CN1982878A - 一种活性污泥比电子传递体系活性诊断方法 - Google Patents

Abstract

一种活性污泥比电子传递体系活性诊断方法，属于给排水技术领域。包括向介质中加入电子受体，提取微生物细胞内的还原态四唑盐，检测还原态四唑盐的光密度，计算的基本步骤。所作的改进是：利用测试管测定污泥干重，用碘硝基四氮唑作为电子受体，以甲醇为萃取剂常温提取微生物细胞内的INTF。本发明的积极效果是：电子亲和力大，与氧竞争电子的能力强，检测在有氧条件下进行，可用于检测好氧、厌氧及脱氮污泥的生物活性。以甲醇为萃取剂，毒副作用较小。于常温(37℃)条件下完成，避免了高温带来的萃取不全、萃取剂蒸发等问题。将污泥干重测定与微生物电子传递过程检测相结合，避免了因混合液浓度不同和取样不均而产生的误差。

Description

一种活性污泥比电子传递体系活性诊断方法

技术领域

本发明属于给排水技术领域，具体涉及一种活性污泥活性的诊断方法。

背景技术

活性污泥的微生物活性是分析、评价和预测污水生物处理性能的重要指标，它既可从分子生物学角度反映处理系统微生物降解有机物质的能力，又可从生物活性的高低衡量有机物的降解速度及生物处理设施的运行效果。我国的污水处理厂是以生物处理法为主导，根据污水生物处理系统生物活性分析结果，可对生物处理性能进行在线监测，判断污水处理微生物的生物活性状态，然后利用自动或人工的方式调控运行参数，使生物处理系统能够运行在最佳的状态点，保证出水水质达到设计要求。因此，研发灵敏准确的生物活性检测方法，并利用该方法来监控污水生物处理系统的运行，对于促进水质生物处理技术的发展，强化和提高污水生物处理系统的运行控制，具有十分重要的意义。

表征污泥生物活性的方法较多，主要包括混合液悬浮固体浓度(MLSS，Mixed Liquid Suspended Solid)、混合液挥发性悬浮固体浓度(MLVSS，MixedLiquid Volatile Suspended Solid)、脱氧核糖核酸(DNA，Deoxyribonucleic Acid)、核糖核酸(RNA，Ribonucleic Acid)、活菌菌数(ABN，Active Bacteria Number)、摄氧速率(OUR，Oxygen Uptake Rate)、三磷酸腺苷(ATP，Adenosine Triphosphate)和电子传递体系(ETS，Electron Transport System)活性等，它们是从微生物细胞干重、细胞组分含量和新陈代谢速率等不同角度反映污泥微生物的生物活性，并表现出不同的特性。其中，MLSS和MLVSS反映的是细胞粗重，但无法准确指示系统的真实反应速率和区分活性污泥中活细胞、死细胞及非生物性挥发固体之间的差别；DNA和RNA含量能够准确指示混合液中的活性生物量，但测定方法太过繁琐，且需要高尖端的仪器，耗时亦长；ABN是较灵敏的反映污泥活性生物量的指标，但ABN检测中培养基的选择和污泥絮体分离方法一直存有争议，尚无法统一；OUR可以准确测定好氧生物处理系统污泥的生物活性，但不能应用于厌氧污泥生物活性的测定，其测试过程要求的特殊仪器和严格操作条件亦成为制约该指标推广应用的瓶颈；ATP受限制之处是它仅能反映系统内微生物的总活性，并不能区分不同生物种群的生物活性，测定方法的繁琐性和复杂性同样限制其进一步应用。

电子传递体系活性是通过测定微生物的电子传递速率来间接指示微生物的呼吸活性，进而可定量活性污泥的生物活性。该方法可同时检测的样品数量不受限制，操作简便，适于现场应用，所需的仪器设备均是实验室常规仪器，因此近年来颇受国内外有关专家的重视。

传统的活性污泥电子传递体系活性常采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，2，3，5-triphenyltetrazolium Chloride)为电子受体进行检测，TTC在微生物电子传递体系作用下会接受电子而还原，生成红色的TF(Triphenyl Formazan)，并以晶体形式沉积在活性污泥微生物细胞内。TTC的氧化还原电位较高(+490mV)，对电子的亲和力小，与氧竞争电子的能力弱，TTC实验因此需增除氧步骤，以避免氧对实验结果的干扰。TTC的适用范围有一定限制，不适合检测厌氧和反硝化脱氮污泥的生物活性；用TTC检测活性污泥的电子传递体系活性时，一般以丙酮、甲苯和丙酮+四氯乙烯(2+3)作为TF的萃取剂，这些萃取剂对实验操作人员的身体健康均有不同程度的危害作用，尤其四氯乙烯还属可疑的致癌物质；TF萃取过程常在高温(90℃)下完成，结果导致萃取剂部分蒸发，从而影响实验结果的准确性；TTC检测的活性污泥电子传递体系活性常以单位体积混合液在单位时间内所产生的TF数量为单位表示，该活性单位不但无法真实表征单位干重活性污泥所具有的电子传递体系活性，即比电子传递体系活性，而且在混合液浓度不同的情况下，用该单位所表示的实验结果，其准确性也受到严重影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种活性污泥比电子传递体系活性诊断方法，克服现有的活性污泥电子传递体系活性诊断方法存在的上述不足。

本发明的方法包括现有的活性污泥电子传递体系活性诊断方法的向介质中加入电子受体，提取微生物细胞内的还原态四唑盐，检测还原态四唑盐的光密度，计算的基本步骤。所作的改进是：利用测试管测定污泥干重，用碘硝基四氮唑作为电子受体，以甲醇为萃取剂常温提取微生物细胞内的INTF，测定出活性污泥比电子传递体系活性，并用 $U=\frac{D_{485}V}{\mathrm{kt}(W_2-W_1)}$ 式计算，式中D₄₈₅为波长485nm处的上清液吸光度；V为萃取剂体积(mL)；k为标准曲线斜率；t为培养时间(h)；W₁为测试管质量(mg)；W₂为测试管和样品质量之和(mg)。

本诊断方法的生化反应机理为：通过向培养介质中加入氧化还原电位低于天然最终电子受体(O₂)的INT，使之在天然的最终电子受体之前从微生物呼吸链上接受电子而还原，并发生明显颜色的变化。通过检测INTF的光密度，并同时测定活性污泥的干重，便可判断微生物呼吸链传递H⁺/e的速率和强度，并依此可定量活性污泥的比电子传递体系活性。在本诊断方法中，INT从微生物呼吸链上接受电子之后，其还原产物为INTF(紫色)，反应式如下：

INT(浅黄色)               INTF(紫色)

本发明的积极效果是：

利用碘硝基四氮唑(INT，2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenylTetrazolium Chloride)作为电子受体诊断活性污泥的电子传递体系活性。该电子受体在微生物作用下会被还原为紫色的INTF(IodonitrotetrazoliumFormazan)。INT的氧化还原电位较低(+90mV)，对电子的亲和力大，与氧竞争电子的能力强，实验可在有氧条件下进行，可用于检测好氧、厌氧及脱氮污泥的生物活性。INT检测的电子传递体系活性是以甲醇为萃取剂提取微生物细胞内的INTF。与丙酮、甲苯和四氯乙烯等传统萃取剂相比，甲醇的毒副作用较小，不会对人体健康产生明显危害。用INT诊断活性污泥的电子传递体系活性时，INTF的萃取过程于常温(37℃)条件下完成，无需提高萃取温度，实现了活性污泥比电子传递体系活性的常温检测，实验操作更为简便，避免了高温实验带来的萃取不完全、萃取剂蒸发等负面问题。将污泥干重测定与微生物电子传递过程检测相结合，首次实现了活性污泥比电子传递体系活性的检测，诊断出活性污泥的比电子传递体系活性，避免了因混合液浓度不同和取样不均而产生的误差，提高了实验结果的准确性和重现性。检测仪器简单，耗时短且适于现场应用。适用所有活性污泥的生物活性测定。有助于污泥活性诊断方法的标准化和规范化。

附图说明

附图为INT从微生物电子传递链上接受电子的部位图。

具体实施方式

1、将测试管用纯水清洗干净，在(105±1)℃下烘干至恒重，记录质量W₁；

2、向10mL的测试管中依次加入0.3mL的活性污泥混合液、1.5mL的Tris-HCl缓冲溶液和1mL的0.2％INT溶液；

3、将制备完成的样品迅速放在(37±1)℃的水浴振荡器内，暗处振荡培养30min；

4、当达到培养时间时，向测试管中加1mL的37％甲醛溶液终止反应，然后将样品在4000r/min下离心5min，弃去上清液；

5、向样品中加入5mL甲醇，混合搅拌均匀，在(37±1)℃下暗处振荡萃取10min；

6、将萃取完毕的样品在4000r/min下离心5min，然后在721-分光光度计的485nm处，以加入3滴间甲酚的样品为空白对照，测定待测样品的INTF萃取液吸光度；

7、将分离的沉淀污泥在(105±1)℃下烘干至恒重，记录质量W₂。

8、计算得结果，活性污泥的比电子传递体系活性计算公式如下：

$U=\frac{D_{485}V}{\mathrm{kt}(W_2-W_1)}$

式中，U为比电子传递体系活性[μg/(mg·h)]；D₄₈₅为波长485nm处的上清液吸光度；V为萃取剂体积(mL)；k为标准曲线斜率；t为培养时间(h)；W₁为测试管质量(mg)；W₂为测试管和样品质量之和(mg)。

Claims (1)

1、一种活性污泥比电子传递体系活性诊断方法，包括现有的活性污泥电子传递体系活性诊断方法的向介质中加入电子受体，提取微生物细胞内的还原态四唑盐，检测还原态四唑盐的光密度，计算的基本步骤。其特征是：利用测试管测定污泥干重，用碘硝基四氮唑作为电子受体，以甲醇为萃取剂常温提取微生物细胞内的INTF，测定出活性污泥比电子传递体系活性，并用 $U=\frac{D_{485}V}{\mathrm{kt}(W_2-W_1)}$ 式计算，式中D₄₈₅为波长485nm处的上清液吸光度；V为萃取剂体积(mL)；k为标准曲线斜率；t为培养时间(h)；W₁为测试管质量(mg)；W₂为测试管和样品质量之和(mg)。