CN111748550B - 核酸的标记方法 - Google Patents

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Abstract

一种核酸的标记方法，包括以下步骤：反应步骤，将核酸探针杂交至标记对象的核酸，其中，所述核酸探针具有与标记对象的核酸互补的碱基序列，并且在与所述标记对象的核酸的成为标记靶的靶碱基互补的位置导入有反应性碱基衍生物；转移步骤，将包含在所述反应性碱基衍生物的转移基团转移至所述标记对象的核酸的包含所述靶碱基的核苷酸残基；以及标记步骤，用放射性物质对转移至所述核苷酸残基的所述转移基团进行标记。

Description

核酸的标记方法
技术领域
本发明涉及核酸的标记方法。
背景技术
反义药物、适体药物及siRNA药物等的核酸药物，基于形成DNA或RNA的短片段与疾病相关基因RNA的特异性的碱基配对发挥作用。核酸药物不仅可以靶向编码蛋白质的RNA，而且还可以靶向非编码区域。作为不能用小分子及抗体药物治疗的疾病的治疗药物，根据核酸药物的药物开发已经展开，并且已经对遗传性疾病及癌症等的顽固性疾病进行了许多临床研究。
为了防止在活体内的酶水解，被实用化的反义药物由许多化学修饰剂组成。源自该化学修饰剂的副作用或毒性成为大课题。相对于反义药物包含许多化学修饰剂，由于作用机理，siRNA的成分多是天然核酸。因此，为了避免生物降解，siRNA药物封装在药物输送系统(DDS)中使用。然而，DDS可能会成为毒性的原因，因此避免不仅源自siRNA而且源自DDS的毒性已经成为一个问题。
对于小分子药物，从开发阶段就研究其药物动力学，并研究提高药效的同时避免毒性。与小分子药物的开发相比较，核酸药物的动力学分析还不充分。这是由于核酸药物的分子量很大通常高达几千Da以上，并且代谢物的结构多样化，因此不能适用质谱法及HPLC分析等。特别是在siRNA药物的情况下，摄入siRNA反义链的活性化RNA诱导沉默复合体(RNAInduced Silencing Complex；RISC)以极低浓度在细胞内发挥作用。作为动力学分析对象的核酸，往往成为低于检测极限的极低浓度。
由于放射性以高灵敏度可检测，因此不仅可以用于在体内(in vivo)实验，还具有可以用于例如PET(positron emission tomography，正电子发射体层显像)及SPECT(single photon emission computed tomography，单光子发射计算机断层显像)在人体内的核酸追踪的可能性。
用放射性标记的核酸，即、放射标签化核酸包括标记核酸的碱基序列的末端的末端标签体(label body)、和标记末端以外的部位的内部标签体。非专利文献1～6公开了末端标签体。在末端标签体的情况下，当核酸在活体内被分解成片段时，只能检测包含以放射性标记的末端的片段。因此，末端标签体适合于如上所述抑制了降解的反义药物的动力学研究。
另一方面，许多天然核酸作为成分的siRNA的情况下，除了易于通过酶水解而片段化以外，未摄入至活性化RISC中的正义链在产生活性化RISC的过程中被分解并代谢。因此，为了检测siRNA向活性化RISC中的摄入和其动力学，需要选择性地放射性标记核酸的期望位置的内部标签体。
通过使用补骨脂素等的光反应剂或聚合酶，可以获得内部标签体。然而，可以用光反应剂或聚合酶标记的核酸上的位置是随机的，不能选择性地放射性标记核酸的期望位置。
非专利文献7～10报告了内部标签体。这些内部标签体，无论哪一个都在核酸合成阶段掺入标签化前驱体，并在核酸合成后导入放射性元素。非专利文献7公开了一种方法，在该方法中，在使用了核酸合成装置的固相法的核酸的合成中，将核糖的5位羟基氧化，并用具有氚的硼氢化钠还原。
非专利文献8公开了一种方法，在该方法中，将在siRNA的合成阶段掺入的溴尿嘧啶具有的Br在加压下与氚气反应，以替换为氚。放射性元素不限于氚。例如，在非专利文献9中，使用碘的同位素。另外，在非专利文献10中，包含铟同位素的金属络合物被导入核酸。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Dolle,F.、外4名、“A general method for labelingoligodeoxynucleotides with 18F for in vivo PET imaging”、J.Label.Compd.Radiopharm.、1997年、39、319-330
非专利文献2：Hatanaka,K.、外7名、“Development of double-stranded siRNAlabeling method using positron emitter and its in vivo trafficking analyzedby positron emission tomography”、2010年、Bioconjugate Chem.、2010年、21、756-763
非专利文献3：Kuboyama,T.、外10名、“Stoichiometry-focused 18F-labeling ofalkyne-substituted oligodeoxynucleotides using azido([18F]fluoromethyl)benzenes by Cu-catalyzed Huisgen reaction”、Bioorg.Med.Chem.、2011年、19、249-255
非专利文献4：Bartlett,D.W.、外4名、“Impact of tumor-specific targetingon the biodistribution and efficacy of siRNA nanoparticles measured bymultimodality in vivo imaging”、Proc Natl Acad Sci USA、2007年、104、15549-15554
非专利文献5：Liu,G.、外5名、“Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino,a DNA analog”、J.Nucl.Med.、2002年、43、384-391
非专利文献6：Roivainen,A.、外11名、“68Ga-labeled oligonucleotides for invivo imaging with PET”、J.Nucl.Med.、2004年、45、347-355
非专利文献7：Tan,W.、外3名、“Site-specific synthesis of [3H]oligonucleotides in high specific activity through direct solid-phase redoxchemistry”、Tetrahedron Lett.、1995年、36、21、p.3631-3634
非专利文献8：Christensen,J.、外5名、「Tritium labeling of full-lengthsmall interfering RNAs」、J.Label.Compd.Radiopharm.、2012年、55,189-196
非专利文献9：Dougan,H.、外3名、「Synthesis and radioiodination of astannyl oligodeoxyribonucleotide」、Nucleic Acids Res.、1997年、25、p.2897-2901
非专利文献10：Fujibayashi,Y.、外7名、「Anovel 111In-labeled antisenseDNAprobe with multi-chelating sites(MCS-Probe)showing high specificradioactivity and labeling efficiency」、Nucl.Med.Biol.、1999年、26、p.17-21
发明内容
(要解决的问题)
非专利文献7～10中报告的内部标签体，由于必须在核酸的合成阶段掺入标签化前驱体，因此不能标记已经合成或从自然界中提取的核酸。另外，在非专利文献9中公开的方法中，由于必须在加压下与氚气反应，因此可实施的设备受到限制。另外，由于非专利文献10中公开的通过金属络合物的内部标签体在空间上庞大，因此可能损害核酸的功能。
本发明是鉴于上述情况而做出的，本发明的目的是提供一种对合成好的核酸或从自然界提取的核酸，在不损害该核酸功能的情况下、即使片段化也能够以高灵敏度可检测地进行标记的核酸的标记方法。
(解决问题的手段)
根据本发明的核酸的标记方法，包括以下步骤：
反应步骤，将核酸探针杂交至标记对象的核酸，其中，所述核酸探针具有与标记对象的核酸互补的碱基序列，并且在与所述标记对象的核酸的成为标记靶的靶碱基互补的位置导入有反应性碱基衍生物；
转移步骤，将包含在所述反应性碱基衍生物中的转移基团转移至所述标记对象的核酸的包含所述靶碱基的核苷酸残基；以及
标记步骤，用放射性物质对转移至所述核苷酸残基的所述转移基团进行标记。
在这种情况下，所述转移基团是吡啶酮类(ピリジンケト)转移基团，
在所述转移步骤中，也可以将所述吡啶酮类转移基团转移至作为所述靶碱基的胞嘧啶碱基或腺嘌呤碱基。
另外，所述转移基团是二酮类(ジケト)转移基团，
在所述转移步骤中，也可以将所述二酮类转移基团转移至作为所述靶碱基的鸟嘌呤碱基。
另外，所述转移基团是乙酰基，
在所述转移步骤中，也可以将乙酰基转移至包含作为靶碱基的尿嘧啶碱基的核苷酸残基的核糖的2'位。
另外，也可以还包括以下步骤：
第一步骤，将核酸探针杂交至标记对象的核酸，其中，所述核酸探针具有与所述标记对象的核酸互补的碱基序列，并且在与所述靶碱基在所述标记对象的核酸的位置不同的碱基互补的位置导入有反应性碱基衍生物；
第二步骤，将在所述第一步骤中杂交至所述标记对象的核酸的所述核酸探针的所述反应性碱基衍生物包含的转移基团转移至所述标记对象的核酸的包含所述不同的碱基的核苷酸残基；以及
第三步骤，用与所述标记步骤的所述放射性物质不同种类的放射性物质对转移至包含所述不同的碱基的核苷酸残基的所述转移基团进行标记。
另外，所述放射性物质，也可以是氚。
(发明的效果)
根据本发明，对合成好的核酸或从自然界提取的核酸，在不损害该核酸功能的情况下、即使片段化也能够以高灵敏度可检测地进行标记。
附图说明
图1A是示出根据实施例1的标记的siRNA的正义链通过高效液相色谱法(HPLC)纯化的结果的图，是示出反应粗产物的紫外线(UV)峰的图。
图1B是示出根据实施例1的标记的siRNA的正义链通过HPLC纯化的结果的图，是示出各UV峰的放射性大小的图。
图2A是示出根据实施例1的标记的siRNA的反义链通过HPLC的纯化结果的图，是示出反应粗产物的UV峰的图。
图2B是示出根据实施例1的标记的siRNA的反义链通过HPLC纯化的结果的图，是示出各UV峰的放射性大小的图。
图3是示出根据试验例1的眼球中的放射剂量的衰减率的图。
图4是示出根据试验例1的小鼠眼球的每个组织的放射性活度随时间变化的图。
图5A是示出根据实施例2的标记的合成mRNA通过HPLC纯化的结果的图，是示出反应粗产物的UV峰的图。
图5B是示出根据实施例2的标记的合成mRNA通过HPLC纯化的结果的图，是示出各UV峰的放射性大小的图。
图6是示出根据试验例2的质谱法的结果的图。
具体实施方式
参考附图说明根据本发明的实施方式。另外，本发明不被下述实施方式所限定。
(实施方式)
根据本实施方式的核酸的标记方法，包括反应步骤、转移步骤和标记步骤。在反应步骤中，将核酸探针杂交至标记对象的核酸。标记对象的核酸没有特别限制，只要2'-脱氧核糖核苷酸可以形成双链即可，例如DNA、RNA及其修饰体。优选地，标记对象的核酸是RNA。更具体地，标记对象的核酸是单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、反义链、siRNA及mRNA等。标记对象的核酸的碱基序列没有特别限制，由任意的碱基序列构成的核酸都可以作为标记对象。优选地，标记对象的核酸的碱基序列，包含选自鸟嘌呤碱基、胞嘧啶碱基或腺嘌呤碱基中的至少一个。
标记对象的核酸的序列长度没有特别限制，例如为5～1000个碱基，8～500个碱基，10～300个碱基，10～200个碱基。标记对象的核酸的序列长度，优选为，10～150个碱基，15～100个碱基或20～100个碱基。
核酸探针是具有与标记对象的核酸互补的碱基序列的寡核苷酸。在核酸探针中，在与标记对象的核酸的作为标记靶的靶碱基互补的位置导入有反应性碱基衍生物。
当靶碱基是鸟嘌呤时，导入核酸探针的反应性碱基衍生物是，例如结构式(1)所示的S-(2-(次甲基)-1-苯基丁烷-1,3-二酮)-6-硫鸟嘌呤(衍生物1)。
【化学式1】
当选择性地对标记对象的核酸的胞嘧啶进行标记时，导入核酸探针的反应性碱基衍生物为，例如结构式(2)所示的(E)-3-(1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮)-6-硫鸟嘌呤(衍生物2)。
【化学式2】
当选择性地对标记对象的核酸的腺嘌呤进行标记时，导入核酸探针的反应性碱基衍生物为，例如结构式(3)所示的(E)-3-(1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮)-4-硫代胸腺嘧啶(衍生物3)。
【化学式3】
为了杂交标记对象的核酸与核酸探针，例如可以在中性或碱性条件下的缓冲溶液内混合标记对象的核酸和核酸探针。当核酸探针杂交至标记对象的核酸时，由于邻近效应，反应性碱基衍生物包含的转移基团转移至标记对象的核酸的包含靶碱基的核苷酸残基(转移步骤)。
转移步骤，可以在35～40℃、优选在37℃下进行。在反应步骤及转移步骤中，标记对象的核酸与核酸探针的反应时间，合计为5分钟～6小时、10分钟～4小时或1～3小时、优选为2小时。
转移基团只要是反应性的就没有特别限制，但优选具有α，β-不饱和羰基。当靶碱基是鸟嘌呤碱基时，优选地，转移基团是二酮类转移基团。当使用衍生物1时，在碱性条件下，二酮类转移基团转移至鸟嘌呤-2-氨基。
【化学式4】
另外，可以根据转移步骤中的反应条件改变转移转移基团的碱基的选择性。在中性条件下，如下，通过衍生物1转移基团转移至胞嘧啶-4-氨基。
【化学式5】
当靶碱基是胞嘧啶碱基或腺嘌呤碱基时，优选地，转移基团是吡啶酮类转移基团。在衍生物2的情况下，如下，转移基团转移至胞嘧啶-4-氨基。
【化学式6】
另外，在衍生物3的情况下，如下，转移基团转移至腺嘌呤-6-氨基。
【化学式7】
上述衍生物1～3将转移基团转移至作为标记对象的核酸的碱基，但是也可以将转移基团转移至标记对象的核酸的糖。在这种情况下，作为导入核酸探针的反应性碱基衍生物，例如，可以使用结构式(4)所示的N-(1-乙酰基-4-吡啶基)-2-羧酰胺-6-氨基嘌呤(衍生物4)。
【化学式8】
衍生物4经过转移步骤，将乙酰基转移至包含作为靶碱基的尿嘧啶碱基的核苷酸残基的核糖的2'位。
【化学式9】
上述核酸探针，可以使用DNA自动合成装置等通过公知方法合成。当合成具有衍生物1的核酸探针时，例如，可以将2-氯亚甲基-1-(吡啶-2-基)丁烷-1,3-二酮(2-(chloromethylene)-1-(pyridin-2-yl)butane-1,3-dione)在缓冲液中与由包含6-硫代-2'-脱氧鸟苷的2'-脱氧核糖核苷酸组成的寡核苷酸反应。
当合成具有衍生物2的核酸探针时，例如，可以将(E)-3-碘-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮((E)-3-iodo-1-(pyridin-2-yl)prop-2-en-1-one)在缓冲液中与由包含6-硫代-2'-脱氧鸟苷的2'-脱氧核糖核苷酸组成的寡核苷酸反应。
当合成具有衍生物3的核酸探针时，例如，可以将(E)-3-碘-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮在缓冲液中与由包含4-硫代胸苷的2'-脱氧核糖核苷酸组成的寡核苷酸反应。
当合成具有衍生物4的核酸探针时，例如，可以将乙酸酐在缓冲液中与由包含N-(1-乙酰基-4-吡啶基)-2-羧酰胺-6-氨基嘌呤的2'-脱氧核糖核苷酸组成的寡核苷酸反应。
核酸探针的长度没有特别限制，只要与RNA之间形成的双链稳定即可。核酸探针的长度，也可以比标记对象的核酸的长度短。核酸探针的长度为，例如，10～20个碱基，12～18个碱基或13～17个碱基。在核酸探针的反应性碱基衍生物的导入位置，例如，具有10～20个碱基长度的寡核苷酸链的3'末端或5'末端是不优选的，优选3'末端或5'末端开始5～10个碱基或6～8个碱基内侧。
在标记步骤中，以放射性物质对转移至核苷酸残基的转移基团进行标记。可以使用任何公知的放射性物质。放射性物质是，例如氚。通过使标记对象的核酸与硼氚化钠在水中反应，可以以氚标记所述转移基团。
例如，转移至标记对象的核酸的、包含在衍生物1的转移基团可以如下用氚来标记。
【化学式10】
转移至标记对象的核酸的、包含在衍生物2及衍生物3的转移基团可以如下用氚来标记。
【化学式11】
转移至标记对象的核酸的、包含在衍生物4的转移基团可以如下用氚来标记。
【化学式12】
除氚外，作为放射性物质，可以列举18F、131I、76Br、67Ga、68Ga、99mTc、111In、89Sr、186Re、153Sm及117mSn等的放射性同位素。为了以放射性同位素标记，例如，如下所示，可以将具有炔烃的转移基团转移至核苷酸残基，并且通过点击(Click)反应将具有放射性同位素的叠氮化合物(放射标记单元)与炔烃进行反应。炔烃与叠氮化合物的点击反应是炔烃与叠氮化合物的[3+2]型环加成反应(Huisgen环化反应)。通过Huisgen环化反应，获得1,2,3-三唑衍生物。Huisgen环化反应的条件，可以适当决定。
【化学式13】
另外，除上述点击反应之外，如下所示，可以通过用卤代乙酰基酯作为放射标记单元的酯化-酰胺化，将18F、131I及76Br等的放射性同位素导入还原的转移基团。酯化条件，可以适当决定。
【化学式14】
如以上的详细说明，根据本实施方式的核酸的标记方法，将核酸探针杂交至标记对象的核酸，并将转移基团转移至标记对象的核酸，其中，所述核酸探针在与标记对象的核酸的作为标记靶的靶碱基互补的位置导入有反应性碱基衍生物。因此，可以根据核酸探针的碱基序列，选择性地以转移基团对合成好的核酸或从自然界提取的核酸的期望位置进行化学修饰。据此，由于可以标记除标记对象的核酸的末端以外的位置，因此适用于追踪例如像siRNA在活体内容易片段化的核酸的动力学。
另外，根据本实施方式的核酸标记方法，由于以放射性物质标记转移基团，因此能够高灵敏度可检测地对标记对象的核酸进行标记。由于根据本实施方式的转移基团不像上述金属络合物那样在空间上庞大，因此，如下面的试验例2所示，不会损害核酸的功能。
另外，当作为标记对象的核酸使用双链核酸时，根据本实施方式的核酸的标记方法，也可以在上述反应步骤之前包括解离双链核酸的步骤。
另外，由于可以通过根据本实施方式的核酸的标记方法以转移基团选择性地化学修饰核酸的期望位置，因此根据该标记方法，对于同一标记对象的核酸可以获得被标记了不同位置的核酸。在这种情况下，除了上述反应步骤、转移步骤及标记步骤之外，核酸的标记方法还包括以下第一～第三步骤。
在第一步骤中，将核酸探针杂交至标记对象的核酸，其中，所述核酸探针具有与标记对象的核酸互补的碱基序列，并且在与靶碱基(称为碱基X)在标记对象的核酸的位置不同的碱基(称为碱基Y)互补的位置导入有反应性碱基衍生物。在第二步骤中，将在第一步骤中杂交至标记对象的核酸的核酸探针的反应性碱基衍生物包含的转移基团转移至标记对象的核酸的包含碱基Y的核苷酸残基。第三步骤中，用与标记步骤中的放射性物质不同种类的放射性物质对转移至包含碱基Y的核苷酸残基的转移基团进行标记。
据此，即使标记对象的核酸在活体内被分解，例如，也能够可识别地检测出包含碱基X的片段和包含碱基Y的片段。通过这样做，可以追踪从标记对象的核酸产生的多个片段的动力学，并且可以综合所获得的信息以阐明标记对象的核酸的动力学。
在另一个实施方式中，提供了一种核酸的制备方法。该核酸的制备方法，包括：将在上述标记步骤中获得的包含碱基X的核苷酸残基标记的第一标记对象的核酸、和上述第三步骤中获得的包含碱基Y的核苷酸残基标记的第二靶核酸混合的步骤。通过将以该核酸的制备方法获得的包含第一标记对象的核酸和第二标记对象的核酸的核酸样品对活体给药，可以详细阐明标记对象的核酸的动力学。另外，在标记对象的核酸中标记的位置，不限于两个，可以是三个以上。
实施例
参照以下实施例，进一步具体地说明本发明，但是本发明不被实施例所限定。
(实施例1：单链RNA中的胞嘧啶的氚标记)
作为标记对象的核酸的RNA01是对于(P)RR/ATP6AP2基因的siRNA的正义链。将RNA01的碱基序列表示为序列号1。将与从RNA01的5'末端开始第4个A至第20个G为止互补的合成DNA作为核酸探针01。将核酸探针01的碱基序列表示为序列号2。核酸探针01在与从RNA01的5'末端开始第13个C互补的位置即从5'末端开始第8个位置处包含6-硫代-2'-脱氧鸟苷。
核酸探针01(50μM)和吡啶酮类转移基团((E)-3-碘-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮((E)-3-iodo-1-(pyridin-2-yl)prop-2-en-1-one)，750μM)的碳酸缓冲溶液(25mM，pH10.0)在0℃下制备，并且在相同温度下反应30分钟，获得具有反应性碱基衍生物的人工核酸01。
将1M NaCl的HEPES缓冲溶液(0.5M HEPES，pH7.0)添加到上述反应溶液中，并添加超纯水将总量稀释成三倍。将该溶液在65℃下加热3分钟后，在0℃下淬火。在0℃下，将RNA01、NiCl2添加到该溶液中，并添加超纯水制成以下的最终浓度。将该溶液在37℃下培养2小时。从而，获得转移基团已转移至RNA01的修饰RNA01。
RNA01 5μM
NiCl2 75μM
人工核酸01 7.5μM
HEPES缓冲溶液50mM(pH7.0)
NaCl 100mM
将获得的反应溶液浓缩，并添加碳酸盐缓冲溶液、NaBT4及超纯水，制成以下的最终浓度。
NaBT4(3.8mM、3.7GBq/mmol)
修饰RNA01(25μM)
碳酸盐缓冲溶液(25mM、pH10.0)
将该溶液在室温下反应30分钟，并添加10％乙酸水溶液中和反应溶液。将反应粗产物用HPLC(Osaka Soda公司制造，4.6×250mm，流速1.0ml/min，A：TEAA，B：CH3CN，B-conc.10-15％/20min，线性梯度，UV检测器254nm)纯化，并分取UV峰。以闪烁液(UltimaGold MV)将各UV峰的10μl稀释100倍后，用液体闪烁计数器测量放射性。将分取的HPLC溶液冷冻干燥后，作为PBS溶液冷冻存储。
另一方面，将对于(P)RR/ATP6AP2基因的siRNA的反义链，即RNA02作为标记对象的核酸，以与RNA01相同的方式用氚标记。将RNA02的碱基序列表示为序列号3。将与从RNA02的5'末端开始第7个A至第21个A互补的合成DNA作为核酸探针02。将核酸探针02的碱基序列表示为序列号4。核酸探针02在与从RNA02的5'末端开始第12个C互补的位置即从5'末端开始第11个位置处包含6-硫代-2'-脱氧鸟苷。与核酸探针01相同地，将核酸探针02与吡啶酮类转移基团((E)-3-碘-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮((E)-3-iodo-1-(pyridin-2-yl)prop-2-en-1-one))反应，获得具有反应性碱基衍生物的人工核酸02。
与RNA01相同地，将从RNA02和人工核酸02获得的、转移基团已转移至RNA02的修饰RNA02也与NaBT4反应，通过HPLC纯化反应粗产物，对分取的各UV峰测量放射性。将分取的HPLC溶液冷冻干燥后，作为PBS溶液冷冻存储。
(结果)
将与修饰RNA01的反应粗产物相关的UV峰示于图1A。图1B示出各UV峰的放射性大小。可以获得峰4，作为分离纯化的氚标签化RNA01(3H-RNA01)。
将与修饰RNA02的反应粗产物相关的UV峰示于图2A。图2B示出各UV峰的放射性大小。可以获得峰2，作为分离纯化的氚标签化RNA02(3H-RNA01)。
(试验例1：小鼠眼球内的氚标签化RNA的动力学测量)
将BALB/c小鼠(雄性)预备饲养一周后，在通过七氟醚的吸入麻醉下，使用微量注射器、33G针从玻璃体内的角膜缘的巩膜给药仅介质(PBS)、3H-RNA01、3H-RNA02、或由3H-RNA02和未标记RNA01制备的siRNA。给药的3H-RNA01、3H-RNA02及siRNA的浓度分别为100pmol/eye。在给药后5分钟、10分钟、30分钟、1小时及3小时，摘取通过颈椎脱臼安乐死的小鼠的单眼球，或分为包含晶状体和玻璃体的部分及视网膜部分按组织摘取。每一个处理时间使用四只小鼠。向单眼球及每个组织分别添加0.5ml的Solvable(由PerkinElmer公司制造)后，在50℃下处理一夜，以使其溶解。完全溶解后，恢复到室温，添加10ml的UltimaGold MV，并用液体闪烁计数器测量放射性。放射性活度以每器官重量的贝克勒来计算。
(结果)
图3示出3H-RNA01、3H-RNA02及siRNA，分别以五分钟后的放射剂量作为基准的在眼球中放射剂量的衰减率。结果表明，与单链3H-RNA01及3H-RNA02相比较，双链siRNA在眼球中的停留时间长。
图4示出从给药siRNA的小鼠摘取的每个组织的放射性活度随时间的变化。可以追踪视网膜部分及包括晶状体和玻璃体的部分分别的放射性活度随时间的变化。结果表明，在视网膜部分的siRNA动力学不同于在包含晶状体和玻璃体的部分的siRNA动力学。
(实施例2：合成mRNA的胞嘧啶的氚标记)
将氨基酸序列由序列号5表示的肽(分子量：2897.4872，质子加合物：2898.2231)通过非细胞翻译体系编码的合成mRNA作为标记对象的核酸，以与RNA01相同的方式用氚标记。将合成mRNA的碱基序列表示为序列号6。将与从合成mRNA的5'末端开始第82个A至第92个A互补的合成DNA作为核酸探针03。核酸探针03是由3'-OMe化的核糖核苷酸组成的合成核酸。将核酸探针03的碱基序列表示为序列号7。核酸探针03在MALDI/TOF MS的理论值为3596.59，观测值为3596.53。核酸探针03在与从合成mRNA的5'末端开始第88个C互补的位置即从5'末端开始第7个位置处包含6-硫代-2'-脱氧鸟苷。与核酸探针01相同地，将核酸探针03与吡啶酮类转移基团((E)-3-碘-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮((E)-3-iodo-1-(pyridin-2-yl)prop-2-en-1-one))反应，获得具有反应性碱基衍生物的人工核酸03。人工核酸03在MALDI/TOF MS的理论值为3727.63，观测值为3727.73。
通过将合成mRNA和人工核酸03在pH7.0的HEPES缓冲液中，在37℃、75μM NiCl2共同存在下培养1小时，来进行转移基团向合成mRNA的转移反应。接着，在NaBT4存在下还原后，通过离心过滤(Amicon Ultra-0.5mL 10K、由Merck公司制造)除去低分子杂质，并通过HPLC纯化反应粗产物。这里，HPLC的洗脱条件变更为如下：A：TEAA、B:CH3CN、B-conc.10-20％/20min、线性梯度。对分取的各UV峰测量放射性。将分取的HPLC溶液冷冻干燥后，作为PBS溶液冷冻存储。
(结果)
图5A示出与反应粗产物相关的UV峰。图5B示出各UV峰的放射性大小。可以获得峰2，作为分离纯化的氚标签化RNA03(3H-RNA03)。
(试验例2：研究对于非放射性标签化RNA的翻译的影响)
除了使用NaBH4代替NaBT4这一点以外，对以与上述氚标签化RNA03相同的方式制备的非放射性标签化RNA03，使用重构无细胞蛋白质合成系统(Pure system)(Pure Frex2.0、Gene Frontier公司制造)在37℃下进行1小时的翻译反应。对反应溶液，进行使用抗T7标签琼脂糖珠(Anti-T7-tag agarose beads)的亲和层析，并通过质谱法(MALDI-TOFMASS)测量分子量。
(结果)
图6示出通过质谱法获得的光谱。合成的肽的精确分子量为2898.22，表明非放射性标签化RNA03产生了与未修饰的mRNA相同的肽。另外，确认了即使是使用了如下人工核酸的非放射性标签化mRNA，也产生了与未修饰的mRNA相同的肽，该人工核酸与从合成mRNA的5'末端开始第86个A至第92个A互补，并且在与合成mRNA的5'末端开始第86个C互补的位置即从5'末端开始第5个位置处包含6-硫代-2'-脱氧鸟苷。相同地，确认了即使是使用了如下人工核酸的非放射性标签化mRNA，也产生了与未修饰的mRNA相同的肽，该人工核酸与从合成mRNA的5'末端开始第70个A至第83个C互补，并且在与合成mRNA的5'末端开始第82个C的互补位置即从5'末端开始第12个位置处包含6-硫代-2'-脱氧鸟苷。通过试验例表明，通过吡啶衍生物修饰胞嘧啶4-位氨基不影响翻译。
(实施例3：衍生物4的合成)
按照以下步骤a～J，由2'-脱氧鸟苷合成衍生物4的前驱体。
【化学式15】
下面，对各步骤进行说明。
(步骤a)3',5'-二-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧鸟苷(3’,5’-Di-O-tert-butyldimethylsilyl-2’-deoxyguanisone)(2-1)的合成
在氩气流下，于室温，将叔丁基二甲基氯硅烷(42.2g，280mmol)和咪唑(30g，441mmol)添加到2'-脱氧鸟苷(20g，70.1mmol)的无水二甲基甲酰胺(400ml)悬浮液中并搅拌。20小时后，加入200ml的冰水继续搅拌，1小时后，滤取沉淀物，并在减压下干燥。将其通过重结晶(甲醇)纯化，得到2-1(28g，80％)，为白色晶体。
2-1:C22H41N5O4Si2(MW＝495.77)
白色固体，mp>300℃
ESI-HRMS(m/z):
计算496.2770[M+H]+
发现496.2794
IR(cm-1):2928,1669,1555
1H-NMR(400MHz,DMSO)
δ(ppm):
10.57(1H,s)
7.86(1H,s)
6.44(2H,s)
6.10(1H,t,J＝6.9Hz)
4.48(1H,m)
3.80(1H,m)
3.66(1H,ddd,J＝22.7,11.0,5.1Hz)
2.63(1H,ddd,J＝13.3,6.6,6.6Hz)
2.23(1H,ddd,J＝13.2,5.9,3.3Hz)
0.88(9H,s)
0.86(9H,s)
0.09(6H,s)
0.033(3H,s)
0.028(3H,s)
(步骤b)2-氨基-9-{(2R,4S,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅氧基)-5-[(叔丁基二甲基甲硅氧基)甲基]四氢呋喃-2-基}-9H-嘌呤-6-基-2,4,6-三异丙基苯磺酸酯(2-2)
(2-amino-9-{(2R,4S,5R)-4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-5-[(tert-butyldimethy lsilyloxy)methyl]tetrahydrofuran-2-yl}-9H-purine-6-yl-2,4,6-triisopropylbenze nesulfonate(2-2))的合成
在氩气流下，于0℃，将三异丙基苯磺酰氯(1.2g，3.96mmol)和N,N-二甲基-4-氨基吡啶(25mg，0.21mmol)、三乙胺(560μl，4.02mmol)添加到用无水乙腈共沸的2-1(1.0g，2.02mmol)的无水二氯甲烷(40ml)悬浮液中并搅拌。27小时后，将反应溶液用水、饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣通过硅胶色谱法(己烷：乙酸乙酯＝10∶1→5∶1)纯化，获得2-2(1.36g，89％)，为白色泡沫状物质。
2-2:C37H63N5O6SSi2(MW＝762.17)
白色泡沫
ESI-HRMS(m/z):
计算762.4110[M+H]+
发现762.4147
IR(cm-1):2955,1634,1574
13C-NMR(125MHz,CDCl3)
δ(ppm):158.6,155.7,155.3,154.3,151.0,140.1,131.6,123.9,116.9,88.0,84.0,72.2,63.0,41.1,34.5,29.9,26.1,25.9,24.80,24.76,23.7,18.6,18.2,-4.5
1H-NMR(500MHz,CDCl3)
δ(ppm):
7.97(1H,s)
7.20(2H,s)
6.29(1H,dd,J＝6.6,6.6Hz)
4.86(2H,s)
4.57(1H,ddd,J＝3.1,3.1,5.9Hz)
4.31(2H,sept,J＝6.7Hz)
3.97(1H,ddd,J＝3.4,3.6,3.6Hz)
3.80(1H,dd,J＝4.2,11.2Hz)
3.74(1H,dd,J＝3.2,11.2Hz)
2.91(1H,sept,J＝6.9Hz)
2.56(1H,m)
2.34(1H,ddd,J＝3.6,6.1,13.1Hz)
1.28-1.25(18H,m)
0.91(9H,s)
0.89(9H,s)
0.10(6H,s)
0.07(3H,s)
0.06(3H,s)
(步骤c)9-{(2R,4S,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅氧基)-5-[(叔丁基二甲基甲硅氧基)甲基]四氢呋喃-2-基}-2-碘-9H-嘌呤-6-基-2,4,6-三异丙基苯磺酸酯(9-{(2R,4S,5R)-4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-5-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]tetrahydrofuran-2-yl}-2-iodo-9H-purine-6-yl-2,4,6-triisopropylbenzenesulfonate)(2-3)的合成
在氩气流下，于室温，将碘化铜(322mg，1.73mmol)、碘(732mg，5.77mmol)、二碘甲烷(700μl，7.22mmol)、亚硝酸异戊酯(970μl，7.22mmol)添加到2-2(1.1g，1.44mmol)的无水乙腈(85ml)悬浮液中并在75℃下搅拌。45分钟后，使反应溶液恢复到室温后，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣溶解于氯仿中，用饱和硫代硫酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣通过硅胶色谱法(关东化学60N，己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，获得2-3(0.874mg，69％)，为白色泡沫状物质。
2-3:C37H61IN4O6SSi2(MW＝873.05)
白色泡沫
ESI-HRMS(m/z):
计算895.2787[M+Na]+
发现895.2792
IR(cm-1):2926
13C-NMR(125MHz,CDCl3)
δ(ppm):154.6,154.3,153.4,151.0,143.5,131.4,124.0,123.3,115.7,88.4,85.1,72.0,62.8,41.5,34.5,30.0,26.1,25.9,25.0,24.9,23.71,23.70,18.6,18.2,-4.5,-4.6,-5.2,-5.3
1H-NMR(400MHz,CDCl3)
δ(ppm):
8.25(1H,s)
7.20(2H,s)
6.38(1H,dd,J＝6.4,6.4Hz)
4.59(1H,m)
4.24(2H,sept,J＝6.3Hz)
3.98(1H,ddd,J＝3.4,3.4,3.4Hz)
3.84(1H,dd,J＝4.0,11.0Hz)
3.74(1H,dd,J＝3.4,11.3Hz)
2.91(1H,sept,J＝6.9Hz)
2.58(1H,m)
2.41(1H,m)
1.19-1.27(18H,m)
0.89(9H,s)
0.88(9H,s)
0.09(6H,s)
0.06(3H,s)
0.06(3H,s)
(步骤d)6-氨基-9-{(2R,4S,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅氧基)-5-[(叔丁基二甲基甲硅氧基)甲基]四氢呋喃-2-基}-2-碘-9H-嘌呤(6-amino-9-{(2R,4S,5R)-4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-5-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]tetrahydrofuran-2-yl}-2-iodo-9H-purine)(2-4)的合成
将28％氨水溶液(7.0ml，8673mmol)添加到2-3(1.0g，1.145mmol)的四氢呋喃(13ml)溶液中，并在室温下搅拌。69小时后，将反应溶液用饱和氯化铵水溶液稀释，并用乙酸乙酯萃取。将其用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥后，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣通过硅胶色谱法(己烷：乙酸乙酯＝3∶1→5∶2)纯化，获得2-4(619mg，89％)，为白色泡沫状物质。
2-4:C22H40IN5O3Si2(MW＝605.67)
白色泡沫
ESI-HRMS(m/z):
计算628.1607[M+Na]+
发现628.1614
IR(cm-1):2956,1649,1589
13C-NMR(125MHz,CDCl3)
δ(ppm):155.2,150.0,139.5,120.1,119.8,88.1,84.7,72.0,62.9,41.3,26.1,25.9,18.6,18.2,-4.5,-4.6,-5.2,-5.3
1H-NMR(400MHz,CDCl3)
δ(ppm):
7.99(1H,s)
6.33(1H,dd,J＝6.4,6.4Hz)
5.61(2H,s)
4.61(1H,m)
3.96(1H,ddd,J＝3.8,3.8,3.8Hz)
3.86(1H,dd,J＝4.5,11.1Hz)
3.75(1H,dd,J＝3.4,11.3Hz)
2.63(1H,m)
2.38(1H,ddd,J＝4.1,6.3,13.3Hz)
0.90(9H,s)
0.90(9H,s)
0.09(6H,s)
0.08(6H,s)
(步骤e)6-氨基-9-{(2R,4S,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅氧基)-5-[(叔丁基二甲基甲硅氧基)甲基]四氢呋喃-2-基}-9H-嘌呤-2-腈(6-amino-9-{(2R,4S,5R)-4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-5-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]tetrahydrofuran-2-yl}-9H-purine-2-carbonitrile)(2-5)的合成
在氩气流下，于室温，将三丁基锡氰化物(548mg，1.73mmol)添加到2-4(700mg，1.156mmol)的无水二甲基甲酰胺(20ml)溶液中，脱气20分钟。然后，添加四(三苯基膦)钯(160mg，0.138mmol)，并在110℃下加热并搅拌。1小时后，将反应溶液恢复到室温后，用乙酸乙酯稀释，用饱和氯化铵水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣通过硅胶色谱法(己烷→己烷：乙酸乙酯＝2∶1)纯化，并进一步通过硅胶色谱法纯化(己烷：乙酸乙酯＝5∶2)，获得2-5(572mg，98％)，为白色泡沫状物质。
2-5:C23H40N6O3Si2(MW＝504.78)
白色泡沫
ESI-HRMS(m/z):
计算527.2593[M+Na]+
发现527.2596
IR(cm-1):2929,2856,1656,1594
13C-NMR(125MHz,CDCl3)
1H-NMR(400MHz,CDCl3)
δ(ppm):
8.26(1H,s)
6.37(1H,dd,J＝6.3,6.3Hz)
5.69(2H,s)
4.62(1H,m)
4.00(1H,ddd,J＝3.7,3.7,3.7Hz)
3.88(1H,dd,J＝4.3,11.3Hz)
3.76(1H,dd,J＝3.1,11.3Hz)
2.65(1H,m)
2.44(1H,m)
0.91(9H,s)
0.89(9H,s)
0.10(3H,s)
0.10(3H,s)
0.07(3H,s)
0.07(3H,s)
(步骤f)6-氨基-9-{(2R,4S,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅氧基)-5-[(叔丁基二甲基甲硅氧基)甲基]四氢呋喃-2-基}-9H-嘌呤-2-甲基羧酸酯(2-6)(6-amino-9-{(2R,4S,5R)-4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-5-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]tetrahydrofuran-2-yl}-9H-purine-2-methylcarboxylate)的合成
在氩气流下，于室温，将0.5N甲醇钠-甲醇溶液(1.0ml，0.50mmol)添加到2-5(540mg，1.07mmol)的无水甲醇(26ml)溶液中并搅拌。28小时后，将反应溶液用Dowex 50(H+)中和，以硅藻土过滤后，将滤液减压下蒸馏除去溶剂。将残渣溶解于甲醇，在室温下一边搅拌一边缓慢加入水(6.5ml)后，加入10％盐酸水(590μl)。20分钟后，将反应溶液用饱和碳酸氢钠水溶液中和，并在减压下蒸馏除去溶剂。向残渣中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，并将其在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣通过硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1∶1→1∶2)纯化，获得2-6(420mg，73％，两步产率)，为白色泡沫状物质。
2-6:C24H43N5O5Si2(MW＝537.81)
白色泡沫
ESI-HRMS(m/z):
计算560.2695[M+Na]+
发现560.2724
IR(cm-1):2953,2928,2856,1739,1646,1591
13C-NMR(125MHz,CDCl3)
δ(ppm):164.7,155.6,150.6,149.7,141.5,121.1,88.2,84.4,71.9,62.9,53.5,42.0,26.1,25.9,18.6,18.2,-4.5,-4.7,-5.2,-5.4
1H-NMR(400MHz,CDCl3)
δ(ppm):
8.28(1H,s)
6.55(1H,dd,J＝6.4,6.4Hz)
5.73(2H,s)
4.62(1H,m)
4.00(3H,s)
3.98(1H,ddd,J＝3.4,3.4,3.4Hz)
3.88(1H,dd,J＝3.7,11.3Hz)
3.77(1H,dd,J＝3.1,11.3Hz)
2.58(1H,ddd,J＝6.5,6.5,6.5Hz)
2.48(1H,m)
0.90(9H,s)
0.90(9H,s)
0.09(6H,s)
0.08(6H,s)
(步骤g)6-(N-苯甲酰基氨基)-9-{(2R,4S,5R)-4-(叔丁基二甲基甲硅氧基)-5-[(叔丁基二甲基甲硅氧基)甲基]四氢呋喃-2-基}-9H-嘌呤-2-甲基羧酸酯
(6-(N-benzoylamino)-9-{(2R,4S,5R)-4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-5-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]tetrahydrofuran-2-yl}-9H-purine-2-methylcarboxylate)(2-7)的合成
在氩气流下，将苯甲酸酐(105mg，0.4641mmol)添加到2-6(50mg，0.0930mmol)的无水吡啶(470μl)溶液中，并在50℃下搅拌。86小时后，将反应溶液用氯仿稀释，用饱和氯化铵水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣通过硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝3∶1)纯化，获得2-7(26.7mg，45％)，为白色泡沫状物质。
2-7:C31H47N5O6Si2(MW＝641.92)
白色泡沫
ESI-HRMS(m/z):
计算664.2957[M+Na]+
发现664.2939
IR(cm-1):2928,2857,1740,1697,1605,1575,1252
13C-NMR(125MHz,CDCl3)
δ(ppm):164.9,164.1,152.5,149.8,149.6,144.1,133.3,133.1,129.0,128.8,128.2,127.5,125.3,88.4,84.7,72.1,63.0,53.7,42.0,26.1,25.9,18.6,18.2,-4.5,-4.7,-5.2,-5.3
1H-NMR(400MHz,CDCl3)
δ(ppm):
9.01(1H,s)
8.51(1H,s)
8.01(2H,d,J＝7.6Hz)
7.59(1H,t,J＝7.3Hz)
7.50(2H,t,J＝7.5Hz)
6.64(1H,t,J＝6.4Hz)
4.63(1H,m)
4.10(1H,m)
4.04(3H,s)
3.88(1H,dd,J＝3.8,11.1Hz)
3.78(1H,dd,J＝3.1,11.3Hz)
2.62(1H,m)
2.51(1H,m)
0.91(9H,s)
0.89(9H,s)
0.10(6H,s)
0.07(6H,s)
(步骤h)6-(N-苯甲酰基氨基)-9-{(2R,4S,5R)-4-羟基-5-羟甲基-四氢呋喃-2-基}-9H-嘌呤-2-甲基羧酸酯(6-(N-benzoylamino)-9-{(2R,4S,5R)-4-hydroxy-5-hydroxymethyl-tetrahydrofuran-2-yl}-9H-purine-2-methylcarboxylate(2-8))(2-8)的合成
在氩气流下，于0℃，将三乙胺(170μl，1.220mmol)、三乙胺三氢氟酸盐(200μl，1.227mmol)添加到2-7(179mg，0.2789mmol)的无水吡啶(1ml)溶液中，并在室温下搅拌。9小时后，将反应溶液通过硅胶柱色谱法(氯仿：甲醇＝50∶1→45∶1)纯化，获得2-8(108.4mg，94％)，为白色粉末。
2-8:C19H19N5O6(MW＝413.39)
白色粉末
ESI-HRMS(m/z):
计算436.1228[M+Na]+
发现436.1248
IR(cm-1 ):3350,2932,1730,1608,1521,1261
13C-NMR(125MHz,DMSO)
δ(ppm):165.7,163.5,152.2,150.6,149.1,145.1,133.0,132.6,128.6,128.5,127.1,88.2,83.7,70.7,61.5,52.8
1H-NMR(400MHz,CD3OD)
δ(ppm):
8.79(1H,s)
8.08(2H,d,J＝7.0Hz)
7.65(1H,t,J＝7.3Hz)
7.55(2H,dd,J＝7.5,7.5Hz)
6.63(1H,t,J＝6.6Hz)
4.64(1H,m)
4.07(1H,m)
4.01(3H,s)
3.87(1H,dd,J＝3.4,12.2Hz)
3.79(1H,dd,J＝4.3,12.2Hz)
2.86(1H,m)
2.53(1H,m)
(步骤i)6-(N-苯甲酰基氨基)-9-{(2R,4S,5R)-4-羟基-5-二甲氧基三苯甲基氧基甲基-四氢呋喃-2-基}-9H-嘌呤-2-甲基羧酸酯(6-(N-benzoylamino)-9-{(2R,4S,5R)-4-hydroxy-5-dimethoxytrityloxymethyl-tetrahydrofuran-2-yl}-9H-purine-2-methylcarboxylate)(2-9)的合成
在氩气流下，将二甲氧基三苯甲基氯(49mg，0.1446mmol)添加到用无水吡啶共沸的2-8(30mg，0.07257mmol)的无水吡啶(600μl)溶液中，并在室温下搅拌。75分钟后，加入甲醇(1ml)，进一步搅拌10分钟，并在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣通过硅胶柱色谱法(氯仿：甲醇＝100∶1)纯化，获得2-9(49.5mg，95％)，为白色粉末。
2-9:C40H37N5O8(MW＝715.76)
白色粉末
ESI-MS(m/z):
计算716.27[M+H]+
发现716.9859
1H-NMR(500MHz,CDCl3)
δ(ppm):
8.96(1H,s)
8.37(1H,s)
8.04(2H,dd,J＝8.6,8.6Hz)
7.62(1H,t,J＝7.4Hz)
7.53(2H,dd,J＝8.8,16.3Hz)
7.39(2H,t,J＝7.4Hz)
7.3-7.2(3H,m)
6.81(4H,m)
6.67(1H,m)
4.73(1H,m)
4.15(1H,m)
4.04(3H,s)
3.78(6H,s)
3.48(1H,dd,J＝4.5,10.3Hz)
3.41(1H,dd,J＝4.65,10.4Hz)
2.78(1H,m)
2.68(1H,m)
4.62(1H,m)
(步骤j)6-(N-苯甲酰基氨基)-9-{(2R,4S,5R)-4-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)氧膦基]-5-二甲氧基三苯甲基氧基甲基-四氢呋喃-2-基}-9H-嘌呤-2-甲基羧酸酯(6-(N-benzoylamino)-9-{(2R,4S,5R)-4-[2-cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinyl]-5-dimethoxytrityloxymethyl-tetrahydrofuran-2-yl}-9H-purine-2-methylcarboxylate)(2-10)的合成
在氩气流下，于0℃，将N,N-二异丙基乙胺(200μl，1.149mmol)，2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(130μl，0.5828mmol)添加到用甲苯、无水乙腈共沸的2-9(138mg，0.1928mmol)的无水二氯甲烷(2.8ml)悬浮液中，在0℃下搅拌。75分钟后，追加加入N,N-二异丙基乙胺(133μl，0.766mmol)和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(87μl，0.3885mmol)，进一步25分钟后，将反应溶液用氯仿稀释。将溶液用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠洗涤后，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣通过硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝3∶2→1∶1→2∶3)纯化。将残渣溶解于二氯甲烷中，添加到冷却至-78℃的己烷中进行再沉淀，并将上清液除去，在真空下干燥，以获得2-10(120mg，68％)，为白色泡沫状物质。
2-10:C49H54N7O9P(MW＝915.98)
白色泡沫
ESI-MS(m/z):
计算916.38[M+H]+
发现915.9497
31P-NMR(162MHz,CDCl3)
δ(ppm):149.1
1H-NMR(500MHz,CDCl3)
δ(ppm):
8.95(1H,s)
8.02(1H,s)
7.59(2H,m)
7.53(2H,m)
7.37(2H,m)
7.30-7.15(8H,m)
6.78(4H,m)
6.66(1H,m)
4.79(1H,m)
4.28(1H,m)
4.23-4.07(2H,m)
4.04(3H,s)
3.77(6H,s)
3.55-3.42(4H,m)
2.63(1H,m)
2.44(1H,m)
(通过固相合成导入至2'-脱氧核糖寡核苷酸)
制备2-10的无水乙腈溶液，装入DNA自动合成装置，并在装置中通过标准化的方法导入至2'-脱氧核糖寡核苷酸。将无水甲醇、4-氨基吡啶添加到固定化有该合成的核酸探针的CPG载体上，并在55℃下加热一夜，从而进行从CPG载体的切出、及碱基的脱保护、胺的导入。向甲醇中吹入氩气以蒸馏去除溶剂，添加0.1M的TEAA缓冲液，用膜滤器过滤除去不溶物后，用HPLCa纯化。接着，在室温下，于5％乙酸水中静置30分钟，进行5'末端的二甲氧基三苯甲基的脱保护，并再次通过HPLCb纯化，以获得衍生物4。
MALDI/TOF MS(负离子模式)
计算4855.1296[M-H]-
发现4856.045.
HPLCa的条件
资生堂-卡赛帕克(CAPCELL PAK)C18，MG型，4.6×250mm；溶剂：A：0.1M TEAA缓冲液pH7.0，B：CH3CN：B：10％至40％/20min，线性梯度；柱温35℃；流量1ml/min；UV：254nm
HPLCb的条件
资生堂-卡赛帕克(CAPCELL PAK)C18，MG型，4.6×250mm；溶剂：A：0.1M TEAA缓冲液pH7.0，B:CH3CN：B：10％至15％/20min，线性梯度；柱温35℃；流量1ml/min；UV：254nm
上述实施方式是用于说明本发明，并不限定本发明的范围。即，本发明的范围不是由实施方式，而是由权利要求示出。并且，在权利要求的范围内及与其同等发明的意义范围内所进行的各种变形，被认为在本发明的范围内。
工业应用性
本发明适用于以高灵敏度对合成好的核酸、特别是核酸药物前导物或从自然界提取的核酸的末端以外的位置进行标记。
[序列表]19F082_ST25.txt
序列表
<110> 国立大学法人九州大学
株式会社久留米研究园地
<120> 核酸的标记方法
<130> 19F082-CN
<150> JP 2019-65888
<151> 2019-03-29
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA01
<400> 1
ccuauaaccu ugcauauaag ucc 23
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA01探针
<220>
<221> 混杂_特性
<222> (8)..(8)
<223> n是a、c、g、或t
<400> 2
cttatatnca aggttat 17
<210> 3
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA02
<400> 3
ggacuuauau gcaagguuau aggga 25
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA02探针
<220>
<221> 混杂_特性
<222> (10)..(10)
<223> n是a、c、g、或t
<400> 4
tataaccttn catat 15
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 5
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Thr Glu Phe Lys Thr
1 5 10 15
Ala Gln Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20 25
<210> 6
<211> 131
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA
<400> 6
gggucuagag uuuaacuuua agaaggagau auacauaugg cuagcaugac ugguggacag 60
caaaugggua ccgaauucaa gaccgcgcaa gacuacaagg acgacgacga uaaguaguga 120
auaacuaauc c 131
<210> 7
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA探针
<220>
<221> 混杂_特性
<222> (7)..(7)
<223> n是a、c、g、或u
<400> 7
ucuugcncgc ggu 13

Claims (3)

1.一种核酸的标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
反应步骤，将核酸探针杂交至标记对象的核酸，其中，所述核酸探针具有与标记对象的核酸互补的碱基序列，并且在与所述标记对象的核酸的成为标记靶的靶碱基互补的位置导入有反应性碱基衍生物；
转移步骤，将包含在所述反应性碱基衍生物的转移基团转移至所述标记对象的核酸的包含所述靶碱基的核苷酸残基；以及
标记步骤，用第一放射性物质对转移至所述核苷酸残基的所述转移基团进行标记，
当靶碱基是鸟嘌呤碱基时，所述反应性碱基衍生物是S-(2-(次甲基)-1-苯基丁烷-1,3-二酮)-6-硫鸟嘌呤，所述转移步骤中，将反应性碱基衍生物二酮类转移基团转移至所述靶碱基，
当靶碱基是胞嘧啶碱基时，所述反应性碱基衍生物为S-(2-(次甲基)-1-苯基丁烷-1,3-二酮)-6-硫鸟嘌呤或者(E)-3-(1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮)-6-硫鸟嘌呤，所述转移步骤中，将S-(2-(次甲基)-1-苯基丁烷-1,3-二酮)-6-硫鸟嘌呤的二酮类转移基团或者(E)-3-(1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮)-6-硫鸟嘌呤的吡啶酮类转移基团转移至所述靶碱基，
当靶碱基是腺嘌呤碱基时，所述反应性碱基衍生物为(E)-3-(1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮)-4-硫代胸腺嘧啶，所述转移步骤中，将反应性碱基衍生物的吡啶酮类转移基团转移至所述靶碱基，
当靶碱基是尿嘧啶碱基时，所述反应性碱基衍生物为N-(1-乙酰基-4-吡啶基)-2-羧酰胺-6-氨基嘌呤，所述转移步骤中，将反应性碱基衍生物的乙酰基转移至包含作为所述靶碱基的尿嘧啶碱基的核苷酸残基的核糖的2'位。
2.根据权利要求1所述的核酸的标记方法，其特征在于，还包括以下步骤：
第一步骤，将核酸探针杂交至所述标记对象的核酸，其中，所述核酸探针具有与所述标记对象的核酸互补的碱基序列，并且在与所述靶碱基在所述标记对象的核酸的位置不同的碱基互补的位置导入有反应性碱基衍生物；
第二步骤，将在所述第一步骤中杂交至所述标记对象的核酸的所述核酸探针的所述反应性碱基衍生物包含的转移基团转移至所述标记对象的核酸的包含所述不同的碱基的核苷酸残基；以及
第三步骤，用与所述标记步骤的所述第一放射性物质不同种类的第二放射性物质对转移至包含所述不同的碱基的核苷酸残基的所述转移基团进行标记。
3.根据权利要求1或2所述的核酸的标记方法，其特征在于，
所述第一放射性物质，是氚。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006033484A1 (ja) * 2004-09-24 2006-03-30 Kyushu University, National University Corporation 核酸マイクロアレイ及び核酸プローブの設計方法並びに遺伝子検出方法
CN102105482A (zh) * 2008-07-24 2011-06-22 国立大学法人九州大学 核苷三磷酸衍生物、核酸探针、多标记核酸探针、制备多标记核酸探针的方法以及探测靶核酸的方法
CN104115003A (zh) * 2012-02-22 2014-10-22 奥林巴斯株式会社 目标粒子的检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006033484A1 (ja) * 2004-09-24 2006-03-30 Kyushu University, National University Corporation 核酸マイクロアレイ及び核酸プローブの設計方法並びに遺伝子検出方法
JPWO2006033484A1 (ja) * 2004-09-24 2008-05-15 国立大学法人九州大学 核酸マイクロアレイ及び核酸プローブの設計方法並びに遺伝子検出方法
CN102105482A (zh) * 2008-07-24 2011-06-22 国立大学法人九州大学 核苷三磷酸衍生物、核酸探针、多标记核酸探针、制备多标记核酸探针的方法以及探测靶核酸的方法
CN104115003A (zh) * 2012-02-22 2014-10-22 奥林巴斯株式会社 目标粒子的检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NORIHIRO SATO ET AL..A new strategy for site-specific alkylation of DNA using oligonucleotides containing an abasic site and alkylating probes.CHEMICAL COMMUNICATIONS.2015,第51卷(第80期),第14885-14888页. *

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