JPS60176589A - 非放射測定ポリヌクレオチドプローブ - Google Patents
非放射測定ポリヌクレオチドプローブInfo
- Publication number
- JPS60176589A JPS60176589A JP60009997A JP999785A JPS60176589A JP S60176589 A JPS60176589 A JP S60176589A JP 60009997 A JP60009997 A JP 60009997A JP 999785 A JP999785 A JP 999785A JP S60176589 A JPS60176589 A JP S60176589A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- nucleotide
- probe
- moiety
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、研究および診断の試薬として有用な核酸交雑
プローブ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）に関する。
プローブ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）に関する。
分子生物学の基本的研究の道具としてのＤＮＡ／ＲＮＡ
交雑プローブの使用は、Ｇｒｕｎｓｔ ｅＩ ｎ ｅ
ｊ ＆ ｌ 、 、 Ｐ ｒ ＯＣ−Ｎ ａ ｔ 、
Ａ Ｃａｄ、ｓｃｉ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ７２ ： ３９
６１（１９７５）および５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍ。
交雑プローブの使用は、Ｇｒｕｎｓｔ ｅＩ ｎ ｅ
ｊ ＆ ｌ 、 、 Ｐ ｒ ＯＣ−Ｎ ａ ｔ 、
Ａ Ｃａｄ、ｓｃｉ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ７２ ： ３９
６１（１９７５）および５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍ。
１、Ｂｉｏｌ、９８：５０３（１９７５）の独創的な論
文の刊行以来、隆盛をきわめてきた。これらの論文は、
放射線標識ポリヌクレオチドプローブを用いる交雑技術
を記載している。
文の刊行以来、隆盛をきわめてきた。これらの論文は、
放射線標識ポリヌクレオチドプローブを用いる交雑技術
を記載している。
臨床診断の道具としてのポリヌクレオチドプローブのＨ
（飽性は現在明らかである。しかしながら、今Ｅ１まで
、研究者の顕著に大部分は放射性同位元素で標識した原
子を用いてきた。これはプローブ／分析物（ａｎａｌｙ
ｔｅ）のオートラジオグラフの検出をかなりの感度で可
能とする。臨床的診断におけるポリヌクレオチドプロー
ブの適用は、Ｌｅｗｉｎ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２１：１
１６７ （１９８３）およびＫｌａｕｓｎｅｒ ｅｔ
ａｌ、、Ｂｉｏ立Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ １
．３− 、ユ・４７１．（１９８３）により強調された
。
（飽性は現在明らかである。しかしながら、今Ｅ１まで
、研究者の顕著に大部分は放射性同位元素で標識した原
子を用いてきた。これはプローブ／分析物（ａｎａｌｙ
ｔｅ）のオートラジオグラフの検出をかなりの感度で可
能とする。臨床的診断におけるポリヌクレオチドプロー
ブの適用は、Ｌｅｗｉｎ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２１：１
１６７ （１９８３）およびＫｌａｕｓｎｅｒ ｅｔ
ａｌ、、Ｂｉｏ立Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ １
．３− 、ユ・４７１．（１９８３）により強調された
。
夜来の放射線標識プローブは許容されうる検出可能な限
界を提供したが、オードラジオグラフ検出に長い期間を
必要とすることがあり、そして作業肖による放射性物質
の監視および廃棄に関連する追加の経費を導入する。こ
うして、高い感度をもつ非放射Ｊｌｌｌ定ポリヌクレオ
チドプローブは、同位覚素標識プローブの便利な、安価
な安全な代替物として重要性をもつ。
界を提供したが、オードラジオグラフ検出に長い期間を
必要とすることがあり、そして作業肖による放射性物質
の監視および廃棄に関連する追加の経費を導入する。こ
うして、高い感度をもつ非放射Ｊｌｌｌ定ポリヌクレオ
チドプローブは、同位覚素標識プローブの便利な、安価
な安全な代替物として重要性をもつ。
公開された欧州特許出願第８２３０１８０４ 。
９１（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ、）は、ポリペプチドと検
出可能な複合体を形成することができる部分へ用堝結合
したプリン、７−デアザプリン、またはピリミジンの塩
基からなるプローブ組成物を開示している。この部分は
プリン塩基へ８＝位置において、デアザプリン塩基へ７
・−位置において、そしてピリミジン塩基へ５−位置に
おいて結合している。得られる変性されたヌクレオチド
は二、り翻訳（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉ。
出可能な複合体を形成することができる部分へ用堝結合
したプリン、７−デアザプリン、またはピリミジンの塩
基からなるプローブ組成物を開示している。この部分は
プリン塩基へ８＝位置において、デアザプリン塩基へ７
・−位置において、そしてピリミジン塩基へ５−位置に
おいて結合している。得られる変性されたヌクレオチド
は二、り翻訳（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉ。
ｎ）技術によりＤＮＡへ組み込まれる。
公開された欧州特許出願第８２３０３７０１ 。
５時（Ｈｅ１１ｅｒ ｅｔ ａｌ、）は、光標識、 −
木調ポリヌクレオチド試薬を使用する標的ポリヌクレオ
チドを同定する交雑法を開示している。交雑は光放射に
より検出され、その光放射の強さは試料混合物中の標的
ポリヌクレオチドの濃度に関係する。化学ルミネセンス
、蛍光およびり〉・光の使用が開示されている。公開さ
れた欧州特許出願第８２３０３６９９．１号（Ｈｅｌｌ
ｅｒｅｔ ａｌ、）は、ルミネセンスで標識した第１お
よび第２の一本釦試薬のセグメントを使用する均質光放
射交雑検定を開示している。非放射線エネルギー移動が
第１セグメントおよび蛍光性第２セグメントの光放射標
識の間で起こるように、前記第１および第２の−・禾釦
試薬のセグメントは標的ポリヌクレオチドに沿って互い
に密に近接して交雑される。光標識の少なくとも・方は
、他方の光標識から吸収されたエネルギーが二次波長に
おいて再放射されるように、吸収体／放射体型である。
木調ポリヌクレオチド試薬を使用する標的ポリヌクレオ
チドを同定する交雑法を開示している。交雑は光放射に
より検出され、その光放射の強さは試料混合物中の標的
ポリヌクレオチドの濃度に関係する。化学ルミネセンス
、蛍光およびり〉・光の使用が開示されている。公開さ
れた欧州特許出願第８２３０３６９９．１号（Ｈｅｌｌ
ｅｒｅｔ ａｌ、）は、ルミネセンスで標識した第１お
よび第２の一本釦試薬のセグメントを使用する均質光放
射交雑検定を開示している。非放射線エネルギー移動が
第１セグメントおよび蛍光性第２セグメントの光放射標
識の間で起こるように、前記第１および第２の−・禾釦
試薬のセグメントは標的ポリヌクレオチドに沿って互い
に密に近接して交雑される。光標識の少なくとも・方は
、他方の光標識から吸収されたエネルギーが二次波長に
おいて再放射されるように、吸収体／放射体型である。
このような−次放射は交雑が起こった場合にのみ起こる
ので、二次波長における放射の強さは試料のマトリック
ス中の標的ポリヌクレオチドの濃度に関係づけられる。
ので、二次波長における放射の強さは試料のマトリック
ス中の標的ポリヌクレオチドの濃度に関係づけられる。
効率よい非放射測定ポリヌクレオチドプローブの、；り
計に対するアプローチは、新規な診断系における応用に
ついて現在探査されている代替法である。超感受性プロ
ーブ組成物は、カスケード増幅（ｃａｓｃａｄｅ ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉ。
計に対するアプローチは、新規な診断系における応用に
ついて現在探査されている代替法である。超感受性プロ
ーブ組成物は、カスケード増幅（ｃａｓｃａｄｅ ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉ。
ｎ）検出反応を開始する役目をする、ポリヌクレオトド
および酵素の酵素原活性化因子（ｅｎｚｙｍａｔｔｅ
ｚｙｍｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔ。
および酵素の酵素原活性化因子（ｅｎｚｙｍａｔｔｅ
ｚｙｍｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔ。
ｒ）の複合体の形で調製することができることが合同発
見された。
見された。
本発明によれば、式
％式％）
式中、
ｎは２〜５００の整数であり、
Ａは標的ポリヌクレオチドに対して実質的に相補的であ
る区域を有するポリヌクレオチドであり、そして ２１〜ｚｎは、同一も１−〈は相異なり、賃金的にポリ
ヌクレオチド配列を形成するヌクレオチド部分であり、
ただしヌクレオチド部分Ｚｌ〜ｚｎの少なくとも１つは
部分Ｘからなり、ここでＸは酵素原（ｚｙｍｏｇｅｎ）
を酵素的に活性化して検出６７能な酵素反応カスケード
を開始することができるポリヌク１７オチドからなる部
分である、 のボリヌクトオチドプローブ組成物が提供される。
る区域を有するポリヌクレオチドであり、そして ２１〜ｚｎは、同一も１−〈は相異なり、賃金的にポリ
ヌクレオチド配列を形成するヌクレオチド部分であり、
ただしヌクレオチド部分Ｚｌ〜ｚｎの少なくとも１つは
部分Ｘからなり、ここでＸは酵素原（ｚｙｍｏｇｅｎ）
を酵素的に活性化して検出６７能な酵素反応カスケード
を開始することができるポリヌク１７オチドからなる部
分である、 のボリヌクトオチドプローブ組成物が提供される。
また、本発明によれば、交雑条件（ｈｙｂｒｉｄｔｚｉ
ｎｇ）下に、」−に定義したポリヌクレオ）ドブローブ
組成物を試料と接触させて、プローブ、／標的雑種を形
成させ；プローブ／標的雑種を交雑していないプローブ
、ＶＩ成物から分離し；そしてプローブ／標的雑種を酵
素原と接触させて、検出可能な酵素反応カスケードを開
始する；ことを特徴とする試料中の標的ボリヌ、クレオ
チドの存在を検出する方法が提供される。
ｎｇ）下に、」−に定義したポリヌクレオ）ドブローブ
組成物を試料と接触させて、プローブ、／標的雑種を形
成させ；プローブ／標的雑種を交雑していないプローブ
、ＶＩ成物から分離し；そしてプローブ／標的雑種を酵
素原と接触させて、検出可能な酵素反応カスケードを開
始する；ことを特徴とする試料中の標的ボリヌ、クレオ
チドの存在を検出する方法が提供される。
本発明は、種々の臨床的、環境的、または生物学的試料
のマトリックス中に存在するか、あるいはそれから誘導
することができる標的ポリヌクレオチドと検出可能な交
雑を形成できる非放射測定ポリヌクレオチドプローブ組
成物を提供するものである。ここに開示するプローブの
感度および特異性は、このような組成物および前記組成
物を使用する方法を、臨床的診断および生物学的研究に
おいて広く有用なものとする。本発明のプローブおよ゛
び方法の例は、遺伝疾患（ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｏｒｄ
ｅｒ）の特性づけ、特定のウィルス、微生物または他の
有機体の検出、および特定の核酸配列の同定を包含する
。
のマトリックス中に存在するか、あるいはそれから誘導
することができる標的ポリヌクレオチドと検出可能な交
雑を形成できる非放射測定ポリヌクレオチドプローブ組
成物を提供するものである。ここに開示するプローブの
感度および特異性は、このような組成物および前記組成
物を使用する方法を、臨床的診断および生物学的研究に
おいて広く有用なものとする。本発明のプローブおよ゛
び方法の例は、遺伝疾患（ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｏｒｄ
ｅｒ）の特性づけ、特定のウィルス、微生物または他の
有機体の検出、および特定の核酸配列の同定を包含する
。
般にＤＮＡ交雑プローブ、およびとくに本発明のプロー
ブの独特の感度および特異性は、特定の病原体ばかりで
なく、また病原体の特定の遺伝特性、例えば、抗生物質
抵抗性を与える染色体または染色体外の要素（ｅ ｌ
ｅｍｅｎｔ）の病原体中の存在について急速かつ明瞭な
同定を可能とする６従来、抗生物質抵抗性の特色の同定
は、骨の折れる反復的培養工程を経てのみ可能であり、
完結までに比較的長い期間を要した。
ブの独特の感度および特異性は、特定の病原体ばかりで
なく、また病原体の特定の遺伝特性、例えば、抗生物質
抵抗性を与える染色体または染色体外の要素（ｅ ｌ
ｅｍｅｎｔ）の病原体中の存在について急速かつ明瞭な
同定を可能とする６従来、抗生物質抵抗性の特色の同定
は、骨の折れる反復的培養工程を経てのみ可能であり、
完結までに比較的長い期間を要した。
この明細書を通じて用いるとき、次の定義を適用する。
「ポリヌクレオチド」は、リポ核酸（ＲＮＡ）またはデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマーを意味し、これら
は 本領または二本鎖であることができ、必要に地じて
、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中への組み込みを可能と
する合成、非天然または変更ヌクレオチドを組み込んで
いてもよい。［標的ポリヌクレオチド」は、試料マトリ
ックス中のその存在を検出すべき遺伝要素（ｇｅｎｅｔ
ｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ）に相当する塩基配列を有するポ
リヌクレオチドから誘導された−・本領ポリヌクし・オ
チドのセグメントを意味する。
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマーを意味し、これら
は 本領または二本鎖であることができ、必要に地じて
、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中への組み込みを可能と
する合成、非天然または変更ヌクレオチドを組み込んで
いてもよい。［標的ポリヌクレオチド」は、試料マトリ
ックス中のその存在を検出すべき遺伝要素（ｇｅｎｅｔ
ｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ）に相当する塩基配列を有するポ
リヌクレオチドから誘導された−・本領ポリヌクし・オ
チドのセグメントを意味する。
「塩基残基」は、Ｎ−グリコシド結合によりリポースま
たはデオキシリポース糖部分へ共有結合されて、ポリヌ
クレオチド中への組み込みを可能とするヌクレオチドを
形成するプリン、ピリミジン、変性プリン、例えば、デ
アザプリン、または変性ピリミジン部分を意味する。「
酵素原（ｚｙｍｏｇｅｎ）Ｊは、限定されたタンパク分
解により不ｎＴ逆的に活性化される酵素の実質的に不活
性なポリヌクレオチド前駆体を意味する。「酵素活性化
因子」は、本発明の分脈において、酵素原と反Ｉ４〜し
て酵素原誘導酵素を生成するタンパク分解酵素を意味す
る。「酵素原誘導酵素」は、酵素原と酵素活性化因子と
の間の生成物を意味し、これは検出可能な反応または反
応カスケードを開始することができる。［カスケード（
ｃａｓｃａｄｅ）」は、９期の反応の生成物が反応の順
序において後の反応のだめの触媒である、結合された反
応の順序を意味する。
たはデオキシリポース糖部分へ共有結合されて、ポリヌ
クレオチド中への組み込みを可能とするヌクレオチドを
形成するプリン、ピリミジン、変性プリン、例えば、デ
アザプリン、または変性ピリミジン部分を意味する。「
酵素原（ｚｙｍｏｇｅｎ）Ｊは、限定されたタンパク分
解により不ｎＴ逆的に活性化される酵素の実質的に不活
性なポリヌクレオチド前駆体を意味する。「酵素活性化
因子」は、本発明の分脈において、酵素原と反Ｉ４〜し
て酵素原誘導酵素を生成するタンパク分解酵素を意味す
る。「酵素原誘導酵素」は、酵素原と酵素活性化因子と
の間の生成物を意味し、これは検出可能な反応または反
応カスケードを開始することができる。［カスケード（
ｃａｓｃａｄｅ）」は、９期の反応の生成物が反応の順
序において後の反応のだめの触媒である、結合された反
応の順序を意味する。
「架橋基（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）」または「結合基
」は、−二官能性分子Ｒ’−Ｌ−Ｒ“から１誘導された
部分を意味し、ここでＲ′およびＲ“は、同一であるか
あるいは相異なり、−ＮＨ，、−Ｃｏ２Ｈ１−ＣＯ２Ｒ
のような官能基を表わし、ここでＲは２−ヒドロキシピ
リジン、Ｎ−ヒ１゛ロキシスクジンイミド、−ＣＯ２Ｍ
ｅまたは他の活性エステル、アシルイミタゾール、マレ
イミド、トリフルオロアセテート、ジケテン、イミドエ
ステル、スルホネートエステル、イミン、−ＣＨｏｌｌ
、２−シクロヘキサンジオン、グリオキサール、スルフ
ェニルハライド、アルファへロケトン、アジドなとであ
り、そしてＬはアルキレンまたは置換アルキレンである
。アルキレン鎖りはハロゲン（１，Ｂｒ、Ｃ１，Ｆ）、
ヒドロキシ、シアノ、フェニル、アミノ、カルボキク、
アル午ル、アルコキシなどのような清適の基で置換され
ることができる。さらに、結合基りのアルキレン鎖は、
ｌまたは２以上の二価の基１例えば、−〇−１−３−、
−ＮＨ−１−ＣＨ＝ＣＨ−１−Ｃ＝Ｃ−、フェニル、−
５Ｏ２−などにより中断されることができる。しかしな
がら、官能基Ｒ′は、適当な条件下で、塩基残基Ｂの窒
素または炭素の原子と共有結合を形成できなくてはなら
ず、そして官能基Ｒ“は、適当な条件下で、ポリペプチ
ド酵素活性化因子Ｅの鎖または末端のアミン、カルボキ
シル 化物の基と共有結合を形成して、部分Ｘを形成しなくて
はならない。しかして、二官能性分子Ｒ′−Ｌ−Ｒ“は
適当な技術により、塩基残基または変性塩基残基および
ポリペプチドＥと反応させて、アミド、エステル、アミ
ン、イミン、スルホンアミド、チオエステル、ホスフェ
ート、またはチオホスフェート結合基りにより結合して
塩基残ＸＢおよびポリペプチドＥの複合体を形成して、
４Ｊ８今的に部分Ｘを形成する。明らかなように、結合
基Ｒ’−Ｌ−Ｒ“および特定の複合化学の選択は、得ら
れるプローブ分子、すなわち、ペプチド、Ｎ−グリコシ
ドおよびホヌホジエステルの結合の完全性（ｉｎｔｅｇ
ｒｉｔｙ）に重要な他の高分子結合を保存する必要性を
考慮しなくてはならない。
」は、−二官能性分子Ｒ’−Ｌ−Ｒ“から１誘導された
部分を意味し、ここでＲ′およびＲ“は、同一であるか
あるいは相異なり、−ＮＨ，、−Ｃｏ２Ｈ１−ＣＯ２Ｒ
のような官能基を表わし、ここでＲは２−ヒドロキシピ
リジン、Ｎ−ヒ１゛ロキシスクジンイミド、−ＣＯ２Ｍ
ｅまたは他の活性エステル、アシルイミタゾール、マレ
イミド、トリフルオロアセテート、ジケテン、イミドエ
ステル、スルホネートエステル、イミン、−ＣＨｏｌｌ
、２−シクロヘキサンジオン、グリオキサール、スルフ
ェニルハライド、アルファへロケトン、アジドなとであ
り、そしてＬはアルキレンまたは置換アルキレンである
。アルキレン鎖りはハロゲン（１，Ｂｒ、Ｃ１，Ｆ）、
ヒドロキシ、シアノ、フェニル、アミノ、カルボキク、
アル午ル、アルコキシなどのような清適の基で置換され
ることができる。さらに、結合基りのアルキレン鎖は、
ｌまたは２以上の二価の基１例えば、−〇−１−３−、
−ＮＨ−１−ＣＨ＝ＣＨ−１−Ｃ＝Ｃ−、フェニル、−
５Ｏ２−などにより中断されることができる。しかしな
がら、官能基Ｒ′は、適当な条件下で、塩基残基Ｂの窒
素または炭素の原子と共有結合を形成できなくてはなら
ず、そして官能基Ｒ“は、適当な条件下で、ポリペプチ
ド酵素活性化因子Ｅの鎖または末端のアミン、カルボキ
シル 化物の基と共有結合を形成して、部分Ｘを形成しなくて
はならない。しかして、二官能性分子Ｒ′−Ｌ−Ｒ“は
適当な技術により、塩基残基または変性塩基残基および
ポリペプチドＥと反応させて、アミド、エステル、アミ
ン、イミン、スルホンアミド、チオエステル、ホスフェ
ート、またはチオホスフェート結合基りにより結合して
塩基残ＸＢおよびポリペプチドＥの複合体を形成して、
４Ｊ８今的に部分Ｘを形成する。明らかなように、結合
基Ｒ’−Ｌ−Ｒ“および特定の複合化学の選択は、得ら
れるプローブ分子、すなわち、ペプチド、Ｎ−グリコシ
ドおよびホヌホジエステルの結合の完全性（ｉｎｔｅｇ
ｒｉｔｙ）に重要な他の高分子結合を保存する必要性を
考慮しなくてはならない。
あるいは、酵素原を酵素的に活性化することができるポ
リペプチドからなる部分Ｘは５′ホスフ工ート結合また
は３′ヒドロキシル結合を経て１または２以」二のヌク
レオチド部分２１〜ｚｎへ結合することができ、あるい
は、直接あるいはエステルまたは他の結合基によりｌま
たは２以上のヌクレオチド部分Ｚ １ 、、、 Ｚ ｎ
の２’，３’または５′炭素原子へ結合して、本発明の
プローブ組成物を形成することができる。
リペプチドからなる部分Ｘは５′ホスフ工ート結合また
は３′ヒドロキシル結合を経て１または２以」二のヌク
レオチド部分２１〜ｚｎへ結合することができ、あるい
は、直接あるいはエステルまたは他の結合基によりｌま
たは２以上のヌクレオチド部分Ｚ １ 、、、 Ｚ ｎ
の２’，３’または５′炭素原子へ結合して、本発明の
プローブ組成物を形成することができる。
標的とプローブのポリヌクレオチドとの間の交雑の検出
のための酵素原誘導酵素により開始されたＭ未反応カス
ケードの使用は本発明にとって重要である。このような
カスケードの出現は、検出Ｎｚの有象の数の増＠（ａｍ
ｐｌｆｆｉｃａｔ ｉｏｎ）である。なぜなら、発生し
た第１生成物の１つの分子は第２生成物などの多数の分
子の生成を触媒することができるからである。酵素カス
ケードの場合シこおいて、回転＠（ｔｕｒｎｏｖｅｒ
ｎｕｍｂｅｒ）が大きいとき、有意の増幅、それゆえ検
出感度の増加を達成ることができる。
のための酵素原誘導酵素により開始されたＭ未反応カス
ケードの使用は本発明にとって重要である。このような
カスケードの出現は、検出Ｎｚの有象の数の増＠（ａｍ
ｐｌｆｆｉｃａｔ ｉｏｎ）である。なぜなら、発生し
た第１生成物の１つの分子は第２生成物などの多数の分
子の生成を触媒することができるからである。酵素カス
ケードの場合シこおいて、回転＠（ｔｕｒｎｏｖｅｒ
ｎｕｍｂｅｒ）が大きいとき、有意の増幅、それゆえ検
出感度の増加を達成ることができる。
プローブポリヌクレオチド
前述のように、本発明のプローブ組成物は、次の式によ
り概略的に表わすことができる：Ａ （Ｚｌ 、 、
、Ｚ”）または −ヒの式において、Ａは標的ポリヌクレオチドに対して
実質的に相補的である区域を有するポリヌクレオチドで
あり，そしてｚｌ 〜ｚｎはヌクレオチド部分であり，
それらの少なくとも１つはリポータ一部分（ｒｅｐｏｒ
ｔｅｒ ｍｏｉｅｔｙ）Ｘがらなり、ここでＸは酵素原
を酵素的に活性化して検出可能な酵素反応カスケードを
開始することができるポリペプチドからなる。本発明の
プローブは高度に特異性であり，プローブの塩基配列と
標的ポリヌクレオチドとの間の完全な相補性は交雑に不
必要であり，それゆえ検出に不必要である。本発明の分
脈において．「実質的な相補性」は適当な交雑条件下の
安定なプローブ−標的交雑性の形成を許すに十分な相同
性を示す。ポリヌクレオチドＡは、デオキシリホキ炭酸
（ＤＮＡ）、リポ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡ
のポリマー中に組み込むことができるある種の合成，非
自然または変更ヌクレオチド、あるいは前記核酸の組み
合わせからなることがでさる。
り概略的に表わすことができる：Ａ （Ｚｌ 、 、
、Ｚ”）または −ヒの式において、Ａは標的ポリヌクレオチドに対して
実質的に相補的である区域を有するポリヌクレオチドで
あり，そしてｚｌ 〜ｚｎはヌクレオチド部分であり，
それらの少なくとも１つはリポータ一部分（ｒｅｐｏｒ
ｔｅｒ ｍｏｉｅｔｙ）Ｘがらなり、ここでＸは酵素原
を酵素的に活性化して検出可能な酵素反応カスケードを
開始することができるポリペプチドからなる。本発明の
プローブは高度に特異性であり，プローブの塩基配列と
標的ポリヌクレオチドとの間の完全な相補性は交雑に不
必要であり，それゆえ検出に不必要である。本発明の分
脈において．「実質的な相補性」は適当な交雑条件下の
安定なプローブ−標的交雑性の形成を許すに十分な相同
性を示す。ポリヌクレオチドＡは、デオキシリホキ炭酸
（ＤＮＡ）、リポ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡ
のポリマー中に組み込むことができるある種の合成，非
自然または変更ヌクレオチド、あるいは前記核酸の組み
合わせからなることがでさる。
プローブポリヌクレオチドＡは，現在当業者にとって慣
用である技術を用いてプラスミドまたはファージ中の標
的ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド
配列のクローニングおよび増幅により、有用な駿で便利
にＱ１離することができる。ＤＮＡの取扱いのほとんど
の面をカバーする有用な参考書は、Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａ２）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．１９８２）であり、その開示を
引用によってここに加える。
用である技術を用いてプラスミドまたはファージ中の標
的ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド
配列のクローニングおよび増幅により、有用な駿で便利
にＱ１離することができる。ＤＮＡの取扱いのほとんど
の面をカバーする有用な参考書は、Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａ２）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．１９８２）であり、その開示を
引用によってここに加える。
有用な品のプローブポリヌクレオチドの製造のだめのク
ローニングビヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅ）
は１次の文献に詳述されているｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）である：Ｒｏｄｒｉｎｇｕｅｚ、ｅｔ ａ
ｌ、、Ｓｃｏｔｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ、１９７７）、Ｐ、７３．このプラスミドは、抗体の
テトラサイクリ〉・およびアンピシリンに対する抵抗性
を乍える遺伝子に加えて、単°のＰｓｔ Ｉ、旦ａｍＩ
、ＥｃｏＲｌ、Ｈｉｎｄｍおよ５ａｌＩ制限工ンドヌク
レアーゼ認識部位を含有する。プラスミドＤＮＡは、Ｃ
ｌｅｗｅｌｌ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１．０ ：
６６７ （１９７２）（７）方゛法に従いクロランフ
ェニコール（１７０ルｇ／ｍｌ）の存在下の生長により
増幅し、そしてＧｕｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉ。
ローニングビヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅ）
は１次の文献に詳述されているｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）である：Ｒｏｄｒｉｎｇｕｅｚ、ｅｔ ａ
ｌ、、Ｓｃｏｔｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ、１９７７）、Ｐ、７３．このプラスミドは、抗体の
テトラサイクリ〉・およびアンピシリンに対する抵抗性
を乍える遺伝子に加えて、単°のＰｓｔ Ｉ、旦ａｍＩ
、ＥｃｏＲｌ、Ｈｉｎｄｍおよ５ａｌＩ制限工ンドヌク
レアーゼ認識部位を含有する。プラスミドＤＮＡは、Ｃ
ｌｅｗｅｌｌ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１．０ ：
６６７ （１９７２）（７）方゛法に従いクロランフ
ェニコール（１７０ルｇ／ｍｌ）の存在下の生長により
増幅し、そしてＧｕｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉ。
上ユ ↓±６：１０６４ （１９７３）の透明化リゼイ
ト手順により精暫し、次いで適当なエンドヌクし・アー
ゼで消化することができる。例えば、ヱ互」■による消
化はアンピシリン抵抗性遺伝標識を不活性化し、Ｐ ｓ
ｔ Ｉで同様に開裂したプローブポリヌクレオチド−
の結合に適する「粘着性末端」を発生する。次いで、得
られる組み換えプラスミドを使用して適当な宿主バクテ
リウム、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩを
形質転換することができる。クロランフェニコールの存
在下に生長させると、高いプラスミドのコピ一番Ｆｙ（
ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）を達成し、前述のように組み
換えプラスミドＤＮＡを弔離し、そして精製することが
できる。
ト手順により精暫し、次いで適当なエンドヌクし・アー
ゼで消化することができる。例えば、ヱ互」■による消
化はアンピシリン抵抗性遺伝標識を不活性化し、Ｐ ｓ
ｔ Ｉで同様に開裂したプローブポリヌクレオチド−
の結合に適する「粘着性末端」を発生する。次いで、得
られる組み換えプラスミドを使用して適当な宿主バクテ
リウム、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩを
形質転換することができる。クロランフェニコールの存
在下に生長させると、高いプラスミドのコピ一番Ｆｙ（
ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）を達成し、前述のように組み
換えプラスミドＤＮＡを弔離し、そして精製することが
できる。
しかしながら、プローブポリヌクレオチドの酸１告にと
くに好ましいベクター（ｖｅｃｔｏｒ）は、コリファー
ジ、Ｍ１３、（ＡＴＣＣ１５６６９−Ｂｌ）であり、こ
れは、ｐＢＲ３２２と同様に、現在商業的に１手可能で
ある（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔ ｔ Ｓ 、 ＵＳＡ） 、 ファージＤＮＡ
および問題の標的ＤＮＡのに対して相補的なりＮＡの消
化により得られるＤＮＡ断片を結合し、増幅し、引き続
いて−・末鎖の形に精製し、次いでリポータ−分子、例
えば、酵素活性化因子ポリペプチド、例えば、ウロキナ
ーゼと複合化することができる。クローニゲビヒクルと
してＭ１３ファージを使用することは、 Ｍ ｅ Ｓ
５１ ｎ ｇ 、 Ｒｅ ＣＯｍ ｂ ｊ ｎ ａｎｔ
ＤＮＡ Ｔｅｃｈ、Ｂｕｌｌ、２ ： ４３、（１９
７９）に記載されており、その開示を引用にってここに
加える。
くに好ましいベクター（ｖｅｃｔｏｒ）は、コリファー
ジ、Ｍ１３、（ＡＴＣＣ１５６６９−Ｂｌ）であり、こ
れは、ｐＢＲ３２２と同様に、現在商業的に１手可能で
ある（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔ ｔ Ｓ 、 ＵＳＡ） 、 ファージＤＮＡ
および問題の標的ＤＮＡのに対して相補的なりＮＡの消
化により得られるＤＮＡ断片を結合し、増幅し、引き続
いて−・末鎖の形に精製し、次いでリポータ−分子、例
えば、酵素活性化因子ポリペプチド、例えば、ウロキナ
ーゼと複合化することができる。クローニゲビヒクルと
してＭ１３ファージを使用することは、 Ｍ ｅ Ｓ
５１ ｎ ｇ 、 Ｒｅ ＣＯｍ ｂ ｊ ｎ ａｎｔ
ＤＮＡ Ｔｅｃｈ、Ｂｕｌｌ、２ ： ４３、（１９
７９）に記載されており、その開示を引用にってここに
加える。
プローブおよびタンパク の −化
ここで戊ＩＩを参照すると、７１〜ｚｎは、同一・であ
るかあるいは相異なり、好ましくは、式％式％ Ｂは塩基残基であり、そして Ｒ５はＨまたはＸであり、ここで Ｘは酵素原を酵素的に活性化して検出可能な酵素反応カ
スケードを開始することができるポリペプチドからなる
部分であり、 Ｒ２およびＨａはＨｌＯＨ，Ｘ、１ｔたｌ＊２以上のホ
スフェート基、隣接するヌクレオチド部分、部分Ｘもし
くは隣接するヌクレオチド部分へ共有結合したホスフェ
ート基、または部分Ｘおよび隣接するヌクレオチド部分
へ共有結合したホスフェート基であり、そして Ｒ４はＨｌＯＨ、ホスフェート基、またはＸでアｊＪ、
ただし、ヌクレオチド部分Ｚｌ、Ｚ！１の少なくとも１
つについて、Ｒ１はＢＨ３でありかつＲ５はＸであるか
、あるいはＲ２、Ｒ３またはＲ４は部分Ｘからなる。
るかあるいは相異なり、好ましくは、式％式％ Ｂは塩基残基であり、そして Ｒ５はＨまたはＸであり、ここで Ｘは酵素原を酵素的に活性化して検出可能な酵素反応カ
スケードを開始することができるポリペプチドからなる
部分であり、 Ｒ２およびＨａはＨｌＯＨ，Ｘ、１ｔたｌ＊２以上のホ
スフェート基、隣接するヌクレオチド部分、部分Ｘもし
くは隣接するヌクレオチド部分へ共有結合したホスフェ
ート基、または部分Ｘおよび隣接するヌクレオチド部分
へ共有結合したホスフェート基であり、そして Ｒ４はＨｌＯＨ、ホスフェート基、またはＸでアｊＪ、
ただし、ヌクレオチド部分Ｚｌ、Ｚ！１の少なくとも１
つについて、Ｒ１はＢＨ３でありかつＲ５はＸであるか
、あるいはＲ２、Ｒ３またはＲ４は部分Ｘからなる。
隣接するヌクレオトドＺは、３”５’ホスホンエステル
結合の形成により共有結合している。
結合の形成により共有結合している。
添字ｎは、ポリヌクレオチドＡへ付加することができる
変性または未変性のヌクレオチドを示し、２〜５００の
間で変化することができる整数である。 般に、ｎは５
〜５０の値である。一般に、合成オリゴヌクレオチドか
らなるプローブは比較的わずかのヌクレオチドから成る
であろうが、核酸消化生成物から誘導されたプローブは
より大きい数のヌクレオトドを有するであろう。
変性または未変性のヌクレオチドを示し、２〜５００の
間で変化することができる整数である。 般に、ｎは５
〜５０の値である。一般に、合成オリゴヌクレオチドか
らなるプローブは比較的わずかのヌクレオチドから成る
であろうが、核酸消化生成物から誘導されたプローブは
より大きい数のヌクレオトドを有するであろう。
ｍＸ残基Ｂはポリヌクレオチドの容量に有意に影響を及
ぼさないで一本領ポリヌクし７オチドに安定に組み込ん
で、実質的な相補性を有する標的ポリヌクレオチドとの
交雑を形成することができるプリン、変性（ｍｏｄｉｆ
ｉｅｄ）プリン、ピリミジンまたは変性ピリミジンの塩
基である。しかしながら、本発明において有用なすべて
の塩基残基の共通の特徴は結合基りの共有的結合に適当
な１または２以上の点である。こうして、「古典的な」
塩基のほかに、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシ
ルおよびチミン、他のそれほど首通ではない塩基、例え
ば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシルチルシ］・
シン、オロチン酸（ｏ ｒ 。
ぼさないで一本領ポリヌクし７オチドに安定に組み込ん
で、実質的な相補性を有する標的ポリヌクレオチドとの
交雑を形成することができるプリン、変性（ｍｏｄｉｆ
ｉｅｄ）プリン、ピリミジンまたは変性ピリミジンの塩
基である。しかしながら、本発明において有用なすべて
の塩基残基の共通の特徴は結合基りの共有的結合に適当
な１または２以上の点である。こうして、「古典的な」
塩基のほかに、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシ
ルおよびチミン、他のそれほど首通ではない塩基、例え
ば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシルチルシ］・
シン、オロチン酸（ｏ ｒ 。
ｔｉｅ ａｃｉｄ）、Ｊ導体２ メチル化塩基、例えば
、■−メチルグアニンなどを必要に応じて本発明のプロ
ーブ中に組み込むことができる。
、■−メチルグアニンなどを必要に応じて本発明のプロ
ーブ中に組み込むことができる。
さらに、ヌクレオチドＺは、塩基または糖部分へ結合す
ることができ、かつ酵素原の活性化または相補画枠的ポ
リヌクレオチドとの交雑を形成する得られるポリヌクレ
オチドの能力に悪影響を及ぼさない、種々の置換基を必
要に応して含むことができる。
ることができ、かつ酵素原の活性化または相補画枠的ポ
リヌクレオチドとの交雑を形成する得られるポリヌクレ
オチドの能力に悪影響を及ぼさない、種々の置換基を必
要に応して含むことができる。
選択された酵素活性化因子のポリペプチド−２の複合化
（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に適するある数のヌクレオ
チドからなるポリマーの「テイル（ｔａｉｌ）Ｊを、子
牛−胸腺末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ（Ｔ ｄ Ｔ）の使用しこよりプローブポリヌクレオ
チドへ付加することかで５、前記トランスフェラーセは
一本鎖または一本鎖のＤＮＡの３°−ヒドロキシル末端
へのデオキシヌクレオチドの付加を触媒する（Ｒｏ ｙ
ｃｈｏｕｄｈｕｒｙｌ ｅｔ ａｌ、、Ｎｕ、ｃｉｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、３：１０１ （１９７６）
参照）。
（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に適するある数のヌクレオ
チドからなるポリマーの「テイル（ｔａｉｌ）Ｊを、子
牛−胸腺末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ（Ｔ ｄ Ｔ）の使用しこよりプローブポリヌクレオ
チドへ付加することかで５、前記トランスフェラーセは
一本鎖または一本鎖のＤＮＡの３°−ヒドロキシル末端
へのデオキシヌクレオチドの付加を触媒する（Ｒｏ ｙ
ｃｈｏｕｄｈｕｒｙｌ ｅｔ ａｌ、、Ｎｕ、ｃｉｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、３：１０１ （１９７６）
参照）。
結合基りは本発明の範囲内で広く変化することができる
。 般に、Ｌは少なくとも３個の炭素原子を有し、酸素
、窒素、またはイオウの原子を含有していてもよく、二
官能性Ｒ’−Ｌ−Ｒ”から、；＾導された線状アルキレ
ン部分であり、官能基Ｒ”を介して塩基残基Ｂへ共有結
合することができ、かつ官能基Ｒ”を介してポリメクレ
オチド酵素活性化因子Ｅへ共有結合することができる。
。 般に、Ｌは少なくとも３個の炭素原子を有し、酸素
、窒素、またはイオウの原子を含有していてもよく、二
官能性Ｒ’−Ｌ−Ｒ”から、；＾導された線状アルキレ
ン部分であり、官能基Ｒ”を介して塩基残基Ｂへ共有結
合することができ、かつ官能基Ｒ”を介してポリメクレ
オチド酵素活性化因子Ｅへ共有結合することができる。
本発明の核酸／ポリペプチドプローブの複合化に適する
ｍ−官能性分子−の例は、Ｎ−スクシニミジル４−グリ
オキサリルベンツエート、カルボニル、イミダゾール、
ジメチルスベリミゾ−１，１−エチル−１，３−ジメチ
ルアミノプロピルカーポジ、イミド（ＥＤＡＣ）、パラ
−ニトロフェニル３−（２−ブロモ、３−ケトブチルス
ルホニル）−プロピオネートまたは核酸の活性エステル
、グルタルアルデヒド、および他の適当な同等物を包含
する。
ｍ−官能性分子−の例は、Ｎ−スクシニミジル４−グリ
オキサリルベンツエート、カルボニル、イミダゾール、
ジメチルスベリミゾ−１，１−エチル−１，３−ジメチ
ルアミノプロピルカーポジ、イミド（ＥＤＡＣ）、パラ
−ニトロフェニル３−（２−ブロモ、３−ケトブチルス
ルホニル）−プロピオネートまたは核酸の活性エステル
、グルタルアルデヒド、および他の適当な同等物を包含
する。
好ましいＢ−Ｌ−Ｅ複合化技術の例は次の反応を包含す
る。次の式において、ＤはヌクレオチドＺの残部を形成
するリポースまたはデオキシリホース糖を意味する。
る。次の式において、ＤはヌクレオチドＺの残部を形成
するリポースまたはデオキシリホース糖を意味する。
ｌ、シチジレートヌクレオチドおよびアルキルアミ〉・
またはアリールアミンのビサルファユ旦］勧ヒ ｌ ■ １ ■ｌ） 前述のようにＴｄＴを使用してプローブボＩＪヌクレオ
チド戸〜伺加されたシチジ１／−トヌクレオチド残基を
、ｎ−アルキルまたはアルカリールアミンを使用するビ
サルファイト触媒アミン交換により、Ｎ４−置換シチジ
レート誘導体へ転化することができる。前記ｎ−アルキ
ルまたはアルカリールアミンは、変性塩基を酵素活性化
因子ポリペプチドＸと結合させるスペーサーアームの役
目をする。関連する複合化化学は次の文献に詳述されて
いる＋５ｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏ ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ。
またはアリールアミンのビサルファユ旦］勧ヒ ｌ ■ １ ■ｌ） 前述のようにＴｄＴを使用してプローブボＩＪヌクレオ
チド戸〜伺加されたシチジ１／−トヌクレオチド残基を
、ｎ−アルキルまたはアルカリールアミンを使用するビ
サルファイト触媒アミン交換により、Ｎ４−置換シチジ
レート誘導体へ転化することができる。前記ｎ−アルキ
ルまたはアルカリールアミンは、変性塩基を酵素活性化
因子ポリペプチドＸと結合させるスペーサーアームの役
目をする。関連する複合化化学は次の文献に詳述されて
いる＋５ｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏ ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ。
４０：８３９（１９７０）；Ｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、ＢＩｏｃｈｅｍ、７ ３ ° ８２１（１９８３）
；および５ｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ、、”Ｃｒｏｓｓ
ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
ａ’ｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｖ Ｂ１５ｕｌｆｊｔ
ｅ”、ｉｎ ＡｄＶｏｌ、Ａ、、（Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、１９７７）ｐ、６３４゜ ｊ二の反応の順序を参照すると、シチジレート誘導体Ｉ
ＩＩをビサルファイトイオンと２０〜３７℃、ｐＨ６，
０〜７．５において約６〜３０時間反応させて、中間体
■を生成させる。０．１−１モルのビサルファイ１４度
が適当である。アミン試薬ＮＨ２−Ｌ−Ｒ” （ここで
Ｌは上に定義したとおり仕る）の反応は Ｎ４−置換誘
導体Ｖを生成する。適当なアミンＮＨ２−Ｌ−Ｒ“は、
リシン、グリシン、グリシルグリシン、メチルアミン、
ジメチルアミン、ピロリジン、アニリン、β−ナフチル
アミンなどを包含する。次いで、得られるＮ４−アルキ
ル化シチジレート残基を、塩基で処理し、次いでポリペ
プチド酵素活性化因子Ｅ、例えば、ウロキナーゼで、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カーポ
ジ・イミド（ＥＤＡＣ）の存在下で約２５℃において処
理する。得られるプローブ複合体は、すぐれた収率で、
適当な媒体を使用するクロマトグラフィーにより精製す
ることができる。
Ｊ、ＢＩｏｃｈｅｍ、７ ３ ° ８２１（１９８３）
；および５ｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ、、”Ｃｒｏｓｓ
ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
ａ’ｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｖ Ｂ１５ｕｌｆｊｔ
ｅ”、ｉｎ ＡｄＶｏｌ、Ａ、、（Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、１９７７）ｐ、６３４゜ ｊ二の反応の順序を参照すると、シチジレート誘導体Ｉ
ＩＩをビサルファイトイオンと２０〜３７℃、ｐＨ６，
０〜７．５において約６〜３０時間反応させて、中間体
■を生成させる。０．１−１モルのビサルファイ１４度
が適当である。アミン試薬ＮＨ２−Ｌ−Ｒ” （ここで
Ｌは上に定義したとおり仕る）の反応は Ｎ４−置換誘
導体Ｖを生成する。適当なアミンＮＨ２−Ｌ−Ｒ“は、
リシン、グリシン、グリシルグリシン、メチルアミン、
ジメチルアミン、ピロリジン、アニリン、β−ナフチル
アミンなどを包含する。次いで、得られるＮ４−アルキ
ル化シチジレート残基を、塩基で処理し、次いでポリペ
プチド酵素活性化因子Ｅ、例えば、ウロキナーゼで、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カーポ
ジ・イミド（ＥＤＡＣ）の存在下で約２５℃において処
理する。得られるプローブ複合体は、すぐれた収率で、
適当な媒体を使用するクロマトグラフィーにより精製す
ることができる。
あるいは、セミカル八シト塩酸塩またはカーポヒドラジ
ドを上に表示したアミンの代わりに二官能性結合分子と
して使用することができる。ポリペプチドと核酸との間
のビサルファイトー媒介複合化反応におけるカーポヒド
ラジドの使用は、５ｈａｒｋｅｒ ｐｔ ａｌ、、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎ：す四日」ユ１１−！虹１ 、
ＬＩＸ 。
ドを上に表示したアミンの代わりに二官能性結合分子と
して使用することができる。ポリペプチドと核酸との間
のビサルファイトー媒介複合化反応におけるカーポヒド
ラジドの使用は、５ｈａｒｋｅｒ ｐｔ ａｌ、、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎ：す四日」ユ１１−！虹１ 、
ＬＩＸ 。
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙ。
ｒｋ、１９７９）、ｐ、１５５に開示されている。
２、タンパク質上の５−ブロモデオキシウリジン およ
びスルフヒドリル基夏良を北−一Ｉ Ｄ！） ■ − ５−ブロモデオキシウリジン（■）（これは商業的に入
手することがでＳ、あるいはＶｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ
、、Ｊ、Ａｍ、Ｃ’ｈｅｍ、Ｓ。
びスルフヒドリル基夏良を北−一Ｉ Ｄ！） ■ − ５−ブロモデオキシウリジン（■）（これは商業的に入
手することがでＳ、あるいはＶｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ
、、Ｊ、Ａｍ、Ｃ’ｈｅｍ、Ｓ。
ｃ、７５：２０１７（１９５３）中に開示されている物
質により製造することができる）を、プローブポリヌク
し・オチド、例えば、−水銀Ｍ１３またはｐＢＲ３２２
制限断片へ、末端デオキシヌ々レオチジルトランスフェ
ラーゼ（ＴｄＴ）へ結合し、５−プロモデオキシウリジ
レートのテイルをもつポリヌクレオチド断片を生成する
ことができる。
質により製造することができる）を、プローブポリヌク
し・オチド、例えば、−水銀Ｍ１３またはｐＢＲ３２２
制限断片へ、末端デオキシヌ々レオチジルトランスフェ
ラーゼ（ＴｄＴ）へ結合し、５−プロモデオキシウリジ
レートのテイルをもつポリヌクレオチド断片を生成する
ことができる。
次いで、得られるティルト（ｔａｊｌｅｄ）ポリヌクレ
オチドを側鎖のスルフヒドリル基が結合しているポリペ
プチド酵素活性化因子Ｅと反応さけることができる。適
当なスルフヒドリル結合基を結合させる１つの方法は、
２−イミノチオラン・ＭＣＩと適当なポリペプチド酵素
活性化因子、例えば、ウロキナーゼと反応させてメルカ
プトブチレートタンパク質を生成する。このタンパク質
は、５−プロモデオキシウリジレートのテイルをもつプ
ローブ断片と反応させると、プローブとタンパク質との
複合体が生成する。このプローブ複合体は、適当な媒質
を使用するクロマトグラフィーにより反応混合物から分
離することができる。
オチドを側鎖のスルフヒドリル基が結合しているポリペ
プチド酵素活性化因子Ｅと反応さけることができる。適
当なスルフヒドリル結合基を結合させる１つの方法は、
２−イミノチオラン・ＭＣＩと適当なポリペプチド酵素
活性化因子、例えば、ウロキナーゼと反応させてメルカ
プトブチレートタンパク質を生成する。このタンパク質
は、５−プロモデオキシウリジレートのテイルをもつプ
ローブ断片と反応させると、プローブとタンパク質との
複合体が生成する。このプローブ複合体は、適当な媒質
を使用するクロマトグラフィーにより反応混合物から分
離することができる。
３、アデニレートおよびシチジレートヌクレオチド残基
とブロモスルフリル架橋体（ｃｒｏｓｓｌｉｒ＋ｋｅｒ
との ヒ ある柿のブロモスルホニル−官能性化合物、例えば、（
２−ブロモ−３−オキソブチルスルホニル）プロピオネ
ートの反応性エステルは、アデニレートまたはシリジレ
ートヌクレオチドと約６までのｐＨ値において優先的に
反応する。次いで、（ｑられる変性ポリヌクレオチドを
ポリペプチド酵素活性化因子とｐＨ７，５〜９において
反応させ、リジンまたは他の塩基性側鎖をアシル化し、
そしてヌクレオチド−ポリペプチド複合体を形成するこ
とができる。この反応の好ましい架橋体は３−（２−ブ
ロモ−３−オキソブチルスルホニル）プロピオン酸Ｐ−
ニトロフェニルエステルである。これはＦｉｎｋ ｅｔ
ａｌ、、Ｂｊｏｃｈｅｍ、ｓ＊ｃ、Ｔｒａｎｓ ３：
１０１４ （１９７５）またはＦｉｎｋ ｅｔ ａｌ、
、Ａｎａｌ 、Ｂ ｉ ｏｃｈｅｍ、↓０８：３９４（
１９８０）中に開示されている方法により製造すること
ができる。
とブロモスルフリル架橋体（ｃｒｏｓｓｌｉｒ＋ｋｅｒ
との ヒ ある柿のブロモスルホニル−官能性化合物、例えば、（
２−ブロモ−３−オキソブチルスルホニル）プロピオネ
ートの反応性エステルは、アデニレートまたはシリジレ
ートヌクレオチドと約６までのｐＨ値において優先的に
反応する。次いで、（ｑられる変性ポリヌクレオチドを
ポリペプチド酵素活性化因子とｐＨ７，５〜９において
反応させ、リジンまたは他の塩基性側鎖をアシル化し、
そしてヌクレオチド−ポリペプチド複合体を形成するこ
とができる。この反応の好ましい架橋体は３−（２−ブ
ロモ−３−オキソブチルスルホニル）プロピオン酸Ｐ−
ニトロフェニルエステルである。これはＦｉｎｋ ｅｔ
ａｌ、、Ｂｊｏｃｈｅｍ、ｓ＊ｃ、Ｔｒａｎｓ ３：
１０１４ （１９７５）またはＦｉｎｋ ｅｔ ａｌ、
、Ａｎａｌ 、Ｂ ｉ ｏｃｈｅｍ、↓０８：３９４（
１９８０）中に開示されている方法により製造すること
ができる。
４ ４−グリオキサリル安息香酸エステルおよびグアニ
レートヌクレオナド の 刈 二官能性架橋剤の他のクラス、４−グリオキサリル安、
（１，香酸のエステルはグアニｌ／−１ヌクレオチ）”
ａ ：Ｊｊ；と複合体を優先的に形成する。次いで、
ｆｌＢられる変性ポリヌクレオチドをポリペプチド酵素
活性化因子１例えば、ウロキナーゼと反応させて、プロ
ーブ−ポリペプチド複合体を得ることができる。この複
合化に好ましい試薬はスクシニミノル４−グリオキサリ
ルベンゾエートである。
レートヌクレオナド の 刈 二官能性架橋剤の他のクラス、４−グリオキサリル安、
（１，香酸のエステルはグアニｌ／−１ヌクレオチ）”
ａ ：Ｊｊ；と複合体を優先的に形成する。次いで、
ｆｌＢられる変性ポリヌクレオチドをポリペプチド酵素
活性化因子１例えば、ウロキナーゼと反応させて、プロ
ーブ−ポリペプチド複合体を得ることができる。この複
合化に好ましい試薬はスクシニミノル４−グリオキサリ
ルベンゾエートである。
５、シチジレート、アゾニレ−１・およびグアニレート
ヌクレオチド残基とジメチルホルムアミドアセタールと
の し Ａ’ （ｃＲ’ｓ ） ２ ｘＩＩＩＸ■ Ｘ■ シチジレート、アデニレートおよびグアニレートヌクレ
オチド残基を室温においてジメチルホルムアミドアセタ
ール、例えば、ジメチルホルムアミドジインプロピルア
セタールまたはジメチルホルムアミドジエチルアセター
ルと反応させて、Ｎ−ジメチルアミノホルムアミジン誘
導体ＸＩＶを形成することができる。Ｈｏ１ｙ ｅｔ
ａｍ、。
ヌクレオチド残基とジメチルホルムアミドアセタールと
の し Ａ’ （ｃＲ’ｓ ） ２ ｘＩＩＩＸ■ Ｘ■ シチジレート、アデニレートおよびグアニレートヌクレ
オチド残基を室温においてジメチルホルムアミドアセタ
ール、例えば、ジメチルホルムアミドジインプロピルア
セタールまたはジメチルホルムアミドジエチルアセター
ルと反応させて、Ｎ−ジメチルアミノホルムアミジン誘
導体ＸＩＶを形成することができる。Ｈｏ１ｙ ｅｔ
ａｍ、。
Ｃｏ ｌ Ｉ 、Ｃｚｅｃｈ、Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕ旦
エ ３９４２５３ （１９６９）は単離されたりポヌク
レオチドの類似の反応を開示している。これらの化合物
は、引き続いて、カルボニルジイミダゾールを使用する
親核反応を経てタンパク質に結合させることができる。
エ ３９４２５３ （１９６９）は単離されたりポヌク
レオチドの類似の反応を開示している。これらの化合物
は、引き続いて、カルボニルジイミダゾールを使用する
親核反応を経てタンパク質に結合させることができる。
ＦＡ素Ｌし１ｇ −一ポリペプチド
木発明のプローブのリポータ−系において適当に使用す
ることができる多数の酵素原が知られている。酵素原は
、プローブ／標的交雑を検出する方７ノ、と１．て、試
薬の安定性、検出の増大、および低いバー２クグラウン
ド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）の活性または「、′イズ（
ｎｏｉｓｅ）Ｊという利点を提供する。
ることができる多数の酵素原が知られている。酵素原は
、プローブ／標的交雑を検出する方７ノ、と１．て、試
薬の安定性、検出の増大、および低いバー２クグラウン
ド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）の活性または「、′イズ（
ｎｏｉｓｅ）Ｊという利点を提供する。
酵素原は、限定されたタンパク分解により種々の生物活
性分子に不可逆的に転化されることができる。はとんど
の既知の酵素原は活性化されて酵素にｙれるが、全身的
活性を有するペプチドホルモンに、あるいはセルファセ
ンブリ−（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を行って構造
的細胞物質を生成することができる分子に、転化するこ
とができる多数の例が存在する。例示的な酵素原／酵素
原誘導体酵素対のリストを下表工に記載するニー犬ニー 一醍」１〜 −生上１ｕ１分子− １リプシノゲン トリプシン キモトリプシノゲン キモトリプシン プロコリパーゼ コリパーゼ プロホスホリパーゼ ホスホリパーゼ プロレンニン レンニン プロカルボキシペプチ カルボキシペプチダーゼダーゼ
Ａ Ａ プロカルボキシペプチ カルボキシペプチダーゼグーゼ
Ｂ Ｂ キニノゲン キニニ／ プロエラスターゼ エラスターゼ プし・カリクレイン カリクレイ〉′ ペブシノゲン ベプシン プラスミノゲン プラスミン フィブリノゲン フィブリン プロトロンビン トロンビン プラスミノゲンプロ活 プラスミノゲンプロ活性性化因
子Ｃ１ｓ 化因子Ｃ！ ｓ （活性化されたもの） プロアクロシン アクロシン 凝結因子ＸＩ 凝結因子ＸＩａ 慶結固結因子Ｉ 凝結因子Ｘ ＩＩ ａ凝結因子ｘｍ
ａ結因子ＸＩＩＩａ プロコラゲナーゼ コラゲナーゼ プロココオナーゼ ココオナーゼ アンギオテンシノゲン アンギオテンシンブロインスリ
ン インスリン プロパラヂロイドホル パラチロイドホルモンプロコラ
ーゲン（可溶 プロコラーゲン（不溶性） 性） プロキチンシンセター キチンシンセターゼゼ（酵母） ウイルスコー［タンパ アセンブリー（ａｓｓｅり質前
駆物賀（パクテ ｍｂ’１ｙ）−能力（ｃ。
性分子に不可逆的に転化されることができる。はとんど
の既知の酵素原は活性化されて酵素にｙれるが、全身的
活性を有するペプチドホルモンに、あるいはセルファセ
ンブリ−（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を行って構造
的細胞物質を生成することができる分子に、転化するこ
とができる多数の例が存在する。例示的な酵素原／酵素
原誘導体酵素対のリストを下表工に記載するニー犬ニー 一醍」１〜 −生上１ｕ１分子− １リプシノゲン トリプシン キモトリプシノゲン キモトリプシン プロコリパーゼ コリパーゼ プロホスホリパーゼ ホスホリパーゼ プロレンニン レンニン プロカルボキシペプチ カルボキシペプチダーゼダーゼ
Ａ Ａ プロカルボキシペプチ カルボキシペプチダーゼグーゼ
Ｂ Ｂ キニノゲン キニニ／ プロエラスターゼ エラスターゼ プし・カリクレイン カリクレイ〉′ ペブシノゲン ベプシン プラスミノゲン プラスミン フィブリノゲン フィブリン プロトロンビン トロンビン プラスミノゲンプロ活 プラスミノゲンプロ活性性化因
子Ｃ１ｓ 化因子Ｃ！ ｓ （活性化されたもの） プロアクロシン アクロシン 凝結因子ＸＩ 凝結因子ＸＩａ 慶結固結因子Ｉ 凝結因子Ｘ ＩＩ ａ凝結因子ｘｍ
ａ結因子ＸＩＩＩａ プロコラゲナーゼ コラゲナーゼ プロココオナーゼ ココオナーゼ アンギオテンシノゲン アンギオテンシンブロインスリ
ン インスリン プロパラヂロイドホル パラチロイドホルモンプロコラ
ーゲン（可溶 プロコラーゲン（不溶性） 性） プロキチンシンセター キチンシンセターゼゼ（酵母） ウイルスコー［タンパ アセンブリー（ａｓｓｅり質前
駆物賀（パクテ ｍｂ’１ｙ）−能力（ｃ。
リオフ了−ジ） ｍｐｅｔｅｎｔ）ウィルスタンパク質
カルシウド／カルモ カルシウム独立酵素デ、リン依存
性酵素 ＮＡＤ”キナーゼ ＮＡＤ＋キナーゼ （Ｃａ＋“依存性） （Ｃａ＋１独立）Ｃａ” ” ７
Ｍｇ” ” Ａ ＡＴパーゼ、（ｃａ＋十Ｔバーゼ、を
推動物 独立） の筋肉（Ｃａ＋＋依存 性） 環式ヌクレオチドホ 環式ヌクレオチドホスホジェステ
ラーゼ スホジエステラーゼ（Ｃａ＋＋依存性） （Ｃ
ａ＋＋独立）本発明の実施において利用することができ
、あるいは適合させることができるある数の生物学的カ
スケード、例えば、凝固、相補性、および消化のカステ
ートは知られている。 ・般に、酵素原誘導酵素と反応
して直接観測できる変更された基質の形態を生成する基
質の試薬を使用することができ、あるいは、酵素原誘導
酵素と反応したとき、着色した物質、蛍光を有する物質
、またはリン光を有する遺伝標識物質を生成する基質を
使用することができる。
性酵素 ＮＡＤ”キナーゼ ＮＡＤ＋キナーゼ （Ｃａ＋“依存性） （Ｃａ＋１独立）Ｃａ” ” ７
Ｍｇ” ” Ａ ＡＴパーゼ、（ｃａ＋十Ｔバーゼ、を
推動物 独立） の筋肉（Ｃａ＋＋依存 性） 環式ヌクレオチドホ 環式ヌクレオチドホスホジェステ
ラーゼ スホジエステラーゼ（Ｃａ＋＋依存性） （Ｃ
ａ＋＋独立）本発明の実施において利用することができ
、あるいは適合させることができるある数の生物学的カ
スケード、例えば、凝固、相補性、および消化のカステ
ートは知られている。 ・般に、酵素原誘導酵素と反応
して直接観測できる変更された基質の形態を生成する基
質の試薬を使用することができ、あるいは、酵素原誘導
酵素と反応したとき、着色した物質、蛍光を有する物質
、またはリン光を有する遺伝標識物質を生成する基質を
使用することができる。
酵素原を酵素原誘導酵素に転化するポリペプチド酵素活
性化因子Ｘは、通常タンパク分解活性を有するタンパク
質である。適当な活性化因子の例は、エンテロペプチダ
ーゼであり、これはトリプンノゲンを酵素的に活性なト
リプシンに転化する。プローブプリヌクレオチドおよび
エンテロペプチダーゼの複合体は、標的ポリヌクレオチ
ドとの交雑および交雑していない物質の除去後、トリプ
ジンノゲン、５．５’−ジチオビス２−二トロ安息香酸
（ＤＴＮＢ、Ｓ ｉ ｇｍａ）およびチオベンジルーベ
ンンジルオキシ力ルポニルーＬ−リジネ − ト （Ｚ
ＬＴＢＥ、Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）からなる検出試薬と接触ｙせることができる。エ
ンテロペプチダーゼおよびトリプシン様酵素の両者（ト
リプシン分子を除外する）は、ＺＬＴＢＥを急速に開裂
（ｃｌｅａｖｅ）ｌ、て、ＤＴＮＢの存在下に、４０５
ｎｍにおいて吸収する着色物質を生ずる。トリプシノゲ
ン活性化の量は、接触してエンテロペプチダーゼ−プロ
ーブ複合体の数に依存し、活性化されたトリプシンの分
子の生ずるカスケードは基質を開裂（ｃ ｊｅ ａｖｅ
）して検出可能な生成物を形成する。こうして、相補的
標的ポリヌクレオチドとの交雑として存在する少数のエ
ンテロペプチダーゼ−７’ロ一プ複合体は、ト１／プン
２′ゲンがらノ多数のトリプシン分子の生成物を触媒し
、検出６丁能な憤象の数を増幅し、そして交雑検出系の
感度を増加することができる。
性化因子Ｘは、通常タンパク分解活性を有するタンパク
質である。適当な活性化因子の例は、エンテロペプチダ
ーゼであり、これはトリプンノゲンを酵素的に活性なト
リプシンに転化する。プローブプリヌクレオチドおよび
エンテロペプチダーゼの複合体は、標的ポリヌクレオチ
ドとの交雑および交雑していない物質の除去後、トリプ
ジンノゲン、５．５’−ジチオビス２−二トロ安息香酸
（ＤＴＮＢ、Ｓ ｉ ｇｍａ）およびチオベンジルーベ
ンンジルオキシ力ルポニルーＬ−リジネ − ト （Ｚ
ＬＴＢＥ、Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）からなる検出試薬と接触ｙせることができる。エ
ンテロペプチダーゼおよびトリプシン様酵素の両者（ト
リプシン分子を除外する）は、ＺＬＴＢＥを急速に開裂
（ｃｌｅａｖｅ）ｌ、て、ＤＴＮＢの存在下に、４０５
ｎｍにおいて吸収する着色物質を生ずる。トリプシノゲ
ン活性化の量は、接触してエンテロペプチダーゼ−プロ
ーブ複合体の数に依存し、活性化されたトリプシンの分
子の生ずるカスケードは基質を開裂（ｃ ｊｅ ａｖｅ
）して検出可能な生成物を形成する。こうして、相補的
標的ポリヌクレオチドとの交雑として存在する少数のエ
ンテロペプチダーゼ−７’ロ一プ複合体は、ト１／プン
２′ゲンがらノ多数のトリプシン分子の生成物を触媒し
、検出６丁能な憤象の数を増幅し、そして交雑検出系の
感度を増加することができる。
本発明のプローブのために好ましい検１１ｊ糸は、プラ
スミ、Ｉゲン活性化因子、例えば、ストレプトキナーゼ
またはウロキナーゼとプローブポリヌクレオチドとの複
合体を使用し、そして１ｔｉｊ記複合体は交雑および交
雑していない物質の除去後、プラスミノケンに富んだフ
ィブリンのマス（ｍａｓＳ）と接触さけることができる
。この明細書を通じて使用するとき、「プラスミノケン
活性化因子」はプラスミノケンを清浄化（ｃｌｅａｒ）
Ｌ−ｃ ｔｌ Ｍ素溶解的に（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔ
＋ｃａｚｙ）活性なプラスミンを生成することができる
ポリペプチドを意味する。ウロキナーゼは効力のある線
維素溶解活性化因子であり、これは高度〕 に特異性のプロテアーゼとして、酵素原のプラスミノケ
ンを線維素溶解的に活性なプラスミンに転化する。プラ
スミン、すなわち、プロテアーゼは不溶性フィブリンポ
リマーを効果的に消化して可溶性フィブリン断片にする
。さらに、ウロキナーゼはエステル分解活性およびアミ
ド分解活性を有する。
スミ、Ｉゲン活性化因子、例えば、ストレプトキナーゼ
またはウロキナーゼとプローブポリヌクレオチドとの複
合体を使用し、そして１ｔｉｊ記複合体は交雑および交
雑していない物質の除去後、プラスミノケンに富んだフ
ィブリンのマス（ｍａｓＳ）と接触さけることができる
。この明細書を通じて使用するとき、「プラスミノケン
活性化因子」はプラスミノケンを清浄化（ｃｌｅａｒ）
Ｌ−ｃ ｔｌ Ｍ素溶解的に（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔ
＋ｃａｚｙ）活性なプラスミンを生成することができる
ポリペプチドを意味する。ウロキナーゼは効力のある線
維素溶解活性化因子であり、これは高度〕 に特異性のプロテアーゼとして、酵素原のプラスミノケ
ンを線維素溶解的に活性なプラスミンに転化する。プラ
スミン、すなわち、プロテアーゼは不溶性フィブリンポ
リマーを効果的に消化して可溶性フィブリン断片にする
。さらに、ウロキナーゼはエステル分解活性およびアミ
ド分解活性を有する。
ウロキナーゼの急速な、感受性のある便利な検定は、事
実存在し、その例は蛍光測定、発色（Ｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｉｃ）、カゼイン分解（ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ）
およびフィブリン溶解の手順である。しかしながら、好
ましい検出系はウロキナーゼのフィブリン溶解性質を利
用し、ここでプラスミノケンを合成フィブリン凝塊へ添
加すると、より高い感度が得られる。こうして、得られ
る「富んだＪフィブリンプレー）（ｆｉｂｒｉｎｐｌａ
ｔｅ）を活性ウロキナーゼと接触させるとき、タンパク
分解増幅カスケードが発生する。
実存在し、その例は蛍光測定、発色（Ｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｉｃ）、カゼイン分解（ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ）
およびフィブリン溶解の手順である。しかしながら、好
ましい検出系はウロキナーゼのフィブリン溶解性質を利
用し、ここでプラスミノケンを合成フィブリン凝塊へ添
加すると、より高い感度が得られる。こうして、得られ
る「富んだＪフィブリンプレー）（ｆｉｂｒｉｎｐｌａ
ｔｅ）を活性ウロキナーゼと接触させるとき、タンパク
分解増幅カスケードが発生する。
このような系の従来の使用において、ウロキナーゼを含
有する試料をブイプリンポリマーを含有するペトリ皿の
表面へ適用する。３７℃において１〜１８時間の間で変
化することができる時間後、円形の液化区域が接触点に
おいて明らかとなり。
有する試料をブイプリンポリマーを含有するペトリ皿の
表面へ適用する。３７℃において１〜１８時間の間で変
化することができる時間後、円形の液化区域が接触点に
おいて明らかとなり。
それは肉眼で容易に検出することができる。
「富んだ」フィブリンのプレー１の検定の感度は、プラ
スミノケン濃縮により提供される追加のタンパク分解増
幅から得られる。詳しくは、ウロキナーゼはフィブリン
溶解酵素、すなわち、プラスミンを生成し、これは３つ
の機能を有する。第１に、プラスミンはフィブリンポリ
マーを液状のフィブリン断片に直接分解する。第２に、
プラスミンは弱いプラスミノケン活性化因子として作用
し２、プラスミノケンから追加のプラスミンを生成する
ウロキナーゼの能力をまねる。第３に、プラスミンはプ
ラスミノケンＡをＢ型に転化し、このＢ型はウロキナー
ゼ゛およびプラスミンによるプラスミノケンのプラスミ
ンへの転化を増強する。
スミノケン濃縮により提供される追加のタンパク分解増
幅から得られる。詳しくは、ウロキナーゼはフィブリン
溶解酵素、すなわち、プラスミンを生成し、これは３つ
の機能を有する。第１に、プラスミンはフィブリンポリ
マーを液状のフィブリン断片に直接分解する。第２に、
プラスミンは弱いプラスミノケン活性化因子として作用
し２、プラスミノケンから追加のプラスミンを生成する
ウロキナーゼの能力をまねる。第３に、プラスミンはプ
ラスミノケンＡをＢ型に転化し、このＢ型はウロキナー
ゼ゛およびプラスミンによるプラスミノケンのプラスミ
ンへの転化を増強する。
プラスミノケン活性化因子、例えば、ウロキナーゼによ
るプラスミノケンの活性化は、フィブリンモノマー、フ
ィブリノケン、フィブリン（）ケン）断片、Ｌ−リジン
、クエン酸塩緩衝液および他の試薬により有意に増強さ
れうる。例えば、Ｇｌｕ−プラスミノケンはＧｌｕ−プ
ラスミンヘウロキナーゼによりゆっくり活性化される；
ウロキナーゼ活性化因子によるタンノくり分解活性イヒ
は、フィブリンモノマー、フィブリメタン、フィブリン
（メタン）断片、およびＬ−リジンの存在ドに数倍増強
される。これらの効果は、また、プラスミンによるＧｌ
ｕ−プラスミノケンのＬｙｓ−プラスミノケンへの開裂
速度を増大し、そしていったんＬｙｓ−プラスミ、Ｉケ
ンが形成すると、フィブリン（メタン）およびフィブリ
ン（メタン）断片はそれへ強く結合する。次１．％で、
１ｙｓ−プラスミノケンはウロキナーゼ活性化を有に受
けやすく、そしてエフェクターへ結合すると、自己分解
から保護される。全体的に、これらの機構はプラスミ・
′ケン活性化因子活性を増大しならびに生ずるプラスミ
ン活性を自己分解から保護することにより、より大きい
フィブリン溶解効率を提供するために利用することがで
きる。
るプラスミノケンの活性化は、フィブリンモノマー、フ
ィブリノケン、フィブリン（）ケン）断片、Ｌ−リジン
、クエン酸塩緩衝液および他の試薬により有意に増強さ
れうる。例えば、Ｇｌｕ−プラスミノケンはＧｌｕ−プ
ラスミンヘウロキナーゼによりゆっくり活性化される；
ウロキナーゼ活性化因子によるタンノくり分解活性イヒ
は、フィブリンモノマー、フィブリメタン、フィブリン
（メタン）断片、およびＬ−リジンの存在ドに数倍増強
される。これらの効果は、また、プラスミンによるＧｌ
ｕ−プラスミノケンのＬｙｓ−プラスミノケンへの開裂
速度を増大し、そしていったんＬｙｓ−プラスミ、Ｉケ
ンが形成すると、フィブリン（メタン）およびフィブリ
ン（メタン）断片はそれへ強く結合する。次１．％で、
１ｙｓ−プラスミノケンはウロキナーゼ活性化を有に受
けやすく、そしてエフェクターへ結合すると、自己分解
から保護される。全体的に、これらの機構はプラスミ・
′ケン活性化因子活性を増大しならびに生ずるプラスミ
ン活性を自己分解から保護することにより、より大きい
フィブリン溶解効率を提供するために利用することがで
きる。
本発明のプローブと一緒に使用するために適合する他の
ウロキナーゼ検出検定は、次の文献中に開示されている
ものを包含する：Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ ｅｔ
ａｌ、、Ａｎａｌ、Ｂｉ。
ウロキナーゼ検出検定は、次の文献中に開示されている
ものを包含する：Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ ｅｔ
ａｌ、、Ａｎａｌ、Ｂｉ。
ｃｈｅｍ、８３：１４３（１９７７）；Ｚｉｍｍｅｒｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ−Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ 、ＵＳＡ ７５ ： ７５０（１９７８）；Ｂｒ
ａｋｍａｎ ｅｔ ａｌ、。
ａｎ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ−Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ 、ＵＳＡ ７５ ： ７５０（１９７８）；Ｂｒ
ａｋｍａｎ ｅｔ ａｌ、。
ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｂｌｅｅｄｎ口
５ｏｒｄｅｒｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ ｊ９７１）ｐ、３３２．およびＨａｖ
ｅｒｋａｔｅ ｅｔ６（１９７４）。前者の２件の参考
文献はプラスミン活性についての蛍光検定を開示し、そ
して後者の２件の参考文献は従来のブイプリンプレート
検定技術を開示している。
５ｏｒｄｅｒｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ ｊ９７１）ｐ、３３２．およびＨａｖ
ｅｒｋａｔｅ ｅｔ６（１９７４）。前者の２件の参考
文献はプラスミン活性についての蛍光検定を開示し、そ
して後者の２件の参考文献は従来のブイプリンプレート
検定技術を開示している。
本発明のプローブ組成物と標的ポリヌクレオチドとの間
の交雑は、当業者に知られた適当な方法により達成する
ことができる。一般に、便利な円滑な技術は適ちな交雑
膜フィルターを使用し、これに変性（ｄｅｎａｔ ｕｒ
ｅｄ）標的ＤＮＡ１ｌＳｏｕｔｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、９８：５０３ （１９７５）の方法を他の適当
な手順により１Ｍ定する。必要に応じて、５〜１０％の
硫酸デキストランまたは他の混和物（ａｄｕｌｔｅｒａ
ｒａｔ）を交雑溶奴中に混和して交雑を加速することが
できる。
の交雑は、当業者に知られた適当な方法により達成する
ことができる。一般に、便利な円滑な技術は適ちな交雑
膜フィルターを使用し、これに変性（ｄｅｎａｔ ｕｒ
ｅｄ）標的ＤＮＡ１ｌＳｏｕｔｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、９８：５０３ （１９７５）の方法を他の適当
な手順により１Ｍ定する。必要に応じて、５〜１０％の
硫酸デキストランまたは他の混和物（ａｄｕｌｔｅｒａ
ｒａｔ）を交雑溶奴中に混和して交雑を加速することが
できる。
プローブ組成物を使用する交雑および適当な洗浄工程後
、得られる固定化されたプローブ／標的交雑を含有する
膜を、ポリヌクレオチド−ウロキナーゼプローブ複合体
の場合において、濃縮したフィブリンプレートと直接接
触させることができ、あるいは、適当ならば、プラスミ
ノケンまたはＪＭな発色または蛍光の検出に適当な基質
と直接接触させることができる。
、得られる固定化されたプローブ／標的交雑を含有する
膜を、ポリヌクレオチド−ウロキナーゼプローブ複合体
の場合において、濃縮したフィブリンプレートと直接接
触させることができ、あるいは、適当ならば、プラスミ
ノケンまたはＪＭな発色または蛍光の検出に適当な基質
と直接接触させることができる。
次の実施例により、本発明の種々の面および実施態様と
説明する。実施例において、すべての部およびパーセン
トは、特記しないかぎり、重りによる。すべての温度は
セ氏であり、そしてプロトン核磁気共鳴（”Ｈ−ＮＭＲ
）化学シフトは、内を兆参照テトラメチル・シラン′か
らの夕′ウンフィールｉ：、）δ中位、ｐｐｍで報告す
る・ −災為誇一 実施例１： ５−プロモデオキジウリンレートヌクし、
オチドおよびウロキナーゼの複 合化 ２５ｍｇ（０，１８ミリモル）の２−イミノチオラン−
ＭＣＩを、１ ｍ ｌのホウ酸ナトリウム緩衝液（１５
ミリモル、ｐＨ８，５）中の３ｍｇのウロキナーゼの溶
液へ添加し、そして０℃において４５分間、インキュベ
ーションした。次いで、得られる反応混合物を各５００
ｍ１の３交換のＩ・リス（Ｔ ｒ ｉ ｓ）／ＥＤＴＡ
（Ｊリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）緩衝液
（１０ミリモル／０．１ミリモル、ｐＨ７、４、以後ｒ
ＴＥ緩衝液」）に対して、約５℃において透析する。保
持される部分は、ＴＥ緩衝液中にメルカプトブチレート
化ウロキナーゼを含有し、未反応のイミノチオランおよ
びその加水分解生成物を含有しない。
説明する。実施例において、すべての部およびパーセン
トは、特記しないかぎり、重りによる。すべての温度は
セ氏であり、そしてプロトン核磁気共鳴（”Ｈ−ＮＭＲ
）化学シフトは、内を兆参照テトラメチル・シラン′か
らの夕′ウンフィールｉ：、）δ中位、ｐｐｍで報告す
る・ −災為誇一 実施例１： ５−プロモデオキジウリンレートヌクし、
オチドおよびウロキナーゼの複 合化 ２５ｍｇ（０，１８ミリモル）の２−イミノチオラン−
ＭＣＩを、１ ｍ ｌのホウ酸ナトリウム緩衝液（１５
ミリモル、ｐＨ８，５）中の３ｍｇのウロキナーゼの溶
液へ添加し、そして０℃において４５分間、インキュベ
ーションした。次いで、得られる反応混合物を各５００
ｍ１の３交換のＩ・リス（Ｔ ｒ ｉ ｓ）／ＥＤＴＡ
（Ｊリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）緩衝液
（１０ミリモル／０．１ミリモル、ｐＨ７、４、以後ｒ
ＴＥ緩衝液」）に対して、約５℃において透析する。保
持される部分は、ＴＥ緩衝液中にメルカプトブチレート
化ウロキナーゼを含有し、未反応のイミノチオランおよ
びその加水分解生成物を含有しない。
新しく調製したトランスフェラーゼ緩衝液（０，１モル
のカリウム力コジレート、ｐＨ７゜２．０．２ミリモル
のジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびｏ、ｏｏｔモル
のＣｏＣｌ２を含有する）中にｐＢＲ３２２且１副Ｔｌ
消化物（１６９ｐｍｏ ｌの３′末端／ ｍ ｌ ）お
よび５−ブロモデオキシウリジントリホスフェート（Ｂ
ＵｄＲ。
のカリウム力コジレート、ｐＨ７゜２．０．２ミリモル
のジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびｏ、ｏｏｔモル
のＣｏＣｌ２を含有する）中にｐＢＲ３２２且１副Ｔｌ
消化物（１６９ｐｍｏ ｌの３′末端／ ｍ ｌ ）お
よび５−ブロモデオキシウリジントリホスフェート（Ｂ
ＵｄＲ。
１ 、７ ｎｍｏ １．／ｍｌ）を含有する混合物を、
１５°Ｃにおいて１５分間インキュベーションする６末
端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＴｄＴ
；３６０Ｕ／ｍ１．２Ｕ／ｐｍｏｌの３゛末端）を添加
し、得られる反応混合物を１５℃においてさらに２時間
インキュベーションする。十分な酢酸ナトリウム（Ｎ
ａＯＡ ｃ）結晶を添加してＮａ０Ａｃ濃度を０．３モ
ルに調節した後、核酸をエタノール沈殿により反応混合
物から単離する。Ｍａｘａｍ、ｅｔ ａｌ、、Ｍｅｔｈ
ｏｄＳ ｉｎ Ｅｎｚ ｍｏｌｏ Ｖｏｌ。
１５°Ｃにおいて１５分間インキュベーションする６末
端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＴｄＴ
；３６０Ｕ／ｍ１．２Ｕ／ｐｍｏｌの３゛末端）を添加
し、得られる反応混合物を１５℃においてさらに２時間
インキュベーションする。十分な酢酸ナトリウム（Ｎ
ａＯＡ ｃ）結晶を添加してＮａ０Ａｃ濃度を０．３モ
ルに調節した後、核酸をエタノール沈殿により反応混合
物から単離する。Ｍａｘａｍ、ｅｔ ａｌ、、Ｍｅｔｈ
ｏｄＳ ｉｎ Ｅｎｚ ｍｏｌｏ Ｖｏｌ。
６５、ｐ、４９９ （１９８０）（７１方法ニヨ４Ｊ、
ＤＮＡ急冷ゲル−Ｅｒ７） ［８２Ｆ］ ５ ’ −末
端Ｗ、１ＬｉＲ分（０，５ｇｇ）の分析は、付加された
ヌクレオチドのテイルの概算の数を示す。
ＤＮＡ急冷ゲル−Ｅｒ７） ［８２Ｆ］ ５ ’ −末
端Ｗ、１ＬｉＲ分（０，５ｇｇ）の分析は、付加された
ヌクレオチドのテイルの概算の数を示す。
ＢＵｄＲティルトｐＢＲ３２２断片（１００ｐｍｏ’ｌ
の末端、１ｍｌのＴＥ緩衝液中）を、上のように調製し
たメルカプトブチレート化ウロキナーゼ（１ｍｌ、３ｍ
ｇ）と 緒に３７℃において４２時間インキュベーショ
ンする。得られる混合物をセフ７デツクヌ（ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−１００）を含有するｌＸ３０ｃｍのカラム
で分離し、追加のＴＥ緩衝液で溶離する。生成物ＰＢＲ
３２２−ウロキナーゼ複合体は２６０ｎｍにおいて吸収
する分画中で同定され、そしてフィブリン＃解活性は標
準のフィブリン凝塊検定により確証される。
の末端、１ｍｌのＴＥ緩衝液中）を、上のように調製し
たメルカプトブチレート化ウロキナーゼ（１ｍｌ、３ｍ
ｇ）と 緒に３７℃において４２時間インキュベーショ
ンする。得られる混合物をセフ７デツクヌ（ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−１００）を含有するｌＸ３０ｃｍのカラム
で分離し、追加のＴＥ緩衝液で溶離する。生成物ＰＢＲ
３２２−ウロキナーゼ複合体は２６０ｎｍにおいて吸収
する分画中で同定され、そしてフィブリン＃解活性は標
準のフィブリン凝塊検定により確証される。
実施例２二 −末鎖Ｍ１３およびウロキナーゼとプロモ
スルホニルノ との ヒ サイトメガロウイルスを組織培地中で生長さげ、そして
培養抽出液から分離されたウィルスＤＮＡをＨｉｎｄｍ
で消化した。Ｈｉ ｎ ｄＩＩＩノ２０番目の断片を、
Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ、。
スルホニルノ との ヒ サイトメガロウイルスを組織培地中で生長さげ、そして
培養抽出液から分離されたウィルスＤＮＡをＨｉｎｄｍ
で消化した。Ｈｉ ｎ ｄＩＩＩノ２０番目の断片を、
Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ、。
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｊｎ Ｅｎｚ ｒｎｏｌ。
Ｖｏｌ、旦８．（Ｗｕ、ｅｄ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｃｒｋ、１９７９）の方法により
ｐＢＲ３２２中にクローニングした。再分離後、得られ
るＣＭＶ断片をＭｅｓｓにより、（ｒｆ型）中に再挿入
し、そして−・木ｆｌフｙ−シＭ １３−ＣＭＶ Ｄ
Ｎ Ａを再分離した。
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｃｒｋ、１９７９）の方法により
ｐＢＲ３２２中にクローニングした。再分離後、得られ
るＣＭＶ断片をＭｅｓｓにより、（ｒｆ型）中に再挿入
し、そして−・木ｆｌフｙ−シＭ １３−ＣＭＶ Ｄ
Ｎ Ａを再分離した。
１！１られるｓ ｓ Ｍ １３フアージＤＮＡを６６川
ｌのホスフェートａ衝液（５０ミリモルのホスフェート
、２．０モルのＮａＣ１，ｐＨ８，０）中に溶解し、追
加の６６ｇ１のホスフェ−１）衝液を添加し、そして得
られる混合物を渦ミキサーで混合した。１２ｋｌのホス
フェート緩衝液中のウロキナーゼ（０，７１４川ｇ／ｐ
−１）の溶液を混合しながら添加し、モしてジオキサン
中のｐ−こトロフェニル３−（２−ブロモ−３−オギン
ブチルスルホニル）プロピオネ−）（６ｇｌ、３５ｎｇ
／ｇｌ）を４℃において添加した。得られる反応混合物
を４℃において６６時間静置した。ホスフェ−１１衝液
中のエタノールアミン（１０゜４ｇｌ、０，２ミリモル
）を添加して反応を停止させ、混合物を３７℃において
さらに１５分間静置させた。次いで、得られる混合物を
ＴＥ緩衝液に対して１８時間透析した。
ｌのホスフェートａ衝液（５０ミリモルのホスフェート
、２．０モルのＮａＣ１，ｐＨ８，０）中に溶解し、追
加の６６ｇ１のホスフェ−１）衝液を添加し、そして得
られる混合物を渦ミキサーで混合した。１２ｋｌのホス
フェート緩衝液中のウロキナーゼ（０，７１４川ｇ／ｐ
−１）の溶液を混合しながら添加し、モしてジオキサン
中のｐ−こトロフェニル３−（２−ブロモ−３−オギン
ブチルスルホニル）プロピオネ−）（６ｇｌ、３５ｎｇ
／ｇｌ）を４℃において添加した。得られる反応混合物
を４℃において６６時間静置した。ホスフェ−１１衝液
中のエタノールアミン（１０゜４ｇｌ、０，２ミリモル
）を添加して反応を停止させ、混合物を３７℃において
さらに１５分間静置させた。次いで、得られる混合物を
ＴＥ緩衝液に対して１８時間透析した。
得られる複合体を０．８％のアガロースゲルの電気泳動
により分析した。このゲル上のＤＮＡを臭化エチジウム
で着色することにより検出し、そ１７て標準フィブリン
凝塊をゲル上に注いでウロキナーゼの存在を検出した。
により分析した。このゲル上のＤＮＡを臭化エチジウム
で着色することにより検出し、そ１７て標準フィブリン
凝塊をゲル上に注いでウロキナーゼの存在を検出した。
着色したＤＮＡスボ、。
トおよび凝塊の溶解の両者はＲｆｏ、５７において明ら
かであったが、溶解のみはＲｆ ０ 、７３において存
在し、未反応のウロキナーゼを示した。
かであったが、溶解のみはＲｆ ０ 、７３において存
在し、未反応のウロキナーゼを示した。
生ずる複合体の精製は、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ）Ｇ１００を含有するカラムチＴＥ緩衝液中におい
てゲル濾過により得られた。複合体はボイド体積中で溶
離され、標準フィブリン凝塊検定により測定してウロキ
ナーゼ活性を含有した。遊離のウロキナーゼは、線維溶
解活性の第２の別のピークとしてカラムから溶離された
。複合体は標識相補的物質で交雑することが観測された
。
ｅｘ）Ｇ１００を含有するカラムチＴＥ緩衝液中におい
てゲル濾過により得られた。複合体はボイド体積中で溶
離され、標準フィブリン凝塊検定により測定してウロキ
ナーゼ活性を含有した。遊離のウロキナーゼは、線維溶
解活性の第２の別のピークとしてカラムから溶離された
。複合体は標識相補的物質で交雑することが観測された
。
実施例３： ５５Ｍ１３およびウロキナーゼとグリオキ
サールノ 体との ヒ − ａ、Ｎ−スクシニミジル４−グリオキサリルベンゾエー
トの・製 １８ｍ１のジオキサン中のニー酸化セレン（２゜２２ｇ
、０．０１モル）の混合物を５０℃に加熱し、そしてす
べてのＳｅＯ２が溶解してしまうまでこの温度に保持し
た。この溶液に３．２８ｇの４−アセチル安息香酸を添
加し、生ずる反応混合物を、黒色の金属セレンの追加の
沈殿が観察されなくなるまで（はぼ６時間）＠流温度に
保持した。沈殿を濾紙を通過する濾過により除去し、そ
してジオキサンを減圧蒸発させた。残留油を沸騰本から
再結晶化すると、水和物として４−グリオキサリル安息
香酸の灰色の固体が得られた：融点 。
サールノ 体との ヒ − ａ、Ｎ−スクシニミジル４−グリオキサリルベンゾエー
トの・製 １８ｍ１のジオキサン中のニー酸化セレン（２゜２２ｇ
、０．０１モル）の混合物を５０℃に加熱し、そしてす
べてのＳｅＯ２が溶解してしまうまでこの温度に保持し
た。この溶液に３．２８ｇの４−アセチル安息香酸を添
加し、生ずる反応混合物を、黒色の金属セレンの追加の
沈殿が観察されなくなるまで（はぼ６時間）＠流温度に
保持した。沈殿を濾紙を通過する濾過により除去し、そ
してジオキサンを減圧蒸発させた。残留油を沸騰本から
再結晶化すると、水和物として４−グリオキサリル安息
香酸の灰色の固体が得られた：融点 。
１７５−１７７℃、’ Ｈ−ＮＭＲ（ｄ、ＤＭＳＯ）
： δ ５．７ （ｉｐ、ｂｒ）、６．８ （２、ｂｒ
交換可能）、８．２ （４ｐ、ｍ）、他のエステルヲ
−１−のようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドの添加に
より調製することができる。
： δ ５．７ （ｉｐ、ｂｒ）、６．８ （２、ｂｒ
交換可能）、８．２ （４ｐ、ｍ）、他のエステルヲ
−１−のようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドの添加に
より調製することができる。
２２２ｍｇ（１，５ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドを、乾燥ジメチルホルムアミド中の１９６ｍｇ
（１ミリモル）の４−グリオキサリル安息香酸および３
０９ｍｇ （１，５ミリモル）のジシクロへキシルカー
ポジイミドに添加した。生ずる混合物を窒素のもとに５
０℃において１６時間撹拌し、そして形成する沈殿した
尿素誘導体を濾過により除去した。エーテルを反応混合
物へ滴々添加し、そして生成物のＮ−スルシニミジルベ
ンソエートは黄色固体として沈殿した、’Ｈ−ＮＭＲ：
δ ２．９（４ｐ、ｓ）。
ンイミドを、乾燥ジメチルホルムアミド中の１９６ｍｇ
（１ミリモル）の４−グリオキサリル安息香酸および３
０９ｍｇ （１，５ミリモル）のジシクロへキシルカー
ポジイミドに添加した。生ずる混合物を窒素のもとに５
０℃において１６時間撹拌し、そして形成する沈殿した
尿素誘導体を濾過により除去した。エーテルを反応混合
物へ滴々添加し、そして生成物のＮ−スルシニミジルベ
ンソエートは黄色固体として沈殿した、’Ｈ−ＮＭＲ：
δ ２．９（４ｐ、ｓ）。
ｂ、髪合進
ヒの実施例４に実質的に記載するように調製した、サイ
トメガロウィルス・インサートを含有する一本ｆｉＭＩ
３を、２０ミリモルのホウ酸ナトリウムおよび１０８９
モルのＭｇＣｌ２を含有する０、１モルのカリウムヵコ
ジレート（ｐｏｔａｓｓｊｕｍ ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ
）ｉ衝液、ｐＨ７，５と平衡化する。最終のＤＮＡｌａ
ｔ度をほぼ２Ａ２６゜単位／ ｍ ｌにする。
トメガロウィルス・インサートを含有する一本ｆｉＭＩ
３を、２０ミリモルのホウ酸ナトリウムおよび１０８９
モルのＭｇＣｌ２を含有する０、１モルのカリウムヵコ
ジレート（ｐｏｔａｓｓｊｕｍ ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ
）ｉ衝液、ｐＨ７，５と平衡化する。最終のＤＮＡｌａ
ｔ度をほぼ２Ａ２６゜単位／ ｍ ｌにする。
３％のジオキサンを含有するカコジレート緩衝液中のス
クシニミジル４−グリオキサリルベンゾエート（７）
６ ｍ ｇ ／ ｍ ｌの溶液の０．２ｍｌを１ｍｌの
前記ｓ ｓ Ｍ ｌ ３溶液へ添加し、そして生ずる反
応混合物を３７℃において１時間インキュベーションす
る。ＤＮＡを２体積の一７０℃の冷エタ・′−ルの添加
により沈殿させ、次いで０゜４モルのＮａＣ１を含有す
るホウ酸ナトリウム（０，，１モル、ｐＨ８、５） １
ｊｃ７）２００ ｇｇ／ｍｌの溶液中に再懸濁させる。
クシニミジル４−グリオキサリルベンゾエート（７）
６ ｍ ｇ ／ ｍ ｌの溶液の０．２ｍｌを１ｍｌの
前記ｓ ｓ Ｍ ｌ ３溶液へ添加し、そして生ずる反
応混合物を３７℃において１時間インキュベーションす
る。ＤＮＡを２体積の一７０℃の冷エタ・′−ルの添加
により沈殿させ、次いで０゜４モルのＮａＣ１を含有す
るホウ酸ナトリウム（０，，１モル、ｐＨ８、５） １
ｊｃ７）２００ ｇｇ／ｍｌの溶液中に再懸濁させる。
この混合物を３７℃において１６時間インキュベーショ
ンし、そしてセファデックスＧ−１ｏｏを含有するカラ
ムへ適用し、ＴＥ緩衝液で溶離する。複合体はボイド体
積中に溶離し、フィブリン凝塊検定によりウロキナーゼ
を保持することが証明される。遊離のウロキナーゼは、
線維溶解活性の第２ピークとして溶離する。
ンし、そしてセファデックスＧ−１ｏｏを含有するカラ
ムへ適用し、ＴＥ緩衝液で溶離する。複合体はボイド体
積中に溶離し、フィブリン凝塊検定によりウロキナーゼ
を保持することが証明される。遊離のウロキナーゼは、
線維溶解活性の第２ピークとして溶離する。
実施例４： ウロキナーゼおよびデオキシシチジレ−１
・のテイルをもつｐＢＲ３２２ とトリメチルオルトホルメートカル ボニルイミダゾール！ｅ橋体との複合 化 ５０％の水性ホルムアミド中のジメチルホルムアミドジ
イソプロピルアセタールのｌｏｏｍｇ／ｍ１の溶液の０
．２５ｍ１を、２Ａ２８０単位／ｍｌのＣ度においてリ
ン＃塩／ＥＤＴＡ＃衝液（０，１モル１０ 、０１モル
、ｐＨ７，２）中の、前述のように調製した、ｄｃＴＰ
−ティルトｐＢＲ３２２制限断片の１ｍｌへ添加した。
・のテイルをもつｐＢＲ３２２ とトリメチルオルトホルメートカル ボニルイミダゾール！ｅ橋体との複合 化 ５０％の水性ホルムアミド中のジメチルホルムアミドジ
イソプロピルアセタールのｌｏｏｍｇ／ｍ１の溶液の０
．２５ｍ１を、２Ａ２８０単位／ｍｌのＣ度においてリ
ン＃塩／ＥＤＴＡ＃衝液（０，１モル１０ 、０１モル
、ｐＨ７，２）中の、前述のように調製した、ｄｃＴＰ
−ティルトｐＢＲ３２２制限断片の１ｍｌへ添加した。
生ずる反応混合物を２５℃において１６時間静置させ、
そしてクロロホルムの３７０．５ｍｌのアリコートで招
ｌ出する。ＤＮＡを一７０℃の２体積のエタノ・−ルで
沈殿させ、リン酸塩／ＮａＣ１、Ｔ）Ｈ８，５（０，１
モル１０．４モル）中の０゜１ ｍ ｇ ／ ｍ ｌの
ウロキナーゼを含有する溶液の０．５ｍｌ中に再懸濁さ
せる。ジオキサン中のカルボニルジイミダゾール（５０
０，１，１００ｍ ｇ ／ ｍ ｌ ）の溶液を添加し
、そしてこの混合物を３７℃において４時間インキュベ
ーションし、次いでクロロホルムで抽出する。複合体を
ＴＥ緩衝液中のセフアデックスＧ１００を含有するｌ×
２０ｃｍのカラムのゲル濾過「より反応混合物から分離
し、そしてボイド体積中に溶離させ、次いで、標準フィ
ブリン凝塊検定により測定して、第２分画は遊離ウロキ
ナーゼを含有する。
そしてクロロホルムの３７０．５ｍｌのアリコートで招
ｌ出する。ＤＮＡを一７０℃の２体積のエタノ・−ルで
沈殿させ、リン酸塩／ＮａＣ１、Ｔ）Ｈ８，５（０，１
モル１０．４モル）中の０゜１ ｍ ｇ ／ ｍ ｌの
ウロキナーゼを含有する溶液の０．５ｍｌ中に再懸濁さ
せる。ジオキサン中のカルボニルジイミダゾール（５０
０，１，１００ｍ ｇ ／ ｍ ｌ ）の溶液を添加し
、そしてこの混合物を３７℃において４時間インキュベ
ーションし、次いでクロロホルムで抽出する。複合体を
ＴＥ緩衝液中のセフアデックスＧ１００を含有するｌ×
２０ｃｍのカラムのゲル濾過「より反応混合物から分離
し、そしてボイド体積中に溶離させ、次いで、標準フィ
ブリン凝塊検定により測定して、第２分画は遊離ウロキ
ナーゼを含有する。
′ガ施例５： プローブ複合体との交雑による人間の尿
試料中のサイトメガロウィルス の検−”′ ａ、フィブリン検定プレート（ｐｌａｔｅ）の４製 ９６のくぼみ（ｗｅ ！ ｌ）の微小力価（ｍｉｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ）の個々のくぼみに、フィブリンプレー＋１
衝液（３３ＩＬｌ、５０ミリモルのナトリウム八ルビタ
ール、９４ミリモルのＮａＣＩ、１．６５ミリモルのＣ
ａ Ｃｌ ２．０．７ミリモルのＭｇＣ１２、ｐＨ７，
７５、［ＦＰＢ］ ）、ヒトのフィブリノケン（１６用
１、Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（スエーデン）
から人手、等級り、１０ｍｇ／ｍｌ、水中で再＆！成し
た）およびヒトのプラスミノケン（９８ｐＬ１．１０ミ
リモルのリン酸塩ＰＨ７，７５中の２５力ゼイン分解中
位／ｍｌ）を添加した。ウシのトロンビン（７ｇｌ、０
．９％ｃｙ）ＮａＣ１中のｌ０ＮＩＨ単位／ｍｌ）釈添
加して凝結を誘発させた。プレートは、室温において４
５分間静置後使用できる状態である。
試料中のサイトメガロウィルス の検−”′ ａ、フィブリン検定プレート（ｐｌａｔｅ）の４製 ９６のくぼみ（ｗｅ ！ ｌ）の微小力価（ｍｉｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ）の個々のくぼみに、フィブリンプレー＋１
衝液（３３ＩＬｌ、５０ミリモルのナトリウム八ルビタ
ール、９４ミリモルのＮａＣＩ、１．６５ミリモルのＣ
ａ Ｃｌ ２．０．７ミリモルのＭｇＣ１２、ｐＨ７，
７５、［ＦＰＢ］ ）、ヒトのフィブリノケン（１６用
１、Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（スエーデン）
から人手、等級り、１０ｍｇ／ｍｌ、水中で再＆！成し
た）およびヒトのプラスミノケン（９８ｐＬ１．１０ミ
リモルのリン酸塩ＰＨ７，７５中の２５力ゼイン分解中
位／ｍｌ）を添加した。ウシのトロンビン（７ｇｌ、０
．９％ｃｙ）ＮａＣ１中のｌ０ＮＩＨ単位／ｍｌ）釈添
加して凝結を誘発させた。プレートは、室温において４
５分間静置後使用できる状態である。
ｂ、出ｒｒ′七の の
−１−のように調製してフィブリンの感度を決定するた
めに、０．１ｆｇ−ｔＰｇの範囲の量のウロキナーゼを
含有する２０Ｌ１の滴およびウロキナーゼを含有しない
対照滴を、プレートの重合したフィブリン表面上へスボ
ンティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）することにより、ウロ
キナーゼの勾配をプレート−適用した。このように調製
して微小／Ｊ価のプｔ、−−１−を３７℃において８時
間インキュベーションし、次いで２５℃において１６１
１１ＪＩ；ｌ！らにインキュベーションした。プレート
を検査すると、対照滴の位置あるい、はＯ，ｌｆｇのウ
ロキナーゼを含有するスポットの位置において溶解（Ｉ
ｙｓｆｓ）を観測することができなかった。
めに、０．１ｆｇ−ｔＰｇの範囲の量のウロキナーゼを
含有する２０Ｌ１の滴およびウロキナーゼを含有しない
対照滴を、プレートの重合したフィブリン表面上へスボ
ンティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）することにより、ウロ
キナーゼの勾配をプレート−適用した。このように調製
して微小／Ｊ価のプｔ、−−１−を３７℃において８時
間インキュベーションし、次いで２５℃において１６１
１１ＪＩ；ｌ！らにインキュベーションした。プレート
を検査すると、対照滴の位置あるい、はＯ，ｌｆｇのウ
ロキナーゼを含有するスポットの位置において溶解（Ｉ
ｙｓｆｓ）を観測することができなかった。
溶解の透明なゾーンは、ｌｆｇ以上の量のウロキナーゼ
を適用したすべてのスポットの位置において明らかであ
った。
を適用したすべてのスポットの位置において明らかであ
った。
Ｃ，ダ■旦主ヅ兼辿
人間の尿のいくつかの試料を蒸発により１ｏＯＯ倍に濃
縮する。９６グリツド（ｇ ｒ ｉ ｄ）の適用装置を
使用して、濃縮した試料を交雑膜へ適用し、乾燥させる
。膜をベーキングしないで試料の固定化を行う。密封し
たプラスチック袋中で、５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、９８： ５０３ （１９７５）の方法によ
り、サイトメガロウィルス／ ｓ ｓ Ｍ １３ ／ウ
ロキナーゼ複合体を使用して、交雑を実施する。
縮する。９６グリツド（ｇ ｒ ｉ ｄ）の適用装置を
使用して、濃縮した試料を交雑膜へ適用し、乾燥させる
。膜をベーキングしないで試料の固定化を行う。密封し
たプラスチック袋中で、５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、９８： ５０３ （１９７５）の方法によ
り、サイトメガロウィルス／ ｓ ｓ Ｍ １３ ／ウ
ロキナーゼ複合体を使用して、交雑を実施する。
交雑および洗浄後、交雑膜を試料の側が下になるように
してプラスミノケンに富んだフィブリン検定プレートヒ
に直接重ね、これを３７℃において１７時間インキュベ
ーションする。溶解活性のゾーンは、サイトメガロウィ
ルスを含有する尿の試料を適用したゾーンに相当する位
置において観察される。
してプラスミノケンに富んだフィブリン検定プレートヒ
に直接重ね、これを３７℃において１７時間インキュベ
ーションする。溶解活性のゾーンは、サイトメガロウィ
ルスを含有する尿の試料を適用したゾーンに相当する位
置において観察される。
実施例６： 非放射測定ＤＮＡ−ウロキナーゼプローブ
および発色（ｃｈｒｏｍｏｇ ｅ ｎ ｉ ｃ）プラスミン基質の検出系を使用するサ
イトメガロウィルスの 検出 この実施例は、サイトメガロウィルスＤＮＡを検出する
ためのウロキナーゼと−・末鎖ファージＭ１３−サイト
メカロウイルスＤＮＡのプローブ複合体の使用を説明す
る。使用するプローブは、上の実施例４中に実質的に記
載するようにして調製Ｉ７た。プラスミンに対して特異
性の発色基質を使用して交雑を検出した。
および発色（ｃｈｒｏｍｏｇ ｅ ｎ ｉ ｃ）プラスミン基質の検出系を使用するサ
イトメガロウィルスの 検出 この実施例は、サイトメガロウィルスＤＮＡを検出する
ためのウロキナーゼと−・末鎖ファージＭ１３−サイト
メカロウイルスＤＮＡのプローブ複合体の使用を説明す
る。使用するプローブは、上の実施例４中に実質的に記
載するようにして調製Ｉ７た。プラスミンに対して特異
性の発色基質を使用して交雑を検出した。
３つの明確なりＮＡ断片を次の実験において使用した。
第１断片はサイトメガロウィルス（ＣＭ■）ゲノムの相
補的Ｂａｍ ７８ＲＦクローンであった；第２断片はＣ
ＭＶゲノムの非相補的ＥｃｏＲ１’Ｆ断片であった；第
３断片はラムダファージＤＮＡであった。０．０５ｎｇ
〜ｌｏｏｎｇの範囲の量のＤＮＡを、慣用の技術によ
り微孔質のナイロン交雑膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ＠、
Ｅ、１．ｄｕ Ｆｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｉｎｃ、）、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏ
ｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、Ｕ、Ｓ。
補的Ｂａｍ ７８ＲＦクローンであった；第２断片はＣ
ＭＶゲノムの非相補的ＥｃｏＲ１’Ｆ断片であった；第
３断片はラムダファージＤＮＡであった。０．０５ｎｇ
〜ｌｏｏｎｇの範囲の量のＤＮＡを、慣用の技術によ
り微孔質のナイロン交雑膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ＠、
Ｅ、１．ｄｕ Ｆｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｉｎｃ、）、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏ
ｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、Ｕ、Ｓ。
Ａ、）上に固定化した。次いで、前記膜を０．５％のド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびｌＯｍ ｇ−／
ｍ ｌのウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）を含有す
る５×５ＳＰＥ緩衝液中で、５５℃において振盪水浴中
で・夜インキュベーションすることにより予備交雑した
。ここで使用するとき、「５ＳＰＥＪは０．１８モルの
ＮａＣ１および１．０ミリモルのエチレンジアミン四酢
ｍ （ＥＤＴＡ）を含有する５０ミリモルのリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ７，４０を意味する。「５×５ＳＰ
Ｅ」は５倍濃俄の５ＳＰＥを意味する； ｒ２ＸｓｓＰ
ＥＪは２倍濃度（７）Ｓ Ｓ ＰＥを意味する； 「０
゜２ＸＳＳＰＥＪは５倍希釈の５ＳＰＥを意味する。
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびｌＯｍ ｇ−／
ｍ ｌのウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）を含有す
る５×５ＳＰＥ緩衝液中で、５５℃において振盪水浴中
で・夜インキュベーションすることにより予備交雑した
。ここで使用するとき、「５ＳＰＥＪは０．１８モルの
ＮａＣ１および１．０ミリモルのエチレンジアミン四酢
ｍ （ＥＤＴＡ）を含有する５０ミリモルのリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ７，４０を意味する。「５×５ＳＰ
Ｅ」は５倍濃俄の５ＳＰＥを意味する； ｒ２ＸｓｓＰ
ＥＪは２倍濃度（７）Ｓ Ｓ ＰＥを意味する； 「０
゜２ＸＳＳＰＥＪは５倍希釈の５ＳＰＥを意味する。
・夜のインキュベーション後、膜を５０ｍ１（７）アリ
コートの５ＸＳＳＰＥで５回洗浄して残留するＳＤＳを
除去した・。次いで膜を水密プラスチックパウチ内に入
れ、そして１０％のホルムアミドおよび０．１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡを含有する５×５ＳＰＨの５．０ｍｌを添加
した。次いで、ウロキナーゼ／ＤＮＡプローブを添加し
て５０ｎｇ／ｍｌ（合計２５０ｎｇ）の最終濃度にした
。交雑はプラスチックパウチを４．０昨間５５℃におい
て振盪浴中でインキュベーションすることにより実施し
た。
コートの５ＸＳＳＰＥで５回洗浄して残留するＳＤＳを
除去した・。次いで膜を水密プラスチックパウチ内に入
れ、そして１０％のホルムアミドおよび０．１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡを含有する５×５ＳＰＨの５．０ｍｌを添加
した。次いで、ウロキナーゼ／ＤＮＡプローブを添加し
て５０ｎｇ／ｍｌ（合計２５０ｎｇ）の最終濃度にした
。交雑はプラスチックパウチを４．０昨間５５℃におい
て振盪浴中でインキュベーションすることにより実施し
た。
インキュベーション後、膜をパウチから取り出し、３７
℃において１２５ｍ１の７リコートの２ＸＳＳＰＥで２
回洗浄し１次いで１２５ｍ１のアリコア１・の０．２Ｘ
ＳＳＰＥで２回洗浄して非特異的に結合したプローブを
除去した。ウロキナーゼ−ＤＮＡプローブ−分析物（ａ
ｎａｌｙｔｅ）交雑分子の検出は、ウロキナーゼプロー
ブ交雑によるプラスミンへのプラスミン基質の活性化に
頼る酵素原カスケード増幅系を使用して達成した。
℃において１２５ｍ１の７リコートの２ＸＳＳＰＥで２
回洗浄し１次いで１２５ｍ１のアリコア１・の０．２Ｘ
ＳＳＰＥで２回洗浄して非特異的に結合したプローブを
除去した。ウロキナーゼ−ＤＮＡプローブ−分析物（ａ
ｎａｌｙｔｅ）交雑分子の検出は、ウロキナーゼプロー
ブ交雑によるプラスミンへのプラスミン基質の活性化に
頼る酵素原カスケード増幅系を使用して達成した。
プラスミンについて特異的な発色性基質、（） −／＜
リンーＬ−ロイシンーＬ−リジン−４−二トロアニリｙ
（Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃａ、スエーデン
）を使用してプラスミンを検出した。次の手順を使用し
た。
リンーＬ−ロイシンーＬ−リジン−４−二トロアニリｙ
（Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃａ、スエーデン
）を使用してプラスミンを検出した。次の手順を使用し
た。
コルク穴あけＩＪＬを使用して、上のようにして調製し
た交雑膜の円形体を切り、試料の側を上にして、平担な
底の９６のくぼみの微小力価プレートの個々のくぼみ内
に入れた。０．０１モルのＮａＣ１，０，１モルのし一
リジン、ｏ、ｔ％の［リドン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１０
０および１ミリモルの前述の基質を含む０，０５モルの
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４中に、１ ｍ ｇ
／ｍｌのｇｌｕ型プラスミノゲンケン有する検定溶液
を、検定プレートの微小力価の各くぼみへ添加した。次
いで、このプレートを３７℃においておだやかに撹拌し
ながらインキュベーションした。
た交雑膜の円形体を切り、試料の側を上にして、平担な
底の９６のくぼみの微小力価プレートの個々のくぼみ内
に入れた。０．０１モルのＮａＣ１，０，１モルのし一
リジン、ｏ、ｔ％の［リドン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１０
０および１ミリモルの前述の基質を含む０，０５モルの
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４中に、１ ｍ ｇ
／ｍｌのｇｌｕ型プラスミノゲンケン有する検定溶液
を、検定プレートの微小力価の各くぼみへ添加した。次
いで、このプレートを３７℃においておだやかに撹拌し
ながらインキュベーションした。
次いで、４０５ｎＭにおける光学濃度を、各くぼみの内
容物をＵ形底の微小力価プレートの別々のくぼみへ移し
、そして各くぼみを自動微小力価プレート読取器で読む
。得られた結果を下表Ｈに記載する０表ＩＩ中に記録さ
れる結果は、バックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
）（７）色の発生ニラいて補正されている。補正されな
い値は、表ＩＩ中の４値へ０．２８７を加えることによ
り得ることができる。
容物をＵ形底の微小力価プレートの別々のくぼみへ移し
、そして各くぼみを自動微小力価プレート読取器で読む
。得られた結果を下表Ｈに記載する０表ＩＩ中に記録さ
れる結果は、バックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
）（７）色の発生ニラいて補正されている。補正されな
い値は、表ＩＩ中の４値へ０．２８７を加えることによ
り得ることができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｌ、式 ％式％） 式中、 ｎは２〜５００の整数であり。 Ａは標的ポリヌクレオチドに対して実質的に相補的であ
る区域を有するポリヌクレオチドであり、そして ｚｌ、Ｚｎは、同一もしくは相異なり、集合的にポリヌ
クレオチド配列を形成するヌクレオチド部分であり、た
だしヌクレオチド部分７１〜ｚｎの少なくとも１つは部
分Ｘからなり、ここでＸは酵素原を酵素的に活性化して
検出可能な酵素反応カスケードを開始することができる
ポリペプチドからなる部分である、 のポリヌクレオチドプローブ組成物。 ２、式 ％式％） 式中、 ｎは２〜５００の整数であり、 Ａは標的ポリヌクレオチドに対して実質的に相補的であ
る区域を有するポリヌクレオチドであり、そして ７１〜ｚｎは、同一 もしくは相異なり、集合的たポリ
ヌクレオチド配列を形成するヌクレオチド部分であり、
前記ヌクレオチド部分は、弐Ｒ”Ｒ’ を有し、ここで Ｒ１はＢＲＩｓであり、ここで Ｂは塩基残基であり、そして Ｒ５はＨまたはＸであり、ここで Ｘは酵素原を酵素的に活性化して検出可能な酵素反応カ
スケードを開始することができるポリペプチドからなる
部分であり、 Ｒ２およびＲ” はＨ，ＯＨ，Ｘ、１まｌｉ２以−ヒの
ホスフェート基、隣接するヌクレオチド部分１部分Ｘも
しくは隣接するヌクレオチド部分へ共有結合したホスフ
ェート基、または部分Ｘおよび隣接するヌクレオチド部
分へ共有結合したホスフェート基であり、そして Ｒ４はＨｌＯＨ、ホスフェート基、またはＸであり、た
だし、ヌクレオチド部分２１〜ｚｎの少なくとも１つに
ついて、ＲＬはＢＨ３でありかつＲ６はＸであるか、あ
るいはＲ２，Ｒ３またはＲ４は部分Ｘからなる、 特許請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチドプローブ
組成物。 ３、ヌクレオチド部分７１〜ｚｎの少なくとも１つにつ
いて、Ｒ１が であり、ここでＲ６はＸである特許請求の範囲第２項記
載の組成物。 ４、ヌクレオチド部分２１〜ｚｎの少なくとも１つにつ
いて、Ｒ五が ■ であり、ここでＲ６はＸである特許請求の範囲第２項記
載の組成物。 ５、ヌクレオチド部分ｚ Ｌ 、、、 ｚ ｎの少なく
とも１つについて、Ｒ１が であり、ここでＲ６はＸである特許請求の範囲第２項記
載の組成物。 ６、ヌクレオチド部分ｚ ！ 、 Ｚｎの少なくとも１
つについて、Ｒ１が 鴛 であり、ここでＲ６はＸである特許請求の範囲第２項記
載の組成物。 ７、式中、 ＸがＬＥであり、ここで Ｌは結合基であり、そして Ｅは酵素原活性化活性を有する酵素である特許請求の範
囲第３項記載の組成物。 ８、Ｅがタンパク分解活性を有する酵素である特許請求
の範囲第７項記載の組成物。 ９、Ｅがプラスミノゲン活性化因子である特許請求の範
囲第８項記載の組成物。 １Ｏ１Ｅがウロキナーゼである特許請求の範囲第９項記
載の組成物。 １１、Ｅがエンテロペプチダーゼである特許請求の範囲
第９項記載の組成物。 １２、 ヌクレオチド部分７１〜ｚｎの少なくとも１つ
について、Ｒ２が部分Ｘからなる特許請求の範囲第２項
記載の組成物。 １３、ヌクレオチド部分Ｚｌ〜・Ｚｎの少なくとも１つ
について、Ｒ３が部分Ｘからなる特許請求の範囲第２項
記載の組成物。 １４、ヌクレオチド部分Ｚｌ、、、Ｚ１ｍの少なくとも
１つについて、Ｒ４がＸである特許請求の範囲第２項記
載の組成物。 １５、Ａがバクテリア、マイコバクテリア、アクチノミ
セテス、ヌピポセテス、リケンチア、クラミゾイア、マ
イコプラズマ、菌類、ウィルス。 真核生物、または多細胞有機体から成る群より選択され
る病原体の構造遺伝子特性のすべてまたは一部に対して
実質的に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレ
オチドである特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １６、Ａが病原体による表現可能な抗生物質抵抗性表現
型と関連する遺伝子のすべてまたは・・部に対して実質
的に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチ
ドである特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １７、Ａが遺伝疾患に関連する哺乳動物のＤＮＡのすべ
てまたは・部に対して実質的に相補的なヌクレオチド配
列からなるポリヌクレオチドである特許請求の範囲第１
項記載の組成物。 １８、（ａ）交雑条件下に、特許請求の範囲第１項記載
のポリヌクレオチドプローブ 組成物を試料と接触させて、プロー ブ／標的雑種を形成させ、 （ｂ）プローブ／標的雑種を交雑していないプローブ組
成物から分離し、そし て （ｃ）プローブ、／標的雑種を酵素前駆体と接触させて
、検出可能な酵素反応カ スケードを開始する、 ことからなることを特徴とする試料中の標的ポリヌクレ
オチドの存在を検出する方法。 １９、標的ポリヌクレオチドが病原体の特性をもつ特許
請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、標的ポリヌクレオチドが病原体により表現可能な
抗生物質抵抗性表現型と関連する特許請求の範囲第１８
項記載の方法。 ２１、標的ポリヌクレオチドが遺伝疾患に関連する哺乳
動物のＤＮＡのすべてまたは一部を表現する特許請求の
範囲第１８項記載の方法。 ２、特許請求の範囲第１項記載の組成物および検出基質
からなり、前記検出基質は、酵素原活性化因子により活
性化されたとき、検出可能な酵素反応カスケードを開始
することができる酵素原からなることを特徴とする、病
原体の特性であるがあるいはそれと関連する標的ポリヌ
クレオチド、ｔｆＥ牛物質抵抗性表現型を表現すること
ができる病原体、または哺乳動物における遺伝疾患の存
在を検出するための診断キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US574630 | 1984-01-27 | ||
| US06/574,630 US4699876A (en) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Nonradiometric polynucleotide probes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60176589A true JPS60176589A (ja) | 1985-09-10 |
Family
ID=24296941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60009997A Pending JPS60176589A (ja) | 1984-01-27 | 1985-01-24 | 非放射測定ポリヌクレオチドプローブ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4699876A (ja) |
| EP (1) | EP0151001A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60176589A (ja) |
| DK (1) | DK36785A (ja) |
| GR (1) | GR850212B (ja) |
| IE (1) | IE850169L (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014511124A (ja) * | 2011-01-07 | 2014-05-08 | ザ ユニバーシティ オブ クィーンズランド | タンパク質分解の検出 |
| US9453833B2 (en) | 2011-01-07 | 2016-09-27 | Digital Diagnostics Pty. Ltd. | System and method for detecting and monitoring proteolysis of protein matrices |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
| JPS622164A (ja) * | 1985-06-25 | 1987-01-08 | シスカ・ダイアグノステイツクス・インコ−ポレ−テツド | Ｎ４−（置換アミノ）シチジンを含む核酸プロ−ブ |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| US5091519A (en) * | 1986-05-01 | 1992-02-25 | Amoco Corporation | Nucleotide compositions with linking groups |
| CA1315222C (en) * | 1986-05-07 | 1993-03-30 | David Mao | Polynucleotide probes and a method for their preparation |
| IL86164A0 (en) * | 1987-04-28 | 1988-11-15 | Tamir Biotechnology Ltd | Improved dna probes |
| WO1989006701A1 (en) * | 1988-01-25 | 1989-07-27 | Microprobe Corporation | Thiol-reactive oligonucleotide intermediates and processes for conjugation of oligonucleotides with enzymes |
| WO1989009409A1 (en) * | 1988-03-31 | 1989-10-05 | Ram Nunna | Immunoassays employing novel markers |
| US6326136B1 (en) | 1988-04-01 | 2001-12-04 | Digene Corporation | Macromolecular conjugate made using unsaturated aldehydes |
| FR2634211B1 (fr) * | 1988-07-13 | 1992-06-26 | Lebacq Philippe | Procede de marquage d'une sonde nucleique et trousse de reactifs pour la mise en oeuvre de ce procede |
| FR2644163B2 (fr) * | 1988-07-13 | 1994-09-30 | Bioprobe Systems Sa | Procede de marquage d'une sonde nucleique et trousse de reactifs pour la mise en oeuvre de ce procede |
| GR1000347B (el) * | 1988-12-21 | 1992-06-25 | Ortho Diagnostic Systems Inc | Μεθοδος παραγωγης νουκλεοτιδικων ανιχνευτων χρησιμοποιωντας ενα συμπληρωμα γεφυρωσεως. |
| US5552541A (en) * | 1990-06-20 | 1996-09-03 | Beckman Instruments, Inc. | Haptenic probes for detecting capture polynucleotides |
| US5512433A (en) * | 1990-11-08 | 1996-04-30 | Vysis, Inc. | Methods and compounds for labeling DNA with xanthine and lower alkyl substituted xanthine derivatives and reagents for the in situ detection of chromosomes |
| CA2075858C (en) * | 1991-08-15 | 1998-05-19 | Scott J. Eisenbeis | Detection of complementary nucleotide sequences |
| US5279937A (en) * | 1992-04-30 | 1994-01-18 | Detechnology Canada | Use of macroglobulins to improve the signal-to-background ratio in affinity binding assays |
| US7713528B1 (en) | 1993-02-18 | 2010-05-11 | Enzo Therapeutics, Inc. | Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate |
| US5795729A (en) * | 1996-02-05 | 1998-08-18 | Biometric Imaging, Inc. | Reductive, energy-transfer fluorogenic probes |
| US5858665A (en) * | 1996-07-25 | 1999-01-12 | Navix, Inc. | Homogeneous diagnostic assay method utilizing simultaneous target and signal amplification |
| US6667299B1 (en) * | 2000-03-16 | 2003-12-23 | Hollis-Eden Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions and treatment methods |
| US6828097B1 (en) * | 2000-05-16 | 2004-12-07 | The Childrens Mercy Hospital | Single copy genomic hybridization probes and method of generating same |
| US6492120B1 (en) | 2000-11-02 | 2002-12-10 | University Of Maryland | Nucleic acid hybridization assay utilizing tricyclic target and signal amplification |
| AU2009282246B2 (en) | 2008-08-15 | 2015-06-25 | Cascade Biosystems, Inc. | Detecting nucleic acid |
| EP2536843B1 (en) * | 2010-02-15 | 2016-10-05 | Cascade Biosystems, Inc. | Methods and materials for detecting contaminated food products |
| EP2536848B1 (en) | 2010-02-15 | 2017-07-19 | Cascade Biosystems, Inc. | Methods and materials for detecting genetic or epigenetic elements |
| CA2789874C (en) | 2010-02-15 | 2020-03-24 | Cascade Biosystems, Inc. | Methods and materials for assessing rna expression |
| WO2011100749A2 (en) | 2010-02-15 | 2011-08-18 | Cascade Biosystems, Inc. | Methods and materials for detecting viral or microbial infections |
| US10050319B2 (en) | 2014-05-28 | 2018-08-14 | John M. Guerra | Photoelectrochemical secondary cell and battery |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3654090A (en) * | 1968-09-24 | 1972-04-04 | Organon | Method for the determination of antigens and antibodies |
| GB2059421A (en) * | 1979-10-03 | 1981-04-23 | Self C H | Assay method and reagents therefor |
| CA1219824A (en) * | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| CA1180647A (en) * | 1981-07-17 | 1985-01-08 | Cavit Akin | Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method |
| US4463090A (en) * | 1981-09-30 | 1984-07-31 | Harris Curtis C | Cascade amplification enzyme immunoassay |
| FR2519005B1 (fr) * | 1981-12-29 | 1985-10-25 | Pasteur Institut | Fragments d'adn marques a l'une au moins de leurs extremites par des ribonucleotides modifies reconnaissables par des molecules affines et procede pour realiser une analyse de tels fragments d'adn |
| DK147184A (da) * | 1983-04-18 | 1984-10-19 | Du Pont | Fremgangsmaade og reagens til kvantitativ immunokemisk analyse |
-
1984
- 1984-01-27 US US06/574,630 patent/US4699876A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-01-24 GR GR850212A patent/GR850212B/el unknown
- 1985-01-24 JP JP60009997A patent/JPS60176589A/ja active Pending
- 1985-01-25 IE IE850169A patent/IE850169L/xx unknown
- 1985-01-25 EP EP85300511A patent/EP0151001A3/en not_active Withdrawn
- 1985-01-25 DK DK36785A patent/DK36785A/da not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014511124A (ja) * | 2011-01-07 | 2014-05-08 | ザ ユニバーシティ オブ クィーンズランド | タンパク質分解の検出 |
| US9453833B2 (en) | 2011-01-07 | 2016-09-27 | Digital Diagnostics Pty. Ltd. | System and method for detecting and monitoring proteolysis of protein matrices |
| US10139361B2 (en) | 2011-01-07 | 2018-11-27 | The University Of Queensland | Proteolysis detection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4699876A (en) | 1987-10-13 |
| DK36785D0 (da) | 1985-01-25 |
| GR850212B (ja) | 1985-05-24 |
| IE850169L (en) | 1985-07-27 |
| EP0151001A3 (en) | 1987-07-15 |
| DK36785A (da) | 1985-07-28 |
| EP0151001A2 (en) | 1985-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS60176589A (ja) | 非放射測定ポリヌクレオチドプローブ | |
| JP6457564B2 (ja) | エキソヌクレアーゼを用いた近接伸長アッセイ | |
| EP1996941B1 (en) | Method for analyte detection using proximity probes | |
| JP6043901B2 (ja) | 遮断試薬及びその使用のための方法 | |
| EP0187332B1 (en) | Photochemical method of labelling nucleic acids for detection in hybridization assays | |
| US5695926A (en) | Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support | |
| AU656965B2 (en) | Detection of DNA/RNA by fluorescence polarization | |
| JPH09506762A (ja) | 近接配列−酵素分子を利用して標的核酸配列を検出するための組成物および方法 | |
| JPS62167793A (ja) | 核酸配列の検出方法及びそのためのハイブリダイゼ−シヨンプロ−ブ | |
| JPH05508074A (ja) | インビトロにおける増幅を用いたポリヌクレオチド捕捉アッセイ | |
| AU653244B2 (en) | Detection of complementary nucleotide sequences | |
| CN102105482A (zh) | 核苷三磷酸衍生物、核酸探针、多标记核酸探针、制备多标记核酸探针的方法以及探测靶核酸的方法 | |
| US4840892A (en) | Polynucleotide hybridization probes | |
| CA1333366C (en) | Enzyme-nucleic acid hydrazone and hydrazide conjugate compositions and methods | |
| EP0172153B1 (en) | Polynucleotide hybridization probes | |
| JP3947597B2 (ja) | 核酸配列の増幅方法 | |
| US20020090617A1 (en) | Hybridisation assay in which excess probe is destroyed | |
| US6306657B1 (en) | Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays | |
| JP2002527078A (ja) | 過剰なプローブを破壊する、改良されたハイブリダイゼーションアッセイ | |
| JPS60179657A (ja) | 標識プロ−ブ及び抗−ハイブリツドを用いるハイブリツド形成分析法 | |
| CN117089641A (zh) | 一种基于脱氧核酶化学发光探针的crispr生物传感器及其应用 | |
| CA2449911A1 (en) | Amplifiable probe |