JPWO2013125124A1 - 標的粒子の検出方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、溶液中に分散しランダムに運動する標的粒子を、発光プローブを用いて間接的に、かつ高感度に検出する方法を提供する。本発明においては、(a)標的粒子、及び前記標的粒子と直接的又は間接的に結合する1種類以上の発光プローブを含む溶液を調製し、(b)前記溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体を形成させ、(c)前記複合体を含む溶液から前記標的粒子と結合していない発光プローブを分離して前記複合体を回収した後、(d)当該複合体から発光プローブを解離させて、遊離の発光プローブと標的粒子とを互いに分離して別個に回収し、(e)回収された標的粒子に再度発光プローブを結合させた後に解離させて、遊離の発光プローブと標的粒子とを互いに分離して回収する工程を繰り返した後、回収された遊離の発光プローブの全量を含む一の測定試料溶液を調製し、(f)当該測定試料溶液中の発光プローブの分子数を算出する。

Description

本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの、溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、標的粒子を検出する方法に関する。
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング(1光子検出)も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となってきている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。特に、蛍光相関分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS)、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis:FIDA)等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域(顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される)の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且つ微量でよく(一回の測定で使用される量は、たかだか数十μL程度)、測定時間も大幅に短縮される(一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される)。
最近、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系等の、溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、当該微小領域内を横切る発光粒子(光を発する粒子)を個別に検出する新規な方式の光分析技術(走査分子計数法)が提案されている(例えば、特許文献1〜3参照)。走査分子計数法は、具体的には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。
走査分子計数法の光検出機構自体は、FIDA等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているため、FIDA等と同様に試料溶液の量は微量(例えば、数十μL程度)であってよく、また測定時間も短くて済む。一方で、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理を要するFIDA等と異なり、このような統計的処理が実行されない。このため、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がFIDA等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。つまり、発光プローブによって標識された試料溶液中の標的粒子(観測対象粒子)を、走査分子計数法を利用して検出することにより、試料溶液中の標的粒子の濃度又は数密度が非常に低い場合であっても、標的粒子の状態又は特性を検出し解析することができる(例えば、特許文献4参照)。
国際公開第2011/108369号 国際公開第2011/108370号 国際公開第2011/108371号 国際公開第2012/014778号
検出対象とする標的粒子に対して発光プローブを結合させることによって間接的に標的粒子を検出する場合、通常は一分子の標的粒子に対して一分子の発光プローブを結合させる。つまり、発光プローブで標識した標的粒子を走査分子計数法等の一分子光検出技術を用いて検出する場合には、一分子の標的粒子から一つのシグナル源しか発生しない。このため、試料溶液中の標的粒子の濃度が非常に低い場合には、シグナルが低くなるため、長時間の測定が必要となったり、高い検出感度に到達しないという課題があった。
本発明は、発光プローブを用いて間接的に標的粒子を検出する方法において、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの、溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた一分子光検出技術を用いて、標的粒子を高感度に検出する方法を提供することを目的としている。
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的粒子と結合した発光プローブを、遊離の発光プローブと分離して回収した後、当該標的粒子と解離させて回収するという工程を複数回繰り返すことにより、一分子の標的粒子から複数のシグナル源(発光プローブ)を発生させることができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の標的粒子の検出方法は下記(1)〜(11)である。
(1)溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を、発光プローブを用いて間接的に検出する方法であって、
(a)検出の対象である標的粒子、及び、前記標的粒子と直接的又は間接的に結合する1種類以上の発光プローブを含む溶液を調製する工程;
(b)前記溶液中で、前記標的粒子及び前記発光プローブを含む複合体を形成する工程;
(c)前記複合体を含む前記溶液から、前記標的粒子に結合していない発光プローブを除去して、前記複合体を回収する工程;
(d)前記回収された複合体から前記発光プローブを解離させ、遊離した発光プローブ、及び標的粒子を分離して、別個に回収する工程;
を行い、
(e)以下の工程:
(a’)前記工程(d)において遊離の発光プローブと分離して回収された標的粒子に、前記発光プローブを新たに添加した溶液を調製する工程;
(b’)前記工程(a’)の後、前記溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体を形成する工程;
(c’)前記工程(b’)の後、前記溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記複合体を回収する工程;
(d’)前記工程(c’)において回収された複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する工程;
からなるサイクルを1回以上繰り返した後、前記工程(d)及び(d’)において回収された遊離の発光プローブの全量を含む一の測定試料溶液を調製する工程;並びに、
(f)前記測定試料溶液中の前記発光プローブの分子数を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記発光プローブから発される光を検出する方法により算出する工程と、
を含む、標的粒子の検出方法。
(2) 前記工程(d’)において、前記複合体からの前記発光プローブの解離を、前記工程(d)において回収された遊離の発光プローブを含む溶液中で行う、前記(1)の標的粒子の検出方法。
(3) 前記工程(e)において、前記工程(d)及び(d’)の各工程において回収された遊離の発光プローブを含む溶液を全て混合した後、濃縮処理を行うことにより、一の測定試料溶液を調製する、前記(1)の標的粒子の検出方法。
(4) 前記工程(a)において、前記溶液にさらに、前記発光プローブとは独立して前記標的粒子と結合する分離用プローブを添加し、
前記工程(b)及び(b’)において形成される複合体が、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離用プローブとを含み、
前記工程(d)及び(d’)において、前記分離用プローブと結合した複合体の状態で、標的粒子を、遊離の発光プローブと分離して回収する、前記(1)〜(3)のいずれかの標的粒子の検出方法。
(5) 前記標的粒子が核酸分子である、前記(1)〜(4)のいずれかの標的粒子の検出方法。
(6) 前記標的粒子が核酸分子であり、かつ前記標的粒子と前記分離用プローブとの複合体のTm値が、前記標的粒子と前記発光プローブとの複合体のTm値よりも高い、前記(4)の標的粒子の検出方法。
(7) 前記工程(d)及び(d’)において、前記複合体を含む溶液の温度を、前記標的粒子と前記発光プローブとの複合体のTm値よりも高く、かつ前記標的粒子と前記分離用プローブとの複合体のTm値よりも低い温度にすることによって、前記複合体からの前記発光プローブの解離を行う、前記(6)の標的粒子の検出方法。
(8) 前記発光プローブが、発光物質が結合した天然型のオリゴヌクレオチドであり、前記分離用プローブが、ペプチド核酸からなるオリゴヌクレオチドである、前記(4)〜(7)のいずれかの標的粒子の検出方法。
(9) 前記工程(d)の前に、前記工程(b)において形成された複合体中の、前記標的粒子と前記分離用プローブとの間に少なくとも1の共有結合を形成させる工程を行う、前記(4)又は(5)の標的粒子の検出方法。
(10) 前記工程(c)における前記複合体の回収、並びに前記工程(d)及び(d’)における遊離の発光プローブの回収を、前記分離用プローブと直接的又は間接的に結合する固相担体を用いた固液分離処理により行う、前記(4)〜(9)のいずれかの標的粒子の検出方法。
(11) 前記1種以上の発光プローブが、2以上の発光プローブである、前記(1)〜(10)のいずれかの標的粒子の検出方法。
本発明の標的粒子の検出方法は、発光プローブを用いて間接的に標的粒子を検出する方法において、標的粒子と結合した発光プローブを当該標的粒子から解離させて回収する、という工程を繰り返すことにより、一分子の標的粒子から発生するシグナル源を、前記工程の繰り返しの回数分倍増させることができる。このため、本発明の標的粒子の検出方法により、標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、高いシグナルが得られるため、走査分子計数法等の一分子光検出技術を用いて検出する場合でも、高感度にかつより短時間で標的粒子を検出することができる。
本発明の標的粒子の検出方法の一態様を模式的に示した図である。 参考例1において、各試料溶液のピーク数の計数結果を示した図である。 実施例1において、試料溶液から調製された測定試料溶液のピーク数(標的粒子存在下におけるピーク数)から、対照試料溶液から調製された測定試料溶液のピーク数(標的粒子非存在下におけるピーク数)を差し引いたピーク数の計数結果を示した図である。
本発明の標的粒子の検出方法(以下、単に「本発明の検出方法」ということがある)は、溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を、発光プローブを用いて間接的に検出する方法であって、下記工程(a)〜(f)を有することを特徴とする。
(a)検出の対象である標的粒子、及び、前記標的粒子と直接的又は間接的に結合する1種類以上の発光プローブを含む溶液を調製する工程;
(b)前記溶液中で、前記標的粒子及び前記発光プローブを含む複合体を形成する工程;
(c)前記複合体を含む前記溶液から、前記標的粒子に結合していない発光プローブを除去して、前記複合体を回収する工程;
(d)前記回収された複合体から前記発光プローブを解離させ、遊離した発光プローブ、及び標的粒子を分離して、別個に回収する工程;
を行い、
(e)以下の工程:
(a’)前記工程(d)において遊離の発光プローブと分離して回収された標的粒子に、前記発光プローブを新たに添加した溶液を調製する工程と;
(b’)前記工程(a’)の後、前記溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体を形成する工程と;
(c’)前記工程(b’)の後、前記溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記複合体を回収する工程;
(d’)前記工程(c’)において回収された複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する工程;
からなるサイクルを1回以上繰り返した後、前記工程(d)及び(d’)において回収された遊離の発光プローブの全量を含む一の測定試料溶液を調製する工程;並びに、
(f)前記測定試料溶液中の前記発光プローブの分子数を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記発光プローブから発される光を検出する方法により算出する工程。
本発明及び本願明細書において、「溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子(発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい)であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
本発明の検出方法の検出の対象である標的粒子は、溶液中に分散しランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、特に限定されるものではない。例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸、若しくはこれらの凝集体などの生体分子;ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物;又は非生物学的な粒子(例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイド等など)等が挙げられる。核酸は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、cDNAのように人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、DNAやRNAのような天然型ヌクレオチド(天然に存在するヌクレオチド)の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Bridged nucleic acid(BNA)や、天然型ヌクレオチドの4’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの2’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやHexitol Nucleic Acid(HNA)、ペプチド核酸(PNA)等が挙げられる。
本発明の検出方法における標的粒子としては、核酸分子又は核酸類似物質であることが好ましい(本明細書においては、これらを「核酸分子等」と呼ぶことがある)。核酸分子又は核酸類似物質としては、2本鎖核酸分子であってもよく、1本鎖核酸分子であってもよい。具体的には、例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウイルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子が挙げられる。中でも、標的粒子として、例えば、マイクロRNA、siRNA、mRNA、hnRNA、ゲノムDNA、PCR増幅等による合成DNA、RNAから逆転写酵素を用いて合成されたcDNA等が好ましい。
また、本発明において用いられる発光プローブは、標的粒子と、特異的又は非特異的に結合(結合には、吸着を含む。以下同様)する物質であって、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系を用いた場合に検出可能な光を発するものであれば、特に限定されるものではない。例えば、標的粒子と特異的又は非特異的に結合する物質に、発光物質を結合させたものであってもよい。発光物質としては、典型的には蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する物質であってもよい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、FCSやFIDA等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。
また、本発明において用いられる発光プローブは、標的粒子と直接結合するものであってもよく、他の物質を用いて間接的に結合するものであってもよい。例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質である場合には、標的粒子と直接結合する発光プローブとしては、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質等の発光物質を結合させたもの、蛍光物質等の発光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する色素分子等が挙げられる。当該オリゴヌクレオチドとしては、DNAであってもよく、RNAであってもよく、cDNAのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。また、標的粒子がタンパク質である場合には、標的粒子と直接結合する発光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体や、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを、蛍光物質等の発光物質で標識したものを発光プローブとして用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への発光物質の結合は、常法により行うことができる。
本発明において用いられる発光プローブは、標的粒子と非特異的に結合するものであってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する発光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよく、標的粒子以外の他の物質と全く結合しないものである必要はない。従って、例えば、標的粒子が核酸分子である場合には、発光プローブとして用いる、発光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、当該標的粒子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、当該標的粒子の部分塩基配列と1〜数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
本発明においては、一分子の標的粒子に一分子の発光プローブを結合させてもよく、一分子の標的粒子に複数分子の発光プローブを結合させてもよい。一分子の標的粒子に複数の発光プローブを結合させる場合、これらの発光プローブは、互いに独立して標的粒子と結合するように設計することができる。一分子の標的粒子に、1種類の発光プローブを複数分子結合させてもよく、一分子の標的粒子に、複数種類の発光プローブを結合させてもよい。複数種類の発光プローブを結合させる場合、それぞれの発光プローブは、互いに放出される光の発光特性が異なる物質で標識されたプローブであってもよいが、低濃度の検出対象が発光プローブと結合した際の検出感度を上げる観点からは、同種の発光物質が結合したプローブであることが好ましい。
具体的には、工程(a)は、まず、標的粒子、及び発光プローブを溶媒に添加して、両者を含む溶液を調製する。該溶媒は、標的粒子及び発光プローブの特性を損なわない溶媒であれば、特に限定されるものではない。典型的には水を溶媒とするが、ホルムアミド等の有機溶媒その他の任意の液体を溶媒としてもよい。具体的には、該溶媒は、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、PBS(リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4)等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
溶液に添加する発光プローブの濃度は特に限定されるものではないが、検出方法において標的粒子の検出感度を高めるため、予想される標的粒子の濃度よりも発光プローブの濃度のほうが高くなるように、両者を含む溶液を調製することが好ましい。本発明の方法においては、以降の工程(c)等において、標的粒子と結合した発光プローブから、標的粒子と結合していない遊離の発光プローブを除去する。このため、工程(a)において過剰量の発光プローブを添加した場合でも、精度よく標的粒子を検出することができる。
次いで、工程(b)として、前記溶液中で、前記標的粒子及び前記発光プローブを含む複合体を形成する。標的粒子及び発光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、両者を含む溶液を調製した後、必要に応じて所定時間当該溶液をインキュベートするだけで、当該溶液中で、標的粒子及び発光プローブを含む複合体を形成することができる。
一方で、標的粒子や発光プローブが2本鎖構造をとる核酸分子や核酸類似物質である場合には、溶液中の核酸分子等を変性させた状態で、標的粒子と発光プローブを会合させることが好ましい。なお、「核酸分子等を変性させる」とは、核酸分子等の分子内の塩基対を解離させることを意味する。例えば、2本鎖核酸分子を1本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、発光プローブがPNA等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が2本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、当該発光プローブと標的粒子とを含む複合体を形成することができることがあり、この場合には核酸分子等を変性することなく複合体を形成することができる。
核酸分子等の変性処理としては、高温処理による変性(熱変性)又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、当該溶液を高温処理することにより、当該溶液中の核酸分子等を変性することができる。一般的には、DNAで90℃、RNAでは70℃で数秒間から2分間程度、保温することによって、核酸分子等を変性させることができるが、標的粒子である核酸分子等の塩基の長さ等により、変性温度は千差万別であるため、変性することが可能であれば、上記の保温温度、保温時間に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
必要に応じて変性させた後、前記溶液中の標的粒子である核酸分子等と発光プローブを会合させて、両者を含む複合体を形成する。核酸分子等の熱変性を行った場合には、変性処理後、当該溶液の温度を、標的粒子及び発光プローブが特異的にハイブリダイズできる温度(特異的会合条件)にまで低下させることにより、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。好ましくは、両者を含む溶液の温度を、複合体中のハイブリダイズしている領域についてのTm値±3℃の温度範囲にまで低下させる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、当該溶液の塩濃度を、核酸分子等と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。
なお、2本の1本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した2本の1本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、2本の1本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
このように、特異的会合条件は、標的粒子や発光プローブの種類ごとに異なり、実験的に決定されるものであるが、標的粒子が核酸分子等である場合には、通常、Tm値(融解温度)で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー/プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、発光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のTm値(2本鎖DNAの50%が1本鎖DNAに解離する温度)を算出することができる。温度がTm値近傍の値である条件、例えばTm値±3℃程度である条件を、特異的会合条件とすることができる。算出されたTm値近傍において実験的に融解曲線を求めることにより、より詳細に特異的会合条件を決定することもできる。
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、複合体を形成させる際に、前記溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、前記溶液の温度を70℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該溶液の液温を、0.05℃/秒以上の降温速度で低下させることができる。
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め前記溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、1種のみを添加してもよく、2種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
工程(b)の後、工程(c)として、前記複合体を含む前記溶液から、前記標的粒子に結合していない発光プローブを除去して、前記複合体を回収する。発光プローブで標識された標的粒子を個別に検出する光分析技術を用いた本発明の方法においては、標的粒子との複合体形成に至らなかった遊離の発光プローブ等からの光が、標的粒子と結合した発光プローブからの光と区別なく検出されてしまうと、標的粒子の検出精度が悪化してしまう。そこで、工程(c)において、当該遊離の発光プローブ等(複合体以外の、溶液中に存在する物質)を、前記溶液から除去する。
工程(c)において、標的粒子と結合していない発光プローブを除去して前記複合体を回収する具体的手段は、特に限定されるものではなく、大きさ又は分子量、任意の物質に対する親和性、帯電状態等の違いを利用して複数の物質を物理的に分離する際に当該技術分野で通常行われる物質の分離方法の中から、適宜選択することができる。当該分離方法としては、例えば、吸着・抽出又は洗浄を含む操作が挙げられる。具体的には、クロマトグラフィー(親水/疎水性クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど)、限外濾過、電気泳動、相分離、遠心分離、溶媒抽出、フィルター吸着等が挙げられる。
工程(c)においては、発光プローブとは独立して標的粒子と結合する分離用プローブを利用して、標的粒子と結合していない発光プローブを除去して前記複合体を回収することもできる。具体的には、工程(a)において、前記溶液にさらに分離用プローブを添加しておき、工程(b)において、標的粒子と発光プローブと分離用プローブとを含む複合体を形成させておく。次いで工程(c)において、当該複合体中の分離用プローブとその他の物質との相互作用を利用して複合体を選択的に保持し、標的粒子と結合していない発光プローブを除去する。
分離用プローブは、発光プローブとは独立して、標的粒子と特異的又は非特異的に結合(吸着を含む。以下同様)する物質であれば、特に限定されるものではない。当該分離用プローブは、標的粒子との間に他の物質介在させて間接的に標的粒子と結合するものであってもよいが、標的粒子と直接結合するものが好ましい。分離用プローブとして使用可能な、標的粒子と直接、特異的又は非特異的に結合する物質としては、上記の発光プローブの説明で挙げられたもののうち、発光物質が結合する前のものと同様である。例えば、標的粒子が核酸分子等である場合には、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、標的粒子がタンパク質である場合には、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターが、分離用プローブである。
本発明において用いられる分離用プローブは、固相担体と結合する部位を有しており、標的粒子と結合した状態でさらに固相担体と直接的又は間接的に結合するものである。当該分離用プローブを用いた場合には、工程(c)における複合体の回収、及び以降の工程(d)における遊離の発光プローブの回収を、分離用プローブと直接的又は間接的に結合する固相担体を用いた固液分離処理により、より簡便に行うことができる。
分離プローブ用の固相担体としては、分離用プローブと結合する部位を備えている固体であれば、その形状、材質等は特に限定されるものではない。例えば、ビーズ等の、水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子であってもよく、メンブレンであってもよく、容器やチップ基板等であってもよい。固相担体としては具体的には、例えば、磁気ビーズ、シリカビーズ、アガロースゲルビーズ、ポリアクリルアミド樹脂ビーズ、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ等のプラスチックビーズ、セラミックスビーズ、ジルコニアビーズ、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート等が挙げられる。
例えば、分離用プローブがオリゴヌクレオチドの場合、当該オリゴヌクレオチド中の、標的粒子とハイブリダイズする領域以外の領域とハイブリダイズする部分が表面に露出した状態で、当該オリゴヌクレオチドを結合させることが可能なビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、分離用プローブが、固相担体と結合する部位として、ビオチン(biotin)を有している場合、アビジンやストレプトアビジンが、ビオチンとの結合特性を保持したまま表面に結合させることが可能なビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、分離用プローブ中の固相担体と結合する部位が、グルタチオン(Glutathione)、DNP(dinitorophenol)、ジゴキシゲニン(digoxigenin、Dig)、ジゴキシン(digoxin)、2以上の糖からなる糖鎖、4以上のアミノ酸からなるポリペプチド、オーキシン、ジベレリン、ステロイド、タンパク質、親水性有機化合物、及び、それらの類縁体等である場合も同様に、これらの物質に対する抗体、抗原、リガンド、若しくはレセプターが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。なお、固相担体は、分離用プローブと非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。
具体的には、複合体を含む前記溶液に固相担体を接触させ、必要に応じてインキュベートすることにより、当該溶液中の標的粒子と発光プローブと分離用プローブとを含む複合体が、当該複合体中の分離用プローブを介して固相担体と結合する。その後、固液分離処理を行うことにより、固相担体と結合した複合体を、遊離の発光プローブ等の、液相に存在する標的粒子と結合していない発光プローブと分離して回収することができる。
固液分離処理としては、溶液中の固相担体を液体成分とは分離して回収可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、固液分離処理に用いられる公知の処理の中から適宜選択して用いることができる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、固相担体を含む懸濁液に対して遠心分離処理を行い、固相担体を沈殿させ、上清を除去してもよく、当該溶液を濾紙又は濾過フィルターを用いて濾過し、濾紙等の表面に残留した固相担体を回収してもよい。また、固相担体が磁気ビーズである場合には、当該溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、該容器の該磁石に最も近接する面に固相担体を収束させた後、上清を除去してもよい。内壁が分離用プローブと結合する物質で被覆された容器が固相担体である場合、前記複合体を含む溶液を当該容器内に注入し、必要に応じてインキュベートした後、当該容器内の液体を排出する。なお、固相担体がメンブレンやフィルターの場合、前記複合体を含む溶液を当該固相担体に透過させることにより、固相担体と前記複合体との結合と、標的粒子と結合していない発光プローブからの前記複合体の分離回収を、一の操作で行うことができる。
本発明においては、工程(a)において、固相担体を、標的粒子と発光プローブと分離用プローブと共に予め溶液に添加しておき、工程(b)において、固相担体と結合した標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含む複合体を形成し、その後に固液分離処理することにより、固相担体と結合した前記複合体を、標的粒子と結合していない発光プローブ等から分離して回収してもよい。また、工程(a)において、予め固相担体と結合した状態の分離用プローブと、標的粒子と発光プローブとを添加して溶液を調製してもよい。なお、この際に用いる分離用プローブは、固相担体と可逆的に結合していてもよく、不可逆的に結合していてもよい。
回収された固相担体に適当な溶媒を添加することにより、固相担体と結合した複合体を含む溶液が調製される。回収された固相担体は、これを含む溶液として、工程(d)に供される。該溶媒は、後の工程において発光プローブから放出される光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、PBS(リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4)等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
回収された固相担体は、工程(d)の前に、適当な溶媒により洗浄してもよい。洗浄により、遊離の発光プローブをより厳密に、固相担体と結合した複合体から分離して除去することができる。固相担体を洗浄する溶媒は、複合体と固相担体との結合を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、工程(d)に供される固相担体と結合した複合体を含む溶液の調製に用いる溶媒と同種であってもよく、異なる溶媒であってもよい。
その後、工程(d)として、工程(c)において回収された複合体から前記発光プローブを解離させ、遊離した発光プローブ及び標的粒子を分離して、別個に回収する。回収された遊離の発光プローブは、後の工程において、走査分子計数法等の一分子光検出技術を用いた測定の試料とする。また、回収された標的粒子は、以降の工程で、再度新たな発光プローブと結合させる。
複合体中の発光プローブを解離させる方法は、当該複合体中の標的粒子と発光プローブとの結合を解消し得る方法であれば特に限定されるものではない。
例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質からなるオリゴヌクレオチドであり、発光プローブ中の、標的粒子と結合する部位が、核酸分子又は核酸類似物質からなる、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである場合、前記複合体を含む溶液の温度を、標的粒子と発光プローブの特異的会合条件よりも充分に高くしたり、前記複合体を含む溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブの特異的会合条件よりも充分に低くすることにより、発光プローブと標的粒子の結合を解消させ、前記複合体から発光プローブを解離させることができる。
工程(c)において回収された複合体が、標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含んでいる場合には、工程(d)では、前記複合体中の標的粒子と発光プローブとの結合のみを解消することによって、当該複合体から発光プローブを解離させることが好ましい。標的粒子と分離用プローブとの結合を維持することにより、標的粒子を、分離用プローブと結合した複合体として、遊離の発光プローブから分離回収することができる。工程(c)において回収された複合体が、標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含んでおり、かつ固相担体と結合している場合も同様である。
例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質からなるオリゴヌクレオチドであり、尚且つ、発光プローブ及び分離用プローブ中の、標的粒子と結合する部位も、核酸分子又は核酸類似物質からなるオリゴヌクレオチドであって、前記標的粒子とハイブリダイズするものである場合、標的粒子と分離用プローブとの複合体のTm値を、標的粒子と発光プローブとの複合体のTm値よりも高くなるように、発光プローブ及び分離用プローブを設計することが好ましい。この場合、標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含む複合体を含む溶液の温度を、標的粒子と発光プローブとの複合体のTm値よりも高く、かつ標的粒子と分離用プローブとの複合体のTm値よりも低い温度にすることにより、標的粒子と分離用プローブとの結合を維持しつつ、標的粒子から発光プローブを解離させることができる。
標的粒子と分離用プローブとの複合体のTm値を、標的粒子と発光プローブとの複合体のTm値よりも高める方法としては、例えば、発光プローブを、発光物質が結合した天然型のオリゴヌクレオチドとし、分離用プローブ中の、標的粒子と結合する領域を、天然型のヌクレオチドよりも強い塩基対を形成し得る核酸類似物質を少なくとも一部に含むオリゴヌクレオチドとする方法が挙げられる。天然型ヌクレオチドよりも安定して結合が可能な核酸類似物質としては、例えば、BNA、PNA等が挙げられる。
中でも、発光プローブを、発光物質が結合した天然型のオリゴヌクレオチドとし、分離用プローブを、PNAからなるオリゴヌクレオチドとすることが好ましい。PNAは負電荷を持たず、天然型のオリゴヌクレオチド同士では会合体を形成し難いほどに溶液中の塩濃度が低い場合でも、PNAからなるオリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドと結合し会合体を形成できる場合があるためである。そこで、標的粒子が天然型のオリゴヌクレオチドの場合、発光プローブを発光物質が結合した天然型のオリゴヌクレオチドとし、分離用プローブをPNAからなるオリゴヌクレオチドとした場合には、標的粒子と発光プローブと分離用プローブとの結合体を形成した後、溶液中の塩濃度を低下させる、又は溶液から塩を除去することにより、発光プローブを、分離用プローブと結合した標的粒子から容易に遊離させることができる。
その他、発光プローブ及び分離用プローブ中の、標的粒子と結合する領域を、共に天然型のオリゴヌクレオチドとする場合には、発光プローブ中の、標的粒子と結合する領域よりも、分離用プローブ中の、標的粒子と結合する領域を充分に長くしたり、発光プローブ中の、標的粒子と結合する領域よりも、分離用プローブ中の、標的粒子と結合する領域のGC含有率を高めることで、いずれも、それぞれの領域のTm値を互いに有意に異ならせる方法も挙げられる。
工程(d)の前に、工程(b)において形成された複合体中の、標的粒子と分離用プローブとの間に少なくとも1の共有結合を形成させておくこともできる。標的粒子と分離用プローブとを共有結合によって架橋することによって、以降の工程において標的粒子と分離用プローブの結合を安定化することができ、複合体からの発光プローブの解離を容易に行うことができる。当該共有結合を形成させた場合には、例えば、標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含む複合体を、発光プローブが標的粒子と完全にハイブリダイズできなくなるほどストリンジェンシーの厳しい溶液条件で洗浄することにより、標的粒子と分離用プローブの結合を安定に維持しつつ、発光プローブを解離させることができる。標的粒子と分離用プローブとの間の共有結合形成は、工程(c)の前に行ってもよく、工程(c)の後に行ってもよい。
共有結合の形成方法は、塩基対を形成している2本の1本鎖核酸分子同士を連結する共有結合を形成可能であれば、特に限定されるものではなく、核酸分子同士をクロスリンクする際に用いられる公知の手法の中から適宜選択して行うことができる。本発明においては、光化学的反応により、共有結合を形成することが好ましい。光化学的反応とは、特定の波長の光を照射し、その光エネルギーを利用して行われる反応を意味する。光化学的反応により共有結合を形成する方法は、溶液に特定の波長の光を照射することによって2本鎖核酸分子の核酸鎖間に共有結合を形成させることができるため、溶液の組成等の条件を変動させる必要がない。このため、溶液中の複合体に対して、共有結合形成以外に与える影響を抑えることができ、かつ操作も簡便である。
例えば、標的粒子と結合する領域内の少なくとも一塩基が、光反応性塩基誘導体に置換されている分離用プローブを用いることにより、光化学反応によって、標的粒子と分離用プローブの間に、当該光反応性塩基誘導体を介した共有結合を形成することができる。分離用プローブ中の光反応性塩基誘導体に置換される塩基は、標的粒子とハイブリダイズする領域中の塩基であれば特に限定されるものではない。また、1塩基のみが光反応性塩基誘導体に置換されていてもよく、2塩基以上が光反応性塩基誘導体に置換されていてもよい。
ここで、光反応性塩基誘導体とは、特定の波長の光が照射されることにより、有機合成反応における反応性が活性化される部位(光反応性部位)を有し、天然のヌクレオチドと同様に核酸鎖を形成することが可能な塩基誘導体を意味する。
このような光反応性塩基誘導体としては、例えば、チミン(T)又はアデニン(A)にリンカーを介してソラーレン(psoralen)(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 5602-5606, July 1991)を付加したものが挙げられる。例えば、分離用プローブ中の標的粒子と結合する領域内のT又はAに、リンカーを介してソラーレンを付加したものを用い、標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含む複合体を形成した後、当該複合体に254nm等の近紫外光を照射すると、このソラーレンを介して塩基対を形成している標的粒子と分離用プローブとの間が架橋される。
また、工程(c)において回収された複合体が、標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含んでおり、かつ固相担体と結合している場合には、発光プローブを複合体から解離させた後、固液分離処理を行うことにより、遊離の発光プローブと、標的粒子と分離用プローブを含み、かつ固相担体と結合している複合体とを、分離して回収することができる。分離回収された固相担体と結合している複合体は、次の工程に供する前に、適当なバッファー等により洗浄してもよい。
次いで、工程(a’)〜(d’)として、以下の工程を行う。工程(d)において遊離の発光プローブと分離して回収された標的粒子(分離用プローブを用いた場合には、分離用プローブと標的粒子を含む複合体)に、発光プローブを新たに添加した溶液を調製する工程(a’);当該溶液中で前記標的粒子と発光プローブとを結合させて複合体を形成する工程(b’);標的粒子と結合していない発光プローブと分離して当該複合体を回収する工程(c’);及び、回収された複合体から発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと標的粒子とを、互いに分離して回収する工程(d’)。これら工程(a’)〜(d’)は、前記工程(a)〜(d)と同様にして行うことができる。
工程(a’)〜(d’)は、少なくとも1回、好ましくは2回以上繰り返す。理論上は、工程(a’)〜(d’)を1回実施するごとに、工程(d’)では、工程(d)において回収された発光プローブと等量の発光プローブが回収される。つまり、工程(a’)〜(d’)を繰り返すことにより、回収された発光プローブの量を繰り返しの回数分倍増させることができる。
工程(d)及び(d’)において回収された遊離の発光プローブは、全量まとめて一の測定試料溶液として、走査分子計数法等の一分子光検出技術を用いた測定に供される。工程(a’)〜(d’)を繰り返すことによるシグナルの増感効果を得るために、工程(d)及び(d’)において回収された遊離の発光プローブの全量を含む一の測定試料溶液の容量は、工程(d)において回収された遊離の発光プローブの溶液の容量と同程度であることが好ましい。
例えば、各工程(d’)において、標的粒子と発光プローブを含む複合体からの発光プローブの解離を、工程(d)において回収された遊離の発光プローブを含む溶液中で行うことにより、全ての工程(d)及び(d’)において、遊離の発光プローブは同じ溶液中に回収される。具体的には、工程(d’)を、工程(c’)において回収された複合体に、工程(d)において回収された遊離の発光プローブを含む溶液を添加し、当該溶液中で当該複合体から発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと標的粒子とを、互いに分離して回収する。
また、各工程(d’)において、遊離の発光プローブをそれぞれ別個の溶液として回収した場合には、全ての溶液を混合した後、凍結乾燥法等の発光プローブからの発光を損なわない方法で濃縮処理を行うことにより、工程(d)及び全工程(d’)において回収された遊離の発光プローブの全量を含む一の測定試料溶液の容量を、工程(d)において回収された遊離の発光プローブの溶液の容量と同程度にすることができる。
その後、得られた測定試料溶液中の前記発光プローブの分子数を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記発光プローブから発される光を検出する方法により算出する。つまり、本発明の検出方法においては、標的粒子に一旦結合させた後、所定の処理を経て解離させた発光プローブが検出されることによって、標的粒子が間接的に検出される。
本発明及び本願明細書において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
測定試料溶液中の発光プローブは、その分光特性に最適な波長の光を照射し、当該発光プローブから発される光の光学的特性を検出することにより検出できる。なお、「発光プローブの光学的特性を検出する」とは、当該発光プローブから発される特定の波長の光シグナルを検出することを意味する。当該光シグナルとしては、蛍光強度や蛍光偏光等がある。
本発明の検出方法においては、走査分子計数法により、測定試料溶液中の発光プローブの分子数を算出する。
走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっているので、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを1対1に対応させて粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。例えば、本発明の検出方法における遊離した発光プローブの検出を走査分子計数法により行い、発光プローブが発する光によって測定試料溶液中の粒子を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する場合には、測定試料溶液の発光プローブの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、発光プローブを検出可能である。
1分子計測等の高感度測定、特に走査分子計数法では、固相担体等のような、溶液中における拡散運動が比較的遅い発光粒子の検出精度が低くなる場合がある。本発明においては、工程の途中で固相担体を用いた場合であっても、走査分子計数法による測定時には固相担体から分離された遊離の状態の発光プローブを検出対象とすることにより、蛍光1分子測定法を用いた場合であっても、固相担体の影響を排除して高精度に発光プローブを検出することができる。
図1は、本発明の検出方法のうち、分離用プローブと、当該分離用プローブと結合する固相担体とを用いた態様を模式的に示した図である。まず、標的粒子1と、発光プローブ2と、分離用プローブ3とが結合し、複合体を形成する。当該複合体を、分離用プローブ3を用いて固相担体4に結合させ、洗浄により遊離の発光プローブ2を除去した後、当該複合体から発光プローブ2を解離させ、遊離の発光プローブ2と、分離用プローブ3を介して固相担体4と結合した標的粒子1とが分離回収される。その後、回収された標的粒子1を含む複合体に、新たな発光プローブ2を添加し、当該複合体中の標的粒子1と結合させて洗浄後に、再度発光プローブ2を解離させ、遊離の発光プローブ2と、分離用プローブ3を介して固相担体4と結合した標的粒子1とを分離して回収する。当該工程を繰り返すことにより、一分子の標的粒子1から複数の発光プローブ2が回収される。
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
[参考例1]
標的粒子に対して発光プローブを1種類用いた場合よりも、複数種類用いた場合の方が、走査分子計数法による測定において高いシグナルが得られることを示す実験を行った。
標的粒子として、配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド(以下、標的核酸分子1)を用い、発光プローブとして、配列番号2〜5に示す塩基配列からなり、5’末端に蛍光物質ATTO(登録商標) 647N(ATTO−TEC社製)が結合したオリゴヌクレオチド(発光プローブ1〜4)を用い、分離用プローブとして、配列番号6に示す塩基配列からなり、3’末端にビオチンが結合したオリゴヌクレオチド(ビオチン化プローブ1)を用いた。それぞれの塩基配列を表1に示す。標的核酸分子1中、下線部はそれぞれ、発光プローブ及びビオチン化プローブが結合する領域を示す。なお、標的核酸分子1、発光プローブ1〜4及びビオチン化プローブ1は、全て天然型のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
Figure 2013125124
トリスバッファー(10mM Tris−HCl,400mM NaCl,0.05% Triton X−100)に標的核酸分子1が1pM、発光プローブ1が800pM、ビオチン化プローブ1が200pM、Poly(deoxyinosinic−deoxycytidylic)acid(Sigma−Aldrich社)が0.1U/mL(1Uは、水中(光路長は1cm)で260nmの吸光度が1.0となる量)となるように試料溶液1(100μL)を調製した。また、発光プローブ1、2、3、4がそれぞれ200pM(合計800pM)となるように調製した以外は上記試料溶液1と同様となる試料溶液2も調製した。さらに、標的核酸分子1を含まない以外は、試料溶液1又は2とそれぞれ同様にして、対照試料溶液1及び2も用意した。
それらの試料溶液を、95℃で5分間加熱後、0.1℃/分の速度で25℃にまで液温を低下させた。0.1% BSA(ウシ血清アルブミン)を1μL加えた後、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズ(Invitrogen社、カタログ番号:650−01)10μgを添加し、25℃で90分間、振とうさせながら反応させた。続いて、試料溶液中の磁気ビーズを、磁石を用いて500μLの洗浄バッファー(10mM Tris−HCl,400mM NaCl,0.05% Triton X−100)によって3回洗浄した後、100μLの溶出バッファー(10mM Tris−HCl,0.05% Triton X−100)を加え、95℃で30秒間加熱後、氷上で急冷した。磁石で磁気ビーズを容器側壁に集めた後、上清を回収し、それらに含まれている発光プローブの分子数を走査分子計数法によって計測した。
計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF20(オリンパス株式会社)を用い、上記の上清について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、642nmのレーザ光を用いて1mWで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて660〜710nmとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は90mm/秒とし、BIN TIMEを10μ秒とし、測定時間は2秒間とした。また、測定は各5回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各上清について取得された時系列のフォトンカウントデータから時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は11個とし、移動平均処理を5回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、(ガウス関数に於ける)ピーク強度、ピーク幅(半値全幅)、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、
下記の条件:
20μ秒<ピーク幅<400μ秒
ピーク強度>1(フォトン/10μ秒)
相関係数>0.90
を満たすピーク信号のみを発光プローブに対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、発光プローブに対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。
各試料溶液のピーク数の計数結果を図2に示す。図中、「発光プローブ×1(−)」は、発光プローブを1種類用い、かつ標的核酸分子1が無添加の対照試料溶液1の結果であり、「発光プローブ×1(+)」は、発光プローブを1種類用い、かつ標的核酸分子1を添加した試料溶液1の結果であり、「発光プローブ×4(−)」は、発光プローブを4種類用い、かつ標的核酸分子1が無添加の対照試料溶液2の結果であり、「発光プローブ×4(+)」は、発光プローブを4種類用い、かつ標的核酸分子1を添加した試料溶液2の結果である。発光プローブを1種類用いた場合と比べて、4種類用いた場合ではシグナルが約3.8倍になった(シグナル:(標的核酸分子1存在下でのピーク数)−(標的核酸分子1非存在下でのピーク数))。これは、標的核酸分子1に対して複数の発光プローブを結合させ、遊離の発光プローブを洗浄して除去した後に、標的核酸分子1から発光プローブを解離させたことによって、一分子の標的核酸分子から複数のシグナル源が発生したためだと考えられる。
本発明の検出方法における工程(a’)〜(d’)の繰り返し回数を0回、1回、又は2回とし、標的粒子の検出感度に対する当該工程の繰り返しの回数の影響を調べた。
標的粒子として、配列番号7に示す塩基配列からなる天然型のポリヌクレオチド(以下、標的核酸分子2)を用い、発光プローブとして参考例1で用いた発光プローブ1を用い、分離用プローブとして配列番号8に示す塩基配列からなり、3’末端にビオチンが結合したPNAからなるオリゴヌクレオチド(ビオチン化プローブ2)を用いた。標的核酸分子2及びビオチン化プローブ2の塩基配列を表2に示す。標的核酸分子2中、下線部はそれぞれ、発光プローブ1及びビオチン化プローブ2が結合する領域を示す。また、ビオチン化プローブ2のPNAの塩基配列は、PNAを対応する天然型のヌクレオチドに置き換えて示す。
Figure 2013125124

まず、トリスバッファー(10mM Tris−HCl,400mM NaCl,0.05% Triton X−100)に標的核酸分子2が1pM、発光プローブ1が200pM、ビオチン化プローブ2が200pM、Poly(deoxyinosinic−deoxycytidylic)acid(Sigma−Aldrich社)が0.1U/mLとなるように試料溶液(100μL)を3つ(試料溶液A〜C)調製した。また、標的核酸分子2を含まない以外は試料溶液1と同様にして、対照試料溶液も3つ(対照試料溶液A〜C)用意した。

それらの試料溶液を、95℃で5分間加熱後、0.1℃/分の速度で25℃にまで液温を低下させた。0.1% BSA(ウシ血清アルブミン)を1μL加えた後、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズ(Invitrogen社、カタログ番号:650−01)10μgを添加し、25℃で90分間、振とうさせながら反応させた。続いて、試料溶液中の磁気ビーズを、磁石を用いて500μLの洗浄バッファー(10mM Tris−HCl,400mM NaCl,0.05% Triton X−100)によって3回洗浄した後、100μLの溶出バッファー(10mM Tris−HCl,0.05% Triton X−100)を加え、50℃で5分間インキュベートした。次いで、磁石で磁気ビーズを容器側壁に集めた後、上清を回収した。回収された上清を「上清1」とし、容器側壁に集めた磁気ビーズを「磁気ビーズ1」とした。試料溶液A及び対照試料溶液Aについては、この時点で終了し、得られた上清1を、走査分子計数法による測定の測定試料溶液とした。試料溶液B、C及び対照試料溶液B、Cについては、以降の工程に進めた。

次に、前記トリスバッファーに、発光プローブ1が200pM、Poly(deoxyinosinic−deoxycytidylic)acid(Sigma−Aldrich社)が0.1U/mL、BSAが0.001%となるように調製した溶液(100μL)を、磁気ビーズ1に添加して混合し、得られた試料溶液を25℃で1時間、振とうさせながら反応させた。続いて、当該試料溶液中の磁気ビーズを、磁石を用いて500μLの前記洗浄バッファーによって3回洗浄した後、前記上清1を加え、50℃で5分間インキュベートした。次いで、磁石で磁気ビーズを容器側壁に集めた後、上清を回収した。回収された上清を「上清2」とし、容器側壁に集めた磁気ビーズを「磁気ビーズ2」とした。試料溶液B及び対照試料溶液Bについては、この時点で終了し、得られた上清2を、走査分子計数法による測定の測定試料溶液とした。試料溶液C及び対照試料溶液Cについては、以降の工程に進めた。

次いで、前記トリスバッファーに、発光プローブ1が200pM、Poly(deoxyinosinic−deoxycytidylic)acid(Sigma−Aldrich社)が0.1U/mL、BSAが0.001%となるように調製した溶液(100μL)を、磁気ビーズ2に添加して混合し、得られた試料溶液を25℃で1時間、振とうさせながら反応させた。続いて、当該試料溶液中の磁気ビーズを、磁石を用いて500μLの前記洗浄バッファーによって3回洗浄した後、前記上清2を加え、50℃で5分間インキュベートした。次いで、磁石で磁気ビーズを容器側壁に集めた後、上清を回収した。

回収された上清を「上清3」とし、容器側壁に集めた磁気ビーズを「磁気ビーズ3」とした。試料溶液C及び対照試料溶液Cについては、この時点で終了し、得られた上清3を、走査分子計数法による測定の測定試料溶液とした。

得られた測定試料溶液(上清1〜3)中の発光プローブ1の分子数を、走査分子計数法によって計測した。計測は、測定時間を20秒間とした以外は、参考例1と同様にして行った。各測定試料溶液のピーク数の計数結果を図3に示す。図3中、「上清1」〜「上清3」はそれぞれ、試料溶液から調製された測定試料溶液のピーク数(標的粒子存在下におけるピーク数)から、対照試料溶液から調製された測定試料溶液のピーク数(標的粒子非存在下におけるピーク数)を差し引いたピーク数を示す。この結果、上清1よりも上清2のほうが、そして上清2よりも上清3のほうが、ピーク数が多くなっていた。つまり、本発明の工程(a’)〜(d’)を繰り返した回数に依存して、得られるピーク数が多くなることが確認された。これらの結果から、本発明の検出方法により、一分子の標的粒子から複数のシグナル源を発生させることができ、よって計測時間を従来よりも短時間化したり、標的粒子の検出感度をより高められることが明らかである。

本発明の検出方法により、溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を、高感度に検出することができるため、本発明の検出方法は、試料中の粒子を検出又は定量解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。

1…標的粒子、2…発光プローブ、3…分離用プローブ、4…固相担体。

Claims (11)

  1. 溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を、発光プローブを用いて間接的に検出する方法であって、
    (a)検出の対象である標的粒子、及び、前記標的粒子と直接的又は間接的に結合する1種類以上の発光プローブを含む溶液を調製する工程;
    (b)前記溶液中で、前記標的粒子及び前記発光プローブを含む複合体を形成する工程;
    (c)前記複合体を含む前記溶液から、前記標的粒子に結合していない発光プローブを除去して、前記複合体を回収する工程;及び
    (d)前記回収された複合体から前記発光プローブを解離させ、遊離した発光プローブ、及び標的粒子を分離して、別個に回収する工程;
    を行い、
    (e)以下の工程:
    (a’)前記工程(d)において遊離の発光プローブと分離して回収された標的粒子に、前記発光プローブを新たに添加した溶液を調製する工程;
    (b’)前記工程(a’)の後、前記溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体を形成する工程;
    (c’)前記工程(b’)の後、前記溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記複合体を回収する工程;
    (d’)前記工程(c’)において回収された複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する工程;
    からなるサイクルを1回以上繰り返した後、前記工程(d)及び(d’)において回収された遊離の発光プローブの全量を含む一の測定試料溶液を調製する工程;並びに、
    (f)前記測定試料溶液中の前記発光プローブの分子数を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記発光プローブから発される光を検出する方法により算出する工程;
    を含む、標的粒子の検出方法。
  2. 前記工程(d’)において、前記複合体からの前記発光プローブの解離を、前記工程(d)において回収された遊離の発光プローブを含む溶液中で行う、請求項1に記載の標的粒子の検出方法。
  3. 前記工程(e)において、前記工程(d)及び(d’)の各工程において回収された遊離の発光プローブを含む溶液を全て混合した後、濃縮処理を行うことにより、一の測定試料溶液を調製する、請求項1に記載の標的粒子の検出方法。
  4. 前記工程(a)において、前記溶液にさらに、前記発光プローブとは独立して前記標的粒子と結合する分離用プローブを添加し、
    前記工程(b)及び(b’)において形成される複合体が、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離用プローブとを含み、
    前記工程(d)及び(d’)において、前記分離用プローブと結合した複合体の状態で、標的粒子を遊離の発光プローブと分離して回収する、
    請求項1〜3のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  5. 前記標的粒子が核酸分子である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  6. 前記標的粒子が核酸分子であり、かつ前記標的粒子と前記分離用プローブとの複合体のTm値が、前記標的粒子と前記発光プローブとの複合体のTm値よりも高い、請求項4に記載の標的粒子の検出方法。
  7. 前記工程(d)及び(d’)において、前記複合体を含む溶液の温度を、前記標的粒子と前記発光プローブとの複合体のTm値よりも高く、かつ前記標的粒子と前記分離用プローブとの複合体のTm値よりも低い温度にすることによって、前記複合体からの前記発光プローブの解離を行う、請求項6に記載の標的粒子の検出方法。
  8. 前記発光プローブが、発光物質が結合した天然型のオリゴヌクレオチドであり、
    前記分離用プローブが、ペプチド核酸からなるオリゴヌクレオチドである、請求項4〜7のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  9. 前記工程(d)の前に、前記工程(b)において形成された複合体中の、前記標的粒子と前記分離用プローブとの間に少なくとも1の共有結合を形成させる工程を行う、請求項4又は5に記載の標的粒子の検出方法。
  10. 前記工程(c)における前記複合体の回収、並びに前記工程(d)及び(d’)における遊離の発光プローブの回収を、前記分離用プローブと直接的又は間接的に結合する固相担体を用いた固液分離処理により行う、請求項4〜9のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  11. 前記1種以上の発光プローブが、2以上の発光プローブである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
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