JP3947597B2 - 核酸配列の増幅方法 - Google Patents
核酸配列の増幅方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3947597B2 JP3947597B2 JP16528297A JP16528297A JP3947597B2 JP 3947597 B2 JP3947597 B2 JP 3947597B2 JP 16528297 A JP16528297 A JP 16528297A JP 16528297 A JP16528297 A JP 16528297A JP 3947597 B2 JP3947597 B2 JP 3947597B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amplification
- mlp
- primer
- sequence
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【産業上の利用分野】
本発明はDNAの増幅方法に関するものである。DNAの増幅反応は遺伝子の塩基配列を特異的に増幅させる反応である。DNAの増幅反応は、感染症の原因となる病原体の高感度な検出方法や遺伝子のクローニング等に応用されている。
【0002】
【従来の技術】
標的核酸配列を増幅する方法の一つとしてPCR(Polymerase Chain Reaction) 法[ 1]が知られている。PCR法は、in vitroにおける核酸の増幅技術として最も一般的な方法である。PCR法は以下のような原理に基づいている。すなわち増幅の対象とする配列の両端に相補的なプライマーを用意し、その3’末端をDNAポリメラーゼの起点として1本鎖の標的配列を鋳型として相補鎖合成を行わせる。反応後に生成する2本鎖を加熱によって1本鎖に変性させ、再びプライマーのアニールと相補鎖合成を行わせる。一連の反応を繰りかえすことによって、理論的には1つの1本鎖から2n本の増幅生成物を得る事ができる。
【0003】
PCR法は、遺伝子のクローニングや検出において広い範囲で応用されている優れた増幅方法であるが、遺伝子の検出に利用する場合にはいくつかの問題点を持っていた。第1に、PCR法のような高度な増幅を行なう反応には、非特異的なノイズも同じように増幅されるという危険性が常にともなう。つまり標的配列が存在しないのにもかかわらずプライマーの非特異的なアニールによって1本でも増幅生成物が生じれば、そのノイズは以降の反応で鋳型として機能するため結果としてプラスと判定されてしまう事になる。一般には、できるだけ非特異的なアニールが生じないように特異的な配列をプライマーに設定し、しかもTmすなわち2本鎖DNAが1本鎖に融解する温度に近い高温条件下でアニールさせることでノイズを防ぐように努力されている。しかし常に望ましい特異性を維持できるとは限らないので、非特異反応の危険性を否定する事はできない。
【0004】
PCR法における非特異反応の対策として提案されたのが入れ子式のPCR法(nested PCR)[ 2]である。この方法では、ある領域の内側に位置する領域を増幅することができる2組目のプライマーセットを組み合わせてPCR法を行う。すなわち、まず外側に位置する1組のプライマーセット(outer primer)でPCR法を行って増幅産物を得、この増幅産物の一部分を増幅することができる2組目のプライマーセット(inner primer)によって再びPCR法を行う。この方法によれば、たとえ1組目のプライマーセットが誤った配列を増幅しても、その産物には2組目のプライマーがアニールできないので誤った結果にはつながらない。その上、増幅産物を鋳型として利用することから高い増幅効率を期待できるので感度向上につながるとされている。しかし増幅産物を直接的に確認できないという特徴(後述)は、基本となっているPCR法と同じである。
【0005】
PCR法の非特異的な反応としては、コンタミネーションによる偽陽性反応も指摘されている。増幅生成物が鋳型として機能するPCR法では、増幅生成物を含む反応液が他の反応系にわずかでも混入すると、それが鋳型となって陽性結果をもたらすことになる。コンタミネーションの影響は、増幅反応の基質としてdUTPを用い、PCR法に先だってウラシルグルコシダーゼで反応液を処理することで防止できる。しかし検出対象であるDNAにはdUTPが取りこまれていないのでウラシルグルコシダーゼで分解することができない。したがって、検出対象であるDNAが多量に存在する時にはこの方法は無力である。また付加的な操作が必要になるので簡便な方法とは言いにくい。
【0006】
特異性の改善を意図したものではないが、複数の領域を同時に増幅しその変異を分析する、いわゆる多重PCR(Multiplex PCR)法によって遺伝子診断を行った報告がある。すなわち、ジストロフィン遺伝子の欠失変異を、9つの領域に対応する18種類のプライマーによるPCR法で検出する試みである[ 3]。この試みは、複数の領域について増幅を行う点で本発明と共通するが、特異性の向上や増幅生成物の直接的な検出を目的とするものではない。
複数の領域を増幅する技術は、プライマーの混合物を使ったPCR法(Mixed oligonucleotide primed amplification;MOPAC)[ 4]においても応用されている。この方法は、PCR法をcDNAのクローニングに応用したもので、増幅生成物の検出を目的とする本発明とは技術分野を異にしている。いずれにせよ、これらの複数の領域を増幅する技術では、通常のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いているので生じる増幅生成物はやはり単なるDNAであり直接的な検出は困難である。
【0007】
PCR法の第2の問題点は、増幅生成物の検出方法である。PCR法の増幅生成物は単なるDNAなので、それを直接検出する事は難しい。通常は電気泳動によって予想される長さのDNAが増幅されているかどうか、あるいはどの程度の量が増幅されたかを検出している。DNAの電気泳動像は、エチジウムブロマイド等で染色すれば比較的容易に確認することはできる。とはいえ、電気泳動操作は多量の検体を迅速に処理するには不向きな分析技術である。
このような問題点は、増幅反応に当たって予め標識したプライマーを利用する事で改善することができる。たとえば、ビオチン化したプライマー[ 5]や蛍光物質標識したプライマー[ 6]が公知である。この反応系によって生成する増幅産物は、ビオチンや蛍光物質を備えている。ビオチン部分は固相化アビジンで捕捉する事ができる。標識には蛍光物質のみならず、酵素、発光物質、あるいは放射性同位元素などが利用できる。またハプテン標識を利用し、これを標識した抗ハプテン抗体で検出する方法も公知である。
【0008】
しかしこの種の標識を利用すると、未反応のプライマーを分離するステップを要求するので反応の進行をリアルタイムに監視することはできない。蛍光−消光物質の組み合わせのように標識の組み合わせによっては分離を不要とするいわゆる均一系(ホモジニアス)な検出反応を可能とする測定原理も知られてはいる。だが蛍光−消光物質の組み合わせを利用した反応は増幅生成物の大きさや塩基の配列などに制限を受けるので、広い範囲に応用しにくい。
【0009】
PCR法による増幅産物を凝集によって確認できることを示唆している報告[ 7]もある。すなわち、1組のプライマーが粒子表面に結合するとき相補鎖の合成にともなって粒子の凝集が期待できるというものである。この方法によって増幅産物の直接的な追跡は可能かもしれないが、使用しているプライマーは一組なのでいぜんとして非特異的な反応による誤った結果につながる可能性は否定できない。
粒子上に多くのプローブを結合させてハイブリダイゼーションアッセイを粒子凝集として捉えようとした試み[ 8][ 9]がある。しかしこの報告では単にプローブとしてのオリゴヌクレオチドを開示するにとどまり、これをプライマーとして利用することはできない。プライマーとして利用するには相補鎖の複製起点として利用できる3’末端を持たなくてはならないが、この報告では粒子上のオリゴヌクレオチドの方向性は考慮されていない。
【0010】
粒子ではなく、ヌクレオチド鎖の中に分岐構造を取り入れることで、やはりハイブリダイゼーションアッセイの高感度化を意図した技術[10][11][12][13]も公知である。分岐構造は本発明におけるマルチリンクプライマーに共通するが、これらの先行技術はプライマーとしての利用を開示していない。そのため先に説明した粒子上に固定したものと同じようにオリゴヌクレオチドの方向性が考慮されていない。したがって、これらの先行技術に開示された分岐構造を持つオリゴヌクレオチドの接合体は、ポリメラーゼによる複製起点として機能する3’末端を持つことが要求されない。あるいはその合成方法では2種類のオリゴヌクレオチドを繰り返し連結した構造は実現できるが、3種類以上のオリゴヌクレオチドを構成比や構造を制御しつつ連結することは困難である。言い換えればいずれもプローブとしての利用しか考慮していないので、ヌクレオチド鎖の構成比や構造はプライマーとして利用する条件とは違っているのである。
【0011】
PCR法の進行は、DNAポリメラーゼの作用による相補鎖合成にともなって生成するピロリン酸を指標として追跡することも可能である。ピロリン酸の検出方法には酵素的な方法[14][15]等が知られている。これらの方法ではピロリン酸を検出するための試薬成分を用意し、PCR法とは別の反応を行わせる必要があるので、簡便な方法とは言いがたい。
【0012】
酵素反応ではなく染色剤を利用してPCRの進行をモニターしようとする試み[16]も知られている。エチジウムブロマイドをはじめとする2本鎖DNAの染色剤の存在下でPCRを行い、特定の波長における蛍光強度の変化をトレースする。2本鎖DNAに吸着して蛍光特性が変化する色素を染色剤に用いれば、反応をリアルタイムに追跡することができる。しかしもともとDNAを分離後に染色するための色素であるエチジウムブロマイドでは、2本鎖DNAに結合しなかったものの蛍光シグナルとの識別が困難であった。エチジウムブロマイドに代えてピリリニウム塩化合物のような2本鎖DNAのシグナルを識別し易い染色剤の利用も報告されている[17]。しかしPCR法に基づいているこれらのモニタリング技術では、PCR法自身が持っている特異性に関する問題点は改善できない。
【0013】
PCR法が加熱による2本鎖の変性操作を伴うのに対して、鎖置換増幅反応(Strand Displacement Amplification、SDA法)[18]では、2本鎖部分を解離させながら相補鎖合成を行う特殊なDNAポリメラーゼを用いることによって増幅反応サイクルを実現している。また隣接する2つの領域にハイブリダイズするプローブをライゲーションし、その産物を検出するLCR法(Ligase Cycling Reaction)[19]も公知である。これらの増幅反応においても、非特異的な反応を生じる可能性や増幅生成物を直接検出することができない点はPCR法と共通である。
【0014】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、PCR法における特異性と増幅生成物の検出操作の改善を課題としている。具体的には、たとえプライマーが非特異的にアニールしたとしてもノイズにつながりにくい増幅原理を提案する。また検出操作については、反応の進行をリアルタイムに監視することができる新しい技術の提供を課題としている。
【0015】
【課題を解決するための手段】
本発明は、複数のオリゴヌクレオチドが相互に連結した新規な構造を持つプライマーの利用によって前記課題を解決するものである。すなわち本発明は、核酸配列の増幅すべき領域(以下標的核酸配列と省略)に対しプライマーをハイブリダイズさせ、このプライマーを複製起点として相補鎖合成反応によって遺伝子を増幅する方法において、相補鎖合成を妨げない部位において互いに連結された3分子以上のオリゴヌクレオチドであって少なくとも2つの異なる標的核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーを用いることを特徴とする方法である。本発明は、この増幅方法によってもたらされるマトリクス状の構造を持つ増幅生成物(図7)を指標とする核酸配列の検出方法、並びに反応に必要な複数のプライマーを相互に連結した新規なプライマーを提供する。なお本発明が提供する相互に連結されたプライマーを、本明細書ではマルチリンクプライマー(multi link primer、以下MLPと省略する)と呼ぶ。
【0016】
本発明による核酸配列の増幅方法で増幅の対象となる複数の領域とは、単一の遺伝子上の複数の領域であっても良いし、あるいは複数の遺伝子に分かれて存在するものであっても構わない。増幅対象が、たとえばウイルスのように1本のDNAあるいはRNAから構成されているときには、この1本の核酸の配列上で複数の領域を選択する。複数の領域は、互いに重複しない独立した領域を選択するのが望ましい。複数の領域が相互に重複していても本発明を実施することは可能である。しかし領域が重複すると、重複部分のみの増幅生成物が同時に生成するために結果として増幅効率の低下につながる可能性がある。
一方複数の遺伝子上から複数の領域を選択するケースとしては、たとえば異なる染色体上の遺伝子配列を増幅対象とする時、細菌のプラスミド等を増幅対象とする時、また複数種のrRNAの配列を増幅対象とする時等が挙げられる。あるいは1本の核酸で構成されるウイルスの遺伝子配列を増幅対象とする場合であっても、複数種のウイルスに対して同時増幅を試みる場合には異なる核酸上に増幅対象を求めることになる。
たとえば、最近報告されたヒトG型肝炎ウイルス(HGV)は、遺伝学的には異なる肝炎ウイルスであるヒトC型肝炎(HCV)との重複感染の可能性が高いことが指摘されている[20]。本発明の複数の増幅対象領域をこれらのウイルスの遺伝子配列上に求め、同時に増幅を行うことによって重複感染の検出に利用することが可能である。
HGVとHCVのように近縁のウイルス間で同時検出を試みる時には、次のような標的配列を選択することもできる。まず3つの標的配列のうち、2つは2種のウイルスにそれぞれ特徴的な配列を設定する。残る1つとして、両者の間で保存性の高い領域を選んで標的配列とするのである。種を越えて保存されている遺伝子は多く知られているので、特殊なウイルス間に限らず同様の手法で様々な検出対象の同時検出が可能である。
【0017】
本発明においては、直接的な検出対象のみならず増幅反応を監視するための対照を増幅のための領域に選ぶこともできる。すなわち、たとえば3つの増幅対象領域を組み合わせる場合に、3つのうちの2つは検出対象である遺伝子から増幅対象領域を設定する。一方残る1つの増幅対象領域として、増幅反応を正常に実施したかどうかを確認することができる配列(内部標準)を選択する。このような目的で利用される配列に、ヒトのβアクチン遺伝子などが知られている。βアクチン遺伝子は全てのヒト細胞に見られる遺伝子なので、そのためのプライマーを加えているのにもかかわらずもしも遺伝子の増幅が観察されない場合には、操作ミスや反応条件が不適切であった可能性が疑われる。
【0018】
本発明の増幅対象とする複数の領域とは、2以上、好ましくは3つ以上の領域である。中でも3つの領域に対して本発明を適用する時には、MLPを構成するプライマーとして各領域に対するプライマーを1つづつとすることができ、均等な増幅効率を得やすい。また3つの領域が揃って増幅された時にのみマトリクス状の増幅生成物を与えることから、特異性の面でも有利である。なぜなら例えば非特異的な増幅生成物が生じたとしても、それが2つの領域までであればマトリクス状の増幅生成物を構成できず陽性結果にはつながらないためである。
【0019】
一方3より多くの領域に対して本発明を適用することも可能である。たとえば6つの領域を選ぶのであれば、6つの領域に対するプライマーを設定し相互に連結してMLPとする。このMLPによって核酸配列の増幅を行えば、6つの領域のうち少なくとも3つの領域が増幅できればマトリクス状の増幅生成物を与える。
このような組み合わせが有利なケースとして、単一の試料で複数の病原体の分析を行う場合を挙げることができる。尿試料に含まれるナイセリアとクラミジアを同時分析する場合を例に取ると、ナイセリア用のプライマーを3組、クラミジア用のプライマーを3組、合計6つの領域に対するプライマーを利用して本発明によるMLPを用意する。このMLPによってPCR法を行うと、ナイセリアとクラミジアのいずれかが存在する時に陽性結果をもたらすことになるので、一度の操作で2種の病原体に対するスクリーニングを実施できる。近縁の微生物を同時にスクリーニングする時にはプライマーのうちの一部を共用することもできるであろう。
逆に種としては1種でありながら、いくつかのサブタイプが存在していることがわかっており、いずれかのサブタイプが存在することを確認したい時には、各サブタイプに対して特異的な標的配列を選び対応するプライマーを連結して本発明のMLPとすることもできる。このような使い方をする時には、サブタイプ間で保存されている領域と特異的な領域とを適宜組み合わせて、どのサブタイプが存在してもマトリクス状の増幅生成物を与えるように設計する。
逆に3以下、すなわち2つの領域に対して本発明を適用するには、MLPを構成するプライマーとして領域Aに対するものと領域Bに対するものの、少なくとも一方を複数としなければならない。プライマーを一つづつ連結したのでは本発明の必須要件であるマトリクス状の構造を持つ増幅生成物を与えず、単なる線状の増幅生成物をもたらすためである。この種の構造は、3以上の違う配列を持つオリゴヌクレオチドを連結するよりも合成操作は単純であることが多い。
【0020】
前記複数の領域に対して相補鎖合成反応の複製起点として機能するプライマーとは、たとえばPCR法でプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドを指す。PCR法のためのプライマーは、増幅対象領域の5’末端に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドと、3’末端と同じ配列(つまり相補鎖にアニールすることができる配列)を持つオリゴヌクレオチドの組み合わせを1セットとするプライマーセットである。ここで5’側のプライマーはセンス側、3’側のプライマーはアンチセンス側と呼ぶこともある。
相補鎖合成反応をDNAポリメラーゼで行う時、オリゴヌクレオチドが複製起点となるためには、その3’末端は必ず増幅対象となるDNAにハイブリダイズして2本鎖のDNAを構成できるものでなければならない。また3’末端はDNAポリメラーゼによる次のヌクレオチドの付加が可能なように活性な−OH基を備えている必要がある。
他方、各オリゴヌクレオチドの3’末端以外の部分は、増幅対象となる塩基配列に対して全体としてハイブリダイズすることができる程度のホモロジーを備えていれば良い。つまり、必ずしも目的とする増幅対象配列に完全に相補的である必要はない。通常の相補鎖合成反応の条件下では、70−100%のホモロジーを備えていれば特異的なハイブリダイズを維持できる。PCR法においては、一般にホモロジーが1%下がるとTmが1℃低下するとされている。したがって70%以下のホモロジーしか備えていない場合にはTmが30℃以上も低下することになり、通常の温度条件ではアニールすることができなくなってしまう。逆に多少の不整合を伴いながらもハイブリダイズが可能な範囲にアニール温度を調節することによって、一定の配列を持つオリゴヌクレオチドで幅広い変異を持つ配列に対しても増幅を行うことができるようになる。
【0021】
本発明におけるオリゴヌクレオチドプライマーは、塩基数で少なくとも6以上、好ましくは10〜50、特に好ましくは15〜30程度とする。6未満では通常の条件ではハイブリダイズしにくいばかりでなく、確率的にも非特異的な反応につながる可能性が増す。これに対して必要以上に長いプライマーを用いると、プライマー間あるいはプライマー内の水素結合による2本鎖が形成されやすくなり非特異的な反応につながる可能性が大きくなる。また塩基数が大きくなるのにしたがって化学的に合成する時に収率が低下していく。
各オリゴヌクレオチドは、相補鎖に対する親和性が同じ程度となるように配列の長さを調整するのが望ましい。相補鎖のハイブリダイズの強さは、構成塩基のG/C含量によって左右されるので、構成塩基の数と共にその構成によって相補鎖とのハイブリダイズ効率には差が生じる。一方本発明では、MLPを構成するオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ効率をできるだけ等しくすることがバランスの良いマトリクス構造につながる。したがって、例えば他のオリゴヌクレオチドに対してG/C含量の極端に低い配列を使う時には、構成塩基数を増やしてやるといった調整を行う。通常は、アニール温度を変えることで配列間のハイブリダイズ効率を調整するが、本発明ではMLPとして全てのオリゴヌクレオチドを同じ環境で遺伝子増幅に利用するので配列そのものによる調整が求められる。
【0022】
こうして選択したプライマーセットは、相補鎖合成を妨げない部位において相互に連結される。相補鎖合成を妨げない部位とは、オリゴヌクレオチドの5’末端やオリゴヌクレオチドの側鎖のような、複製起点となる3’末端以外の部分である。また本発明においては、この連結されたプライマーセットを起点とする分岐した増幅生成物が相互にハイブリダイズしたマトリクス状の構造を持つことが特徴である。したがって、プライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドの組み合わせも増幅生成物がマトリクス状の構造を取るように連結する必要がある。以下に3つの重複しない領域に対するプライマーセットを連結し、本発明に基づいてPCR法による核酸配列の増幅を試みる場合に可能な組み合わせを示す。なお各プライマーセットは、3つの領域A、B、およびCに対してそれぞれの5’側、3’側をAF/AR、BF/BR、並びにCF/CRで示した。連結後のプライマーをMLP1、MLP2、MLP3、およびMLP4とし、各MLPを構成するオリゴヌクレオチドの組み合わせを表1にまとめた。
【0023】
【表1】
【0024】
表1の組み合わせから明らかなようにMLPを構成するプライマーは3’側用と5’側用のものを任意に組み合わせることができる。3つのオリゴヌクレオチドが互いに異なるようにすれば、どのように組み合わせても本発明のMLPとして機能する。またマトリクス状の生成物を生成させるには、1分子のMLP内に同一の領域に対する3’側と5’側のプライマーがともに存在しないように設定することも本発明のMLPの条件である。1分子内に同一の標的配列に対するプライマーがともに存在すると、MLP1分子内部だけで相補的な2本鎖を形成してしまうため、他のMLP分子との連結を阻害しマトリクス状の生成物の形成を妨害する結果につながる。
表1の組み合わせのうち、3つのオリゴヌクレオチドを連結したもののみでMLPを構成する場合(すなわちcaseA−D)は、本発明におけるもっとも望ましい態様である。これらの組み合わせでは、各プライマーの間でハイブリダイズする機会、増幅反応の効率といった条件が等しくなり、結果としてバランスの良いマトリクス状の増幅生成物につながりやすいためである。
【0025】
表1の組み合わせの他にもマトリクス状の増幅生成物をもたらすプライマーの組み合わせは考えられる。たとえば、同じ領域に対するプライマー(たとえばAFとARのセット)とが1つの分子となるように連結した場合がそうである。プライマーセットのうち少なくともいずれか一方を複数連結しておけば、これをプライマーとして得られた増幅生成物はマトリクス状の構造を与える。しかしこのような組み合わせでは、1つの増幅対象領域に由来する増幅生成物で陽性の結果につながることから公知のPCRと同じ程度の特異性が期待できるに過ぎないことになる。したがって本発明における望ましいMLPは、少なくともある増幅対象領域のプライマーセットの一方のみで構成され、複数のMLPを用いて初めてマトリクス状の増幅生成物を生じるように組み合わされたものと言うことができる。このようなMLPを用いることで、従来のPCRでは達成できない特異性を実現できるのである。
【0026】
ここまではMLPをPCR法に利用するケースを想定して説明した。しかし本発明によって提供される核酸配列の増幅方法は、PCR法以外の遺伝子増幅反応へも応用することができる。たとえばリガーゼを利用したLCR法[19]、あるいはその改良法[21]、そしてTMA法(Transcription-Mediated Amplification)[22]へもMLPを利用することが可能である。LCR法では、1つの増幅対象領域に対して4つのプライマーが必要となる。LCR法を本発明によるMLPを使って実現するためには、3つの領域A、B、およびCのそれぞれに4つのプライマー(センス鎖とアンチセンス鎖に対してそれぞれ3’側と5’側のプライマー)が必要なことから、合計4種類のMLPを用意することになる。一方LCR法と同じく遺伝子の増幅反応として知られているSDA法[18]では、増幅生成物にニックを生じて切り出す反応が基本になっていることから、本発明に応用することはできない。増幅生成物がマトリクス状の構造をもたらさないためである。
【0027】
一方、TMA法ではRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を付加した第1プライマー、そして標的配列のアンチセンス側の合成起点となる第2プライマーを用い、RNAポリメラーゼと逆転写酵素を組み合わせて標的配列に相補的なRNAとDNAを増幅する。RNAを標的配列とするとき、第一段階ではRNAにハイブリダイズした第1プライマーを合成起点として逆転写酵素により相補的な配列を持つDNAが合成される。次いで標的配列であるRNAがRNaseHによって消化分解され、残ったDNA(1本鎖)に対して第2プライマーがハイブリダイズしてこれを合成起点とする相補鎖合成が行われる。続く第二段階は、第一段階で生成したDNA(2本鎖)を鋳型として進行するRNAポリメラーゼによる転写反応である。第一段階で生成したDNA(2本鎖)は、第1プライマーに由来するプロモーター部分が2本鎖となっているので、RNAポリメラーゼがこれを認識して標的配列に対応するRNAが転写される。こうして生じたRNAはDNA増幅のための鋳型として機能できるとともに、RNaseHにより酵素的に分解できることから、PCRのような加熱変性工程が不要となり結果的に等温条件のもとで増幅が実現する。したがって、第1プライマーと第2プライマーのそれぞれを、MLPとしておけば本発明に基づくマトリクス構造を持つ増幅生成物を与える。
TMAの増幅対象とする標的配列は、DNAであってもRNAであっても良い。特にrRNAを標的配列として選んだ場合には、もともと1本鎖の状態で存在しているので変性工程が不要であり、更に1細胞中に数百コピー存在していることから感度的にも有利である。TMA法と同様にRNAポリメラーゼを利用した遺伝子増幅方法としてNASBA法(Nucleic Acid Basedsequence Amplification)が知られているが、この方法に本発明によるMLPを組み合わせることも可能である。
【0028】
本発明に必要なMLPは、β−シアノエチルアミダイト法[23]のような通常の方法によって合成した各オリゴヌクレオチドを適当な方法で連結することによって得ることができる。たとえば、トリスアミンと呼ばれる一群の3官能性試薬によってオリゴヌクレオチドの5’末端を連結すれば3つのオリゴヌクレオチドを連結することができる。トリスアミンを用いた合成方法の詳細については後に述べる。
【0029】
4つのオリゴヌクレオチドを連結するには、まず2つのオリゴヌクレオチドを5’側で連結し、得られた連結オリゴヌクレオチドを更に結合する方法を利用する。5’側で2つのオリゴヌクレオチドが連結した構造はILO (inverse linkage oligonucleotides) として公知である[24]。ILOは、通常の固相ホスホルアミダイト法により得ることができる固相−3’−5’というオリゴヌクレオチド[25]をもとに、更に逆ホスホルアミダイト法[26]に基づいて5’→3’方向へオリゴヌクレオチドを付加していくことで製造することができる。こうして得られるILOにアミノ基やチオール基を導入し、ヘテロ2官能性試薬によって架橋すれば4種類のオリゴヌクレオチドを1分子づつ連結し、しかもそれぞれのオリゴヌクレオチドがプライマーとして相補鎖合成の起点となりうるMLPとすることができる。
【0030】
MLPは修飾されていないオリゴヌクレオチドを連結したものであっても良いが、検出のために標識しておくこともできる。好ましい標識成分としては、蛍光物質や発光物質、あるいはこれらの標識物質の間接的な結合を可能とする結合性リガンドを示すことができる。
【0031】
本発明による核酸配列の増幅方法は、プライマーとしてMLPを利用する他は、公知のPCR法と同じ条件の基で実施することができる。すなわち、相補鎖合成を触媒するDNAポリメラーゼに必要な補助的な成分、活性の発現に好適なpHを維持する緩衝液や保護剤、DNA合成に必要なヌクレオチド類を加えて温度サイクルを行えば良い。MLPは増幅対象となる遺伝子の予想される量に対して大過剰となるように加える。プライマーを過剰とすることで、鋳型との間でハイブリダイズが促進され、結果として増幅効率の向上につながる。
【0032】
本発明による核酸配列の増幅方法は、遺伝子の検出に応用することができる。本発明によって生成するマトリクス状の構造を持つ増幅産物は、単なる2本鎖のDNAとは異なり光学的な手法などによって直接的に検出することが可能である。マトリクス状の構造を持つ増幅生成物は、アグリゲートとして光学的に追跡することができる。したがって、相補鎖合成を行いながらリアルタイムで反応の進行を監視することができる。
【0033】
本発明に基づいて遺伝子の検出を行う時、検出対象は、その塩基配列が既知のポリヌクレオチドである。本発明の検出対象は、動物、植物、細菌、酵母、糸状菌、マイコプラズマ、リケッチア、ウイルス他あらゆるものに由来するポリヌクレオチドにおよぶ。またポリヌクレオチドとしては、ゲノミック核酸はもちろん、RNAウイルスやmRNAから逆転写酵素によって誘導されたcDNAを検出対象とすることも可能である。
【0034】
本発明に基づく遺伝子の検出方法に必要な各種成分は、予め組み合せた試薬の形で供給することができる。あらためて本発明による塩基配列検出用試薬の構成を次に示す。以下に示す試薬には、反応液を構成する緩衝剤、あるいは陰性や陽性の対照等の任意の成分を組み合せてキットの形とすることもできる。
【0035】
本発明に基づく遺伝子の検出方法に必要な成分;
1.MLP
2.DNAポリメラーゼ
3.dNTP
【0036】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸配列の増幅方法を、ある遺伝子の検出に応用する場合を例に具体的な実施の形態を説明する。まず増幅対象領域には、検出対象である遺伝子の3つの重複しない領域に設定する。ここで選択した3つの領域をそれぞれ標的配列A、B、そしてCと呼ぶ。標的配列の3’末端、5’末端に対応してPCR法において複製起点となるプライマーセットを設計する。各プライマーは、必要な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって容易に得ることができる。合成したオリゴヌクレオチドは、それぞれAF/AR、BF/BR、そしてCF/CRと名付けられる。
【0037】
合成された各オリゴヌクレオチドをもとに、[AF+BF+CF]、そして[AR+BR+CR]という構成を持つ2つのMLPを製造する。本発明のMLPを図1に示した。3官能性試薬にはトリスアミンと呼ばれる試薬を利用すると良い。合成操作を図2にまとめた。トリスアミンとしてはトリス(2−アミノエチル)アミン(Tris(2-aminoethyl)amine)等が好適である。連結には次のような操作を行なえば簡便である。つまり、1本目のオリゴヌクレオチドをトリスアミンと結合した後に、残りの2種類を同時に結合させるのである。1本目のオリゴヌクレオチドは選択的に結合させることができるから、残りの2本についてランダムに結合させてしまうことになる。この結果得られる生成物は、3つの異なる配列を持つオリゴヌクレオチドが1本づつ連結されたものと、1本目のオリゴヌクレオチドに対して2本の同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを連結してしまったものとの混合物である。
いずれの生成物も分子量がほとんど変わらないことから、これらの混合物の精製は通常の技術では困難である。本発明者らは、オリゴヌクレオチドの相補鎖をハイブリダイズさせ、非変性条件下で電気泳動による分離を行なえば、各生成物を確実に分離できることを見出した。この分離技術の原理を以下に説明する。
3つの異なる配列を持つオリゴヌクレオチドA、B、およびCを連結するとき、まずAを3官能性試薬に結合する。このときの結合は条件設定によって特異的に行なうことができるので、たとえばAだけが複数本結合してしまうことはない。次いでBとCを同時に結合させる。このときの結合はランダムに生じることから、反応生成物はABC、ABB、そしてACCの3種類の混合物である。この混合物に、たとえばBの相補配列を持つオリゴヌクレオチドB−ASを加えると、各反応生成物に対して以下のような割合でB−ASがハイブリダイズする。
ABC←B−AS×1
ABB←B−AS×2
ACC←B−AS×0
したがってハイブリダイズの後に非変性条件下で分子量に基づく分離を行なえば、3つの生成物は確実に分離することができる。分離後に加熱やアルカリ変性すれば相補鎖は外れ、目的とするMLPの精製を行なうことが可能である。出発原料に対する収率の面では必ずしも効率的な方法とは言えないが、合成ステップが簡単なため実施例ではこの方法を採用している。
【0038】
またシステイン骨格を利用してMLPを合成することも可能である。システインのチオール基(SH基)部分、アミノ基部分、そしてカルボキシル基部分に、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドA、B、およびCを連結した構造を合成することができる。具体的には、次のような操作に基づいて合成する。
すなわち5’末端をアミノ基で修飾したオリゴヌクレオチド(A)とシステインのSH基をスルホサクシンイミジル−4−(N−マレイミドエチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate、PIERCE製、以下Sulfo−SMCCと省略する)のような2官能性試薬を介して結合させる。このシステインのアミノ基に更にSulfo−SMCCを導入する一方、シスタミン化したオリゴヌクレオチド(B)と混合して両者を結合させる。
得られた生成物のシステインが持つカルボキシル基を、N−ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccinimide)でスクシンイミド化し、次いで5’をアミノ化したオリゴヌクレオチド(C)を加えれば、A、BそしてCが連結した構造となる。
【0039】
3官能性試薬を利用して各オリゴヌクレオチドの5’末端を連結するには、以下のような方法を採用することもできる。合成操作は図3−図4に示した。すなわち、MLPを構成するオリゴヌクレオチドを1本づつ連結していくのである。具体的には以下のような方法を用いる。
トリスアミンが持つ3つのアミノ基のうちのひとつに保護基を導入しておき、第1のオリゴヌクレオチドをイミダゾール存在下で結合する。第2のオリゴヌクレオチドはアミノ基に2官能性試薬であるマレイミドによって結合させる。マレイミドは残る2つのアミノ基のうちの一方にしか導入できないので、第2のオリゴヌクレオチドを1分子だけ連結することが可能である。2つのオリゴヌクレオチドが連結した状態のトリスアミンを最後に脱保護し、再びマレイミドを介して第3のオリゴヌクレオチドを結合させれば、3つのオリゴヌクレオチドが1本づつその5’末端で連結されたMLPが完成する。合成したMLPは、ゲルろ過等の方法によって精製しポリメラーゼによる相補鎖合成に用いる。
【0040】
いずれの方法を用いるにしても、これらの方法で得ることができるMLPは、3つのオリゴヌクレオチドの全てがDNAポリメラーゼによる相補鎖合成に必要な3’−OHを備えている。またその連結構造は高温でも安定なので、加熱操作を要求されるPCR法にも応用することができる。
【0041】
本発明による核酸配列の増幅方法は、プライマーとしてMLPを用いる他は一般的なPCR法と同じ操作に基づいて実施される。本発明に基く遺伝子の増幅反応を図5、図6、そして図7に示した。すなわち、増幅対象となるDNAを含む試料に対して、MLP、Taqポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼ、そして相補鎖合成に必要なdNTPを加え、温度サイクルを行えば良い。反応液には、酵素活性の発現に必要なMg等の金属イオン、反応に好適なpHを与える緩衝剤、酵素の反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイル、反応効率を向上させるためのポリエチレングリコールやゼラチン等の補助的な成分を加えておく。以下に一般的なPCR法のための反応液組成を例示する。MLPの使用量は予想される増幅対象DNAの量に対して過剰になるように設定する。具体的には、MLPを0.1−1μM程度の濃度で用いれば多くの場合十分である。
【0042】
50mMのKCl
10mMのTris−HCl(pH8.4)
1.5mMのMgCl2
5000unit/mLのTaqポリメラーゼ
25μM dNTP
50μg/mL 牛血清アルブミン(以下BSAと略す)
10mM ジチオスレイトール
【0043】
温度サイクルは、プライマーとして用いる配列の長さ、添加するMgイオンの濃度、使用するDNAポリメラーゼの種類などによって変動する。DNAポリメラーゼにTaqポリメラーゼを使った場合、一般的には次のような温度サイクルが利用されている。なお反応開始前に93℃で数分間の変性ステップの後にDNAポリメラーゼを添加するとよい結果を得られる。伸長に必要な時間は、増幅対象配列1000塩基あたり1分程度を目安として設定されている。
なお変性とアニールの条件は、DNAポリメラーゼの種類にかかわらず、主として先に例示した反応液中の塩濃度と、用いるプライマーの相補鎖に対する親和性や特異性に大きく左右される。
変性(denature):90−95℃で20秒−1分
アニール(anneale):40−60℃で20秒−1分
伸長(extention):70−75℃で30秒−1分
【0044】
この反応によって生成する増幅産物は、MLPを構成する3つのオリゴヌクレオチドの全てが伸長したものと、1ないし2つが伸長し未反応のオリゴヌクレオチドが残っているものが生じる。3つ全てが伸長したものは他のMLP伸長生成物と相互に2本鎖を構成し、マトリクス状の構造をもたらす。このマトリクス状の構造を、ろ過によって回収したり、あるいは散乱光分析方法によって追跡すればPCRの増幅生成物の測定が可能となる。
【0045】
本発明によるMLPを使った核酸配列の増幅方法を、分岐プローブの製造に応用することもできる。先に先行技術として紹介したように、分岐構造を持つプローブを利用した核酸配列の高感度検出方法が公知である。本発明による分岐構造を持つ増幅生成物は、そのままこれらの高感度ハイブリダイゼーションアッセイ用のプローブとする事が可能である。PCR反応を行なう時に蛍光物質、ハプテン、あるいはビオチン等で標識したヌクレオチドを利用すれば簡単に標識プローブとすることができる。また、化学合成では製造が困難な長い塩基配列であっても、簡単に合成することができる。
ハイブリダイゼーションアッセイ用のプローブとするときには、MLPやその増幅生成物の塩基配列の少なくとも一部が検出対象となる塩基配列とハイブリダイズできるように設定する。本発明に基づいて製造した分岐構造のプローブを利用するには、たとえば固相サンドイッチ法のような反応系を応用する。すなわち、ある検出対象配列に対して、その一部とハイブリダイズする捕捉プローブを用意する。これに検出対象配列を含む核酸を接触させて捕捉し、次いで捕捉プローブとは異なる部分で検出対象配列に対してハイブリダイズする本発明による分岐構造を持ったプローブと接触させる。この状態で固相を洗浄すれば、検出対象配列を介して分岐構造を持ったプローブが固相上に捕捉された状態(サンドイッチ)となる。分岐構造を持つプローブはマトリクス状態となっていることから多くの標識を持っており、結果として1分子の検出対象配列に対して多分子の標識を結合させられるため高い感度を実現することができる。
【0046】
【作用】
本発明における重要なポイントは、MLPである。これまでにも分岐した構造を持つオリゴヌクレオチドの存在は知られていた。しかし公知の分岐構造は、もっぱらハイブリダイゼーションアッセイにおいて、より多くのシグナルを結合することを意図して設計されたものである。これに対して本発明におけるMLPは、遺伝子の増幅産物にマトリクス状の特殊な構造を与えることを目的としている。このような特殊な構造が複数の領域に対するプライマーを連結したMLPによって実現できることはまったく新規な知見である。
【0047】
更に本発明におけるMLPが複数の領域に対応していることは、遺伝子の増幅精度の向上に貢献するものである。たとえば1つの領域のみの増幅反応では、予想に反してプライマーに類似した配列が存在する時に誤って増幅生成物が生じる可能性がある。これに対して複数の領域を同時に増幅対象として選択する本発明では、対象となる全ての領域が同時に存在していない限りマトリクス状の増幅生成物を生じない。たとえ1つの領域が非特異的に増幅されてしまっても、マトリクス状の増幅生成物は生じないので誤った結果にはつながりにくいと言うことができる。
【0048】
【発明の効果】
本発明によって、単一の領域をPCR法で増幅するケースでは期待できなかった高い特異性を容易に実現することができる。すなわち複数の領域で増幅反応がもたらされるため、確率論的にいって非特異的な反応が疑陽性につながる危険性が小さくなるのである。
【0049】
また本発明では、公知のPCR法では困難であった増幅生成物の直接的な検出、あるいはリアルタイムに反応を監視することが可能となる。より具体的には、たとえば本発明に基く増幅反応によってもたらされるマトリクス状の構造を持つ増幅生成物は、これまでの遺伝子増幅反応では得ることができなかった新規な構造を持つものである。このような新規な特徴により、本発明に固有の検出方法を採用することができるのである。
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【0050】
[1]オリゴヌクレオチドの合成
MLPを構成する各オリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルアミダイト法[23]に従って合成した。DNA合成機としてCyclone(登録商標)PlusDNA/RNAシンセサイザー(日本ミリポアリミテッド)を用いた。合成したホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、常法に従いHPLCで精製して使用した。合成した配列は配列1−9に示す9種類である。これらの配列のうち実際にPCRによる増幅反応に用いるのは、以下の6種類で、M13ファージmp18の遺伝子配列において3つの重複しない異なる領域A、B、およびCを規定するプライマーである。
AF(配列1)
BF(配列2)
CF(配列3)
AR(配列4)
BR(配列5)
CR2(配列6)
以下に示す残りの3種は、合成後のMLPの分離のために用意したBF、CF、およびCR2の相補鎖である。
BF−AS(配列7)
CF−AS(配列8)
CR2−AS(配列9)
【0051】
[2]同じ配列を持つオリゴヌクレオチド接合体の合成
[2]−1 5’チオール化オリゴヌクレオチド
まず本発明のモデルとして、同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチド3本をその5’で連結した接合体を合成した。基本的には、オリゴヌクレオチドの5’末端にチオール基を導入し、これを3官能性試薬とマレイミド基を介して結合することにより上記接合体とした。具体的な操作は次のとおりである。
オリゴヌクレオチドとしてはCF(配列3)とCR2(配列6)を用いた。40nmolの5’リン酸化したCFまたはCR2を0.1Mの1−メチルイミダゾール(1-methylimidazole、pH7.5)と0.1Mのシスタミン2塩酸塩(cystamine)を含む溶液に溶解した。これに5mgの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、EDCと省略する、ナカライテスク)を加えて室温で一晩反応させた。反応液は精製水で平衡化したSephadexG-25 fine 5mL カラム(商品名、ファルマシア製)にて脱塩後、真空乾燥した。得られた生成物は200μLの精製水で再溶解し、ジチオスレイトール(以下DTTと省略する)2mgを添加して37℃で1時間還元した。脱気した精製水で平衡化したSephadexG-25 fine 5mLカラムにて脱塩後、真空乾燥して5’をチオール化したオリゴヌクレオチドを得た。
【0052】
[2]−2 TAEAのマレイミド化
350nmolのトリス(2−アミノエチル)アミン(N(CH2CH2NH2)3、東京化成製、以下TAEAと省略する)を含む0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.4)200μLに5μmolのSulfo−SMCCを添加し、室温で1時間反応後に、マイクロ遠心機で遠心分離した(15000rpm、4℃、30分間)。回収した沈殿を500μLの精製水で2回遠心洗浄して最終的にマレイミド化したTAEAを得た。得られたマレイミド化TAEAは精製水350μLで再懸濁後、20μLづつ分注して凍結乾燥し−80℃に保存した。
【0053】
[2]−3 同じ配列を持つオリゴヌクレオチド接合体
[2]−1の還元したチオール化オリゴヌクレオチドCF、およびCR2はそれぞれ0.1Mのリン酸緩衝液(pH6.9)で0.25nmol/μLに再溶解し、マレイミド化TAEA([2]−2)の1nmol/μLジメチルフォルムアミド(以下DMFと省略する)溶液とモル比で3:1となるように混合し、室温で一晩反応させた。反応後に逆相HPLCカラムWakopak WS−DNA(和光純薬工業製、商品名)へアプライし、リニアグラジエントにて溶出した。溶出条件は、次のとおりである。
溶出条件:
溶出液A:0.1Mのtriethylamine-acetate(pH7.1)
溶出液B:0.1Mのtriethylamine-acetate(pH7.1)+70%のacetonitrile
gradient0-40% B in 27min.
DNAによる紫外部の吸収を追跡して各ピークフラクションを分取し、各フラクションを7M尿素を含む10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。オリゴヌクレオチド3本分が結合した分子量を持つ接合体を含むピークを確認し、そのフラクションを最終合成物とした。このフラクションは脱塩後、真空乾燥後に精製水で溶解した。
【0054】
[3]本発明によるMLPの合成
3つの異なる配列を持つオリゴヌクレオチドが5‘末端で結合した構造を持つ、本発明によるMLPを合成した。結合させる組み合わせは、AF−BF−CF、ならびにAR−BR−CR2とした。基本的には、まず3つの異なる塩基配列を持つオリゴヌクレオチドのうちの1本を3官能性試薬に結合し、次いで他の2本を同時に結合させる。この操作によって3本の異なる塩基配列で構成されるMLPの他に、2本の同じ塩基配列を結合してしまったものも生じる。これらの混合物を相補配列とのハイブリダイズ特性の違いを利用して分離し、最終的に3本の異なるオリゴヌクレオチドを連結したMLPを精製する。
AF
BF
CF
AR
BR
CR2
以下にAF−BF−CFの合成について述べるが、AR−BR−CR2についても原料となるオリゴヌクレオチドが違う他はまったく同じ操作によって本発明によるMLPを得た。
[3]−1 5’TAEA結合オリゴヌクレオチド
60nmolの5’−リン酸化したAFを、それぞれ0.1μmolのTAEAを含む0.1Mの1−メチルイミダゾール(pH7.5)に加え500μLとした。これに15mgのEDCを添加して室温で一晩反応させて5’TAEA結合AFとした。
[3]−2 TAEA−AFとBFのマレイミド化
5’TAEA結合AFとBFを100μLの精製水で再溶解し、30μLの1Mリン酸緩衝液(pH7.4)を加え、更に精製水で220μLとした。精製水で溶解した0.1MのSulfo−SMCCを80μL添加し、室温で2時間反応させた。精製水で平衡化したSephadexG-25 fine6mLカラムにて脱塩後、真空乾燥してマレイミド化したTAEA−AFとBFを得た。
【0055】
[3]−3 5’をチオール化したBFとCF
5’−リン酸化BF(またはCF)のそれぞれ60nmolを、0.1Mの1−メチルイミダゾール(pH7.5)および0.1Mの塩酸シスタミン2塩酸塩を含む反応液に添加し精製水で500μLとした。これに、15mgのEDCを添加し、室温で一晩反応させた。反応後に精製水で平衡化したSephadexG-25 fine 6mLカラムにて脱塩後、真空乾燥した。得られた生成物はそれぞれ200μLの精製水で再溶解し、4mgのDTTを添加して37℃で1時間還元した。脱気した精製水で平衡化したSephadexG-25 fine 6mLカラムにて脱塩後、真空乾燥して5’をチオール化したBF(またはCF)を得た。
【0056】
[3]−4 MLPの合成と分離
5’チオール化BF(またはCF)([3]−3)を、それぞれ脱気した0.1Mのリン酸緩衝液(pH6.9)で0.5nmol/μLとなるように再溶解した。一方、マレイミド化TAEA−AFも同じ緩衝液で0.5nmol/μLとなるように再溶解した。3者をモル比で1:1:1となるように混合し、室温で一晩反応させた。この反応により3者が1本ずつ結合したAF−BF−CFという構成のMLPが生じるが、同時にAF−BF−BF(あるいはAF−CF−CF)という3つのうちの2つは同じ配列を持つもので構成されたMLPも生じる。したがって、このあとの相補鎖を組み合わせた精製方法により目的とするMLP、すなわちAF−BF−CFという構造のMLPを分離する。
【0057】
[3]−5 MLPの確認と分離
1μLの合成反応液([3]−4)にBFに対する相補鎖BF−AS200pmol/μLを添加し、65℃で5分加温後室温まで徐冷してハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後の反応液を12%のポリアクリルアミドゲルにて泳動した。この操作によってBF部分が2本鎖となるため、AF−BF−CF(目的とするMLP)と、AF−BF−BFやAF−CF−CFといった2つの同じオリゴヌクレオチドを含む目的外のMLPとの間で構成塩基数に違いができてくる。結果として、それぞれ異なった移動度を示すはずである。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、相補鎖を添加しないときは得られたMLPの混合物は十分に分離できないのに対して、相補鎖を添加することにより3本のバンドに分離可能であった。したがって、この原理を応用して以下の精製操作を行なうこととした。
【0058】
[3]−6 MLPの精製
[3]−5の条件にしたがってMLPの混合物を含む反応液([3]−4)に200pmol/μLとなるようにCFの相補鎖CF−ASを添加し、相補鎖をMLPにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後の反応液は、いったん非変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により目的とするMLPをCF−ASとハイブリダイズした状態で分離後、そのまま変性条件下のポリアクリルアミドゲルで泳動することでCF−ASとの分離を行なった。すなわち、下段に7M尿素を含む12%ポリアクリルアミドゲルを、上段に7M尿素を含まない12%ポリアクリルアミドゲルを積層した2段ゲルを調製し、上記相補鎖結合反応液をアプライして上段でMLPを分離後、下段で相補鎖との分離を行なった。泳動後のゲルより、目的とするMLPに相当するバンドを切り出し精製して最終的に本発明によるMLPを回収した。
【0059】
[4]同じ配列のオリゴヌクレオチド3本の接合体による増幅実験
本発明のモデルとして、[2]で合成した同じ配列のオリゴヌクレオチド3本の接合体による増幅実験を試みた。下記組成の反応液20μLを95℃で5分の前処理後、95℃/30秒→55℃/2分→72℃ /2分を1サイクルとして35サイクル反応させてPCR法を行なった。また対照として、CFとCR2のモノマーを用いて同条件で反応を行った。
【0060】
反応液の組成:
10mM トリス塩酸緩衝液(pH8.3)
50mM KCl
1.5mM MgCl2
200μM dNTPs
2.5U Taq DNAポリメラーゼ
1fmol M13ファージmp18
2.5pmol CFトリマー
2.5pmol CR2トリマー
反応液は、0.7%のアガロースゲル(0.5×TBE)、および同ゲル(50mMのNaOH+1mMのEDTA)で泳動しエチジウムブロマイド(以下EtBrと省略)にて染色して確認した。0.5×TBE(前者)ではλファージのEcoRI/HindIII二重消化断片を、またNaOH+EDTA(後者)ではXIV(100bpラダー、ベーリンガーマンハイム社製、商品名)を分子量マーカーとした。前者では2本鎖が変性しないので、ハイブリダイズした状態のまま泳動される。
【0061】
電気泳動の結果を図8として模式的に示す。この結果から以下のようなことが確認できた。
−0.5×TBE−
モノマーのみでPCRを行なった対照では、プライマーによって規定される約400bpの位置に1本の単一バンドが得られた。一方、トリマーを用いた場合には約10kbp程度の位置までに明瞭に識別できない幅広いバンド(スメアなバンド)が得られた。
−50mMのNaOH+1mMのEDTA−
このアルカリゲルでもモノマーのみによる対照は約400baseに単一バンドが得られる。しかしトリマーを用いた場合は、400b、800b、そして1200bの3本のバンドが得られた。それぞれ、トリマーを構成するオリゴヌクレオチドの1つ、2つ、そして3つ全てから伸長した産物に対応する。これらの結果から、本合成プライマー(トリマー)の使用により高分子のマトリクスが形成されることが判明した。
【0062】
[5]異なる3つのオリゴヌクレオチドで構成される本発明のMLPによる増幅実験
プライマーとして異なる3つのオリゴヌクレオチドで構成される本発明のMLP(AF−BF−CFとAR−BR−CR2)を各2pmolとする他は[4]と同じ条件でPCR法を行なった。また対照として、AFとAR、BFとBR、およびCFとCR2の単独の組み合わせを用いて同じ条件で反応を行った。反応後の反応液は、[4]と同じ条件で電気泳動した。
【0063】
電気泳動分析の結果を図9として模式的に示す。この結果から以下のようなことが確認できた。
−0.5×TBE−
モノマーのみでPCRを行なった対照では、プライマーによって規定される約400bpの位置にそれぞれ1本の単一バンドが得られた。一方、MLPトリマーを用いた場合には約20kbp程度の位置までの明瞭に識別できない幅広いバンド(スメアなバンド)が得られた。3つの異なる配列を連結したMLPを用いたことにより、同じ配列を持つオリゴヌクレオチド3本による接合体をプライマーとした[4]よりも大きなマトリクス構造ができていることが推測された。
−50mMのNaOH+1mMのEDTA−
このアルカリゲルでもモノマーのみによる対照は約400baseに単一バンドが得られる。しかしMLPトリマーを用いた場合は、400b、800b、そして1200bの3本のバンドが得られた。それぞれ、トリマーを構成するオリゴヌクレオチドの1つ、2つ、そして3つ全てから伸長した産物に対応する。これらの結果から、本合成プライマー(トリマー)の使用により高分子のマトリクスが形成されることが判明した。
【0064】
引用文献:
[ 1] Science,230,1350-1354,1985
[ 2] J.Clin.Microbiol.,28,1560-1564,1990
[ 3] Nucleic Acids Res.,16,11141-11156,1988
[ 4] Science,239,1288-1291,1988
[ 5] Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6230-6234,1989
[ 6] Nucleic Acid Res.17,2517,1989
[ 7] 特開平1-98499
[ 8] 特開平6-78797
[ 9] 特許2560003
[10] 特開平2-109999
[11] 特開平5-260972
[12] J.Am.Chem.Soc.115:2119-2124;1993
[13] 公表平9-500378(WO95/01365)
[14] J.Immunological Methods,156,55-60 (1992)
[15] Anal.Biochem.94,117-120 (1979)
[16] 特開平5-184397
[17] 特開平7-163399
[18] Proc.Natl.Acad.Sci.89:392-396;1992
[19] EP-320308
[20] SCIENCE, Vol.231,505-508,1996
[21] 特開平4-229200
[22] J.Clin.Microbiol.31:3270-3274 (1993)
[23] J.Am.Chem.Soc.112,1253-1254(1990)
[24] USP 5462854 (公表平8-509129)
[25] Tetrahedron Letters,Vol.22,No.20,1859-1862,1981
[26] Tetrahedron Letters,No.33,2861-2863,1974
【0065】
【配列表】
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
【0073】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明によるMLPの構造
【図2】本発明によるMLPの合成フロー
【図3】本発明によるMLPの別の合成フロー(図4へ続く)
【図4】本発明によるMLPの別の合成フロー(図3の続き)
【図5】本発明のMLPに基く遺伝子の増幅反応を示す模式図(図6へ続く)
【図6】本発明のMLPに基く遺伝子の増幅反応を示す模式図(図7へ続く)
【図7】本発明のMLPに基く遺伝子の増幅反応を示す模式図(図7の続き)
【図8】同じ配列を持つオリゴヌクレオチドの接合体をプライマーとしたPCRによる増幅生成物の電気泳動像を模式的に示す図
【図9】本発明のMLPをプライマーとしたPCRによる増幅生成物の電気泳動像を模式的に示す図
Claims (6)
- 標的核酸配列に対しプライマーをハイブリダイズさせ、このプライマーを複製起点として相補鎖合成反応によって遺伝子を増幅する方法において、5’末端において互いに連結された3分子以上のオリゴヌクレオチドであって少なくとも2つの異なる標的核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーを用いることを特徴とする方法。
- 5’末端において互いに連結された3分子のオリゴヌクレオチドであって3つの異なる標的核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーを用いることを特徴とする請求項1の核酸配列の増幅方法。
- 標的核酸配列が、複数の遺伝子の配列から選択されるものである、請求項1から2いずれかに記載の核酸配列の増幅方法。
- 請求項1から3のいずれかに記載された方法によってもたらされるマトリクス状の構造を有する増幅生成物を指標とする、標的遺伝子の検出方法。
- マトリクス状の構造を持つ増幅産物を光学的な手段によって追跡する請求項4の標的核酸配列の検出方法。
- 複数の標的核酸配列に対応する3以上のオリゴヌクレオチドを、5’末端において互いに連結したマルチリンクプライマー。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16528297A JP3947597B2 (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | 核酸配列の増幅方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16528297A JP3947597B2 (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | 核酸配列の増幅方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10337186A JPH10337186A (ja) | 1998-12-22 |
JP3947597B2 true JP3947597B2 (ja) | 2007-07-25 |
Family
ID=15809377
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16528297A Expired - Fee Related JP3947597B2 (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | 核酸配列の増幅方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3947597B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3310662B2 (ja) | 2000-03-31 | 2002-08-05 | 三光純薬株式会社 | プローブポリマー作製用プローブ、プローブポリマーの作製方法及びその利用 |
DE60119533T2 (de) * | 2000-05-01 | 2007-05-16 | Eiken Kagaku K.K. | Verfahren zur erkennung des produkts einer nukleinsäuresynthetisierungsreaktion |
JP2001309785A (ja) * | 2000-05-01 | 2001-11-06 | Eiken Chem Co Ltd | 遺伝子配列間の相違検出方法 |
JP2002171998A (ja) * | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Olympus Optical Co Ltd | 核酸増幅反応測定方法及び装置 |
JP2002171997A (ja) * | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Olympus Optical Co Ltd | 核酸増幅反応測定方法及び装置 |
JP2002171999A (ja) * | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Olympus Optical Co Ltd | 核酸増幅反応測定方法及び装置 |
WO2005093059A1 (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Sapporo Breweries Limited | 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法 |
-
1997
- 1997-06-06 JP JP16528297A patent/JP3947597B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH10337186A (ja) | 1998-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6457564B2 (ja) | エキソヌクレアーゼを用いた近接伸長アッセイ | |
FI98932C (fi) | Menetelmä monistetun DNA-näytteen aiheuttaman kontaminaation pienentämiseksi amplifikaatiomenetelmässä | |
CN108368538B (zh) | 用于生成邻近探针的方法 | |
US6632606B1 (en) | Methods for single nucleotide polymorphism detection | |
Knez et al. | Emerging technologies for hybridization based single nucleotide polymorphism detection | |
US20020182598A1 (en) | Nucleic acid amplification methods | |
US20030175706A1 (en) | Nucleic acid amplification methods | |
CA2505254A1 (en) | Universal tag assay | |
AU656965B2 (en) | Detection of DNA/RNA by fluorescence polarization | |
AU2002220132A1 (en) | Nucleic acid amplification methods | |
EP1844163A2 (en) | Highly orthogonal universal sequences for use in nucleic acid assays | |
EP0855447B1 (en) | Method of assay of nucleic acid sequences | |
WO2002103013A2 (en) | Partially double-stranded nucleic acids, methods of making, and use thereof | |
WO1997045555A1 (en) | Method for detection of mutations | |
JP3947597B2 (ja) | 核酸配列の増幅方法 | |
EP1426448A1 (en) | Method for lowering the effects of sequence variations in a diagnostic hybridization assay, probe for use in the assay and assay | |
US20050095606A1 (en) | Partially double-stranded nucleic acids, methods of making, and use thereof | |
WO1989009281A1 (en) | Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid | |
EP1200624A2 (en) | Multiplexed strand displacement for nucleic acid determinations | |
WO2003102179A1 (fr) | Nouveau procede de dosage d'acide nucleique au moyen d'un nucleotide marque | |
JPH0588A (ja) | 新規核酸断片およびこれらを用いたマイコプラズマの検出法 | |
US7118864B2 (en) | Amplifiable probe | |
JP3291555B2 (ja) | プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のdnaまたはrnaとハイブリッドするプローブを精製する方法 | |
EP0975804A2 (en) | Amplification based mutation detection | |
JP2002034599A (ja) | 1塩基多型を検出する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040527 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061115 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070111 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070403 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070416 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100420 Year of fee payment: 3 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100420 Year of fee payment: 3 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100420 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100420 Year of fee payment: 3 |
|
R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100420 Year of fee payment: 3 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100420 Year of fee payment: 3 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |