CN102105482A - 核苷三磷酸衍生物、核酸探针、多标记核酸探针、制备多标记核酸探针的方法以及探测靶核酸的方法 - Google Patents

核苷三磷酸衍生物、核酸探针、多标记核酸探针、制备多标记核酸探针的方法以及探测靶核酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种新的核苷三磷酸衍生物、一种核酸探针和一种能方便并高灵敏度地探测靶核酸的多标记核酸探针，以及一种制备该多标记核酸探针的方法，和一种使用该多标记核酸探针或该核酸探针探测靶核酸的方法。通过使用转谷氨酰胺酶(TGase)，并使用通过共价结合预先引入多个标记部分的多标记核酸探针，或者通过共价结合将多个标记部分引入已与靶核酸杂交的核酸探针中，从而可以方便和高灵敏度地探测靶核酸。

Description

核苷三磷酸衍生物、核酸探针、多标记核酸探针、制备多标记核酸探针的方法以及探测靶核酸的方法
技术领域
本发明涉及一种核苷三磷酸衍生物、核酸探针、多标记核酸探针、制备多标记核酸探针的方法以及探测靶核酸的方法。
背景技术
通过使用核酸探针，如带有某种标记的RNA探针，从而在细胞水平上探测和显示DNA或RNA的表达模式，可以解释有关生命现象的许多问题。这种使基因表达模式在细胞水平上可视化的技术被称为原位杂交(ISH)，并且在该技术中使用的探针标记方法可大体上分为“放射性同位素标记法”、“荧光抗体标记法”和“酶抗体标记法”。在历史上，最先开发了具有引入的放射性同位素的核酸探针，但近些年来，关于这种探针的操作已经加入了很多限制，因此，不需要使用放射性同位素成分的荧光抗体标记法和酶抗体标记法正在引起广泛的关注。
在这些技术中，在核酸探针的制备过程中用抗原或抗生素进行标记，然后将核酸探针和靶核酸进行杂交后，采用由酶或荧光材料标记的抗体或亲和素的免疫染色法来进行探测。由于酶反应可实现信号放大效应，所以酶抗体标记法具有良好的灵敏度，因此目前使用最为广泛。
已知的应用酶抗体标记法的核酸探针的例子包括抗原-多标记核酸探针，其中以随机排列的方式引入了在如地高辛(DIG)的抗体识别位点处进行了修饰的多个核苷酸衍生物。在将该抗原-多标记核酸探针和靶核酸进行原位杂交后，由识别抗体识别位点的酶标记抗体引导抗原-抗体反应，并采取利用与碱性磷酸酶杂交的显色反应来进行探测。然而，这种方法有一些问题，包括：酶标记抗体极其贵，抗原-抗体反应所需的操作复杂，以及由非特异性吸附引起的背景值升高等等。
另一方面，人们已经知道一种方法，其中，使用转谷氨酰胺酶(TGase)来实现外源性分子与肽或蛋白质的位点-特异性结合，其中，所述外源性分子为阴离子性的并且具有TGase可识别的谷氨酰胺(Gln)残基，而所述肽或蛋白质具有TGase可识别的赖氨酸残基或伯胺(例如，见专利文献1)。
现有技术
专利文献：
专利文献1 JP 2008-54658A
发明内容
本发明要解决的问题
本发明提供了一种新型核苷三磷酸衍生物，一种核酸探针以及一种能方便并高灵敏度地探测靶核酸的多标记核酸探针，并且还提供了一种制备该多标记核酸探针的方法，以及一种使用该多标记核酸探针或该核酸探针探测靶核酸的方法。
解决问题的方法
本发明提供了一种具有谷氨酰胺(Gln)残基的核苷三磷酸衍生物。
而且，该核苷三磷酸衍生物优选用下述式(1)表示。
Figure BPA00001306998800021
在式(1)中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
此外，该核苷三磷酸衍生物优选用下述式(2)表示。
Figure BPA00001306998800031
在式(2)中，A1和A2中的至少一个代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，其余的另一个代表氢原子，B代表氢原子或羟基。
另外，该核苷三磷酸衍生物优选用下述式(3)表示。
Figure BPA00001306998800032
在式(3)中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
进一步地，该核苷三磷酸衍生物优选用下述式(4)表示。
Figure BPA00001306998800033
在式(4)中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
更进一步地，该核苷三磷酸衍生物优选用下述式(5)表示。
Figure BPA00001306998800041
在式(5)中，X和Y各自独立地代表二价连接基团，并且Z代表取代基。
此外，在所述核苷三磷酸衍生物中，上述的X和Y优选各自独立地代表具有1到48个碳原子数的亚烷基或者具有2到48个碳原子数的亚烯基，并且Z优选代表具有1到48个碳原子数的烷基、具有1到48个碳原子数的烷氧基、具有6到48个碳原子数的芳基、具有6到48个碳原子数的芳氧基、具有7到48个碳原子数的芳烷基、或者具有7到48个碳原子数的芳烷氧基。而且，Y可以为具有2到48个碳原子数的亚烷氧基(如亚乙氧基或亚丙氧基)，并且Y和Z中至少一个可以独立地被除赖氨酸以外的氨基酸取代。
进一步地，在该核苷三磷酸衍生物中，X优选为亚乙烯基，Y优选为亚甲基，并且Z优选为苄氧基。
此外，本发明也提供了一种核酸探针，该核酸探针为在其中已引入多个上述核苷三磷酸衍生物作为结构单元的核酸。
另外，本发明也提供了一种多标记核酸探针，其包含具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺并含有标记部分的标记化合物，并且该标记化合物与上述核酸探针中的至少两个谷氨酰胺(Gln)残基分别结合。
进一步地，在该多标记核酸探针中，标记部分优选为酶和荧光染料中的至少一种。
进一步地，在该多标记核酸探针中，所述酶优选为来源于超嗜热菌的酶。
更进一步地，在该多标记核酸探针中，所述酶优选为对有机溶剂和热稳定的酶。
此外，本发明也提供了一种制备多标记核酸探针的方法，该方法包括用转谷氨酰胺酶(TGase)使具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺并包含标记部分的标记化合物与上述核酸探针中的至少两个谷氨酰胺(Gln)残基分别结合。
进一步地，在所述多标记核酸探针的制备方法中，所述标记部分优选为酶和荧光染料中的至少一种。
更进一步地，在所述多标记核酸探针的制备方法中，所述酶优选未来源于超嗜热菌的酶。
此外，本发明也提供了一种探测靶核酸的方法，该方法包括将所述多标记核酸探针和存在于靶材料中的靶核酸通过核酸部分进行特异性结合，以及通过所述标记部分探测所结合的多标记核酸探针。
另外，本发明还提供了一种探测靶核酸的方法，该方法包括将上述核酸探针和存在于靶材料中的靶核酸通过核酸部分进行特异性结合，随后通过使用转谷氨酰胺酶(TGase)使核酸探针内的谷氨酰胺(Gln)残基与具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺并包含标记部分的标记化合物内的赖氨酸(Lys)残基或伯胺反应，从而引入多个标记部分，以及通过该标记部分来探测所结合的核酸探针。
有益效果
本发明能够提供一种新型核苷三磷酸衍生物，以及一种用于制备多标记核酸探针的核酸探针，该多标记核酸探针具有多个通过共价结合而引入其中的标记部分。
此外，在核酸探针与靶核酸杂交前，通过预先将多个标记部分经共价结合引入到核酸探针中，本发明能够提供一种能方便并高灵敏度地探测靶核酸的多标记核酸探针。
进一步地，通过使用转谷氨酰胺酶(TGase)将多个标记部分经共价结合引入到核酸探针中，本发明也能够提供一种制备能方便并高灵敏度地探测靶核酸的多标记核酸探针的方法。
进一步地，通过使用经共价结合预先在其中引入多个酶的多标记核酸探针，本发明能够提供一种方便且高灵敏度地探测靶核酸的方法。
更进一步地，通过将核酸探针和靶核酸杂交，并随后经核酸探针内的谷氨酰胺(Gln)残基和标记化合物中的赖氨酸(Lys)残基或伯胺之间的简单反应，通过共价结合引入多个标记部分，本发明能够提供一种方便且高灵敏度地探测靶核酸的方法。
附图说明
图1为说明根据本发明一个实施方式的核苷酸衍生物(Z-QG-UTP)结构的一个实例的图。
图2为说明根据本发明的一个实施方式制备酶-多标记核酸探针的方法的示意图。
图3为说明Z-QG-UTP合成方法的一个实例的图，Z-QG-UTP表示根据本发明一个实施方式的核苷酸衍生物的一个例子。
图4A为说明对本发明实施例1中的氨基烯丙基-UTP进行反相HPLC(在如表1所列出的HPLC测量条件下)的结果的图。
图4B为说明在本发明实施例1中的Z-QG-UTP合成后进行反相HPLC(在如表1所列出的HPLC测量条件下)的结果的图。
图5为说明在本发明实施例1中的Z-QG-UTP合成后进行反相HPLC(在如表2所列出的HPLC测量条件下)的结果的图。
图6为说明对在本发明实施例1中合成的Z-QG-UTP进行MALDITOF-MS分析的结果的图。
图7为说明使用实施例1中测试1的标准探针进行斑点印迹试验的结果的图。
图8为说明使用实施例1测试2中的酶-多标记核酸探针按照Alkphos Direct法(碱性磷酸酶直接标记法)所探测的结果的图。
图9A为说明使用琼脂糖凝胶电泳设备进行电泳的结果的图，其示出了当用不同比例的UTP和Z-QG-UTP制备RNA时观察到的分子量的改变。
图9B为说明使用微芯片电泳设备进行电泳结果的图，其示出了当用不同比例的UTP和Z-QG-UTP制备RNA时观察到的分子量的改变。
图10为说明用MTG进行PfuAP标记时，使用琼脂糖凝胶电泳设备进行电泳的结果的图。
图11为说明在室温下使用PfuAP-多标记RNA探针的核酸探针进行斑点印迹的结果的图。
图12为说明使用用Alkphos Direct试剂盒制备的酶-多标记核酸探针来评价ISH的检测灵敏度的图。
图13为说明在50℃下使用PfuAP-多标记RNA探针的核酸探针进行斑点印迹的结果的图。
图14为说明在氨基烯丙基-UTP的TE缓冲液(pH 8.0)中，测量相对于氨基烯丙基-UTP的浓度的吸收光谱的结果的图。
图15为说明在该光谱范围内由290nm处的吸光度计算的校准曲线图。
图16为说明根据本发明的一个实施方式的探测靶核酸方法的一个实例的示意图。
图17为说明对本发明实施例3中合成的Z-QG-dUTP进行MALDI TOF-MS分析的结果的图。
图18为说明在本发明实施例3中Z-QG-dUTP合成后进行反相HPLC(在如表13所列出的HPLC测量条件下)的结果的图。
图19为说明对本发明实施例3中的氨基烯丙基-dUTP进行反相HPLC(在如表13所列出的HPLC测量条件下)的结果的图。
图20为说明在本发明实施例3中制备Z-QG DNA期间，当对不同比率的Z-QG-dUTP做PCR时，进行电泳的结果的图。
图21为说明在本发明实施例3中在研究Z-QG DNA的PfuAP标记期间，与MTG反应后进行琼脂糖电泳的结果的图。
图22为说明为了制备本发明实施例3的PfuAP-多标记DNA探针，与MTG反应后进行琼脂糖电泳的结果的图。
图23为说明本发明实施例3中的各个PfuAP-多标记DNA探针进行斑点印迹的结果的图。
图24为说明为了制备本发明实施例4的PfuAP-多标记DNA探针，与MTG反应后进行琼脂糖电泳的结果的图。
图25为说明对本发明实施例4中的各个PfuAP-多标记DNA探针进行斑点印迹的结果的图。
图26为说明当在本发明实施例5中用MTG进行BAP标记时，使用琼脂糖凝胶电泳设备进行电泳的结果的图。
图27为说明在室温下使用本发明实施例5中的BAP-多标记RNA探针的核酸探针进行斑点印迹的结果的图。
图28为说明在本发明实施例6中使用MTG对Z-QG RNA进行Alexa Fluor 555尸胺标记的结果的图。
图29为说明在室温下使用本发明实施例6中的Alexa Fluor 555-多标记RNA的核酸探针进行斑点印迹的结果的图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行描述。这些实施方式仅为实施本发明的例子，并且本发明不限于这些实施方式。
本发明的发明人关注于例如微生物转谷氨酰胺酶(MTG)的转谷氨酰胺酶(TGase)所具有的位点特异性蛋白质修饰的能力，作为一种在核酸探针中通过共价结合来引入多个酶的技术。TGase是一种催化酰基转移反应的酶，例如，催化蛋白中特异性Gln残基(Q)的γ-氨甲酰基团和赖氨酸残基(K)或任意一种伯胺上的ε-氨基之间的共价结合。使用该TGase，能够制出包含多个被引入的标记部分(如标记酶)的多标记核酸探针。
在一个具体的实例中，合成了图1所示的核苷酸衍生物Z-QG-UTP，其中，具有被TGase识别的Gln残基(MTG-可识别Gln)的Z-QG与尿苷三磷酸(UTP)结合，然后如图2所示，在制备用作核酸探针的RNA期间通过并入该Z-QG-UTP，制备出在多个位置具有引入的TGase-可识别Gln残基的Z-QG RNA。随后，通过使用TGase(如MTG)来实现与标记化合物(例如具有引入的TGase-可识别Lys(如MTG-可识别Lys)的标记酶)的结合，从而制备出一种多标记核酸探针，其中RNA和标记部分(如标记酶)之间的标记比率为1∶n(其中n为2或更大的整数)。
由于该多标记核酸探针在与靶核酸杂交后能迅速进行探测反应，所以可以显著简化操作并降低背景值，并且因为使用了大量微生物转谷氨酰胺酶(MTG)，可以预期的是，与常规技术相比能显著降低成本。
在图2中，核酸探针中的Gln残基与标记化合物中的Lys残基可以互换。也就是说，通过合成一种具有被TGase识别的Lys残基(MTG-可识别Lys)的核苷三磷酸衍生物，然后在制备用作核酸探针的RNA期间并入该衍生物，可以制备出一种在多个位置具有引入的TGase-可识别Lys残基的核酸探针。随后，通过使用TGase(如MTG)来实现与具有引入的TGase-可识别Gln残基(如MTG-可识别Gln)的标记化合物的结合，从而制备出一种多标记核酸探针，其中RNA和标记部分之间的标记比率为1∶n(其中n为2或更大的整数)。
此外，如图16所示，如Z-QG RNA的核酸探针可以首先与靶核酸杂交，然后用如MTG的TGase与标记化合物(如具有引入的TGase-可识别Lys(如MTG-可识别Lys)的标记酶)结合。RNA和标记部分(如标记酶)之间的标记比率为1∶n(其中n为2或更大的整数)，并且通过随后对这些引入的标记部分进行检测反应，可以显著简化操作并降低背景值，而且，因为使用了大量微生物转谷氨酰胺酶(MTG)，可以预期的是，与常规技术相比能显著降低成本。
在图16中，核酸探针中的Gln残基和标记化合物中的Lys残基可以互换。也就是说，通过合成一种具有被TGase识别的Lys残基(MTG-可识别Lys)的核苷三磷酸衍生物，然后在制备起核酸探针作用的RNA期间并入该衍生物，可以制备出一种在多个位置具有引入的TGase-可识别Lys残基的核酸探针。随后，该核酸探针可以与靶核酸杂交，然后用如MTG的TGase与具有引入的TGase-可识别Gln(如MTG-可识别Gln)的标记化合物结合。
<核苷三磷酸衍生物>
根据本发明一个实施方式的核苷三磷酸衍生物具有谷氨酰胺(Gln)残基。这种具有谷氨酰胺(Gln)残基的核苷三磷酸衍生物的例子包括具有谷氨酰胺(Gln)残基的尿苷三磷酸(UTP)衍生物，具有谷氨酰胺(Gln)残基的腺苷三磷酸(ATP)衍生物，具有谷氨酰胺(Gln)残基的鸟苷三磷酸(GTP)衍生物，具有谷氨酰胺(Gln)残基的胞苷三磷酸(CTP)衍生物，具有谷氨酰胺(Gln)残基的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)衍生物，具有谷氨酰胺(Gln)残基的脱氧腺苷三磷酸(dATP)衍生物，具有谷氨酰胺(Gln)残基的脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)衍生物，以及具有谷氨酰胺(Gln)残基的脱氧胞苷三磷酸(dCTP)衍生物。在根据该实施方式的核苷三磷酸衍生物中，例如，谷氨酰胺(Gln)残基被结合到尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶部分上，或者直接结合或者通过置于其间的取代基结合。
这些核苷三磷酸衍生物可以由UTP、ATP、GTP、CTP、dUTP、dATP、dGTP、dCTP或其衍生物获得。
此外，这些核苷三磷酸衍生物也可以由尿苷、尿苷一磷酸(UMP)和尿苷二磷酸(UDP)，腺苷、腺苷一磷酸(AMP)和腺苷二磷酸(ADP)，鸟苷、鸟苷一磷酸(GMP)和鸟苷二磷酸(GDP)，胞苷，胞苷一磷酸(CMP)和胞苷二磷酸(CDP)，脱氧尿苷、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)和脱氧尿苷二磷酸(dUDP)，脱氧腺苷，脱氧腺苷一磷酸(dAMP)和脱氧腺苷二磷酸(dADP)，脱氧鸟苷，脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)和脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)，脱氧胞苷，脱氧胞苷一磷酸(dCMP)和脱氧胞苷二磷酸(dCDP)，以及这些化合物的各种衍生物获得。
例如，上述化合物的三磷酸衍生物可以通过使用磷酸化酶等的磷酸化作用(例如，见Seibutsu-kogaku kaishi(Journal of The Society for Biotechnology，Japan)，85(9)，pp.397-399(2007)，和Journal of Bioscience and Bioengineering，87(6)，pp.732-738(1999))，或者在有质子海绵存在的条件下通过三氯氧磷或类似物的磷酸化作用(例如，见Tetrahedron Letters，29(36)，pp.4525-4528(1988))，由尿苷、腺苷、鸟苷、胞苷、脱氧尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷或脱氧胞苷获得。
根据本发明实施方式的核苷三磷酸衍生物为，例如，下式(1)表示的尿苷三磷酸衍生物，其具有TGase可识别的谷氨酰胺(Gln)残基。
Figure BPA00001306998800101
式(1)中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
根据本发明实施方式的核苷三磷酸衍生物为，例如，下式(2)表示的腺苷三磷酸衍生物，其具有TGase可识别的谷氨酰胺(Gln)残基。
Figure BPA00001306998800111
式(2)中，A1和A2中的至少一个代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，其余的另一个代表氢原子，B代表氢原子或羟基。
根据本发明实施方式的核苷三磷酸衍生物为，例如，下式(3)表示的胞苷三磷酸衍生物，其具有TGase可识别的谷氨酰胺(Gln)残基。
Figure BPA00001306998800112
式(3)中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
根据本发明实施方式的核苷三磷酸衍生物为，例如，下式(4)表示的鸟苷三磷酸衍生物，其具有TGase可识别的谷氨酰胺(Gln)残基。
Figure BPA00001306998800113
式(4)中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
对于由A代表的具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基没有特别限定，并且例子包括包含具有谷氨酰胺(Gln)残基的直链、支链或环状的饱和或不饱和的烷基、氨烷基、芳基或杂芳基的取代基。所述取代基可以通过适当考虑例如便于合成的因素来选择。
根据本发明实施方式的核苷三磷酸衍生物为，例如，下式(5)表示的由TGase底物修饰的核苷酸衍生物，其具有TGase可识别的谷氨酰胺(Gln)残基。
Figure BPA00001306998800121
式(5)中，X和Y各自独立地代表二价连接基团，并且Z代表取代基。
X和Y各自独立代表的二价连接基团的例子包括：具有1到48个碳原子数的亚烷基，如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基，以及具有2到48个碳原子数的亚烯基，如亚乙烯基、亚丙烯基或亚丁烯基。其中，X和Y优选各自独立地代表具有1到48个碳原子数的亚烷基，具有2到48个碳原子数的亚烯基，或者具有1到48个碳原子数的烷氧基，并且特别优选X代表亚乙烯及以及Y代表亚甲基的那些情况。X和Y也可以被亚乙烯基或亚烷氧基取代，如-(C2H4O)n-或-(C3H6O)n-(其中n代表重复数，如n＝2，4，8，12或24)。
Z代表的取代基的例子包括：具有1到48个碳原子数的烷基，如甲基、乙基或丙基，具有1到48个碳原子数的烷氧基，如甲氧基、乙氧基或丙氧基，具有6到48个碳原子数的芳基，如苯基或萘基，具有6到48个碳原子数的芳氧基，如苯氧基，具有7到48个碳原子数的芳烷基，如苄基，以及具有7到48个碳原子数的芳烷氧基，如苄氧基。其中，Z优选为具有1到48个碳原子数的烷基，具有1到48个碳原子数的烷氧基，具有6到48个碳原子数的芳基，具有6到48个碳原子数的芳氧基，具有7到48个碳原子数的芳烷基，或者具有7到48个碳原子数的芳烷氧基，并且更优选为苄氧基。Z也可以被二硝基苯基或L-3，4-二羟苯基等取代。此外，结合上述Y代表的取代基，Y和Z中的至少一个可以独立地被除赖氨酸以外的氨基酸取代。
通过适当选择X，连接Z-QG和UTP的连接区域的结构可以得到优化，例如通过引入柔性连接区域，从而能够改进酶等的接触。另外，适当选择Y和Z能够使底物肽序列得到优化，例如，从而改善对酶等的亲和力。
在使用微生物TGase(MTG)的那些情况下，MTG-可识别Gln残基优选以苄氧羰基-L-谷氨酰基甘氨酸(Z-QG)存在。Z-QG为优选的是因为其分子尺寸小于地高辛(DIG)等。在由式(5)代表的核苷三磷酸衍生物中，其中X代表亚乙烯基，Y代表亚甲基并且Z代表苄氧基的核苷酸衍生物为其中Z-QG与UTP结合的核苷酸衍生物Z-QG-UTP。此外，优选选择不包含TGase-可识别Lys残基或伯胺的核苷三磷酸衍生物。这是因为如果核苷三磷酸衍生物也包含如Lys残基或伯胺，则TGase可以引起自交联，这会给目标多标记核酸探针的产率带来不良影响。
另外，对微生物TGase而言良好底物的例子包括：由LLQG(序列号：1)、LAQG(序列号：2)、LGQG(序列号：3)、PLAQSH(序列号：4)、FERQHMDS(序列号：5)或TEQKLISEEDL(序列号：6)所代表的氨基酸序列组成的肽，或者由GLGQGGG(序列号：7)、GFGQGGG(序列号：8)、GVGQGGG(序列号：9)或GGLQGGG(序列号：10)所代表的氨基酸序列组成的肽。对源自豚鼠肝脏的TGase而言良好底物的其他例子包括：苄氧羰基-L-谷氨酰基苯丙氨酸(Z-QF)，由GGGQLGG(序列号：12)、GGGQVGG(序列号：13)、GGGQRGG(序列号：14)、GQQQLG(序列号：15)、PNPQLPF(序列号：16)、或PKPQQFM(序列号：17)代表的氨基酸序列组成的肽。根据使用的TGase的类型，TGase可识别的Gln残基可以以这些类型的肽之一的形式存在。
在N末端为甘氨酸(G)的底物肽中，其N末端氨基可以用作TGase底物，并且由此会产生自交联造成的副产物。因此，在N末端为甘氨酸(G)的底物肽类的情况中，可以通过用合适的基团取代N末端氨基的氢原子来保护肽，避免其成为TGase的底物，从而确保发生所需的连接。在本说明书中，除非具体说明，否则“N末端保护”的表达就用于描述这种保护。众所周知，反应活性随着N末端保护所用的方法而变化。具体来说，已知对于源自哺乳动物的TGase，通过GQQQLG的N末端乙酰化(即Ac-GQQQLG)或将N末端氨基转变为DOPA(L-3，4-二羟苯丙氨酸)(即DOPA-GQQQLG)进行的保护可以导致反应活性的增加。这些类型的保护例子也可以应用于本发明的实施方式中。
制备Z-QG-UTP的一种方法图示在图3中。这仅代表制备根据本实施方式的核苷三磷酸衍生物方法的一个例子，并且本发明不限于此实施例。
首先，将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团等引入至苄氧羰基-L-谷氨酰基甘氨酸(Z-QG)中来活化该分子(Z-QG-NHS)。随后，末端具有胺化的取代基的UTP(如氨基烯丙基-UTP)与Z-QG-NHS缩合，产生Z-QG-UTP。
此外，除了上述将C末端羧基转变为活性酯的方法外，将对氨基呈现出高反应性的官能团引入至肽中的方法，也可以作为将具有TGase-可识别Gln残基的肽引入UTP中的方法。例如，如果可以制备已转变为醛、酰基叠氮化物、磺酰氯、环氧化物、异氰酸酯或异硫氰酸酯的底物肽，随后，将该底物肽与胺化了的UTP反应可以用来制备具有TGase可识别的Gln残基的UTP。然而，这些反应性官能团可以按不影响TGase识别的比例而引入至底物肽。为了满足这一需求，最优选其中活化远离Gln残基的C末端羧基的上述方法。
Z-QG-UTP的纯化可以通过高效液相色谱(HPLC)或凝胶渗透色谱(GPC)等进行。此外，Z-QG-UTP的鉴定可以通过MALDI TOF-MS、NMR和IR等进行。另外，HPLC可以用于确认产物并测定产量。
<TGase底物-多标记核酸>
根据本发明一个实施方式的TGase底物-多标记核酸是这样一种TGase底物-多标记核酸，其中，制备式(1)到(5)代表的一种TGase底物-标记核苷三磷酸衍生物，并且随后将多个这种TGase底物-标记核苷三磷酸衍生物作为结构单元引入核酸，其中核酸部分具有的序列与表示探测靶的靶分子上靶核酸的特异性序列的全部或部分互补。
所述核苷酸包括DNA、PNA和RNA。对核酸的序列或长度没有特别限定。在长度方面，优选长度至少为约20mer。
例如，使用Z-QG-UTP作为底物，用具有RNA聚合酶活性的酶来并入多个Z-QG-UTP，并在多个位置引入TGase-可识别Gln残基，就能制备出具有所需序列的TGase底物-多标记核酸探针Z-QG RNA(见图2)。
<多标记核酸探针>
根据本发明一个实施方式的多标记核酸探针包含具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺并含有标记部分的标记化合物，并且该标记化合物与上述核酸探针中用作结构单元的核苷三磷酸衍生物中的至少两个谷氨酰胺(Gln)残基分别结合。所述多标记核酸探针可以通过，例如，使用TGase(如MTG)将具有引入其中的TGase-可识别Lys的标记酶等与在多个位置具有TGase-可识别Gln残基(如MTG-可识别Gln)的核酸探针Z-QG RNA结合而制备，并且具有的RNA和标记酶等的标记部分之间的标记比率为1∶n(见图2)。
对RNA和标记酶等的标记部分之间的标记比率值n没有特别限定，只要n为2或更大就可以。n值可以根据需要改变，但是n值越大，探测的灵敏度就越高，因此优选n值更大。然而，如果n太大，则会降低与靶核酸杂交的效率。
此外，通过采用下述方法，可以制备出多个具有不同标记部分(如不同标记酶或不同荧光染料)的多标记核酸探针。
(1)改变TGase的来源；
(2)改变TGase的底物特异性。
在方法(1)中，例如，可是通过改变所使用的TGase的种类来制备出已用不同底物肽修饰的UTP分子。
在方法(2)中，例如，可以通过蛋白质工程来引入氨基酸变体从而改变底物特异性。例如，可以在大肠杆菌中制备MTG(例如，见Christian K.Marx，Thomas C.Hertel和Markus Pietzch，Enzyme and Microbial Technology，volume 40，issue 6，2 May 2007，pp.1543-1550，“Soluble expression of a pro-transglutaminase from Streptomyces mobaraensis in Escherichia coli”)，然后产生了变体库，并随后得到呈现出改进耐热性的MTG变体(例如，见Christian K.Marx，Thomas C.Hertel和Markus Pietzch，Journal of Biotechnology，volume 136，issues 3-4，10 September 2008，pp.156-162，“ Random mutagenesis of a recombinant microbial transglutaminase for the generation of thermostable
当本说明书表述“使用TGase进行结合”时，除特殊情况外，该表述是指所得到的连接部分是由Lys残基和Gln残基形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸键而产生的。
在本实施方式中，TGase可识别的Lys残基可以为伯胺。在本说明书中，使用Lys残基作为例子，但是除非有特殊表述，否则该描述也适用于伯胺。
对于具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺且含有标记部分的标记化合物没有特别限定。
标记部分的例子包括：酶、荧光染料、含有放射性同位素的化合物、可磁性检测的标记物(如磁性纳米粒子)、可热检测的标记物(如温度响应性聚合物)以及可电检测的标记物(如包含二茂铁活性中心的聚合物)，虽然从检测灵敏性和操作角度来看，至少优选酶和荧光染料中的一种。
对荧光染料没有特别限定，只要其是这样一种材料，其可由所选定波长的紫外线或可见光等的辐射导致发出荧光或磷光。荧光染料的例子包括荧光素、若丹名、丹磺酰和羰花青衍生物，而荧光蛋白的例子包括绿色荧光蛋白及其变体。
放射性同位素的例子包括氘(2H)、氚(3H)、10B、11B、13C、15N和18O。
通常认为，对于TGase来说，用作Lys残基(或伯胺)供体的底物，其结构限制少于用作Gln残基供体的底物的结构限制。因此，存在要被修饰的标记酶一开始就具有TGase-可识别Lys残基的情况，以及将包含TGase-可识别Lys残基的标签添加到酶中的情况。
TGase可识别的Lys残基(K)可以作为具有如下代表的氨基酸序列的肽存在：MKHKGS(序列号：18)、MRHKGS序列号：35)、MRRKGS(序列号：36)或MHRKGS(序列号：37)。用这种包含TGase-可识别Lys残基的肽作标记，可以用于使标记酶结合到蛋白质的所需位点上，如C末端或N末端。包含TGase-可识别Lys残基和它们的氨基酸序列的其它肽类的例子包括包括改造的S肽(GSGMKETAAARFERAHMDSGS(序列号：19))、MGGSTKHKIPGGS(序列号：20)、N末端甘氨酸(N末端GGG，N末端GGGGG(序列号：21))以及其中N末端MKHKGS和靶蛋白之间的连接部分已经延长的MKHKGGGSGGGSGS(序列号：22)。
可以采用基因工程技术将具有在C末端和N末端包含TGase-可识别Lys残基的添加肽的标记酶作为重组蛋白质来制备。可以使用在N末端或C末端添加的纯化肽标签(例如，(His)6-标签(六个组氨酸标签))，用凝胶渗透色谱等对这样已在其中的C末端或N末端引入TGase底物肽标签的重组蛋白质进行纯化，(为了避免TGase的反应性的任何下降，应当做这样的设计，以使引入纯化肽标签的末端不同于包含引入底物肽标签的末端)。可以用DNA测序仪来确定编码蛋白的质粒载体的基因序列，从而对氨基酸序列进行确定，或者在N末端引入底物肽的情况中，通过N末端分析来直接鉴定。可以采用SDS-PAGE等方法对蛋白质纯化进行确定。
对标记酶没有特别限定，只要其具有能采用显色反应等进行检测的性质。这样的例子包括碱性磷酸酶(AP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、荧光素酶和过氧化物酶。其中，从获得高催化性和良好稳定性的角度来看，优选碱性磷酸酶或过氧化物酶。从方便引入肽标签的角度来看，优选用基因工程制备的蛋白质。
为了在多标记酶核酸探针和靶核酸之间得到更精确的碱基序列特异性的双链结构，有时可以在相对较高的温度条件下进行(例如，70℃或更高)，因此若使用嗜中温菌来源的酶，则可能发生活性损失。所以，优选使用超嗜热强烈火球菌来源的碱性磷酸酶(PfuAP)作为靶酶。
已知来源于超嗜热菌的酶对有机溶剂和热通常呈现出高水平的稳定性，并因此是优选的(例如，见H.Atomi，Current Opinion in Chemical Biology，9，pp.166-173(2005))，并且从使用大肠杆菌宿主而相对容易地进行大量制备的方面来说，也是优选的。当采用大肠杆菌宿主制备耐热酶时，通过使细胞匀浆经高温处理(例如，通过在80℃下保持30分钟)，随后沉淀所有来自大肠杆菌的杂蛋白质，从而能相对容易地进行粗纯化。
超嗜热菌是能够在大多数生物细胞不能存活的极端环境生长的微生物，因此，超嗜热菌来源的蛋白质呈现出极高水平的耐热性。而且，它们不仅呈现出优异的耐热性，通常对变性剂、有机溶剂和pH值等也比嗜中温菌来源的酶具有更高的抗性。因此，据认为通过使用PfuAP，可以得到更精确且不会损失酶活性的双链结构。
根据本发明实施方式的酶-多标记核酸探针的一个优选构型的例子为PfuAP和Z-QG RNA的复合物。在这种复合物中，稳定的酶PfuAP和稳定的RNA分子通过酰胺连接键提供的稳定共价键合而结合在一起，因此，整体复合物也就具有良好稳定性的优点。
此外，在所述酶-多标记核酸探针中，所述酶可以对有机溶剂和热稳定。这种高稳定性酶可以通过从自然界筛选获得(例如，见Chemistry and Chemical Industry，vol.61(No.6)，pp.571-575(2008)，Taku Uchiyama and Kentaro Miyazaki，Bioscience and Industry，vol.66(No.5)，pp.234-239(2008)，以及Noriyuki Dokyu，Bioscience and Industry，vol.66(No.12)，pp.667-670(2008))，或者通过采用蛋白质工程技术来提高稳定性(例如，见Hiroyasu Ogino，Bio Industry，vol.25(No.7)，pp.16-23(2008)，以及Kentaro Miyazaki，Bio Industry，vol.25(No.7)，pp.52-58(2008))。通过采用这些技术，即使是来源于嗜中温菌的酶，也能转变为呈现出良好有机溶剂耐性和耐热性的酶。
包含引入的荧光染料部分并具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺的标记化合物，例如，可以通过在羧基上引入二胺来制备(例如，见G T.Hermanson(1996)，Bioconjugate Techniques，chapter 1，section 4.3，pp.100-104，Academic Press，San Diego)。
很多种酶可以用作转谷氨酰胺酶(TGase)。目前知道的TGase的种类包括来源于哺乳动物(豚鼠和人类)、无脊椎动物(昆虫、鲎、海胆)、植物、细菌和原生生物(粘液菌)的那些TGase，并且在人来源的TGase的情况中，已发现8种同工酶。用于本发明实施方式的优选的TGase的一个例子，尤其是在稳定性、操作简便性、可大量生产性等方面，为微生物转谷氨酰胺酶(MTG)。
当在本发明实施方式中使用MTG时，基于预期的MTG催化作用，包含标记部分的标记化合物(如具有Lys残基的标记酶)和Z-QG RNA之间的结合反应预计经历两个阶段，即在Z-QG RNA的Gln上，经过代表MTG活性中心的半胱氨酸(Cys)残基的亲核取代反应来形成酰基酶复合物，以及随后通过标记化合物的Lys经过在酰基酶复合物上的亲核取代反应来消除MTG。
在本发明实施方式的一个优选构型中，具有TGase-可识别Lys残基或伯胺的标记化合物与具有TGase-可识别Gln残基的Z-QG RNA的摩尔浓度比优选为2或更大，并且更优选为5或更大。当在本说明书中使用简略词“浓度比”时，除非特别说明，否则该词是指摩尔浓度之间的比。例如，NK14-PfuAP与Z-QG RNA的摩尔浓度比表述为[NK14-PfuAP]/[Z-QG RNA]。
[制备NK14-PfuAP]
NK14-PfuAP为这样的结构：其中，在PfuAP的N末端通过基因工程引入一段附加序列，该序列由具有MKHKGGGSGGGSGS序列的氨基酸14残基组成，并在C末端引入纯化标签。PfuAP的表达载体得自Kagawa大学的Haruhiko Sakuraba教授。在由PCR扩增PfuAP的编码区期间，进行蛋白表达载体pET22的重组从而同时引入这两种标签，并转化大肠杆菌BL21。在含有氨苄青霉素的LB培养基中预培养和随后的主培养后，通过离心分离收集所得到的转化体，然后用25mM的TBS洗涤两次。在冰冻和融化这样得到的微生物后，用超声波处理破碎细胞，并随后使用离心分离来收集可溶性部分。超嗜热菌来源的PfuAP即使在高温条件下依然稳定，因此将得到的无细胞提取物在80℃下处理30分钟进行粗纯化，从而沉淀其他蛋白。粗纯化后，通过离心分离并过滤来收集上清，随后用组氨酸标签(His-tag)柱进行纯化。纯化后，超滤浓缩液体，用PD-10柱将溶剂培养基替换为10mM Tris-HCl (pH8.0)，并将样品冷冻保存至试验。
此外，为了改善NK14-PfuAP在大肠杆菌中的表达，可以使用其中依据大肠杆菌密码子的使用频率而改变了碱基序列的NK14-PfuAP表达载体(登录号：AB479383，序列号：26)。该表达载体由Codon Devices，Inc.(http://www.codondevices.com)用常规合成得到。在编码NK14-PfuAP的基因区的两末端引入合适的限制性内切酶位点，这些位点用于得到重组的pET22蛋白表达载体，并且用得到的NK14-PfuAP表达载体来转化大肠杆菌BL21。在含有氨苄青霉素的LB培养基中进行预培养和随后的主培养后，通过离心分离收集所得到的转化体，然后用25mM的TBS洗涤两次。在冰冻和融化这样得到的微生物后，用超声波处理破碎细胞，并随后使用离心分离来收集可溶性部分。超嗜热菌来源的PfuAP即使在高温条件下依然稳定，因此将得到的无细胞提取物在80℃下处理30分钟进行粗纯化，从而沉淀其他蛋白。粗纯化后，通过离心分离并过滤来收集上清，随后用组氨酸标签(His-tag)柱进行纯化。纯化后，超滤浓缩液体，用PD-10柱将溶剂培养基替换为10mM Tris-HCl(pH8.0)，并将样品冷冻保存至试验。
在其中使用MTG作为结合反应中的TGase的情况下，除确保使摩尔浓度比满足上述特定范围以外，该反应优选在pH为5.5到8.0、温度为4到50℃的条件下进行(例如，室温下(18到22℃))。在这样的条件下，12小时内可以得到满意的高反应速率，优选在6个小时内，更优选在3个小时内。
使用这种高反应率的方法得到的多标记核酸探针溶液，包含大量未反应的核酸探针(如游离的Z-QG RNA)，即使该溶液没有进一步处理就用于如下详述的靶核酸探测，在多标记核酸探针和未反应的分子之间也基本上不会发生竞争，或者即使发生这样的竞争，可以认为是足够轻微的，从而对目标探测的结果不会有实质的影响。因此，多标记核酸探针溶液所赋予的优点是不需纯化就能直接用于探测。
在该实施方式之前，还没有通过用TGase将标记化合物(例如具有TGase-可识别Lys残基或伯胺的标记酶)结合到具有TGase-可识别Gln残基的Z-QGRNA上得到多标记核酸探针的已知例子。因此，用本发明实施方式的方法生成的多标记核酸探针可以作为新材料来要求得到保护。
形成本发明实施方式的酶-多标记核酸探针的方法，与常规方法相比，具有以下特征和优点。
-靶酶包括具有TGase-可识别Lys残基或伯胺的酶，以及所有能引入TGase-可识别的Lys残基或伯胺的酶。而且，不需要大蛋白质标签(如内蛋白)。
-酶的修饰区不限于C末端。修饰可以发生在存在具有TGase活性的Lys残基的任何区域，或者可以引入具有这种Lys残基的标签的任何区域。
-除C末端和N末端以外，蛋白质结构内部的具有高度波动的区域，如环区，也可以用作修饰的靶。
-对结合核酸的碱基序列或长度没有特别限定。
<探测靶核酸的方法>
根据本发明的一个实施方式的探测靶核酸的方法包括：制备多标记核酸探针，其包括标记化合物(如具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺的标记酶)，该标记化合物与核酸探针内的至少两个谷氨酰胺(Gln)残基分别结合，所述核酸探针为在其中已引入多个由上式(1)至(5)中的一个所代表的核苷三磷酸衍生物作为结构单元的核酸，其中，多标记核酸探针具有易被探测到的标记部分，并且具有带有与靶核酸特异性结合的碱基序列的核酸部分；使多标记核酸探针的核酸部分与靶材料内的靶核酸进行特异性结合；以及经标记部分(如酶部分)来探测结合的多标记核酸探针。
根据本发明实施方式的探测靶核酸的方法可用于定性或定量分析，或者用于靶核酸的鉴定、染色或定位等。
该方法中，使用了上述的多标记核酸探针，并且核酸部分具有能与靶核酸特异性结合的核酸序列。标记部分(如酶部分)具有易探测性。该方法中，含有靶核酸的靶分子可以为核酸、分子量相对较低的有机化合物(ATP)、蛋白质、肽、金属离子、具有复合结构的多聚体或者病毒等。探测靶可以为(i)DNA转移膜，或者(ii)细胞或实体组织切片等。
在探测靶(i)的情况下，靶核酸为经PCR扩增的DNA或基因组片段DNA，而在探测靶(ii)的情况下，靶核酸为细胞或实体组织内包含的核酸(mRNA或DNA)。该方法在许多方面优于使用例如地高辛(DIG)-标记探针的常规方法。例如，DIG方法中，需要对核酸探针进行DIG修饰和标记抗DIG抗体，因此该方法需要复杂的洗涤程序，而如果使用根据本发明实施方式的多标记核酸探针，则既不需要DIG标记的探针也不需要标记抗DIG抗体，这就意味着反应物的数量以及时间和操作量可显著减少。此外，由于多个信号放大区域(如酶)位于单一识别区域(核酸)内，探测灵敏度可以得到改进。
在该方法中，将多标记核酸探针提供给靶核酸，靶核酸与具有与靶核酸互补的序列的多标记核酸探针部分杂交，并且，本领域技术人员可以根据所使用的核酸部分的长度和碱基序列等对该杂交的条件进行合适地设计。
根据本发明实施方式的探测靶核酸的方法中，可以制备多个具有不同标记部分(如不同的酶或不同的荧光染料)的多标记核酸探针，因此，可以同时探测多个靶核酸。
此外，在本发明实施方式中，探测靶核酸的方法包括：制备
(a)固定于基底表面上的核酸，
(b)适体核酸，其具有与固定核酸的全部或部分互补的序列(固定核酸的互补序列)，和能与靶核酸特异性结合的序列(靶核酸特异性序列)，以及
(c)多标记核酸探针，其包括标记化合物(如具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺的标记酶)，该标记化合物与核酸探针内的至少两个谷氨酰胺(Gln)残基分别结合，所述核酸探针为在其中已引入多个由上式(1)等所代表的核苷酸衍生物作为结构单元的核酸，其中，多标记核酸探针具有易被探测到的标记部分，和/或具有与适体核酸的靶核酸特异性序列的全部或部分互补的序列的核酸部分，以及随后
(A)向固定核酸供应适体核酸，使固定核酸与具有固定核酸互补序列的适体核酸部分杂交，由此固定适体核酸，
(B)向固定的适体核酸供应可能包含含有靶核酸的靶分子的样品，并且在靶分子确实存在的情况下，使靶核酸与具有靶核酸特异性序列的适体核酸部分结合，然后供应上述多标记核酸探针，而在靶分子确实不存在的情况下，使多标记核酸探针的核酸部分与适体核酸杂交，由此固定蛋白质，以及
(C)基于酶的性质来检测固定的酶部分的存在和含量，从而探测在样品内的靶分子。
在本发明中，为了使核酸固定于基底表面上，可采用常规技术，如在制备DNA微阵列过程中使用的技术。“基底”可以为由玻璃、硅或塑料等制成的基片、珠体、孔、平板等，并且使用常规技术通过非共价结合(静电结合)或共价结合可以将核酸固定于基底表面上。可以将预先制备好的核酸固定于基底上，或者可以直接在基底上合成核酸。为了方便，可以使用用抗生物素蛋白质等包被的市售平板，然后将生物素化的所需DNA固定于该平板上。
在该方法中，使用的核酸(适体核酸)具有与全部或部分固定核酸相互补的序列(固定核酸互补序列)，以及可以与靶分子内包含的靶核酸特异性结合的序列(靶核酸特异性序列)。所述靶分子可以为核酸、相对较低分子量的有机化合物、蛋白质、肽、金属离子、具有复合结构的多聚体或者病毒等。可是采用常规技术制备具有靶核酸特异性序列的部分，例如通过采用SELEX步骤(一种体外人工进化方法)。此外，该部分对于靶分子可以呈现出极高的靶亲和性和特异性。所述具有靶核酸特异性序列的部分可以由修饰的核苷酸组成。
在该方法中，使用了如上所述的多标记核酸探针，其中所述探针的核酸部分具有与适体核酸的靶核酸特异性序列的全部或部分互补的序列。所述标记部分(如酶部分)具有易探测的性质。在该方法中，包含靶核酸的靶分子可以为核酸、相对较低分子量的有机化合物(ATP)、蛋白质、肽、金属离子、具有复合结构的多聚体或者病毒等等。探测靶可以为(ii)DNA转移膜，或者(ii)细胞或实体组织切片等。
在该方法中，通过将适体核酸供应于固定核酸，并且使固定核酸与具有与固定核酸互补序列的适体核酸部分杂交而固定适体核酸，本领域技术人员可以根据所使用的核酸部分的长度和碱基序列等对该杂交条件进行合适的设计。
此外，在该方法中，随后向固定核酸供应可能包括靶分子的样品，并且在靶分子确实存在的情况下，使靶分子与具有靶核酸特异性序列的适体核酸部分结合，然后供应上述多标记核酸探针，而在靶分子确实不存在的情况下，使多标记核酸探针的核酸部分与适体核酸杂交。所述样品可以为细胞或组织提取物，或者为体液等等。
而且，在该方法中，基于酶的性质来检测固定酶部分的存在和含量，从而探测在样品内的靶分子。
适体核酸可以设计为：使具有固定核酸互补序列的部分和具有靶核酸特异性序列的部分设置成重叠、连续排列，或者在其中设置合适的间隔而存在。考虑到为实现分子识别，具有靶核酸特异性序列的部分(适体区域)采用了一定的三维空间结构，该部分可以至少优选不与具有固定核酸互补序列的部分重叠。
如有需要，除固定核酸互补序列和靶核酸特异性序列外，适体核酸也可以包含与多标记核酸进行了适当杂交的的序列。多标记核酸探针的核酸部分具有与适体核酸的靶分子特异性序列的全部或部分互补的序列，但是如果包括与全部或部分特异性序列互补的序列的区域较长(从而使和靶核酸特异性序列的重叠较大)，则在一些情况中，实际上不可能发生与适体核酸的杂交。而且，如果该区域过短(极小的重叠)，则即使在靶分子存在并与适体核酸结合的情况下，多标记核酸探针和适体核酸仍然会发生杂交。本领域技术人员在设计固定核酸、适体核酸和多标记核酸探针的核酸部分的时候，可以考虑这些因素。
此外，根据本发明一个实施方式的探测靶核酸的方法包括：通过核酸部分将核酸探针和靶材料中的靶核酸进行特异性结合，其中所述核酸部分为具有能与靶核酸特异性结合的碱基序列的核酸，并且在其中已引入多个由上式(1)至(5)中的一个所代表的核苷三磷酸衍生物作为结构单元，然后通过使用转谷氨酰胺酶(TGase)使核酸探针中的谷氨酰胺(Gln)残基与具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺并包含标记部分的标记化合物中的赖氨酸(Lys)残基或伯胺反应，来引入多个具有易被探测性质的标记部分，然后通过标记部分探测所结合的核酸探针(见图16)。
在该方法中，使用如上所述的核酸探针，并且核酸部分具有能与靶核酸特异性结合的核酸序列。此外，标记部分具有易被探测性。
该方法在许多方面优于使用例如地高辛(DIG)-标记探针的常规方法。例如，DIG方法中，需要对核酸探针进行DIG修饰和标记抗DIG抗体，因此该方法需要复杂的洗涤程序，而如果使用根据本发明实施方式的多标记核酸探针，则既不需要DIG标记的探针也不需要标记抗DIG抗体，这就意味着反应物的数量以及时间和操作量可显著减少。此外，由于多个信号放大区域(如酶)位于单一识别区域(核酸)内，探测灵敏度可以得到改进。
例如，使用TGase(如MTG)，具有引入的TGase-可识别Lys的标记化合物(如酶或荧光染料)可以被结合到含有在多个位点引入的TGase-可识别Gln残基(如MTG-可识别Gln残基)的核酸探针Z-QG RNA上。
实施例
以下通过一系列实施例和对比实施例对本发明进行更详细的描述，然而本发明不限于以下实施例。
本发明中，开发超嗜热菌来源的酶-多标记RNA旨在应用于原位杂交(ISH)。微生物转谷氨酰胺酶(MTG)的蛋白质修饰能力用于进行酶标记。合成了ZQG-UTP，其包含引入的作为MTG的良好底物的Z-QG，然后使用采用RNA聚合酶的转录反应来制备Z-QG RNA。随后，使用MTG制备超嗜热菌来源的酶-多标记核酸探针，并且通过斑点印记来评价探针的性能。
(实施例1)
<Z-QG-UTP的合成和纯化>
Z-QG-UTP的合成流程如图3所示。
首先，使100mM的N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、100mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50mM的Z-QG于室温(制备日的温度27.0℃)下在4mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应20个小时，由此产生NHS-修饰的Z-QG(50mM)(这一阶段将其分装成500μL并在-80℃储存)。然后，使25mM的NHS-修饰的Z-QG和5mM的5-(3-氨基烯丙基)-UTP(以下缩写为“氨基烯丙基-UTP”，由Sigma-Aldrich Co.，Ltd.制造)于25℃下在0.32mL 100mM的硼酸缓冲液(pH8.8)和DMF的混合溶剂(v/v＝1/1)中反应12小时。反应完成后，用Milli-Q将样品稀释10倍，并通过HPLC(由JASCO制造)(高效液相色谱仪和泵：TRI ROTAR-V系列，可调循环进样器：型号VL-613，紫外可见光谱检测器：型号UVIDEC-100-IV)进行纯化。HPLC的检测条件如表1所列。通过激光电离飞行时间质谱仪MALDI TOF-MS(AXIMA(注册商标)-CFR Plus，由Shimadzu公司制造)对产物进行鉴定。样品制备的程序为首先在MALDI样品板上滴1μL的样品，接着在所述板的顶部滴基质溶液(10mg/ml的2，5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液(在超纯水中))，吹干所述板，然后将这样制备的样品板引入至MALDI TOF-MS仪的离子源中用于检测。
合成Z-QG-UTP后，在如表1所列的条件下进行反相HPLC的结果如图4所示。与氨基烯丙基-UTP得到的结果(图4A)相比，在疏水侧出现了一个新的峰(22min)(图4B)，并且认为该峰代表Z-QG-UTP。然而，产物峰的分离不充分，所以对其进行研究，其中HPLC条件改为如表2所列。结果如图5所示。
表1
HPLC检测条件
柱 Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm)
  溶剂   A＝50mM TEAA(pH 7.0)，B＝乙腈
  梯度   A＝98％→58％(40min)
  流速   1.0mL/min
  检测波长   260nm
表2
HPLC检测条件
Figure BPA00001306998800251
通过MALDI TOF-MS收集保留时间为18.8分钟的峰并分析(见图6)。结果为，一个峰被确定为856.89，这表示与理论分子量857.13有较好的匹配，且因此表明了Z-QG-UTP的合成。
[测试1：Alkphos Direct试剂盒探测灵敏度的评价]
<有义链RNA和反义链RNA的制备>
通过使用RNA聚合酶进行转录，制备了有义链RNA和反义链RNA。作为靶核酸(靶)，采用编码称为Sonic hedgehog(SHH)的蛋白的mRNA(shh)作为模型，其在小鼠内具有公知的表达模式。首先，使用包含编码SHH的基因的质粒作为模板进行PCR，得到长度约为1,000bp的DNA片段。进行引物设计以使在上游引入T3启动子，下游引入T7启动子。然后，使用得到的PCR产物作为底物，采用T3聚合酶进行RNA的合成(制备有义链(S))，从而用T3聚合酶来引发转录反应并制备出有义链序列(序列号：24)。用类似的方式，采用T7聚合酶进行RNA的合成(制备反义链(AS))，从而用T7聚合酶引发转录反应并制备出反义链序列(序列号：25)。条件如表3所列。在37℃下进行反应2小时，并且得到的有义链RNA和反义链通过在乙醇中沉淀来回收，然后悬浮在20μL的TE缓冲液中。然后加入RNA酶抑制剂和DTT来抑制RNA酶造成的分解。
表3
体外转录条件
  组分   加入量
  模板(220ng/μL)   2μL
  10×缓冲液   2μL
  10×NTP混合物   2μL
  RNA酶抑制剂(40U/μL)   1μL
  无菌水   11μL
  T3或T7聚合酶   2μL
<RNA浓度的检测>
转录反应后，采用Nano Drop仪检测RNA浓度。结果显示，有义链的浓度为1,019ng/μL，反义链的浓度为815ng/μL。
<标记探针的制备>
使用Alkphos Direct试剂盒(注册商标，由GE Healthcare Bioscience Bioprocess公司制造)提供的试剂制备标记探针。首先，取60μL用无菌水稀释上述反义链RNA至浓度为10ng/μL(总量600ng)而制备的样品，在99.9℃下热变性并随后迅速冷却。将试剂盒附带的60μL的反应缓冲液、12μL的标记试剂和60μL的交联剂溶液以此顺序加入到热变性RNA中，并将混合物在37℃下孵育30分钟来完成标记探针的制备。
<探测膜的制备>
首先，通过无菌水将有义链RNA和反义链RNA靶稀释成6个在1pg/μL到50ng/μL的范围内的不同的浓度级而制备一系列样品，分别各取1μL施加到正电荷膜上(Hybond N+，由GE Healthcare Bioscience Bioprocess公司制造)。随后，每个样品在80℃下烘烤2小时。
<杂交>
将上述探测膜制备中制备的膜转移到试剂盒附带的杂交缓冲液中，在55℃下进行预杂交5分钟。随后，加入充足量的上述标准探针以达到50ng/mL的浓度，并在55℃下进行杂交过夜(约14到16小时)。
<洗膜>
杂交后，将膜转移至洗涤I缓冲液(表4)并在55℃下通过震荡15分钟进行洗涤。该操作进行两次。随后，在洗涤II缓冲液(表5)中洗涤膜。该操作也进行两次。
表4
洗涤I缓冲液的组分
  组分   终浓度
  尿素   2M
  SDS   0.1％
  磷酸钠(Na phosphate)(pH 7.0)   50mM
  NaCl   150mM
  MgCl2   1mM
  封闭试剂   0.2％
表5
洗涤II缓冲液的组分
  组分   终浓度
  Tris碱   50mM
  NaCl   100mM
  MgCl2   2mM
<通过显色方法探测>
室温下(测试日约18到22℃)在NTMTx缓冲液(表6)中洗涤膜5分钟，然后将其转移至染色液(在375μg/mL NBT+188μg/mL BCIP的NTMTx溶液中)，并在遮蔽条件下于室温显色两个小时。NBT为氯化硝基四氮唑蓝，BCIP为5溴-4-氯-3-吲哚磷酸，对甲苯胺盐。
表6
NTMTx缓冲液组分
  组分   终浓度
  NaCl   100mM
  Tris-HCl(pH 9.5)   100mM
  MgCl2   50mM
  Triton X-100   0.1％
斑点印迹的结果如图7所示。探针和互补有义链的膜可以检测到低至100pg/μL斑点。而且，即使是反义链，也可以观察到50和10ng/μL斑点的微弱信号。这一结果表明这样一种可能，即在制备靶RNA中使用的模板DNA不会被DNA酶DNaseI处理掉并保留在样品内。此外，另一种可能是在洗涤过程中温度降低，并且所得的在严格性方面的降低可以引起非特异性吸附。
[测试2：对于在根据Alkphos Direct方法的体系中使用TGase-底物多标记核酸探针的情况下探测灵敏度的评价]
<TGase-底物多标记核酸的制备>
除制备上述测试1中的有义链RNA和反义链RNA外，依据表7和表8所列条件，TGase-底物多标记核酸也采用T7聚合酶以相似的方式制备。制备后，用DNaseI处理该核酸，并且通过在乙醇中沉淀来浓缩和纯化RNA，然后悬浮在20μL的TE缓冲液中。加入RNA酶抑制剂和DTT从而完成所述新型酶-多标记核酸探针的制备。
表7
TGase-底物多标记核酸的体外转录条件
表8
各种NTP混合物的组分
Figure BPA00001306998800301
<RNA浓度的检测>
转录反应后，采用Nano Drop仪来检测RNA浓度。检测结果如下所列。
(1)Z-QG-UTP 0％：410ng/μL
(2)Z-QG-UTP 20％：424ng/μL
(3)Z-QG-UTP 40％：378ng/μL
(4)Z-QG-UTP 60％：368ng/μL
(5)Z-QG-UTP 80％：311ng/μL
(6)Z-QG-UTP 100％：256ng/μL
<标记探针的制备>
将含有不同比例Z-QG-UTP的TGase-底物多标记核酸在99.9℃下热变性5分钟，并随后迅速冷却。在表9所列条件下，用热变性核酸制备了一系列反应溶液，然后将各溶液在4℃下反应6小时以制备酶-多标记探针(序列号：23)。
表9
反应条件
  组分   终浓度
  Z-QG RNA   50ng/μL
  pfuAP   0.4mg/mL
  MTG   5U/mL
  Tris-HCl(pH 8.0)   100mM
  RNA酶抑制剂   1U/μL
然后，探测膜的制备、杂交以及膜的洗涤采用与上述测试1相同的方式进行。
<通过显色方法探测>
显色期间除将温度设置成室温(测试日温度约18到22℃)或50℃外，依据测试1描述的显色方法进行检测。依据Alkphos Direct方法使用酶-多标记核酸探针探测的结果如图8所示。在显色在室温下进行的情况下，具有20到40％比例Z-QG-UTP的探针的探测能力为低至10ng/μL，有60到100％比例Z-QG-UTP的探针的探测能力为低至1ng/μL。此外，在显色在50℃下进行的情况下，具有20％比例Z-QG-UTP的探针的探测能力为低至10ng/μL，具有40到60％比例Z-QG-UTP的探针的探测能力为低至1ng/μL，具有80到100％比例的Z-QG-UTP的探针的探测能力为低至100pg/μL。
这些结果证明探测灵敏度随着引入的Z-QG的比例升高而提高。在室温的显色条件下，当Z-QG-UTP的比例为60％或更大时，可以成功检测1ng/μL的靶核酸。而且，当显色期间的温度接近新酶(碱性磷酸酶：PfuAP)的最佳温度时，80％或更大比例的Z-QG-UTP使得探测灵敏度水平与市售的Alkphos Direct的检测限(100pg/μL)相似，并且能得到高对比度的图片。
(实施例2：依据ISH方法通过斑点印迹进行探测灵敏度的评价)
[PfuAP-多标记RNA探针的制备和功能性评价]
将在细胞组织内的基因表达模式是已知的Sonic hedgehog基因(shh)用作靶mRNA。首先，采用PCR得到编码shh的DNA片段(约1,000bp)。进行引物设计从而在基因上游引入T3启动子，下游引入T7启动子。然后，使用得到的PCR产物作为底物，采用T7聚合酶进行转录反应(表10)。该反应期间，通过加入不同比例的(0到100％)测试1合成的Z-QG-UTP来代替UTP，以制备具有不同引入比例的Z-QG RNA样品。所得到的Z-QG RNA样品通过乙醇沉淀收集，并通过琼脂糖凝胶电泳和微芯片电泳设备(Experion，由Bio-Rad Laboratories，Inc.制造)来评价。
表10
体外转录条件
  组分   浓度
  10×转录缓冲液   1×Buffer
  PCR产物   20ng/μL
  ATP，CTP，GTP   各1mM
  UTP+Z-QG-UTP   总量1mM
  RNA酶抑制剂   1.0units/μL
  T7 RNA聚合酶   1.0units/μL
10×转录缓冲液＝0.4M Tris-HCl(pH 8.0)，60mM MgCl2，100mM二硫苏糖醇，20mM亚精胺
<PfuAP-多标记RNA的制备>
采用基因工程方法，为了研究使用MTG能否使在N末端具有引入的包含MTG-可识别K(MKHK(GGGS)2GS)的肽标签的NK14-PfuAP结合到Z-QGRNA上，首先，将用不同比例Z-QG-UTP制备的Z-QG RNA样品通过加热到99.9℃进行热变性，之后迅速冷却。然后，在100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，在包括50μg/mL的每个Z-QG RNA样品，0.4mg/mL的NK14-PfuAP，5.0U/mL的MTG以及1.0U/μL的RNA酶抑制剂的条件下反应6小时。作为对照，不添加MTG进行相同的操作。通过琼脂糖凝胶电泳评价反应。
<通过斑点印迹评价探针的性能>
将shh S(靶)固定于膜上，使用PfuAP-多标记核酸探针(shh反义，AS)进行探测测试。首先，制备出一系列未标记的稀释shh S(使用T3聚合酶制备)(50ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，0.1mg/μL)，并将各个溶液的1μL样品点加到膜上，在烘箱中固定(80℃，2小时)。然后，进行表11所列的操作，并用PfuAP-多标记探针进行shh S探测。作为对照，用上述相同的方式固定shhAS链来制备膜，并使用该膜同样进行探测。各种溶液的组成列在表12中。
表11
依据ISH方法进行靶探测操作的条件
Figure BPA00001306998800331
表12
各种缓冲液的组成
Figure BPA00001306998800332
<Z-QG-多标记RNA的制备>
用不同比例的UTP和Z-QG-UTP制备RNA的结果如图9A和图9B所示。这些结果表明，在使用的所有不同条件下都成功合成了RNA，证实了所合成的Z-QG-UTP作为为相对较好的底物而被T7聚合酶识别。而且，由于存在这样一个转变，提高Z-QG-UTP的比例，分子量会更高，所以可以通过改变Z-QG-UTP的浓度来调节引入至Z-QG RNA中的Z-QG-UTP的量。
<PfuAP-多标记核酸探针的制备>
使用MTG对具有不同引入量的Z-QG-UTP的Z-QG RNA样品进行PfuAP标记的结果如图10所示。泳道2示出的是未添加MTG时的结果，泳道3示出的是加入MTG时的结果。在20％到100％的条件下，当加入MTG时可以观察到分子量变高的转变，而当Z-QG-UTP为0％时，就没有这样的转变，这表明引入的Z-QG的特异性标记。此外，随着Z-QG的引入量的增加，分子量变高的转变在尺寸上增加，这一事实意味着探针的PfuAP标记量可以通过改变Z-QG-UTP的比例来控制。
<通过斑点印迹评价探针的性能>
进行斑点印迹以研究所制备的PfuAP-多标记RNA探针作为核酸探针的功能(图11)。当将AS(反义)链固定于膜上时没有任何斑点，这表明实现了碱基序列的特异性探测。对与包含20到100％引入量的探针，可以探测1ng/μL的有义链。这些结果表明，在转录反应期间通过改变Z-QG-UTP的浓度，在所得的修饰RNA中的Z-QG的引入量以及随后使用MTG完成的PfuAP标记量都可以得到控制。不同于实施例1，增加Z-QG的引入量没有提高探测灵敏度。这一实验结果的一个可能的原因是，如表11和表12所示，杂交条件和洗涤条件比Alkphos Direct条件明显更为严格。如图10所示，在每种情况下，在PfuAP标记时条带都变宽，意味着PfuAP不能被声称为均一引入。因此，据推测，包含较少引入量的PfuAP标记的探针或未修饰的探针与靶(AS链)的杂交会更好，从而使所有探针的灵敏度水平相似。而且，由于PfuAP的引入可能降低了探针双链的形成性可能是上述敏感性实验结果的另一个原因。
另一方面，如果染色期间的温度从室温升高至约为50℃以活化超嗜热微生物来源的酶PfuAP，则在这一阶段可以预期会有灵敏度的进一步改进。
<在高温条件下进行显色过程的情况下采用酶标记核酸探针评价ISH的探测灵敏度>
本发明中用于标记核酸探针的PfuAP在高温条件下呈现的催化活性比室温下高。因此，在如表11所列的酶显色条件下的反应温度从室温升高至50℃的情况下来评价探测灵敏度。为了评价作为酶-标记核酸探针的特性，首先，将用Alkphos Direct试剂盒获得的酶-标记核酸探针和本发明PfuAP-标记核酸探针的性能在ISH条件下进行比较。除使用试剂盒制备酶-标记核酸探针外，使用上述相同的操作进行斑点印迹测试。结果表明，可以探测1ng/μL的有义链(图12)。这些结果表明，在ISH条件下，新制备的PfuAP多标记核酸探针可以用作探针，其与用市售的Alkphos Direct试剂盒制备的探针呈现出相似的探测灵敏度。进行核酸最终探测的步骤期间，也就是酶(碱性磷酸酶)区域的显色反应期间的温度为室温。然而，用于标记本发明核酸探针的PfuAP在高温条件下呈现出的催化活性比在室温下高。因此，在如表10所列的酶显色条件的反应温度从室温升高至50℃的情况下评价探测灵敏度。如图13所示，结果表明，探测限随着Z-QG引入的比例而变化，Z-QG的比例为80％或100％时，可以探测100pg/μL到1ng/μL的核酸，Z-QG的比例为60％，可以探测10pg/μL的核酸，并且可以清楚地看出与上述测试1使用的AlkphosDirect探针(1ng/μL)相比，可以提高探测灵敏度至少约两个数量级。
上述实施例中，使用浓度用下述方式测定的样品进行测试。
[Z-QG-UTP的浓度计算]
<氨基烯丙基-UTP吸光系数的计算(在290nm处)>
将氨基烯丙基-UTP溶于TE缓冲液(pH8.0)中，然后制备出浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mM的样品，然后进行吸收光谱的测量(图14)。从光谱中计算290nm处的吸光度值并用于作出校准曲线(图15)。图14的光谱中，具有最高吸收灵敏度的光谱图为0.1mM浓度，此后吸收灵敏度从0.08mM到0.06mM、0.04mM、0.02mM和0mM按序下降。
由图15计算290nm处的吸光系数(ε290＝5760M-1cm-1)，并且考虑到市售氨基烯丙基-UTP(由Sigma-Aldrich Co.，Ltd.制造)的纯度为84％时，得到的值为ε290＝6860M-1cm-1的事实。而且，由于Z-QG在290nm处基本没有吸收，即使有未反应的Z-QG残留在Z-QG-UTP样品中，也可以忽略对于浓度检测的影响。
<Z-QG-UTP贮备样品的制备>
用HPLC纯化后，通过冷冻干燥除去溶剂，然后将样品溶于无菌水中(2mL)。接着，使用真空离心浓缩仪(Speed vac)浓缩样品(此时，观察到沉淀，且认为该沉淀是由未反应的Z-QG的沉淀导致的。随着浓度的增加，与氨基烯丙基-UTP的光谱形状相同的光谱也增加，所以可以推定该沉淀不是Z-QG-UTP)。浓缩后，收集上清，然后用TE缓冲液稀释10倍，采用Nano Drop仪(光程长：1mm)测量吸光度，并且所得吸光度结果为ABS＝1.061。因此，稀释前Z-QG-UTP的浓度C可以通过下式计算。
(公式1)
1.061＝6860[M-1cm-1]×0.1[cm]×C/10
所以，C＝约15.5[mM]
(实施例3)
[使用Z-QG DNA制备PfuAP-多标记DNA探针以及使用斑点印迹评价探测灵敏度]
使用Z-QG DNA制备了PfuAP-多标记DNA探针，并且通过斑点印迹来评价该探针的探测灵敏度
<Z-QG-dUTP的合成和纯化>
首先，使100mM的N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、100mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50mM的Z-QG于室温(制备日温度约18到22℃)下在4mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应20小时，由此产生NHS-修饰的Z-QG(50mM)。同时，将16μL包含50mM的5-(3-氨基烯丙基)-dUTP(以下缩写为“氨基烯丙基-dUTP”，由Sigma-Aldrich Co.，Ltd.制造)的10mM的Tris-HCl(pH 7.5)溶液(由Ambion，Inc.制造)、40μL的硼酸缓冲液(pH8.8)和16μL的无菌水混合，以制备80μL的10mM的氨基烯丙基)-dUTP溶液。在该溶液中加入上述制备的80μL的NHS-修饰的Z-QG溶液，得到的混合物在25℃下反应过夜。反应完成后，用Milli-Q将样品稀释10倍，并在表13所列条件下用HPLC(由JASCO制造，高效液相色谱仪和泵：TRIROTAR-V系列，可调循环进样器：型号VL-613，紫外可见光检测器：型号UVIDEC-100-IV)进行纯化。用MALDI TOF-MS设备(Autoflex III，由Bruker Daltonics公司制造)对产物进行鉴定。结果如图17所示。对于该鉴定，使用3-羟基吡啶甲酸(3-HPA)作为基质。
表13
HPLC测量条件
合成Z-QG-dUTP后进行反相HPLC的结果如图18所示。与对氨基烯丙基-dUTP得到的结果(图19)相比，在疏水侧出现了一个新峰，并且认为该峰代表Z-QG-dUTP。用MALDI TOF-MS收集保留时间为19.1分的峰并分析。结果如图17所示，一个峰确定为841.46，这表示与理论分子量842.13有较好的匹配，且因此表明了Z-QGd-UTP的合成。
<通过PCR制备Z-QG DNA>
首先，为了对编码小鼠来源的sonic hedgehog(SHH)的基因中的约300bp(序列号：27)进行PCR扩增而设计引物(表14，序列号：28，29)。使用包含用于编码小鼠来源Shh的基因的整个序列(约990bp)的质粒DNA作为PCR模板，使用KOD-Fx(由Toyobo Co.，Ltd.制造)作为DNA聚合酶来制备反应溶液(表15和表16)。PCR条件包括94℃×2分钟的1个循环和94℃×20秒、52℃×20秒以及72℃×15秒的30个循环。PCR后，用琼脂糖电泳验证扩增片段。采用MinElute PCR Purification试剂盒(浓缩型PCR产物纯化试剂盒，由Qiagen制造)纯化得到的扩增片段，并且采用Nano Drop仪测定Z-QG DNA的浓度。
表14
Shh 300bp片段引物序列
  引物序列
  Shh300引物-1   5’-AGGAAAACACGGGAGCAGAC-3’
  Shh300引物-2   5’-TCTCTGCTTTCACAGAACAG-3’
表15
PCR反应溶液组成
Figure BPA00001306998800381
表16
  Z-QG-dUTP 0％   Z-QG-dUTP 50％   Z-QG-dUTP 100％
  dTTP   1.5mM   0.75mM   -
  Z-QG-dUTP   -   0.75mM   1.5mM
对不同Z-QG-dUTP比例进行PCR时的电泳结果如图20所示。即使当Z-QG-dUTP的比例设置为50％或100％时进行PCR也确定出扩增片段的条带，这一事实表明Z-QG-dUTP被识别为DNA聚合酶的底物。而且，当Z-QG-dUTP的比例增加时条带会向更高的分子量转变，从这一事实清楚地看出可以通过改变PCR期间Z-QG-dUTP的量来调节Z-QG的引入量。当采用Nano Drop仪来测量每个纯化样品中的Z-QG DNA的浓度水平时，结果表明：由0％的Z-QG-dUTP制备的Z-QG DNA浓度为73.8ng/μL，由50％的Z-QG-dUTP制备的Z-QG DNA浓度为111.6ng/μL，以及由100％的Z-QG-dUTP制备的Z-QG DNA浓度为59.1ng/μL。
<Z-QG DNA的PfuAP标记的研究>
通过具有不同引入量的Z-QG的Z-QG DNA样品来研究：基因工程是否可以用于用MTG使具有引入的包含MTG-可识别赖氨酸残基(K)的肽标签的NK14-PfuAP与Z-QG DNA结合。首先，在4℃时，在不同的Z-QG DNA样品中各取15ng/μL与0.4mg/mL的NK14-PfuAP和5.0Unit/mL的MTG在Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中反应6小时。未加入MTG的情况也进行了研究。PfuAP标记的确定通过琼脂糖电泳进行。
MTG反应后琼脂糖电泳的结果如图21所示。当使用在50％或100％的Z-QG-dUTP的条件下制备的Z-QG DNA时，加入MTG可以观察到向更高分子量的转变，但是，用Z-QG未标记的DNA(用0％的Z-QG-dUTP制备的阴性对照DNA)就没有观察到这种向更高分子量的转变。此外，当没有将MTG添加至Z-QG DNA中时也没有观察到分子量的增加。这些结果清楚表明，在MTG的存在下，NK14-PfuAP可以与Z-QG DNA的Z-QG区域特异性结合。另外，当Z-QG DNA是在在100％的Z-QG-dUTP而不是50％的Z-QG-dUTP的条件下制备出来时，向更高分子量的转变更加明确，这一事实表明，可以通过改变PCR扩增期间使用的Z-QG-dUTP的比例来调节PfuAP的结合量。
<PfuAP-多标记DNA探针的制备>
用MTG使在50％或100％的Z-QG-dUTP的条件下制备的Z-QG DNA和NK14-PfuAP结合来制PfuAP-多标记DNA探针。首先，将各Z-QG DNA在90℃进行热处理5分钟从而将DNA转变为单链，然后在100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，在包括25ng/μL的Z-QG DNA，0.4mg/mL的NK14-PfuAP，5.0Unit/mL的MTG的条件于下4℃反应6小时(得到在MTG反应之前进行热处理的探针)。通过加热处理使DNA转变成单链对探针的探测能力有很大影响，因此，采用没有经过热处理的Z-QG DNA，通过在相同的条件下进行PfuAP标记并随后在90℃进行热处理5分钟，还制备了一种探针(在MTG反应之后进行热处理的探针)。通过琼脂糖凝胶电泳确定DNA探针的PfuAP标记。
MTG反应后的琼脂糖电泳结果如图22所示。在MTG反应之前经热处理的Z-QG DNA和在MTG反应之后经热处理的Z-QG DNA都呈现出向更高分子量的转变，这一事实证实了Z-QG DNA的PfuAP标记。
<通过斑点印迹评价探测灵敏度>
通过斑点印迹对制备的各个PfuAP-多标记探针的探测灵敏度分别进行评价。杂交期间使用的各种组成和方法都依据市售的检测试剂盒Alkphos Direct(由GE Healthcare Bioscience Bioprocess公司制造)进行。将包含探针序列(序列号：30，引物序列见表17(序列号：31))的990bp的Shh DNA片段和具有与探针相同序列的300bp的Shh DNA片段用作靶DNA。此外，将PfuAP编码基因(序列号：32，引物序列见表18(序列号33，34))的约为1.7kb的DNA片段用作阴性对照。
表17
引物序列
  T7启动子引物 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGGTGCCAATGTGGTAGAGC-3’
表18
  引物序列
  PfuAP引物-1   5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’
  PfuAP引物-2   5’-TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3’
用TE缓冲液分别将靶DNA样品的浓度稀释成50ng/μL和50pg/μL(阴性对照只稀释成50ng/μL)，并将1μL的各个溶液点加到正电荷膜上(Hybond N+，由GE Healthcare Bioscience Bioprocess公司制造)，然后在80℃下热处理2小时，由此将DNA固定于膜上。随后，将膜转移到检测试剂盒附带的杂交缓冲液中，在55℃下进行预杂交30分钟。在杂交缓冲液中分别加入充足量的用上述方法制备的PfuAP-多标记DNA探针以达到50ng/mL的浓度，并在55℃下杂交过夜(约14到16小时)。
杂交后，将膜转移至洗涤I缓冲液(表19)并在55℃下通过震荡15分钟洗涤。该操作进行两次。然后，于室温(测试日约18到22℃)下在洗涤II缓冲液(表20)中洗涤膜5分钟。该操作也进行两次。
表19
  组分   终浓度
  尿素   2M
  SDS   0.1％
  磷酸钠(pH 7.0)   50mM
  NaCl   150mM
  MgCl2   1mM
  封闭试剂   0.2％
表20
  组分   终浓度
  Tris碱   50mM
  NaCl   100mM
  MgCl2   2mM
室温下在NTMTx缓冲液(表12)中洗膜5分钟，然后转移至染色液(375μg/mLNBT+188μg/mL BCIP的NTMTx溶液)中，于50℃在遮蔽条件下静置2小时进行显色。
表21
  组分   终浓度
  Tris-HCl(pH 9.5)   100mM
  NaCl   100mM
  MgCl2   50mM
  Triton X-100   0.1％
使用各个PfuAP-标记的DNA探针的斑点印迹的结果如图23所示。不论使用哪种DNA探针都能检测到斑点信号，表明通过使用MTG用PfuAP标记Z-QG DNA而制备的DNA探针都呈现出作为核酸探针的探测能力。还显然的是，在MTG反应之前对Z-QG DNA进行热处理而制备的探针(在MTG反应之前进行热处理的探针)与在MTG反应之后对Z-QG DNA进行热处理而制备的探针(在MTG反应之后进行热处理的探针)相比，呈现出改进的探测灵敏度。据认为，这一实验结果的原因可能包括这样的事实：在MTG反应之后进行热处理的探针中，由于对PfuAP-标记的DNA探针进行热处理，热处理期间反应体积的增加可能导致热处理不充分，意味着DNA可能没有经过完全的热变性，以及对标记探针进行热处理可能导致PfuAP的失活。
在MTG反应之前进行热处理的探针，对于包含50％引入的Z-QG的探针和包含100％引入的Z-QG的探针而言都能够探测到低至50pg/μL浓度的斑点。在靶核酸浓度值为50ng/μL的高值的阴性对照中，检测到微弱的非特异性信号，但是可以很清楚地区分互补DNA。此外，靶核酸链长的不同对探测灵敏度没有明显影响。
(实施例4)
[依据ISH方法，通过使用Z-QG DNA的PfuAP-多标记DNA探针进行RNA探测]
实施例3中，探测靶核酸为DNA。在实施例4中，在探测靶核酸为RNA的情况下，对作为核酸探针的PfuAP-多标记DNA探针的性能进行评价。
<用PCR制备Z-QG DNA>
采用与实施例3描述的相同的方式用PCR制备Z-QG DNA。
<PfuAP-多标记DNA探针的制备>
用MTG使在50％或100％的Z-QG-dUTP的条件下制备的Z-QG DNA样品和NK14-PfuAP结合来制备PfuAP-多标记DNA探针。首先，对各个Z-QG DNA在90℃下进行热处理5分钟从而使DNA转变为单链，然后在100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，在包括25ng/μL的Z-QG DNA、0.4mg/mL的NK14-PfuAP和5.0Unit/mL的MTG的条件于4℃下反应6小时。通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA探针的PfuAP标记。
MTG反应后的琼脂糖电泳结果如图24所示。对包含50％引入Z-QG-dUTP的Z-QG DNA和包含100％引入Z-QG-dUTP的Z-QG DNA来说，MTG反应后条带都向更高分子量转变。这些结果证实了Z-QG DNA的PfuAP标记，并因此标记的Z-QG DNA样品作为DNA探针用于斑点印迹。
<依据ISH方法通过斑点印迹评价探测灵敏度>
通过PCR获得包含探针序列的990bp的Shh DNA片段(序列号：30)。设计引物从而使T7启动子掺入Shh基因的下游(序列号：31，见表17)。然后，用得到的PCR产物作为底物，用T7聚合酶进行转录反应(表22)。转录反应后，用凝胶渗透柱(Mini Quick Spin Column，由Roche Ltd.制造)纯化以除去未反应的NTP等，并将纯化产物用作靶RNA。
表22
  组成   加入量   终浓度
  模板DNA(200ng/μL)   2μL   20ng/μL
  T7聚合酶   2μL   1.0Units/μL
  10mM NTP混合物   2μL   1mM
  20U/μL RNA酶抑制剂   1μL   1.0Units/μL
  10×转录缓冲液   2μL   1×
  无菌水   11μL
  总量   20μL
用TE缓冲液分别将所得的靶RNA稀释成50ng/μL、1ng/μL和50pg/μL的3-阶段系列溶液，并将1μL的各个溶液点加到正电荷膜上(Hybond N+，由GE Healthcare Bioscience Bioprocess公司制造)，然后在80℃下热处理2小时，由此将RNA固定于膜上。作为阴性对照，将市售酵母菌RNA(核糖核酸圆酵母菌RNA，由Sigma-Aldrich Co.Ltd.制造)稀释至50ng/μL，并将1μL的该稀释溶液用与上述相同的方式点加到膜上并固定。随后，将膜转移到杂交缓冲液(表23)中，在60℃下进行预杂交30分钟。在杂交缓冲液中分别加入充足量的用上述方法制备的各种DNA探针以达到50ng/μL的浓度，并在60℃下杂交过夜(约14到16小时)。
表23
  组分   终浓度
  甲酰胺   50％
  SSC(pH 7.0)   5×
  酪蛋白   2％
  Trion X-100   0.1％
  CHAPS   0.1％
  圆酵母菌RNA   1mg/mL
  EDTA   5mM
  肝素   50μg/mL
杂交后，对膜进行洗涤操作。各种洗涤溶液列在表24中。将膜转移至洗涤I缓冲液并在60℃下通过震荡20分钟洗涤。该操作进行三次。然后，于55℃下在洗涤II缓冲液中洗涤膜20分钟。该操作也进行三次。随后，将膜于室温(测试日约18到22℃)下在NTMTx缓冲液中洗涤两次，每次5分钟，然后将洗涤过的膜转移至染色溶液中(375μg/mL NBT+188μg/mL BCIP的NTMTx溶液)，于50℃在遮蔽条件下静置2小时进行显色。
表24
Figure BPA00001306998800441
依据ISH方法使用各个PfuAP-标记的DNA探针进行斑点印迹的结果如图25所示。包含50％和100％的引入Z-QG的探针都能够探测到低至1ng/μL浓度的斑点，并且不论使用哪个探针，显色信号强度都基本相同。在阴性对照中，没有检测到非特异性信号。基于这些结果，可以清楚地看出，通过使用MTG来用PfuAP标记Z-QG DNA制备的DNA探针能够用作探测RNA的探针。
(实施例5)
以与实施例2所述相同的方式，对通过使用嗜中温菌大肠杆菌来源的AP(BAP)进行标记而制备的多标记核酸探针的探针性能进行评价。
<BAP-多标记RNA的制备>
采用与实施例2所述相同的方式对RNA进行变性处理，然后在100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，在包括50μg/mL的各个Z-QG RNA样品，0.4mg/mL的NK14-PfuAP，5.0U/mL的MTG以及1.0U/μL的RNA酶抑制剂的条件下反应6小时。作为对照，在不添加MTG的情况下进行相同的操作。通过琼脂糖凝胶电泳来评价反应。
<通过斑点印迹评价探针性能>
以与实施例2所述相同的方式，通过斑点印迹对探针性能进行评价。
在标记时分子量的变化如图26所示。这些结果证实，分子量的明显增加与Z-QG的引入量成比例。此外，当使用Z-QG RNA(100％)时，证实分子量的分布变窄。当在RNA制备期间仅使用Z-QG-UTP时，据认为由于引入的Z-QG的数量和位置具有有效的单分散性(理论上，所有的U位点)，所以标记进程基本均一。与PfuAP(图10)相比，观察到更加明显的分子量增加，这一事实是BAP与Z-QG RNA呈现出高水平的反应性的结果。
使用获得的BAP-多标记RNA，通过斑点印迹评价探针的性能(图27)。结果表明，当对具有60％、80％或100％的引入Z-QG的mRNA进行BAP标记时，可检测约1ng的RNA。在20％和40％处基本上没有观察到任何的检测，其原因据认为是由于残余的BAP-未修饰的RNA导致的(见图26)。与用PfuAP标记的探针(检测限：10pg)相比，表明对于该系统，PfuAP更适合作为标记酶。
(实施例6：使用MTG对Z-QG RNA进行荧光染料标记，以及通过斑点印迹探测靶核酸)
对伯胺衍生的Alexa Fluor(注册商标)555尸胺(由Invitrogen公司制造)作为荧光染料，是否能够使用MTG与Z-QG RNA结合进行研究。首先，使在包括Z-QG-UTP使用率为100％的条件下制备的Z-QG RNA通过加热到99.0℃进行变性处理然后迅速冷却。随后，在100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)中，在包括50μg/mL的Z-QG RNA、20μM的Alexa Fluor 555尸胺、5.0units/mL的MTG和1.0U/μL的RNA酶抑制剂的条件下反应6小时。作为对照，在不添加MTG的情况下并且对于没有引入Z-QG的未修饰的RNA进行同样的操作。通过琼脂糖凝胶电泳来评价所述反应。
使用MTG用Alexa Fluor 555尸胺标记Z-QG RNA的结果如图28所示。图中，泳道2示出了对于未修饰的RNA和Alexa Fluor 555尸胺的结果，泳道3示出了在与泳道2相同的条件下加入MTG的结果，泳道4示出了Z-QGRNA和Alexa Fluor 555尸胺的结果，以及泳道5示出了与泳道4相同的条件下加入MTG的结果。泳道4和5中，在与未修饰的RNA基本相同的位置处观察到的信号，被认为是来自未反应的Alexa Fluor 555尸胺。这一观点也可以通过在溴化乙锭染色前，在泳道2到4中均出现了相似的条带这一事实得到支持。然而在泳道2和3之间没有观察到任何变化，与泳道4和5相比可知，当加入MTG时，来自Z-QG RNA的条带消失，并证实向更低的分子量转变。该发现标志着带负电荷的Alexa Fluor 555尸胺已与Z-QG RNA结合，表明了Alexa Fluor 555-多标记RNA的产生。
<通过斑点印迹评价探针性能>
将shh S(靶)固定于膜上，并使用Alexa Fluor 555-多标记核酸探针进行探测测试。首先，制备浓度为50ng/μL的未标记shh S溶液，将该溶液的1μL样品点加于膜上，接下来干燥，另加入1μL(总量：1,000ng)并在烘箱中进行固定(80℃2小时)。然后，进行表25所列出的操作，用Alexa Fluor 555-多标记核酸探针探测shh S采用荧光成像仪(Molecular Imager FX Pro，由BIO-RAD制造Laboratories，Inc.，532nm激发，555nm长通)进行。作为对照，在其上用上述相同方式固定了shhAS链的膜上也进行上述相同的操作。各种溶液的组成列在表26中。
表25
当使用Alexa Fluor 555-多标记RNA作为探针时进行的斑点印迹操作
Figure BPA00001306998800471
表26
使用的各种缓冲液组成
Figure BPA00001306998800472
为了研究所制备的Alexa Fluor 555-多标记RNA作为核酸探针的性能，进行一系列的斑点印迹(见图29)。然而，当AS链被固定时，没有观察到任何信号，在S链被固定时证实有荧光，表明Alexa Fluor 555-多标记RNA可以用作探针。此外，由于保持了碱基序列特异性，所以可以预期的是，在杂交进程中进一步优化温度和甲酰胺浓度可以得到更高的探测灵敏度。
Figure IPA00001306998200011
Figure IPA00001306998200031
Figure IPA00001306998200041
Figure IPA00001306998200061
Figure IPA00001306998200081
Figure IPA00001306998200101
Figure IPA00001306998200111
Figure IPA00001306998200121
Figure IPA00001306998200131
Figure IPA00001306998200141

Claims (17)

1.一种具有谷氨酰胺(Gln)残基的核苷三磷酸衍生物。
2.根据权利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(1)表示：
Figure FPA00001306998700011
其中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
3.根据权利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(2)表示：
其中，A1和A2中的至少一个代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，其余的另一个代表氢原子，B代表氢原子或羟基。
4.根据权利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(3)表示：
Figure FPA00001306998700013
其中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
5.根据权利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(4)表示：
其中，A代表具有谷氨酰胺(Gln)残基的取代基，B代表氢原子或羟基。
6.根据权利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(5)表示：
Figure FPA00001306998700022
其中，X和Y各自独立地代表二价连接基团，并且Z代表取代基。
7.根据权利要求6所述的核苷三磷酸衍生物，其中，X和Y各自独立地代表具有1到48个碳原子数的亚烷基或者具有2到48个碳原子数的亚烯基，并且Z代表具有1到48个碳原子数的烷基、具有1到48个碳原子数的烷氧基、具有6到48个碳原子数的芳基、具有6到48个碳原子数的芳氧基、具有7到48个碳原子数的芳烷基、或者具有7到48个碳原子数的芳烷氧基。
8.根据权利要求7所述的核苷三磷酸衍生物，其中，X代表亚乙烯基，Y代表亚甲基，并且Z代表苄氧基。
9.一种核酸探针，其为在其中已引入多个根据权利要求1～8中任一项的核苷三磷酸衍生物作为结构单元的核酸。
10.一种多标记核酸探针，其包含具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺并含有标记部分的标记化合物，该标记化合物与根据权利要求9的核酸探针中的至少两个谷氨酰胺(Gln)残基分别结合。
11.根据权利要求10所述的多标记核酸探针，其中，所述标记部分为酶和荧光染料中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的多标记核酸探针，其中，所述酶为来源于超嗜热菌的酶。
13.一种制备多标记核酸探针的方法，该方法包括：
用转谷氨酰胺酶(TGase)使具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺并包含标记部分的标记化合物与根据权利要求9的核酸探针中的至少两个谷氨酰胺(Gln)残基分别结合。
14.根据权利要求13所述的制备多标记核酸探针的方法，其中，所述标记部分为酶和荧光染料中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的制备多标记核酸探针的方法，其中，所述酶为来源于超嗜热菌的酶。
16.一种探测靶核酸的方法，该方法包括：
将根据权利要求10～12中任一项所述的多标记核酸探针和存在于靶材料中的靶核酸通过核酸部分进行特异性结合，以及
通过标记部分探测所结合的多标记核酸探针。
17.一种探测靶核酸的方法，该方法包括：
将根据权利要求9所述的核酸探针和存在于靶材料中的靶核酸通过核酸部分进行特异性结合，
随后通过使用转谷氨酰胺酶(TGase)使核酸探针内的谷氨酰胺(Gln)残基与具有赖氨酸(Lys)残基或伯胺并包含标记部分的标记化合物内的赖氨酸(Lys)残基或伯胺反应，从而引入多个标记部分，以及
通过标记部分来探测所结合的核酸探针。
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