CN104115003A - 目标粒子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用发光探针间接地并且高灵敏度地检测溶液中分散并随机运动的目标粒子的方法。本发明中,(a)调制包含目标粒子、和与前述目标粒子直接或间接地结合的一种以上的发光探针的溶液;(b)在前述溶液中形成包含前述目标粒子和前述发光探针的复合体;(c)从包含前述复合体的溶液中分离未与前述目标粒子结合的发光探针并回收前述复合体,之后,(d)使发光探针由该复合体解离,使游离发光探针与目标粒子相互分离并分别回收;(e)重复进行下述工序:使发光探针再度与回收的目标粒子结合,之后使之解离,使游离发光探针与目标粒子相互分离并将其回收的工序;之后调制一个包含回收的全部游离发光探针的测定试样溶液;(f)算出该测定试样溶液中的发光探针的分子数。
Description
技术领域
本发明涉及使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学系统,从而检测目标粒子的方法。
背景技术
随着近年来光学测量技术的发展,使用共聚焦显微镜的光学系统和能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术,能够检测/测定单光子或一分子荧光水平的微弱光。因此,提出了使用这样的微弱光的检测技术,进行生物分子等的分子间相互作用或者分子间的结合/解离反应的检测的各种装置或方法。特别是,通过应用荧光相关光谱分析(Fluorescence CorrelationSpectroscopy:FCS)、荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity DistributionAnalysis:FIDA)等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域(显微镜的激光聚光而成的焦点区域,被称为共焦体积)的荧光测定技术的方法,测定所必需的试样的浓度比以前低得多且可以是微量(每次测定使用的量最多数十μL左右),测定时间也大幅地缩短(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。
最近,提出了使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等、能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学系统,一边在试样溶液内移动作为光的检测区域的微小区域的位置,一边逐个地检测在该微小区域内出入的发光粒子(发出光的粒子)的新颖方式的光分析技术(扫描分子计数法)(例如,参照专利文献1~3)。扫描分子计数法为如下技术:具体而言,使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统,一边在试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置,一边检测由该光检测区域中的发光粒子发出的光,由此一个一个地逐个检测试样溶液中的发光粒子,能够取得关于发光粒子的计数、试样溶液中的发光粒子的浓度或数密度的信息。
扫描分子计数法的光检测机理自身与FIDA等光分析技术的情况相同,采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的构成,所以与FIDA等同样地,试样溶液的量可以是微量(例如数十μL左右)的,另外,测定时间也缩短。另一方面,扫描分子计数法与需要计算出荧光强度的波动这样的统计学处理的FIDA等不同,不需要实行这样的统计学处理。因此,扫描分子计数法的光分析技术能够适用于粒子的数密度或浓度大幅地低于FIDA等光分析技术所需要的水平的试样溶液。即,利用扫描分子计数法检测被发光探针标记的试样溶液中的目标粒子(观测对象粒子),即便在试样溶液中的目标粒子的浓度或数密度非常低的情况下,也能够检测并解析目标粒子的状态或特性(参照例如专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2011/108369号
专利文献2:国际公开第2011/108370号
专利文献3:国际公开第2011/108371号
专利文献4:国际公开第2012/014778号
发明内容
发明要解决的问题
通过使作为检测对象的目标粒子与发光探针结合而间接地检测目标粒子的情况下,通常使一分子的目标粒子与一分子的发光探针结合。即,使用扫描分子计数法等一分子光检测技术检测用发光探针标记的目标粒子的情况下,由一分子的目标粒子只产生一个信号源。因此,试样溶液中的目标粒子的浓度非常低的情况下,由于信号降低,所以存在需要长时间的测定、或者达不到高的检测灵敏度的问题。
本发明目的在于提供一种方法,其在使用发光探针间接地检测目标粒子的方法中,使用一分子光检测技术高灵敏度地检测目标粒子,所述一分子光检测技术使用了共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学系统。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题,经过深入研究,结果发现,通过重复数次使与目标粒子结合的发光探针与游离发光探针分离后将其回收之后、与该目标粒子解离后将其回收这样的工序,能够使一分子的目标粒子产生多个信号源(发光探针),至此完成本发明。
即,本发明的目标粒子的检测方法为以下的(1)~(11)。
(1)一种目标粒子的检测方法,其为使用发光探针间接地检测在溶液中分散并随机运动的粒子的方法,其包括如下工序:
进行如下(a)~(d):
(a)调制包含作为检测对象的目标粒子、和与前述目标粒子直接或间接地结合的一种以上的发光探针的溶液的工序;
(b)在前述溶液中形成包含前述目标粒子和前述发光探针的复合体的工序;
(c)从包含前述复合体的前述溶液中去除未与前述目标粒子结合的发光探针并回收前述复合体的工序;
(d)使前述发光探针由前述回收的复合体解离,将游离发光探针和目标粒子分离并分别回收的工序,
(e)将由以下的(a’)~(d’)构成的循环重复1次以上,之后,调制一个包含所述工序(d)和(d’)中回收的全部游离发光探针的测定试样溶液的工序;
(a’)调制在前述工序(d)中与游离发光探针分离并回收的目标粒子中重新添加了前述发光探针的溶液的工序;
(b’)在前述工序(a’)之后在前述溶液中形成包含前述目标粒子与前述发光探针的复合体的工序;
(c’)在前述工序(b’)之后,从前述溶液中分离未与前述目标粒子结合的发光探针并回收前述复合体的工序;
(d’)使前述发光探针由前述工序(c’)中回收的复合体解离,之后使游离发光探针和前述目标粒子相互分离并回收的工序;以及,
(f)使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统,一边在前述测定试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置,一边检测由该光检测区域中的前述发光探针发出的光,通过这样的方法算出前述测定试样溶液中的前述发光探针的分子数的工序。
(2)根据前述(1)所述的目标粒子的检测方法,在前述工序(d’)中,在包含前述工序(d)中回收的游离发光探针的溶液中进行前述发光探针由前述复合体的解离。
(3)根据前述(1)所述的目标粒子的检测方法,前述工序(e)中,将前述工序(d)和(d’)的各工序中回收的包含游离发光探针的溶液全部混合,之后进行浓缩处理,由此调制一个测定试样溶液。
(4)根据前述(1)~(3)的任一项所述的目标粒子的检测方法,
前述工序(a)中,向前述溶液中进一步添加相对于前述发光探针独立地与前述目标粒子结合的分离用探针;
前述工序(b)和(b’)中形成的复合体包含:前述目标粒子、前述发光探针和前述分离用探针;
前述工序(d)和(d’)中,以与前述分离用探针结合的复合体的状态,将目标粒子与游离发光探针分离并进行回收。
(5)根据前述(1)~(4)的任一项所述的目标粒子的检测方法,前述目标粒子为核酸分子。
(6)根据前述(4)所述的目标粒子的检测方法,前述目标粒子为核酸分子,并且前述目标粒子与前述分离用探针的复合体的Tm值高于前述目标粒子与前述发光探针的复合体的Tm值。
(7)根据前述(6)所述的目标粒子的检测方法,前述工序(d)和(d’)中,将包含前述复合体的溶液的温度设为高于前述目标粒子与前述发光探针的复合体的Tm值、并且低于前述目标粒子与前述分离用探针的复合体的Tm值的温度,由此进行前述发光探针由前述复合体的解离。
(8)根据前述(4)~(7)的任一项所述的目标粒子的检测方法,前述发光探针为结合了发光物质的天然型的寡核苷酸,前述分离用探针为包含肽核酸的寡核苷酸。
(9)根据前述(4)或(5)所述的目标粒子的检测方法,在前述工序(d)之前进行下述工序:使前述工序(b)中形成的复合体中的、前述目标粒子与前述分离用探针之间形成至少一个共价键。
(10)根据前述(4)~(9)的任一项所述的目标粒子的检测方法,通过固液分离处理,进行前述工序(c)中的前述复合体的回收、以及前述工序(d)和(d’)中的游离发光探针的回收;所述固液分离处理使用了与前述分离用探针直接或间接地结合的固相载体。
(11)根据前述(1)~(10)的任一项所述的目标粒子的检测方法,前述一种以上的发光探针为两种以上的发光探针。
发明的效果
本发明的目标粒子的检测方法为使用发光探针间接地检测目标粒子的方法,通过重复使与目标粒子结合的发光探针由该目标粒子解离并回收这样的工序,能够将由一分子的目标粒子产生的信号源增加前述工序重复次数倍。因此,通过本发明的目标粒子的检测方法,即便在目标粒子的浓度非常低的情况下也能得到高的信号,所以使用扫描分子计数法等一分子光检测技术进行检测的情况下,能够高灵敏度并且在短时间检测目标粒子。
附图说明
图1为示意地表示本发明的目标粒子的检测方法的一实施方式的图。
图2为表示参考例1中各试样溶液的峰数的计数结果的图。
图3为表示实施例1中,由试样溶液调制的测定试样溶液的峰数(目标粒子存在下的峰数)减去由对照试样溶液调制的测定试样溶液的峰数(目标粒子非存在下的峰数)的峰数的计数结果的图。
具体实施方式
本发明的目标粒子的检测方法(以下,有时简单地称为“本发明的检测方法”)的特征在于,其为使用发光探针间接地检测溶液中分散并随机运动粒子的方法,具有下述工序(a)~(f)。
(a)调制包含作为检测对象的目标粒子、和与前述目标粒子直接或间接地结合的一种以上的发光探针的溶液的工序;
(b)在前述溶液中形成包含前述目标粒子和前述发光探针的复合体的工序;
(c)从包含前述复合体的前述溶液中去除未与前述目标粒子结合的发光探针并回收前述复合体的工序;
(d)使前述发光探针由所述回收的复合体解离,将游离发光探针和目标粒子分离并分别回收的工序,
(e)将由以下的(a’)~(d’)构成的循环重复1次以上,之后,调制一个包含所述工序(d)和(d’)中回收的全部游离发光探针的测定试样溶液的工序:
(a’)调制在前述工序(d)中与游离发光探针分离并回收的目标粒子中重新添加了所述发光探针的溶液的工序;
(b’)在前述工序(a’)之后在前述溶液中形成包含前述目标粒子与前述发光探针的复合体的工序;
(c’)在前述工序(b’)之后,从前述溶液中分离未与前述目标粒子结合的发光探针并回收前述复合体的工序;
(d’)使前述发光探针由前述工序(c’)中回收的复合体解离,之后将游离发光探针和前述目标粒子相互分离并回收的工序;以及,
(f)使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统,一边在前述测定试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置,一边检测由该光检测区域中的前述发光探针发出的光,通过这样的方法算出前述测定试样溶液中的前述发光探针的分子数的工序。
本发明和本说明书中,“在溶液中分散并随机运动的粒子”是指在溶液中分散或溶解的原子、分子或者它们的聚集体等粒子(可以为发光的或不发光的的任一者),是指非固定于基板等而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子。
本发明的检测方法的作为检测对象的目标粒子,只要是溶液中分散并随机运动的粒子就可以是任意的,没有特别的限定。可列举出例如:蛋白质、肽、核酸、核酸类似物质、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等生物分子、病毒、细胞等粒子状的生物学的对象物、或非生物学的粒子(例如:原子、分子、胶束、金属胶体等)等。核酸可以为DNA,也可以为RNA,还可以为cDNA这样的人工扩增的核酸。核酸类似物质可列举DNA或RNA这类天然类型核苷酸(天然存在的核苷酸)的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等标记的物质等。更具体而言,可列举出例如:桥式核酸(BNA,Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子置换的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA,Hexitol Nucleic Acid)、肽核酸(PNA)等。
作为本发明的检测方法的目标粒子,优选为核酸分子或核酸类似物质(本说明书中,有时将它们称为“核酸分子等”)。核酸分子或核酸类似物质既可以是双链核酸分子,也可以是单链核酸分子。具体而言,可列举出例如:存在于动物或植物的染色体、细菌或病毒基因中的具有碱基序列的核酸分子、具有人工设计的碱基序列的核酸分子。其中,作为目标粒子,优选例如:microRNA、siRNA、mRNA、hnRNA、基因组DNA、利用PCR扩增等得到的合成DNA、使用逆转录酶由RNA合成的cDNA等。
另外,本发明中使用的发光探针只要是与目标粒子特异或非特异结合(结合中包括吸附。以下同样)的、发出使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统能够检测的光的物质,就没有特别的限定。例如,可以是与目标粒子特异或非特异结合的物质结合了发光物质而成的物质。作为发光物质,典型地为荧光性物质,但也可以为通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的物质。作为荧光物质,只要是由特定波长的光照射就发出荧光的物质即可,没有特别的限定,可以从用于FCS或FIDA等的荧光色素中适当的选择使用。
另外,本发明中使用的发光探针可以是与目标粒子直接结合的物质,也可以是使用其他的物质间接地结合的物质。例如,目标粒子为核酸分子或核酸类似物质的情况下,作为与目标粒子直接结合的发光探针,可列举出:使与目标粒子杂交的寡核苷酸结合荧光物质等发光物质而成的物质、结合有荧光物质等发光物质的核酸结合性蛋白质、与核酸结合的色素分子等。作为该寡核苷酸,可以为DNA,也可以为RNA,也可以为cDNA这样的人工扩增物质。可以是部分或全部包含核酸类似物质的物质;所述核酸类似物质能够与天然的核酸碱基同样地形成核苷酸链或碱基对。另外,目标粒子为蛋白质的情况下,作为与目标粒子直接结合的发光探针,可以使用用荧光物质等发光物质对目标粒子的抗原或抗体、目标粒子的配体或受体进行标记而得到的物质作为发光探针。需要说明的是,与核酸、蛋白质等目标粒子特异或非特异地结合或吸附的物质与发光物质的结合可以通过常规方法进行。
本发明中使用的发光探针也可以为与目标粒子非特异地结合的物质,从目标粒子的检测/定量的精度的观点出发,优选特异地结合的物质。需要说明的是,作为与目标粒子特异地结合的发光探针,只要是与物理或化学的性质与目标粒子类似的其他物质相比更优先与目标粒子结合的物质即可,不需要是与目标粒子以外的其他物质完全不结合的物质。因此,例如,目标粒子为核酸分子的情况下,作为发光探针使用的被发光物质标记的寡核苷酸既可以具有与该目标粒子的部分碱基序列完全地互补的碱基序列,也可以具有与该目标粒子的部分碱基序列错配1~数碱基的碱基序列。
本发明中,可以是一分子的目标粒子与一分子的发光探针结合,也可以是一分子的目标粒子与多分子的发光探针结合。一分子的目标粒子与多个发光探针结合的情况下,这些发光探针可以设计成相互独立地与目标粒子结合。一分子的目标粒子可以结合多分子的一种发光探针,一分子的目标粒子也可以结合多种发光探针。结合多种发光探针的情况下,各种发光探针可以是用相互发出的光的发光特性不同的物质标记的探针;从提高低浓度的检测对象与发光探针结合时的检测灵敏度的观点出发,优选为结合了同种的发光物质的探针。
具体而言,工序(a)首先向溶剂中添加目标粒子和发光探针而调制包含两者的溶液。该溶剂只要是不有损目标粒子和发光探针的特性的溶剂,就没有特别的限定。典型地将水作为溶剂,也可以将甲酰胺等有机溶剂及其他的任意的液体作为溶剂。具体而言,该溶剂可以从该技术领域中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。作为该缓冲液,有例如:PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。
对于添加至溶液中的发光探针的浓度没有特别的限定,检测方法中为了提高目标粒子的检测灵敏度,优选将包含两者的溶液调制成发光探针的浓度高于预想的目标粒子的浓度。本发明的方法中,在以后的工序(c)等中,从与目标粒子结合的发光探针中去除未与目标粒子结合的游离发光探针。因此,即便在工序(a)中添加了过剩量的发光探针的情况下,也能够精度良好地检测目标粒子。
接着,作为工序(b),在前述溶液中形成包含前述目标粒子和前述发光探针的复合体。只是使目标粒子与发光探针共存于相同的溶液中就能够使两者结合的情况下,调制包含两者的溶液之后,只需根据需要以规定时间孵育该试样溶液,就能使包含目标粒子与发光探针的复合体在该溶液中形成。
另一方面,目标粒子与发光探针为双链结构的核酸分子或者核酸类似物质的情况下,优选以使溶液中的核酸分子等变性的状态使目标粒子和发光探针缔合。需要说明的是,“使核酸分子等变性”是指使核酸分子等的分子内的碱基对解离。例如,意味着使双链核酸分子成为单链核酸分子。需要说明的是,当发光探针是包含PNA等核酸类似物质的寡核苷酸时,即使目标粒子是双链核酸分子,有时不进行特别的变性处理也可以形成包含该发光探针和目标粒子的复合体。该情况下,可以不使核酸分子等变性而形成复合体。
作为核酸分子等的变性处理,可列举出:利用高温处理的变性(热变性)或利用低盐浓度处理的变性等。其中,热变性对于荧光物质等发光物质的影响比较小且操作简便,所以优选进行热变性。具体而言,热变性可以通过将该溶液进行高温处理而使该溶液中的核酸分子等变性。通常地,DNA在90℃下、RNA在70℃下保温数秒至2分钟左右能够使核酸分子等变性;但根据作为目标粒子的核酸分子等的碱基的长度等进行变性的温度千差万别,所以只要能够变性,就对上述的保温温度、保温时间没有限定。另一方面,通过低盐浓度处理进行变性可以是例如利用纯水等稀释,将该溶液的盐浓度调整至足够低,从而进行。
根据需要使之变性之后,使前述溶液中的作为目标粒子的核酸分子等与发光探针缔合,从而形成包含两者的复合体。当进行核酸分子等的热变性时,在变性处理后,使该溶液的温度降至目标粒子能够与发光探针特异地杂交的温度(特异的缔合条件),由此能够使该溶液中的两者适当缔合。优选使包含两者的溶液的温度降低至复合体中的杂交区域的Tm值±3℃的温度范围。另外,当通过低盐浓度处理进行变性时,通过添加盐溶液等,使该溶液的盐浓度升高至核酸分子等能够与发光探针特异地杂交的浓度,能够使该溶液中的两者适当缔合。
需要说明的是,可以根据两者的缔合体的熔解曲线,求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如可以使仅含有两者的溶液的温度从高温向低温变化,测定该溶液的吸光度或荧光强度来求出熔解曲线。根据所获得的熔解曲线,从变性了的两条单链核酸分子开始形成缔合体的温度,至几乎全部成为缔合体的温度这一范围内的温度,都可以作为两者能够特异地杂交的温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度,同样地确定熔解曲线,能够求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的浓度。
这样,特异的缔合条件根据目标粒子、发光探针的种类而不同,由实验而决定;目标粒子为核酸分子等的情况下,通常,可以用Tm值(熔解温度)代替。例如,利用普遍使用的引物/探针设计软件等,根据发光探针的碱基序列信息,能够算出与目标粒子杂交的区域的Tm值(双链DNA的50%解离为单链DNA的温度)。可以将温度为Tm值附近的值的条件例如Tm值±3℃左右的条件作为特异的缔合条件。在算出的Tm值附近通过实验求出熔解曲线,由此也能够更详细地确定特异的缔合条件。
此外,为了抑制非特异杂交,在形成缔合体时,优选使前述溶液的温度较缓慢地下降。例如,使前述溶液温度为70℃以上而使核酸分子变性后,可以按0.05℃/秒以上的降温速度,降低该溶液的液温。
此外,为了抑制非特异地杂交,还优选预先在前述溶液中添加表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。这些化合物可以只添加一种,也可以组合添加2种以上。通过添加这些化合物,在较低温度环境下也能够使非特异的杂交难以发生。
工序(b)之后,作为工序(c),从包含前述复合体的前述溶液中去除未与前述目标粒子结合的发光探针,并回收前述复合体。使用了逐个检测用发光探针标记的目标粒子的光分析技术的本发明的方法中,无法将来自未与目标粒子形成复合体的游离发光探针等的光、和来自与目标粒子结合了的发光探针发出的光区别地检测出,目标粒子的检测精度变差。因此,工序(c)中,将该游离发光探针等(复合体以外的、溶液中存在的物质)从前述溶液中去除。
工序(c)中,对于将没有结合目标粒子的发光探针去除而回收前述复合体的具体的手段,没有特别的限定,利用大小或分子量、对于任意物质的亲和性、带电状态等的差异将多个物质物理地分离时,可以从该技术领域中通常进行的物质的分离方法中适宜地选择。作为该分离方法,可列举出例如:包括吸附/提取或者洗涤的操作。具体而言,可列举出:色谱法(亲水/疏水性色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法等)、超滤、电泳、相分离、离心分离、溶剂提取、过滤吸附等。
工序(c)中,利用相对于发光探针独立地与目标粒子结合的分离用探针,能够将没有结合目标粒子的发光探针去除而回收前述复合体。具体而言,工序(a)中,向前述溶液中进一步添加分离用探针;工序(b)中,形成包含目标粒子与发光探针和分离用探针的复合体。接着,工序(c)中,利用该复合体中的分离用探针与其他的物质的相互作用选择地保持复合体,将未与目标粒子结合的发光探针去除。
分离用探针只要是相对于发光探针独立地与目标粒子特异或非特异结合(包括吸附。以下同样)的物质,就没有特别地限定。该分离用探针可以是与目标粒子之间通过其他的物质间接地与目标粒子结合的物质,优选为与目标粒子直接结合的物质。作为能够用作分离用探针的与目标粒子直接、特异或非特异地结合的物质,为上述发光探针的说明中列举出的物质中与结合发光物质之前的物质相同的物质。例如,目标粒子为核酸分子等的情况下,与目标粒子杂交的寡核苷酸为分离用探针;目标粒子为蛋白质的情况下,目标粒子的抗原或抗体、目标粒子的配体或受体为分离用探针。
本发明中使用的分离用探针具有与固相载体结合的部位,在与目标粒子结合的状态下进而与固相载体直接或间接地结合。使用该分离用探针的情况下,通过固液分离处理能够更简便地进行工序(c)中的复合体的回收、以及后面的工序(d)中的游离发光探针的回收,所述固液分离处理使用了与分离用探针直接或间接地结合的固相载体。
作为分离探针用的固相载体,只要是具备与分离用探针结合的部位的固体,对于其形状、材质等就没有特别的限定。例如,可以为珠等能够悬浮于水中的、并且通过通常的固液分离处理能够与液体分离的粒子即可,可以为膜片(membrane),也可以为容器、芯片基板等。作为固相载体,具体而言,可列举出例如:磁珠、二氧化硅珠、琼脂糖凝胶珠、聚丙烯酰胺树脂珠、胶乳珠、聚苯乙烯珠等塑料珠,陶瓷珠、氧化锆珠、二氧化硅膜片、二氧化硅过滤器、塑料板等。
例如,分离用探针为寡核苷酸的情况下,可以使用下述珠或过滤器作为固相载体,所述珠或过滤器能够以该寡核苷酸中的与和目标粒子杂交的区域以外的区域杂交的部分在表面上露出的状态结合该寡核苷酸。另外,分离用探针具有生物素(biotin)作为与固相载体结合的部位的情况下,可以使用能够使抗生物素蛋白、链亲合素保持了与生物素的结合特性地结合于表面的珠、过滤器作为固相载体。另外,分离用探针中的与固相载体结合的部位为谷胱甘肽(Glutathione)、DNP(dinitorophenol,二硝基苯酚)、异羟基洋地黄毒配质(digoxigenin、Dig)、异羟基洋地黄毒苷(digoxin)、由2个以上的糖形成的糖链、由4个以上的氨基酸形成的多肽、生长素、赤霉素、类固醇、蛋白质、亲水性有机化合物以及它们的类似物等的情况下也同样地,可以使用表面结合了这些物质的抗体、抗原、配体或受体的珠、过滤器作为固相载体。需要说明的是,固相载体可以为与分离用探针非特异地结合等的物质,但从目标粒子的检测·定量的精度的观点出发,优选为与分离用探针特异地结合等的物质。
具体而言,通过使包含复合体的前述溶液与固相载体接触,根据需要进行孵育,该溶液中的包含目标粒子与发光探针和分离用探针的复合体通过该复合体中的分离用探针与固相载体结合。之后,通过进行固液分离处理,能够将与固相载体结合的复合体、与游离发光探针等存在于液相中的没有结合目标粒子的发光探针分离并回收。
作为固液分离处理,只要是能够将溶液中的固相载体与液体成分分离并回收的方法,就没有特别的限定,可以从固液分离处理中使用的已知的处理中适宜选择而使用。例如,固相载体为珠等粒子的情况下,对于包含固相载体的悬浮液进行离心分离处理,使固相载体沉淀,去除上清;也可以将该溶液使用滤纸或过滤器进行过滤,将残留于滤纸等的表面的固相载体回收。另外,当固相载体为磁珠时,可以使加入了该溶液的容器接近磁体,将固相载体集中到该容器的与该磁体最接近的面之后去除上清。固相载体为内壁被与分离用探针结合的物质覆盖的容器的情况下,将包含前述复合体的溶液注入至该容器内、根据需要进行孵育之后,将该容器内的液体排出。需要说明的是,固相载体为膜片或过滤器的情况下,通过使包含前述复合体的溶液透过该固相载体,能够一次性地进行固相载体与前述复合体的结合、前述复合体与未与目标粒子结合的发光探针的分离和回收。
本发明中,也可以在工序(a)中,将固相载体与目标粒子与发光探针和分离用探针一起预先添加至溶液中,工序(b)中,形成与固相载体结合的包含目标粒子与发光探针和分离用探针的复合体,之后进行固液分离处理,由此进行结合于固相载体的前述复合体的与未与目标粒子结合的发光探针等的分离和回收。另外,工序(a)中,也可以预先添加与固相载体结合的状态的分离用探针、目标粒子和发光探针而调制溶液。需要说明的是,此时使用的分离用探针可以可逆地与固相载体结合,也可以不可逆地结合。
通过向回收的固相载体添加适当的溶剂,调制包含与固相载体结合的复合体的溶液。回收的固相载体以包含其的溶液的形式供于工序(d)中。该溶剂只要是在后面的工序中不阻碍由发光探针发出的光的检测的溶剂,就没有特别的限定,可以从该技术领域中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。作为该缓冲液,有例如:PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。
回收的固相载体也可以在工序(d)之前,用适当的溶剂进行洗涤。通过洗涤,可以更严密地将游离发光探针从与固相载体结合的复合体中分离而去除。洗涤固相载体的溶剂只要不有损复合体与固相载体的结合就没有特别的限定,可以与供于工序(d)的包含与固相载体结合的复合体的溶液的调制中所使用的溶剂相同,也可以为不同的溶剂。
之后,作为工序(d),使前述发光探针由工序(c)中回收的复合体解离,将游离发光探针和目标粒子分离并分别进行回收。回收的游离发光探针作为后面的工序使用扫描分子计数法等一分子光检测技术的测定中的试样。另外,使回收的目标粒子在以后的工序中再度与新的发光探针结合。
使复合体中的发光探针解离的方法,只要是能够解除该复合体中的目标粒子与发光探针的结合的方法,就没有特别的限定。
例如,目标粒子为由核酸分子或核酸类似物质组成的寡核苷酸,发光探针中的与目标粒子结合的部位为由核酸分子或核酸类似物质形成的、与目标粒子杂交的寡核苷酸的情况下,通过将包含前述复合体的溶液的温度设为充分地高于目标粒子与发光探针特异的缔合条件的温度,或者将包含前述复合体的溶液的盐浓度设为充分地低于目标粒子与发光探针特异的缔合条件的盐浓度,能够解消发光探针与目标粒子的结合、能够使发光探针由前述复合体解离。
工序(c)中回收的复合体包含目标粒子与发光探针和分离用探针的情况下,工序(d)中,优选通过只解除前述复合体中的目标粒子与发光探针的结合而使发光探针由该复合体解离。通过维持目标粒子与分离用探针的结合,能够以与分离用探针结合的复合体的形式,将目标粒子与游离发光探针分离并回收。工序(c)中回收的复合体包含目标粒子与发光探针和分离用探针并且与固相载体结合的情况下也是同样的。
例如,目标粒子为由核酸分子或核酸类似物质形成的寡核苷酸,并且发光探针和分离用探针中的、与目标粒子结合的部位也是由核酸分子或核酸类似物质形成的寡核苷酸并且与前述目标粒子杂交的情况下,优选将发光探针和分离用探针设计成目标粒子与分离用探针的复合体的Tm值高于目标粒子与发光探针的复合体的Tm值。该情况下,通过将包含含有目标粒子与发光探针和分离用探针的复合体的溶液的温度设为高于目标粒子与发光探针的复合体的Tm值并且低于目标粒子与分离用探针的复合体的Tm值的温度,能够维持目标粒子与分离用探针的结合并且使发光探针由目标粒子解离。
作为使目标粒子与分离用探针的复合体的Tm值高于目标粒子与发光探针的复合体的Tm值的方法,可列举出例如:将发光探针设为结合了发光物质的天然型的寡核苷酸,将分离用探针中的与目标粒子结合的区域设为下述寡核苷酸的方法,所述寡核苷酸至少包含一部分能够形成比天然型的核苷酸强的碱基对的核酸类似物质。作为比天然型核苷酸能够稳定地结合的核酸类似物质,可列举出例如:BNA、PNA等。
其中,优选将发光探针设为结合了发光物质的天然型的寡核苷酸,将分离用探针设为包含PNA的寡核苷酸。这是因为PNA不带有负电荷,即便在溶液中的盐浓度低而天然型的寡核苷酸之间难以形成缔合体的情况下,存在包含PNA的寡核苷酸能够与天然型的寡核苷酸结合并形成缔合体的情况。因此,目标粒子为天然型的寡核苷酸的情况下,将发光探针设为结合了发光物质的天然型的寡核苷酸、将分离用探针设为由PNA形成的寡核苷酸的情况下,形成目标粒子与发光探针和分离用探针的结合体之后,通过使溶液中的盐浓度降低或者从溶液中去除盐,能够使发光探针容易地从与分离用探针结合的目标粒子游离。
其他地,还可以列举出如下方法:将发光探针和分离用探针中的、与目标粒子结合的区域均设为天然型的寡核苷酸的情况下,通过使分离用探针中的与目标粒子结合的区域充分地长于发光探针中的与目标粒子结合的区域,或者,使分离用探针中的与目标粒子结合的区域的GC含有率高于发光探针中的与目标粒子结合的区域,均能够使各个区域的Tm值相互地明显不同。
也可以在工序(d)之前,预先使工序(b)中形成的复合体中的、目标粒子与分离用探针之间形成至少一个共价键。将目标粒子与分离用探针通过共价键交联,由此能够在以后的工序中使目标粒子与分离用探针的结合稳定化,能够容易地进行发光探针由复合体的解离。形成该共价键的情况下,例如,通过在使发光探针不能与目标粒子完全地杂交的严谨溶液条件下洗涤包含目标粒子与发光探针和分离用探针的复合体,由此能够稳定地维持目标粒子与分离用探针的结合并且使发光探针解离。目标粒子与分离用探针之间的共价键形成可以在工序(c)前进行,也可以在工序(c)之后进行。
对于共价键的形成方法,只要能够形成共价键以连接形成了碱基对的两条单链核酸分子之间,就没有特别的限定,可以从使核酸分子之间交联时使用的公知的手法中适宜选择而进行。本发明中,优选通过光化学反应形成共价键。光化学反应是指照射特定波长的光利用其光能而进行的反应。通过光化学反应形成共价键的方法通过对溶液照射特定波长的光,能够在双链核酸分子的核酸链间形成共价键,所以没有必要改变溶液的组成等条件。因此,能够抑制对于溶液中的复合体施加除共价键形成外的影响,并且操作也简便。
例如,通过使用与目标粒子结合的区域内的至少一碱基被光反应性碱基衍生物置换而成的分离用探针,能够利用光化学反应在目标粒子与分离用探针之间介由该光反应性碱基衍生物形成共价键。分离用探针中的被光反应性碱基衍生物置换的碱基,只要是与目标粒子杂交的区域中的碱基就没有特别的限定。另外,可以只有1个碱基被光反应性碱基衍生物置换,也可以是2个碱基以上被光反应性碱基衍生物置换。
此处,光反应性碱基衍生物是指具有通过照射特定的波长的光而使有机合成反应中的反应性被活性化的部位(光反应性部位)并与天然的核苷酸同样地能够形成核酸链的碱基衍生物。
作为这样的光反应性碱基衍生物,可列举出例如:在胸腺嘧啶(T)或腺嘌呤(A)上通过连接体附加补骨脂素(psoralen)(例如,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.88,pp.5602-5606,July 1991)而成的物质。例如,使用在分离用探针中的与目标粒子结合的区域内的T或A上利用连接体附加补骨脂素而成的物质,形成包含目标粒子与发光探针和分离用探针的复合体之后,对该复合体照射254nm等近紫外光,则通过该补骨脂素而使形成了碱基对的目标粒子与分离用探针之间交联。
另外,工序(c)中回收的复合体包含目标粒子与发光探针和分离用探针并且与固相载体结合的情况下,使发光探针由复合体解离之后进行固液分离处理,由此能够使游离发光探针与包含目标粒子和分离用探针并且与固相载体结合的复合体分离并回收。分离回收的与固相载体结合的复合体也可以在供于以下的工序之前用适当的缓冲液等进行洗涤。
接着,作为工序(a’)~(d’)进行以下的工序。工序(d)中,调制在与游离发光探针分离并回收的目标粒子(使用分离用探针的情况下,为包含分离用探针和目标粒子的复合体)中重新添加发光探针的溶液的工序(a’);在该溶液中使前述目标粒子与发光探针结合而形成复合体的工序(b’);与没有结合目标粒子的发光探针分离并回收该复合体的工序(c’);以及,使发光探针由回收的复合体解离之后,将游离发光探针与目标粒子相互分离并回收的工序(d’)。这些工序(a’)~(d’)可以与前述工序(a)~(d)同样地进行。
工序(a’)~(d’)至少重复1次,优选重复2次以上。理论上,每实施1次工序(a’)~(d’),工序(d’)中回收了与工序(d)中回收的发光探针等量的发光探针。即,通过重复工序(a’)~(d’),能够使回收的发光探针的量增加重复的次数倍。
将工序(d)和(d’)中回收的游离发光探针全部合并作为一个测定试样溶液,供于使用了扫描分子计数法等一分子光检测技术的测定。为了通过重复工序(a’)~(d’)而得到信号的敏化效果,包括工序(d)和(d’)中回收的游离发光探针总量的一个测定试样溶液的体积,优选为与工序(d)中回收的游离发光探针的溶液的体积是相同程度的。
例如,各工序(d’)中,通过在包含工序(d)中回收的游离发光探针的溶液中进行发光探针由包含目标粒子和发光探针的复合体的解离;由此在全部的工序(d)和(d’)中,游离发光探针回收至同一溶液中。具体而言,如下进行工序(d’):向工序(c’)中回收的复合体中添加包含工序(d)中回收的游离发光探针的溶液,在该溶液中使发光探针由该复合体解离之后,使游离发光探针与目标粒子相互分离并回收。
另外,各工序(d’)中,将游离发光探针分别地以各个溶液的形式回收时,将全部的溶液进行混合之后,利用冷冻干燥法等不损害来自发光探针的光的方法进行浓缩处理,由此能够将包含工序(d)和全部的工序(d’)中回收的全部游离发光探针的一个测定试样溶液的体积设为与工序(d)中回收的游离发光探针的溶液体积相同程度。
之后,使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统,一边在前述测定试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置,一边检测由该光检测区域中的前述发光探针发出的光,通过这样的方法算出得到的测定试样溶液中的前述发光探针的分子数的工序。即,本发明的检测方法中,通过对与目标粒子暂时结合之后经过规定的处理解离的发光探针进行检测,能够间接地检测目标粒子。
本发明和本说明书中,共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测到光的微小区域,当由物镜照射照明光时,相当于该照明光聚光的区域。需要说明的是,在共聚焦显微镜中,所述区域尤其根据物镜与小孔之间的位置关系确定。
测定试样溶液中的发光探针是这样检测到的:照射其分光特性的最适波长的光而检测由该发光探针发出的光的光学的特性。需要说明的是,“检测发光探针的光学的特性”是指检测由该发光探针发出的特定波长的光信号。作为该光信号,有荧光强度、荧光偏光等。
本发明的检测方法中,通过扫描分子计数法计算测定试样溶液中的发光探针的分子数。
扫描分子计数法能够逐个检测溶液中分散或溶解的各个粒子,所以可以使用该信息定量地进行粒子的计数、测定试样溶液中的粒子的浓度或数密度的计算、或者取得与浓度或数密度相关的信息。即,通过扫描分子计数法,使通过光检测区域的粒子与检测到的光信号一一对应,一个一个地检测出粒子,所以能够进行溶液中分散并随机运动的粒子的计数,与以前相比较,能够精度良好地确定测定试样溶液中的粒子的浓度或数密度。例如,通过扫描分子计数法进行本发明的检测方法中的游离发光探针的检测,由发光探针发出的光逐个检测测定试样溶液中的粒子并计数其个数而确定粒子浓度的情况下,即便当测定试样溶液的发光探针的浓度低于能够利用荧光分光光度计、酶标仪测量的荧光强度确定的浓度时,也能够检测发光探针。
1分子测量等高灵敏度测定特别是扫描分子计数法中,存在固相载体等这类在溶液中的扩散运动比较缓慢的发光粒子的检测精度降低的情况。本发明中,即便在工序的途中使用固相载体的情况下,利用扫描分子计数法进行测定时,将由固相载体分离的游离状态的发光探针作为检测对象,由此即便在使用荧光1分子测定法的情况下,也能够排除固相载体的影响而高精度地检测发光探针。
图1为示意地表示本发明的检测方法中使用了分离用探针、与该分离用探针结合的固相载体的方式的图。首先,目标粒子1与发光探针2和分离用探针3结合,形成复合体。用分离用探针3使该复合体与固相载体4结合,通过洗涤而去除游离发光探针2之后,使发光探针2由该复合体解离,将游离发光探针2、与利用分离用探针3结合于固相载体4的目标粒子1分离并回收。之后,对于包含回收的目标粒子1的复合体添加新的发光探针2,使之与该复合体中的目标粒子1结合并洗涤之后,再度使发光探针2解离,将游离发光探针2、通过分离用探针3结合于固相载体4的目标粒子1分离并回收。通过重复该工序,由一分子的目标粒子1回收多个发光探针2。
实施例
接着,示出实施例等进一步详细说明本发明,但本发明不限于以下的实施例。
[参考例1]
进行显示如下现象的实验:相比于针对目标粒子使用一种发光探针的情况,使用多种发光探针的情况下,通过扫描分子计数法的测定中能够得到高的信号。
使用由序列号1所表示的碱基序列形成的多核苷酸(以下,目标核酸分子1)作为目标粒子,使用由序列号2~5所表示的碱基序列形成的、5’末端结合有荧光物质ATTO(注册商标)647N(ATTO-TEC公司制)的寡核苷酸(发光探针1~4)作为发光探针,使用由序列号6表示的碱基序列形成的、3’末端结合了生物素的寡核苷酸(生物素化探针1)作为分离用探针。将各个碱基序列示于表1中。目标核酸分子1中下划线分别表示发光探针和生物素化探针的结合区域。需要说明的是,目标核酸分子1、发光探针1~4和生物素化探针1全部为由天然型的核苷酸形成的多核苷酸。
[表1]
调制试样溶液1(100μL)并使Tris缓冲液(10mM Tris-HCl,400mM NaCl,0.05%TritonX-100)中,目标核酸分子1为1pM、发光探针1为800pM、生物素化探针1为200pM、聚(脱氧肌苷-脱氧胞苷)酸(Poly(deoxyinosinic-deoxycytidylic)acid)(Sigma-Aldrich公司)为0.1U/mL(1U为水中(光程为1cm)260nm的吸光度成为1.0的量)。另外,还调制了除了发光探针1、2、3、4分别为200pM(总计800pM)以外与上述试样溶液1同样的试样溶液2。进而,除了不包含目标核酸分子1以外,还分别与试样溶液1或2同样地准备了对照试样溶液1和2。
将这些试样溶液在95℃下加热5分钟之后,以0.1℃/分钟的速度使液温降低至25℃为止。添加0.1%BSA(牛血清白蛋白)1μL之后,加入用链亲合素涂布的磁珠(Invitrogen公司、目录序号:650-01)10μg,在25℃下使之边振荡边反应90分钟。接着,将试样溶液中的磁珠使用磁体通过500μL的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl,400mM NaCl,0.05%TritonX-100)洗涤3次之后,添加100μL的洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl,0.05%TritonX-100),在95℃下加热30秒之后,在冰上骤冷。用磁体使磁珠集中到容器侧壁之后,回收上清,通过扫描分子计数法测量其中包含的发光探针的分子数。
测定中,使用具备共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的一分子荧光测定装置MF-20(Olympus Corporation)作为光分析装置,对于上述的上清,获得按照时间顺序的光子计数数据。此时,激发光使用642nm的激光以1mW进行照射,检测光波长使用带通滤波器设为660~710nm。使试样溶液中的光检测区域的位置的移动速度为90mm/秒,将BIN TIME设为10μ秒,将测定时间设为2秒钟。另外,测定各进行5次,计算出其平均和标准偏差。光强度的测定后,由对于各上清取得的按照时间顺序的光子计数数据来计数按照时间顺序的数据中检测到的光信号。数据的利用移动平均法的平滑化中,一次平均的数据点为11个、将移动平均处理重复5次。另外,在拟合中,对于按照时间顺序的数据通过最小二乘法拟合高斯函数,确定(高斯函数中的)峰强度、峰宽(半值全宽)、相关系数。进而,峰的判断处理中,只将满足下述条件的峰信号判定为对应于发光探针的光信号:
20μ秒<峰宽<400μ秒
峰强度>1(光子/10μ秒)
相关系数>0.90
另一方面,不满足上述的条件的峰信号作为噪音而无视,将判定为对应于发光探针的光信号的信号的个数作为“峰数”进行计数。
将各试样溶液的峰数的计数结果示于图2中。图中,“发光探针×1(-)”为使用一种发光探针并且没有添加目标核酸分子1的对照试样溶液1的结果;“发光探针×1(+)”为使用一种发光探针并且添加了目标核酸分子1的试样溶液1的结果;“发光探针×4(-)”为使用4种发光探针并且没有添加目标核酸分子1的对照试样溶液2的结果;“发光探针×4(+)”为使用4种发光探针并且添加了目标核酸分子1的试样溶液2的结果。与使用了一种发光探针的情况相比较,使用了4种发光探针的情况下,信号成为约3.8倍(信号:(目标核酸分子1存在下的峰数)-(目标核酸分子1非存在下的峰数))。可以认为这是因为,通过使目标核酸分子1结合多个发光探针,在将游离发光探针洗涤去除之后,使发光探针由目标核酸分子1解离,从而由一分子的目标核酸分子产生多个信号源。
实施例1
将本发明的检测方法中的工序(a’)~(d’)的重复次数设为0次、1次或2次,考察该工序的重复次数对于目标粒子的检测灵敏度的影响。
使用由序列号7所示的碱基序列形成的天然型的多核苷酸(以下,目标核酸分子2)作为目标粒子;使用参考例1中使用的发光探针1作为发光探针;使用由序列号8所示的碱基序列形成的、3’末端结合了生物素的PNA形成的寡核苷酸(生物素化探针2)作为分离用探针。将目标核酸分子2和生物素化探针2的碱基序列示于表2中。目标核酸分子2中下划线分别表示发光探针1和生物素化探针2的结合区域。另外,生物素化探针2的PNA的碱基序列换成对应于PNA的天然型的核苷酸而表示。
[表2]
首先,调制3种试样溶液(100μL)(试样溶液A~C)并使Tris缓冲液(10mMTris-HCl,400mM NaCl,0.05%TritonX-100)中目标核酸分子2为1pM、发光探针1为200pM、生物素化探针2为200pM、聚(脱氧肌苷-脱氧胞苷)酸(Sigma-Aldrich公司)为0.1U/mL。另外,除了不包含目标核酸分子2以外,与试样溶液1同样地准备了3种对照试样溶液(对照试样溶液A~C)。
将这些试样溶液在95℃下加热5分钟之后,以0.1℃/分钟的速度使液温降低至25℃为止。添加0.1%BSA(牛血清白蛋白)1μL之后,加入用链亲合素涂布的磁珠(Invitrogen公司、目录序号:650-01)10μg,在25℃下使之边振荡边反应90分钟。接着,将试样溶液中的磁珠使用磁体通过500μL的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl,400mM NaCl,0.05%TritonX-100)洗涤3次之后,添加100μL的洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl,0.05%TritonX-100),在50℃下孵育5分钟。接着,用磁体使磁珠集中到容器侧壁之后,回收上清。将回收的上清作为“上清1”、将集中到容器侧壁的磁珠作为“磁珠1”。对于试样溶液A和对照试样溶液A,在该时点结束,将得到的上清1作为利用扫描分子计数法测定的测定试样溶液。对于试样溶液B、C以及对照试样溶液B、C,按照以后的工序进行。
接着,调制溶液(100μL)并使前述Tris缓冲液中发光探针1为200pM、聚(脱氧肌苷-脱氧胞苷)酸(Sigma-Aldrich公司)为0.1U/mL、BSA为0.001%,将磁珠1添加到该溶液并混合,边振荡边使得到的试样溶液在25℃下反应1小时。接着,将该试样溶液中的磁珠使用磁体通过500μL的前述洗涤缓冲液洗涤3次之后,加入前述上清1,在50℃下孵育5分钟。接着,用磁体使磁珠集中到容器侧壁之后,回收上清。将回收的上清作为“上清2”、将集中到容器侧壁的磁珠作为“磁珠2”。对于试样溶液B和对照试样溶液B,在该时点结束,将得到的上清2作为利用扫描分子计数法测定的测定试样溶液。对于试样溶液C和对照试样溶液C,按照以后的工序进行。
接着,调制溶液(100μL)并使前述Tris缓冲液中发光探针1为200pM、聚(脱氧肌苷-脱氧胞苷)酸(Sigma-Aldrich公司)为0.1U/mL、BSA为0.001%,将磁珠2添加到该溶液并混合,边振荡边使得到的试样溶液在25℃下反应1小时。接着,将该试样溶液中的磁珠使用磁体通过500μL的前述洗涤缓冲液洗涤3次之后,加入前述上清2,在50℃下孵育5分钟。接着,用磁体使磁珠集中到容器侧壁之后,回收上清。
将回收的上清作为“上清3”、将集中到容器侧壁的磁珠作为“磁珠3”。对于试样溶液C和对照试样溶液C,在该时点结束,将得到的上清3作为利用扫描分子计数法测定的测定试样溶液。
通过扫描分子计数法测量得到的测定试样溶液(上清1~3)中的发光探针1的分子数。测量除了将测定时间设为20秒以外,与参考例1同样地进行。将各测定试样溶液的峰数的计数结果示于图3中。图3中,“上清1”~“上清3”分别表示由试样溶液调制的测定试样溶液的峰数(目标粒子存在下的峰数)减去由对照试样溶液调制的测定试样溶液的峰数(目标粒子非存在下的峰数)而得到的峰数。结果,上清2的峰数多于上清1,并且上清3的峰数多于上清2。即,可以确认得到的峰数依赖于本发明的工序(a’)~(d’)的重复次数而变多。由这些结果可知,通过本发明的检测方法,可以由一分子的目标粒子产生多个信号源,因此相比以前能够缩短测量时间而且提高目标粒子的检测灵敏度。
产业上的可利用性
通过本发明的检测方法,能够高灵敏度地检测溶液中分散并随机运动粒子,所以本发明的检测方法能够利用于检测或定量解析试样中的粒子这样的生物化学、分子生物学、临床检查等领域中。
附图标记说明
1…目标粒子、2…发光探针、3…分离用探针、4…固相载体。
Claims (11)
1.一种目标粒子的检测方法,
其为使用发光探针间接地检测在溶液中分散并随机运动的粒子的方法,其包括如下工序:
进行如下(a)~(d):
(a)调制包含作为检测对象的目标粒子、和与所述目标粒子直接或间接地结合的一种以上的发光探针的溶液的工序;
(b)在所述溶液中形成包含所述目标粒子和所述发光探针的复合体的工序;
(c)从包含所述复合体的所述溶液中去除未与所述目标粒子结合的发光探针并回收所述复合体的工序;以及
(d)使所述发光探针由所述回收的复合体解离,将游离发光探针和目标粒子分离并分别回收的工序,
(e)将由以下的(a’)~(d’)构成的循环重复1次以上,之后,调制一个包含所述工序(d)和(d’)中回收的全部游离发光探针的测定试样溶液的工序;
(a’)调制在所述工序(d)中与游离发光探针分离并回收的目标粒子中重新添加了所述发光探针的溶液的工序;
(b’)在所述工序(a’)之后在所述溶液中形成包含所述目标粒子与所述发光探针的复合体的工序;
(c’)在所述工序(b’)之后,从所述溶液中分离未与所述目标粒子结合的发光探针并回收所述复合体的工序;
(d’)使所述发光探针由所述工序(c’)中回收的复合体解离,之后使游离发光探针和所述目标粒子相互分离并回收的工序;以及,
(f)使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统,一边在所述测定试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置,一边检测由该光检测区域中的所述发光探针发出的光,通过这样的方法算出所述测定试样溶液中的所述发光探针的分子数的工序。
2.根据权利要求1所述的目标粒子的检测方法,其中,在所述工序(d’)中,在包含所述工序(d)中回收的游离发光探针的溶液中进行所述发光探针由所述复合体的解离。
3.根据权利要求1所述的目标粒子的检测方法,其中,所述工序(e)中,将所述工序(d)和(d’)的各工序中回收的包含游离发光探针的溶液全部混合,之后进行浓缩处理,由此调制一个测定试样溶液。
4.根据权利要求1~3的任一项所述的目标粒子的检测方法,其中,
所述工序(a)中,向所述溶液中进一步添加相对于所述发光探针独立地与所述目标粒子结合的分离用探针;
所述工序(b)和(b’)中形成的复合体包含:所述目标粒子、所述发光探针和所述分离用探针;
所述工序(d)和(d’)中,以与所述分离用探针结合的复合体的状态,将目标粒子与游离发光探针分离并进行回收。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的目标粒子的检测方法,其中,所述目标粒子为核酸分子。
6.根据权利要求4所述的目标粒子的检测方法,其中,所述目标粒子为核酸分子,并且所述目标粒子与所述分离用探针的复合体的Tm值高于所述目标粒子与所述发光探针的复合体的Tm值。
7.根据权利要求6所述的目标粒子的检测方法,其中,所述工序(d)和(d’)中,将包含所述复合体的溶液的温度设为高于所述目标粒子与所述发光探针的复合体的Tm值、并且低于所述目标粒子与所述分离用探针的复合体的Tm值的温度,由此进行所述发光探针由所述复合体的解离。
8.根据权利要求4~7的任一项所述的目标粒子的检测方法,其中,
所述发光探针为结合了发光物质的天然型的寡核苷酸,
所述分离用探针为包含肽核酸的寡核苷酸。
9.根据权利要求4或5所述的目标粒子的检测方法,其中,在所述工序(d)之前进行下述工序:使所述工序(b)中形成的复合体中的、所述目标粒子与所述分离用探针之间形成至少一个共价键。
10.根据权利要求4~9的任一项所述的目标粒子的检测方法,其中,通过固液分离处理来进行所述工序(c)中的所述复合体的回收、以及所述工序(d)和(d’)中的游离发光探针的回收;所述固液分离处理使用了与所述分离用探针直接或间接地结合的固相载体。
11.根据权利要求1~10的任一项所述的目标粒子的检测方法,其中,所述一种以上的发光探针为两种以上的发光探针。
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