，Lenhard(1956)首次采用了四唑盐，其方法原理，后来得到了不同程度的改进和完善。这些改进主要在于改变土壤称量、四唑盐的浓度和采用不同的甲月替提取剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检验土壤中脱氢酶活性的分析方法。该方法是在借鉴前人测定方法的原理基础上对一些实验步骤(称样重、TTX浓度等)进行了改进，提高了实验效率、甲月替的提取程度、使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测土壤中脱氢酶活性的分析方法，
1)称取10-20g风干土样n份于离心管中，n≥2，向其中n-1支离心管中分别先用1-3ml重量浓度0.1-1％TTX溶液，后用水2-3ml，将混合物饱和至土壤最大持水量；向另一支离心管中加等量的蒸馏水代替TTX溶液，其它操作步骤相同；将离心管塞紧，放入27-29℃恒温培养箱中恒温培养20±1h；同时作试剂空白对照；
2)培养结束后，1900-2100r/min离心2-5min，分别取出土壤上清液；
3)然后，用10-20ml提取剂丙酮分别处理土壤8-10min，以提取生成的甲月替，将混合物离心1900-2100r/min离心2-6min，将上清液分别倒入容量瓶中；
4)用提取剂丙酮分别向三角瓶中洗涤沉淀2-4次，至获得无色提取液，将提取液全部转移到其相应的容量瓶中，并用丙酮定容；
5)立刻在分光光度计上于485nm处比色测定吸光度A；
6)制作标准曲线：用提取剂丙酮配制一系列TPF标准溶液与样品一起在485nm处比色测定吸光度A’；以一系列TPF溶液的浓度和其所测得的吸光度值A’制作标准曲线，求得斜率b；
7)计算滤液中甲月替的量：a＝A*b(根据用甲月替的标准溶液绘制的标准曲线查知)；
8)计算脱氢酶活性：
计算公式：x＝av*150.35，单位：微升H+/10g干土.20h
式中：a为1ml滤液中甲月替的毫克数mg/ml，根据标准曲线查知；v为提取液的体积ml；150.35是将1mg甲月替换算为氢的体积(微升)的系数。
对于酸性土样品，分析前应调节其pH为7-8.5，可采用加入碳酸钙的方法调解，每支离心管中分别加入0.1-0.2g CaCO3充分混合，混匀向其中n-1支离心管中加入1-3ml重量浓度0.1-1％TTX溶液，另1支离心管中加入等量的蒸馏水代替TTX溶液作为样本对照。
所述制作标准曲线过程如下，吸取10ml 1mg/ml的TPF标准溶液用丙酮稀释至100ml，其浓度为100μgTPF/ml，分别吸取0，5，10，15，20ml稀释标准溶液于100ml容量瓶中，每瓶中含有TPF分别为0，0.5，1，1.5，2mg，用丙酮定容后充分摇匀，每瓶中TPF的浓度为0，0.005，0.01，0.015，0.02mg/ml，与样品一起在485nm处比色测定吸光度A’；以一系列TPF溶液的浓度和其所测得的吸光度值A’制作标准曲线，求得斜率b。
所述的提取剂丙酮可用甲醇或体积百分比为90％丙酮和10％四氯化碳组成的混合液替代；当采用不同的提取剂提取培养土中的甲月替时，应采用与其相同的提取剂配制TPF标准曲线。
在测定潜在的脱氢酶活性时，向反应混合物中加入脱氢物质葡萄糖、丙酮盐酸或者甘露醇，其用量为1-3mg基质/50mg土壤碳。
本发明方法改进的依据
土壤脱氢酶是土壤中酶促脱氢反应的一类酶的总称，它们都参与土壤中有机物质的脱氢反应。可以用各种碳水化合物、有机酸、氨基酸、醇类等作为脱氢基质。在脱氢过程中离析的氢可以转移给空气氧或醌型有机物质。在测定土壤的潜在脱氢酶活性时，用葡萄糖作为脱氢作用的基质；而在测定土壤的有效脱氢酶活性时，则不加基质。与此相同，本方法测定的是土壤的有效脱氢酶活性，以硫酸氨为底物，经过20h的恒温培养，通过计算单位时间内单位土壤中H+的微升数来表示脱氢酶的活性。
本发明所使用的测定原理为：
为了测定土壤中脱氢酶活性，常用无色的四唑盐，特别是2，3，5-三苯基四唑氯化物(TTX)作为基质，后者能接受脱氢酶活化的氢，转变成红色的2，3，5-三苯基甲月替(TPF)，根据颜色的深浅，用比色法485nm处测出甲月替的含量，进而计算出脱氢酶的活性。
与过去的分析方法相比较，本发明的优点主要有：
1)所需设备简单、降低了试验成本。本测定方法中的培养试验是在离心管中进行，不需用更加复杂的仪器，减少对设备要求的依赖性。
2)所使用的方法没有显色过程，只是用丙酮少量多次的浸提TPF，减少操作过程的复杂性。
3)操作简单，分析结果稳定可靠，重现性好。本发明简化了操作步骤，易操作，方法准确度高；原来方法需要设置灭菌土壤作为对照，本发明只需要一个不加底物的溶液作为对照，与传统方法比较，所需设备简单，成本低；同时，遵循少量多次的原则，用丙酮尽可能的浸提产生的TPF，提高了实验结果的准确度。
具体实施方式
试剂配制：
1 CaCO，分析纯
2 1％2，3，5-三苯基四唑氯化物(TTX)溶液：将1g TTX溶于约80ml蒸馏水中，定容至100ml。
3 丙酮，分析纯
4 三苯基甲月替(TPF)标准溶液：将100mgTPF溶于约80ml丙酮中，并用丙酮定容到100ml，混匀。TPF浓度为1mg/ml。
操作步骤：
1)称取10g风干土样4份于离心管中，与0.1gCaCO3充分混合。向3支离心管中分别先用1ml 1％TTX溶液，后用水2ml，将混合物饱和至土壤最大持水量；向另一支离心管中加等量的蒸馏水代替TTX溶液，其它操作步骤相同。将离心管塞紧，放入28±1℃恒温培养箱中恒温培养20h；同时作试剂空白对照；
2)培养结束后，2000±100r/min离心5min，取出土壤上清液；
3)然后，用20ml丙酮处理土壤10min，以提取生成的甲月替，将混合物离心(2000r/min，5min)，将上清液倒入100ml容量瓶中；
4)用丙酮洗涤沉淀2-4次，至获得无色提取液，将提取液全部转移到100ml容量瓶中，并用丙酮定容；
5)立刻在分光光度计上于485nm处比色测定吸光度A；
6)制作标准曲线：吸取10ml 1mg/ml的TPF标准溶液用丙酮稀释至100ml(浓度为100μgTPF/ml)，分别吸取0，5，10，15，20ml稀释标准溶液于100ml容量瓶中(每瓶中含有TPF分别为0，0.5，1，1.5，2mg)，用丙酮定容后充分摇匀(每瓶中TPF的浓度为0，0.005，0.01，0.015，0.02mg/ml)，与样品一起在485nm处比色测定吸光度A’。以一系列TPF溶液的浓度和测得的吸光度值A’制作标准曲线，求得斜率b；
7)计算滤液中甲月替的量：a＝A*b(根据用甲月替的标准溶液绘制的标准曲线查知)；
8)计算脱氢酶活性：
计算公式：x＝av*150.35(单位：微升H+/10g干土.20h)
式中：a为1ml滤液中甲月替的毫克数(mg/ml根据标准曲线查知)；v为提取液的体积(ml)；150.35将1mg甲月替换算为氢的体积(微升)的系数。
实施例1
本实施例所使用的黑土采自于吉林省农业科学院(公主岭市)的长期定位试验地，设三个不同的处理：1号位对照，既不经过任何处理和添加任何土壤添加剂在普通土壤；2号为添加有机质处理的土壤；3号为添加有机质和NPK处理的土壤。土壤含水量均为20％(风干土重)，用上述方法检测三种处理的脱氢酶活性。
每种土壤得具体分析步骤如下：
1)称取10g风干土样4份于离心管中，与0.1gCaCO3充分混合。向3支离心管中分别先用1ml 1％TTX溶液，后用水2ml，将混合物饱和至土壤最大持水量；向另一支离心管中加等量的蒸馏水代替TTX溶液，其它操作步骤相同。将离心管塞紧，放入28±1℃恒温培养箱中恒温培养20h；同时作试剂空白对照；
2)培养结束后，2000±100r/min离心5min，取出土壤上清液；
3)然后，用20ml丙酮处理土壤10min，以提取生成的甲月替，将混合物离心(2000r/min，5min)，将上清液倒入100ml容量瓶中；
4)用丙酮洗涤沉淀2-4次，至获得无色提取液，将提取液全部转移到100ml容量瓶中，并用丙酮定容；
5)立刻在分光光度计上于485nm处比色测定吸光度A；
6)制作标准曲线：吸取10ml 1mg/ml的TPF标准溶液用丙酮稀释至100ml(浓度为100μgTPF/ml)，分别吸取0，5，10，15，20ml稀释标准溶液于100ml容量瓶中(每瓶中含有TPF分别为0，0.5，1，1.5，2mg)，用丙酮定容后充分摇匀(每瓶中TPF的浓度为0，0.005，0.01，0.015，0.02mg/ml)，与样品一起在485nm处比色测定吸光度A’。以一系列TPF溶液的浓度和测得的吸光度值A’制作标准曲线，求得斜率b；
7)计算滤液中甲月替的量：a＝A*b(根据用甲月替的标准溶液绘制的标准曲线查知)；
8)计算脱氢酶活性
试验结果如下：
由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。
实施例2
本实施例所使用的棕壤采于中国科学院沈阳生态实验站的长期定位试验地：其中1号土壤为对照处理的土壤，2号土壤为添加有机质的处理土壤，3号土壤为添加有机质和NPK的处理土壤。三种处理的土壤含水量均为20％(风干土重)，具体步骤如下：TTX溶液浓度为0.5％L，加入2mL，，其余步骤同实例1。
试验结果如下：
表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。
Claims (5)
1.一种检测土壤中脱氢酶活性的分析方法，其特征在于：
1)称取10-20g风干土样n份于离心管中，n≥2，向其中n-1支离心管中分别先用1-3ml重量浓度0.1-1％TTX溶液，后用水2-3ml，将混合物饱和至土壤最大持水量；向另一支离心管中加等量的蒸馏水代替TTX溶液，其它操作步骤相同；将离心管塞紧，放入27-29℃恒温培养箱中恒温培养20土1h；同时作试剂空白对照；
2)培养结束后，1900-2100r/min离心2-5min，分别取出土壤上清液；
3)然后，用10-20ml提取剂丙酮分别处理土壤8-10min，以提取生成的甲月替，将混合物离心1900-2100r/min离心2-6min，将上清液分别倒入容量瓶中；
4)用提取剂丙酮分别向三角瓶中洗涤沉淀2-4次，至获得无色提取液，将提取液全部转移到其相应的容量瓶中，并用丙酮定容；
5)立刻在分光光度计上于485nm处比色测定吸光度A；
6)制作标准曲线：用提取剂丙酮配制一系列TPF标准溶液与样品一起在485nm处比色测定吸光度A’；以一系列TPF溶液的浓度和其所测得的吸光度值A’制作标准曲线，求得斜率b；
7)计算滤液中甲月替的量：a＝A*b；
8)计算脱氢酶活性：
计算公式：x＝av*150.35，单位：微升H+/10g干土.20h
式中：a为1ml滤液中甲月替的毫克数mg/ml，根据标准曲线查知；v为提取液的体积ml；150.35是将1mg甲月替换算为氢的体积(微升)的系数。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：对于酸性土样品，分析前应调节其pH为7-8.5，可采用加入碳酸钙的方法调解，每支离心管中分别加入0.1-0.2g CaCO3充分混合，混匀向其中n-1支离心管中加入1-3ml重量浓度0.1-1％TTX溶液，另1支离心管中加入等量的蒸馏水代替TTX溶液作为样本对照。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述制作标准曲线过程如下，吸取10ml 1mg/ml的TPF标准溶液用丙酮稀释至100ml，其浓度为100μgTPF/ml，分别吸取0，5，10，15，20ml稀释标准溶液于100ml容量瓶中，每瓶中含有TPF分别为0，0.5，1，1.5，2mg，用丙酮定容后充分摇匀，每瓶中TPF的浓度为0，0.005，0.01，0.015，0.02mg/ml，与样品一起在485nm处比色测定吸光度A’；以一系列TPF溶液的浓度和其所测得的吸光度值A’制作标准曲线，求得斜率b。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述的提取剂丙酮可用甲醇或体积百分比为90％丙酮和10％四氯化碳组成的混合液替代；
当采用不同的提取剂提取培养土中的甲月替时，应采用与其相同的提取剂配制TPF标准曲线。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：在测定潜在的脱氢酶活性时，向反应混合物中加入脱氢物质葡萄糖、丙酮盐酸或者甘露醇，其用量为1-3mg基质/50mg土壤碳。
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| CNA2007100111201A CN101294193A (zh) | 2007-04-27 | 2007-04-27 | 一种检测土壤脱氢酶活性的分析方法 |
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| CN (1) | CN101294193A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI382173B (zh) * | 2009-01-07 | 2013-01-11 | Mingchi Inst Of Technology | Method for Evaluating Soil Fertility Release Strength of Pure Organic Fertilizer Using Multi-channel Carbon Dioxide Respiration |
| CN104422690A (zh) * | 2013-09-09 | 2015-03-18 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种检测土壤谷氨酰氨酶活性的分析方法 |
| CN113817801A (zh) * | 2020-06-18 | 2021-12-21 | 新疆大学 | 一种测定植物叶中甲酸脱氢酶活性及其评价的方法 |
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2007
- 2007-04-27 CN CNA2007100111201A patent/CN101294193A/zh active Pending
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| TWI382173B (zh) * | 2009-01-07 | 2013-01-11 | Mingchi Inst Of Technology | Method for Evaluating Soil Fertility Release Strength of Pure Organic Fertilizer Using Multi-channel Carbon Dioxide Respiration |
| CN104422690A (zh) * | 2013-09-09 | 2015-03-18 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种检测土壤谷氨酰氨酶活性的分析方法 |
| CN104422690B (zh) * | 2013-09-09 | 2018-03-27 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种检测土壤谷氨酰胺酶活性的分析方法 |
| CN113817801A (zh) * | 2020-06-18 | 2021-12-21 | 新疆大学 | 一种测定植物叶中甲酸脱氢酶活性及其评价的方法 |
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