JP2002171998A - 核酸増幅反応測定方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】標識物質を用いずに標的核酸を定量的に測定す
る装置を提供する。 【解決手段】核酸増幅反応測定装置１００は、反応液を
収容した反応部１２０を保持する反応部設置部１４２
と、反応部１２０の温度を制御する反応部温度制御部１
４４と、反応部１２０に向けて光ビームを射出する光源
部１０２と、反応部１２０で反射された光ビームを受け
る光検出器１０８とを備えている。反応部１２０は、平
板状の反応部下板と凹部を有する反応部上板とを接合し
て作られた閉鎖型セルである。反応部１２０の内部で
は、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応が行なわれる。反応
部上板は光学的に透明であり、反応部下板は光を良好に
反射する上面を有している。反応部１２０は、光源部１
０２から来る光ビームが斜めに入射するように配置され
ており、その入射角は、反応部上板で反射される光と反
応部下板で反射される光が干渉する角度に設定されてい
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸を測定す
る技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝学的検査にとってＤＮＡまたはＲＮ
Ａのような核酸の増幅反応は重要であり、中でもＰＣＲ
(Polymerase Chain Reaction)法が広く利用されてい
る。核酸の増幅反応を測定する従来技術は、蛍光色素の
ような標識物質を用いて、電気泳動のような分離技術と
組み合わせたり、標識化された結合試薬との結合反応を
行なう工程を付加することによって、定量的な測定を可
能にしている。標識物質を用いない測定技術も幾つか提
案されており、特表２０００−５０８１６８号は、目的
の核酸と競合の核酸を個体支持体に固定化させ、目的の
核酸および競合の核酸と特異的に結合する核酸配列を反
応させる。このときの反応を表面プラズモン共鳴法を用
いて測定することで目的の核酸の有無および量を決定し
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来の核酸増幅反応の
測定技術は、標識物質を用いる場合に実用的な水準で、
定量的な測定を可能にしているので、広く利用されてい
る。しかしながら、標識物質は、Ｓ/Ｎ比を改善するた
めに余分な標識化試薬を除去する工程を要求する。ま
た、標識物質は、時間とともに、あるいは使用環境によ
り標識性能が低下するように変化する可能性がある。ま
た、標識物質は、一般に高価であるとともに、人体もし
くは自然環境に対して有害であり得る。また一般に、目
的の核酸と特異的に結合する核酸配列は塩基配列が７〜
２４の大きさであり、特異的に結合する核酸配列が結合
することによる個体支持体上の重量変化は非常に小さ
く、感度の点で問題がある。

【０００４】本発明の目的は、標識物質を用いずに実用
的な水準で標的核酸を定量的に測定する方法と装置を提
供することである。

【０００５】また、本発明の別の目的は、サンプルを高
感度に測定できる高精度な測定方法と測定装置を提供す
ることである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＷＯ ０
０/２８０８２およびＥＰ−１０２０５３４Ａ１や Nucl
eic Acids Research Vol. 28, No. 12, e63(2000) にお
いて、ＬＡＭＰ法と呼ばれる新規な核酸増幅反応技術を
提案している。この核酸増幅反応技術によると、その反
応は増幅すべき核酸塩基配列を繰り返し増幅しながら延
長する作用を有しているために従来のＰＣＲ法などと比
べると個々の増幅産物はより一層の高分子化が生じてお
り、ＰＣＲ法による産物に比べ分子量が遙かに高くな
る。上述したようなより一層の高分子化とそれいに伴う
高分子量化は、反応液の光学的特性(例えば屈折率)を変
化させる。この光学的特性の変化は、反応液を通る光と
反応液を通らない参照光との干渉を調べることにより、
より詳しくは、干渉により形成される干渉縞の移動を測
定することにより検出することができる。

【０００７】本発明は、ひとつの面においては、増幅産
物を高分子化する工程を含む核酸増幅反応を測定するた
めの核酸増幅反応測定方法であり、高分子化された増幅
産物に起因する反応液の屈折率の変化を干渉により継続
的に測定する工程を含んでいる。核酸増幅反応測定方法
は、好ましくは、核酸増幅反応によって得られる産物と
特異的に反応する試薬を反応液と接する面に固定する工
程を更に含んでいる。

【０００８】本発明は、別の面においては、増幅産物を
高分子化する工程を含む核酸増幅反応を測定するための
核酸増幅反応測定装置であり、反応液を収容した反応部
を保持するための反応部設置部と、反応部の温度を制御
するための反応部温度制御部と、光ビームを発する光源
部と、光源部からの光ビームを反応液を通過する光ビー
ムと反応液を通過しない光ビームとに分割するビーム分
割手段と、反応液を通過する光ビームと反応液を通過し
ない光ビームとを結合するビーム結合手段と、反応液を
通過する光ビームと反応液を通過しない光ビームの結合
により生じる干渉縞を検出するための光検出器とを備え
ている。好ましい核酸増幅反応測定装置では、反応部
は、反応液と接する面に、核酸増幅反応によって得られ
る産物と特異的に反応する試薬が固定されている。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の実施の形態について説明する。

【００１０】［第一の実施の形態］図１に示されるよう
に、本実施形態の核酸増幅反応測定装置１００は、反応
液を収容した反応部１２０を保持するための反応部設置
部１４２と、反応部１２０の温度を制御するための反応
部温度制御部１４４と、反応部１２０に向けて光ビーム
を射出する光源部１０２と、光源部１０２からの光ビー
ムを拡大するためのビームエキスパンダー１０４と、反
応部１２０で反射された光ビームを受ける光検出器１０
８とを備えている。光検出器１０８はケーブル１１０を
介してコンピュータ等のデータ処理部１１２に接続され
ている。

【００１１】光源部１０２は、可干渉性の光を発する光
源を有している。光源は、好ましくはヘリウムネオンレ
ーザーやアルゴンレーザー等の気体レーザーであるが、
位相の揃っている光を発する固体レーザーや半導体レー
ザーや色素レーザー等でもよい。

【００１２】ビームエキスパンダー１０４は、好ましく
はケプラータイプであるが、ガリレオタイプであっても
よい。ケプラータイプの好ましいビームエキスパンダー
は、それを構成するレンズの間の焦点位置に空間フィル
ターを有している。

【００１３】反応部１２０は、図１に示されるように、
光源部１０２から来る光ビームが、斜めに入射するよう
に配置されている。

【００１４】光検出器１０８は、好ましくは、ＣＣＤイ
メージセンサーやＣＭＯＳイメージセンサーやＣＣＤラ
インセンサー等の光電変換素子であるが、フォトダイオ
ードであってもよい。核酸増幅反応測定装置１００は、
光検出器１０８の受光面積を有効に使用するために、反
応部１２０と光検出器１０８の間に、集光レンズを更に
備えていてもよい。

【００１５】反応部設置部１４２は、エアー吸引や押し
付けなどにより、反応部１２０を確実に固定できる。

【００１６】反応部温度制御部１４４は、必要に応じて
反応部１２０を所望の一定温度に加熱して保持すること
ができる。反応部温度制御部１４４は、ペルチェ素子や
抵抗やランプなどによって加熱を行ない、放熱や水冷や
空冷によって冷却を行なう。

【００１７】反応部設置部１４２は反応部温度制御部１
４４の機能を含んでいてもよい。図に示されるように、
反応部設置部１４２と反応部温度制御部１４４が別体で
ある場合、反応部設置部１４２は、熱伝導率の高い材
料、例えば銅や金や真鍮やアルミ等の金属で作られてる
とよい。

【００１８】反応部１２０は、図２に示されるように、
平板状の反応部下板１２２と凹部を有する反応部上板１
２６とを陽極接合や接着剤により接合して作られた閉鎖
型セルであり、被検物質と試薬等を含む反応液を収容す
る空間部１３０を有している。空間部１３０は、好まし
くは十分な量の反応液を収容できる容積を有している
が、微量の反応液を測定する場合には、空間部１３０の
一部または全体を毛管力が生じる程度の寸法に設定して
もよい。また、空間部１３０の厚さは、一定であっても
よいが、一定の勾配を有している方が干渉縞の観測にと
って好適である。

【００１９】反応部上板１２６は、反応液を空間部１３
０に注入するためと反応液を空間部１３０から排出する
ために、図示されていないが、注入排出口あるいは注入
口と排出口を有している。注入排出口あるいは注入口と
排出口は、測定光が当たらない任意の位置に形成されて
よいが、特に測定光の光路の邪魔になり得ない側部に設
けられるとよい。このような反応部は小型化に好適であ
る。

【００２０】反応部上板１２６は、光学的に透明であ
り、例えば石英ガラスやソーダガラス等のガラス、ポリ
エチレンやポリプロピレンやポリスチレン等のプラスチ
ックで作られている。

【００２１】反応部下板１２２は、光を良好に反射する
上面を有している。このため、反応部下板１２２は、例
えば、高い平面度と熱伝導率を有するシリコン板が好適
であるが、金やシリコン等を蒸着等して形成された反射
コートを有する石英ガラスやソーダガラス等のガラス板
やポリエチレンやポリプロピレンやポリスチレン等のプ
ラスチック板等であってもよい。

【００２２】さらに、反応部下板１２２の上面には、被
検物質に対する抗体やターゲットＤＮＡ等と特異的に反
応する特異親和性結合試薬(プローブやプライマー)が、
物理的あるいは化学的に結合されている。つまり、特異
親和性結合試薬が反応部下板１２２の上面に固定(固相
化)されている。特異親和性結合試薬は、反応部下板１
２２の上面の全面に結合されていても、あるいは反応部
下板１２２の上面の一部の領域のみに結合されていても
よい。後者の場合、その一部の領域に、測定のための光
が照射される。

【００２３】特異親和性結合試薬は、反応部下板１２２
の上面にではなく、反応部上板１２６の下面に結合され
ていてもよく、また、反応部下板１２２の上面と反応部
上板１２６の下面の両方に結合されていてもよい。もち
ろん、特異親和性結合試薬は、側板部の内面にも結合さ
れていてもよい。また、特異親和性結合試薬の結合は、
可逆的に結合され、測定後に同一または異なる測定項目
に関する未反応の特異親和性結合試薬と交換されてもよ
い。

【００２４】また、特異親和性結合試薬が固定されたセ
ンサーチップ(プローブを有する支持体)が反応部１２０
に埋め込まれてもよい。このようなセンサーチップが埋
め込まれるタイプは、製造スペースが狭く済むととも
に、量産し易いという利点を有している。また、センサ
ーチップを使用しないタイプは、構造が単純になるので
コストを低く抑えられるという利点を有している。

【００２５】続いて、核酸増幅反応の測定手順について
説明する。

【００２６】まず、生物学的材料(被検物質)と特定の試
薬を混合して反応液を用意する。次に、十分な量の反応
液を反応部１２０の空間部１３０内に入れた後、反応部
１２０を反応部設置部１４２に設置する。反応液は、反
応部１２０を反応部設置部１４２に設置した後に、反応
部１２０の空間部１３０内に入れてもよい。

【００２７】反応部温度制御部１４４によって反応部１
２０を所定の温度に加熱して、ＬＡＭＰ法による核酸増
幅反応を行なう。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は等
温、例えば試料溶液を６５℃に保持することで繰り返し
延長しながら高分子量化反応が進行する。ここで、反応
が進行する温度が従来のＰＣＲ法と比べて低温であるた
め耐熱性を有する試薬、例えば耐熱性ポリメラーゼを用
いる必要がない。また、温度制御部が簡易になる利点が
ある。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については、特開
平１０−３３７１８６号や日経バイオテク第４４８号第
１１頁〜第１３頁に詳しく示されている。これらの文献
は参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【００２８】図３と図４はそれぞれ反応部１２０内にお
けるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の前後の状態を模式
的に示されている。

【００２９】図３に示されるように、反応部１２０に収
容された反応液１５０には、目的のＤＮＡ１５２、目的
以外のＤＮＡ１５４、プライマー(ＮＤＡ合成開始用試
薬)１５６、ｄＮＴＰ(ＤＮＡ合成用試薬)１５８、ＤＮ
Ａ合成酵素１６０などが含まれている。また、反応部下
板１２２の上面に、増幅産物と特異的に反応する試薬
(プローブやプライマー)１３４が固定(固相化)されてい
る。つまり、反応部１２０は固相化された試薬１３４を
有している。

【００３０】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の結果、図
４に示されるように、試薬１３４と結合した高分子化し
た目的のＤＮＡ１６４から成る増幅産物を含む領域とし
ての膜１７０が形成される。この増幅産物の膜１７０の
構成する高分子化した目的のＤＮＡ１６４は、高分子化
した目的のＤＮＡ１６４が試薬１３４に結合したもの、
高分子化の途中で試薬１３４に結合したもの、試薬１３
４に結合して高分子化したものを含んでいる。

【００３１】増幅産物の膜１７０の光学的特性(例えば
屈折率)は、増幅産物の膜１７０を通過する光と増幅産
物の膜１７０を通過しない光との干渉を調べることによ
り測定される。より詳しくは、干渉により形成される干
渉縞の移動を調べることにより測定される。

【００３２】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応では、目的
以外のＤＮＡ１５４は高分子化せずに、目的のＤＮＡ１
５２だけが高分子量化する。また、高分子量化した産物
同士は、反応部１２０の内部、特に試薬１３４が配置さ
れた二次元領域において、お互いに密集することによ
り、増幅産物の膜１７０の高密度化にも寄与する。この
ような増幅産物の膜１７０の高密度化は、これを通過す
る光の位相を変化させ、さらに高分子量化による個々の
産物の三次元的な体積増加は位相の変化を顕著に増大さ
せる。

【００３３】前述したように、試薬１３４は、反応部下
板１２２の上面の全面に結合されていても、あるいはそ
の一部の領域のみに結合されていてもよいが、後者の方
が好ましいと考えられる。それは、試薬１３４の存在す
る領域が減る分、限られた領域に位置する試薬１３４
に、高分子化の前後最中を問わず目的のＤＮＡが結合す
る割合が増し、増幅産物の膜１７０の形成効率が高まる
と予想されるからである。

【００３４】図１において、光源部１０２から射出され
た光ビームは、ビームエキスパンダー１０４によってビ
ーム径が拡大され、反応部設置部１４２に固定された反
応部１２０に斜めに照射される。

【００３５】図２に示されるように、反応部１２０に照
射される光ビームは、反応部上板１２６の上面で部分的
に反射されることにより、二本の光ビームに分割され
る。その一方の光ビームは、反応部上板１２６の上面で
反射され、光検出器１０８に方向付けられる。また、他
方の光ビームは、反応部１２０の空間部に収容された反
応液を通過し、反応部下板１２２の上面で反射され、再
び反応部上板１２６を通過し、光検出器１０８に方向付
けられる。光検出器１０８に方向付けられたこれら二本
の光ビームは、互いに結合し、干渉を起こす。この干渉
により形成される干渉縞は、増幅産物の膜１７０の光学
的特性(例えば屈折率)の変化に応じて移動する。

【００３６】前述したように、反応部１２０は、光源部
１０２から来る光ビームが斜めに入射するように配置さ
れている。反応部１２０に対する光ビームの入射角は、
反応部上板１２６の上面で反射される光ビームと反応部
下板１２２の上面で反射される光ビームとが干渉し得る
角度に設定される。好ましくは、両光ビームの強度がほ
ぼ等しくなる角度に設定される。あるいは、所望の入射
角において、両光ビームが干渉縞を形成し得るように、
より好ましくは両光ビームの強度がほぼ等しくなるよう
に、反応部下板１２２の上面の反射率に応じて、反応部
上板１２６の上面に増反射コートが施されてもよい。

【００３７】反応部１２０で反射された光ビームは、光
検出器１０８を照明し、その受光面に干渉縞が形成され
る。光検出器１０８に照射された光は電気信号に変換さ
れ、その電気信号は、ケーブル１１０を介して、コンピ
ュータ等のデータ処理部１１２に取り込まれる。データ
処理部１１２では、例えば干渉縞の移動が所定の演算処
理により求められる。その結果、例えば増幅産物の膜の
光学的特性(例えば屈折率)の変化を反映した測定データ
が得られる。

【００３８】以上の説明から分かるように、反応部１２
０は、核酸増幅反応の際も、常に反応部設置部１４２の
上に配置されたままである。言い換えれば、核酸増幅反
応測定装置１００に載置されたままで、核酸増幅反応が
行なわれる。つまり、反応部１２０は、核酸増幅反応測
定装置１００から外されることなく、所定の位置に配置
されたままでいる。従って、核酸増幅反応を継続的に測
定を行なうことができる。また、反応部１２０の角度調
整が一回だけで済む。

【００３９】本実施形態によれば、電気泳動法では測定
できない増幅産物が高分子化する反応であっても測定で
きる。また、蛍光色素などの検出用の化合物を添加する
ことなく核酸増幅産物を測定できる。さらに、核酸増幅
反応を開始させてから継続的に測定することで、増幅の
初期段階で検出し、その変化の単位時間あたりの変化量
から最終的な変化量を算出することができる。従って、
これまでにない高速で高感度で低価格な核酸増幅反応の
測定方法と測定装置が提供される。

【００４０】また、反応部１２０の空間部１３０に反応
液を充填することにより、液量が一定となり、反応結果
を正確に測定できるばかりでなく、屈折率の測定に重要
な光学的条件を一定に保つことができるとともに、反応
液の蒸発や零れによる反応条件の変動や外部への汚染等
も有効に回避できる。

【００４１】上述した実施形態では、反応部１２０は、
反応部下板１２２の上面に固相化された試薬(プローブ
やプライマー)１３４を有しているが、必ずしも、この
ような試薬を有している必要はない。本実施形態の核酸
増幅反応測定装置は、このような試薬を持たない反応部
を用いても、十分に測定可能である。

【００４２】図５と図６はそれぞれこのような反応部１
２０Ａ内におけるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の前後
の状態を模式的に示されている。

【００４３】図５に示されるように、反応部１２０Ａ
は、固相化された試薬(プローブやプライマー)を有して
いない。これに収容された反応液１５０には、前述した
ように、目的のＤＮＡ１５２、目的以外のＤＮＡ１５
４、プライマー１５６、ｄＮＴＰ１５８、ＤＮＡ合成酵
素１６０などが含まれている。

【００４４】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の結果、図
６に示されるように、高分子化した目的のＤＮＡ１６４
が生成される。反応部１２０Ａは固相化された試薬を有
していないので、高分子化した目的のＤＮＡ１６４は反
応液１５０中を浮遊し続ける。

【００４５】高分子化した目的のＤＮＡ１６４は反応液
１５０の光学的特性(例えば屈折率)を変化させる。この
光学的特性の変化は、反応液１５０を通過する光と反応
液１５０を通過しない光との干渉を調べることにより、
より詳しくは、干渉により形成される干渉縞の移動を調
べることにより測定される。

【００４６】［第二の実施の形態］図７に示されるよう
に、本実施形態の核酸増幅反応測定装置２００は、反応
液を収容した反応部２２０を保持するための反応部設置
部２４２と、反応部２２０の温度を制御するための反応
部温度制御部２４４と、光ビームを射出する光源部２０
２と、光源部２０２からの光ビームを拡大するためのビ
ームエキスパンダー２０４と、光源部２０２からの光ビ
ームを二本に分割するためのビーム分割素子２０６と、
分割された二本の光ビームを結合するためのビーム結合
素子２１２と、分割された一方の光ビームを反応部２２
０を介してビーム結合素子２１２に方向付けるためのミ
ラー２０８と、分割された他方の光ビームをビーム結合
素子２１２に方向付けるためのミラー２０８と、ビーム
結合素子２１２からの光ビームを受ける光検出器２１４
とを備えている。光検出器２１４はケーブル２１６を介
してコンピュータ等のデータ処理部２１８に接続されて
いる。

【００４７】光源部２０２とビームエキスパンダー２０
４と光検出器２１４とデータ処理部２１８は、それぞ
れ、第一実施形態における光源部１０２とビームエキス
パンダー１０４と光検出器１０８とデータ処理部１１２
と同様の部材である。

【００４８】反応部２２０は、図８に示されるように、
平板状の反応部下板２２２と凹部を有する反応部上板２
２６を接合して作られた閉鎖型セルであり、反応部下板
２２２が光学的に透明である以外は、第一実施形態にお
ける反応部１２０と同等の構造体である。

【００４９】つまり、この反応部２２０は、反応部下板
２２２と反応部上板２２６が共に光学的に透明である。
例えば、反応部下板２２２と反応部上板２２６が共に、
石英ガラスやソーダガラス等のガラス、ポリエチレンや
ポリプロピレンやポリスチレン等のプラスチックで作ら
れている。従って、測定用の光ビームは、反応部２２０
を透過し得る。

【００５０】反応部２２０は、好ましくは、増幅産物と
特異的に反応する試薬(プローブやプライマー)が反応部
下板２２２の上面に固定されているが、このような試薬
を有していなくてもよい。

【００５１】反応部設置部２４２と反応部温度制御部２
４４は、それぞれ、機能的には、第一実施形態における
反応部設置部１４２と反応部温度制御部１４４と同様の
部材であるが、図８に示されるように、測定用の光ビー
ムを通過させるための開口部２４６と開口部２４８を有
している。

【００５２】図７に示されるように、反応部設置部２４
２と反応部温度制御部２４４は、ミラー２０８とビーム
結合素子２１２の間において、光路上に配置されてお
り、反応部設置部２４２に固定された反応部２２０は、
光路を横切って配置される。

【００５３】ビーム分割素子２０６は、例えば、偏光ビ
ームスプリッターや、透過率のあるミラー例えばハーフ
ミラーである。

【００５４】ミラー２０８とミラー２１０は、好ましく
は、誘電体多層膜やクロムメッキ等による全反射ミラー
である。

【００５５】ビーム結合素子２１２は、偏光ビームスプ
リッターや、透過率のあるミラー例えばハーフミラーで
ある。

【００５６】測定は、第一の実施の形態と同様の手順で
行なわれる。すなわち、まず、被検物質と特定の試薬を
混合して反応液を用意し、これを反応部２２０に十分な
量を入れた後、反応部２２０を反応部設置部２４２に設
置する。反応部温度制御部２４４によって反応部２２０
を所定の温度に加熱して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反
応を行なう。

【００５７】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の結果、反
応部２２０が固相化された試薬を有している場合には、
第一実施形態で説明したように、反応部下板の上面に固
定された試薬(プローブやプライマー)と結合した高分子
化した目的のＤＮＡから成る増幅産物の膜が形成され
る。この増幅産物の膜の光学的特性は、増幅産物の膜を
通過する光と増幅産物の膜を通過しない光との干渉を調
べることにより測定される。

【００５８】また、反応部２２０が固相化された試薬を
有していない場合には、第一実施形態で説明したよう
に、反応液中に高分子化した目的のＤＮＡが生成され
る。この高分子化した目的のＤＮＡを含む反応液の光学
的特性は、反応液を通過する光と反応液を通過しない光
との干渉を調べることにより測定される。

【００５９】図７において、光源部２０２から射出され
た光ビームは、ビームエキスパンダー２０４によってビ
ーム径が拡大され、ビーム分割素子２０６により部分的
に反射されることにより、二本の光ビームに分割され
る。ビーム分割素子２０６で反射された一方の光ビーム
は、ミラー２０８で反射され、反応部２２０を透過し、
ビーム結合素子２１２を透過する。一方、ビーム分割素
子２０６を透過した他方の光ビームは、ミラー２１０で
反射され、ビーム結合素子２１２で反射される。

【００６０】ビーム結合素子２１２を透過した光ビーム
とビーム結合素子２１２で反射された光ビーム、すなわ
ち反応部２２０を通過した光ビームと反応部２２０を通
過しない光ビームは、ビーム結合素子２１２によって、
共に光検出器２１４に方向付けられ、その結果、互いに
結合し、干渉を起こす。

【００６１】ビーム結合素子２１２からの結合された光
ビームは、光検出器２１４を照明し、その受光面に干渉
縞が形成される。光検出器２１４に照射された光は電気
信号に変換され、その電気信号は、ケーブル２１６を介
して、コンピュータ等のデータ処理部２１８に取り込ま
れる。データ処理部２１８では、例えば干渉縞の移動が
所定の演算処理により求められる。その結果、例えば、
増幅産物の膜あるいは反応液の光学的特性(例えば屈折
率)の変化を反映した測定データが得られる。

【００６２】このように本実施形態においても、第一実
施形態と同様に、電気泳動法では測定できない増幅産物
が高分子化する反応であっても測定できる。また、蛍光
色素などの検出用の化合物を添加することなく核酸増幅
産物を測定できる。さらに、核酸増幅反応を開始させて
から継続的に測定することで、増幅の初期段階で検出
し、その変化の単位時間あたりの変化量から最終的な変
化量を算出することができる。従って、これまでにない
高速で高感度で低価格な核酸増幅反応の測定方法と測定
装置が提供される。

【００６３】［第三の実施の形態］図９に示されるよう
に、本実施形態の核酸増幅反応測定装置３００は、反応
液を収容した反応部３２０を保持するための反応部設置
部３４２と、反応部３２０の温度を制御するための反応
部温度制御部３４４と、光ビームを射出する光源部３０
２と、光源部３０２からの光ビームを拡大するためのビ
ームエキスパンダー３０４と、光源部３０２からの光ビ
ームを部分的に反射するための参照板３０８と、参照板
３０８からの光ビームを集光するための集光レンズ３１
０と、参照板３０８と反応部３２０からの光ビームを偏
向するためのビーム分離素子３０６と、ビーム分離素子
３０６からの光ビームを受ける光検出器３１２とを備え
ている。光検出器３１２はケーブル３１４を介してコン
ピュータ等のデータ処理部３１６に接続されている。

【００６４】光源部３０２とビームエキスパンダー３０
４と光検出器３１２とデータ処理部３１６と反応部設置
部３４２と反応部温度制御部３４４は、それぞれ、第一
実施形態における光源部１０２とビームエキスパンダー
１０４と光検出器１０８とデータ処理部１１２と反応部
設置部１４２と反応部温度制御部１４４と同様の部材で
ある。

【００６５】反応部３２０は、好ましくは、第一実施形
態で説明した反応部１２０と同じ構造体であり、好まし
くは、増幅産物と特異的に反応する固相化された試薬
(プローブやプライマー)を有しているが、固相化された
試薬は有していなくてもよい。

【００６６】参照板３０８は、光源部３０２からの光ビ
ームを部分的に反射することにより、反応部３２０を通
る光ビームと反応部３２０を通らない光ビームを作り出
す。反応部３２０を通らない光ビームは、参照板３０８
で反射された光の他に、反応部３２０の反応部上板の上
面あるいは前側面で反射された光も含んでいる。このた
め、反応部３２０の反応部上板の上面で反射される光が
多い場合には、反応部３２０を通らない光ビームの強度
を抑えるために、参照板３０８に適宜減光膜が設けられ
るとよい。また、反応部３２０の反応部上板の上面で反
射される光が多く、それだけで十分な強度の反応部３２
０を通らない光ビームが得られる場合には、省略されて
もよい。

【００６７】集光レンズ３１０は、参照板３０８を透過
した光ビームを集光する。このような集光レンズ３１０
を設けることは、複数の反応部３２０の間における設置
時の反応部３２０の傾き誤差を考慮する必要をなくすと
いう利点を有している。集光レンズ３１０は、省略され
てもよい。

【００６８】ビーム分離素子３０６は、参照板３０８と
反応部３２０で反射された光ビームを、光源部３０２か
らの光ビームから分離して、光検出器３１２に方向付け
る。ビーム分離素子３０６は、ビームエキスパンダー３
０４を構成するレンズ間に配置されてもよい。

【００６９】測定は、第一の実施の形態と同様の手順で
行なわれる。すなわち、まず、被検物質と特定の試薬を
混合して反応液を用意し、これを反応部３２０に十分な
量を入れた後、反応部３２０を反応部設置部３４２に設
置する。反応部温度制御部３４４によって反応部３２０
を所定の温度に加熱して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反
応を行なう。

【００７０】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の結果、反
応部３２０が固相化された試薬を有している場合には、
第一実施形態で説明したように、反応部下板の上面に固
定された試薬(プローブやプライマー)と結合した高分子
化した目的のＤＮＡから成る増幅産物の膜が形成され
る。この増幅産物の膜の光学的特性は、増幅産物の膜を
通過する光と増幅産物の膜を通過しない光との干渉を調
べることにより測定される。

【００７１】また、反応部３２０が固相化された試薬を
有していない場合には、第一実施形態で説明したよう
に、反応液中に高分子化した目的のＤＮＡが生成され
る。この高分子化した目的のＤＮＡを含む反応液の光学
的特性は、反応液を通過する光と反応液を通過しない光
との干渉を調べることにより測定される。

【００７２】図９において、光源部３０２から射出され
た光ビームは、ビームエキスパンダー３０４によってビ
ーム径が拡大され、ビーム分離素子３０６を透過し、参
照板３０８に達する。光ビームは、参照板３０８によ
り、これを透過する光ビームと、これにより反射される
光ビームとに分割される。参照板３０８を透過した光ビ
ームは、集光レンズ３１０により集光され、反応部３２
０に達する。反応部３２０に達した光ビームは、反応部
３２０に収容された反応液を透過し、反応部３２０の反
応部下板の上面で反射され、集光レンズ３１０を通り、
参照板３０８を透過する。この参照板３０８を透過した
光ビームは、参照板３０８で反射された光ビームと結合
し、干渉を起こす。

【００７３】なお、場合によっては、反応部３２０に達
した光ビームは、反応部３２０の反応部上板の上面によ
り、これを透過する光ビームと、これにより反射される
光ビームとに分割されるが、反応部上板を透過した光ビ
ームは、反応部下板で反射された後、反応部上板で反射
された光ビームと結合される。

【００７４】すなわち、光源部３０２からの光ビーム
は、参照板３０８によって、また反応部３２０の反応部
上板によって、反応液を通過する光ビームと反応液を通
過しない光ビームとに分割された後、再びそれらによっ
て、これら二本のビームは結合され、干渉を起こす。

【００７５】参照板３０８からの結合された光ビーム
は、ビーム分離素子３０６によって光検出器３１２に方
向付けられ、光検出器３１２を照明し、その受光面に干
渉縞が形成される。光検出器３１２に照射された光は電
気信号に変換され、その電気信号は、ケーブル３１４を
介して、コンピュータ等のデータ処理部３１６に取り込
まれる。データ処理部３１６では、例えば干渉縞の移動
が所定の演算処理により求められる。その結果、例え
ば、増幅産物の膜あるいは反応液の光学的特性(例えば
屈折率)の変化を反映した測定データが得られる。

【００７６】このように本実施形態においても、第一実
施形態と同様に、電気泳動法では測定できない増幅産物
が高分子化する反応であっても測定できる。また、蛍光
色素などの検出用の化合物を添加することなく核酸増幅
産物を測定できる。さらに、核酸増幅反応を開始させて
から継続的に測定することで、増幅の初期段階で検出
し、その変化の単位時間あたりの変化量から最終的な変
化量を算出することができる。従って、これまでにない
高速で高感度で低価格な核酸増幅反応の測定方法と測定
装置が提供される。

【００７７】これまで、いくつかの実施の形態について
図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上
述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨
を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。

【００７８】

【発明の効果】本発明によれば、電気泳動法では測定で
きない増幅産物が高分子化する反応であっても測定でき
る。また、蛍光色素などの検出用の化合物を添加するこ
となく核酸増幅産物を測定できる。さらに、核酸増幅反
応を開始させてから継続的に測定することで増幅の初期
段階で検出し、その変化の単位時間あたりの変化量から
最終的な変化量を算出することができる。すなわち、レ
ートアッセイと呼ばれる測定方法が、非標識、非プロー
ブで可能になる。従って、今までに類を見ない高速で高
感度で低価格な核酸増幅反応の測定方法と測定装置が提
供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第一の実施の形態による核酸増幅反応
測定装置を示している。

【図２】図１に示される反応部の断面図である。

【図３】固相化された試薬を有する反応部内におけるＬ
ＡＭＰ法による核酸増幅反応の前の状態を模式的に示し
ている。

【図４】固相化された試薬を有する反応部内におけるＬ
ＡＭＰ法による核酸増幅反応の後の状態を模式的に示し
ている。

【図５】固相化された試薬を持たない別の反応部内にお
けるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の前の状態を模式的
に示している。

【図６】固相化された試薬を持たない別の反応部内にお
けるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の後の状態を模式的
に示している。

【図７】本発明の第二の実施の形態による核酸増幅反応
測定装置を示している。

【図８】図７に示される反応部と反応部設置部と反応部
温度制御部の断面を示している。

【図９】本発明の第三の実施の形態による核酸増幅反応
測定装置を示している。

【符号の説明】

１００ 核酸増幅反応測定装置 １０２ 光源部 １０８ 光検出器 １２０ 反応部 １４２ 反応部設置部 １４４ 反応部温度制御部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森 安義 栃木県大田原市下石上1381−３ 栄研化学 株式会社那須事業所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 HA11 HA19 4B029 AA07 AA11 AA12 AA23 FA10 FA12 4B063 QA01 QQ42 QR08 QR32 QR42 QS25 QS39 QX02

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 増幅すべき核酸配列を繰り返し延長しな
   がら高分子量化する工程を含む核酸増幅反応を測定する
   ための核酸増幅反応測定方法であり、増幅すべき核酸配
   列を繰り返しながら高分子量化した産物を含む領域を通
   過する光と通過しない光の干渉に基づいて測定する工程
   を含んでいる、核酸増幅反応測定方法。
2. 【請求項２】 核酸増幅反応によって得られる産物と特
   異的に反応する試薬を反応液と接する面に固定する工程
   を更に含んでいる、請求項１に記載の核酸増幅反応測定
   方法。
3. 【請求項３】 増幅すべき核酸配列を繰り返し延長しな
   がら高分子量化する工程を含む核酸増幅反応を測定する
   ための核酸増幅反応測定装置であり、 反応液を収容した反応部を保持するための反応部設置部
   と、 反応部の温度を制御するための反応部温度制御部と、 光ビームを発する光源部と、 光源部からの光ビームを反応液を通過する光ビームと反
   応液を通過しない光ビームとに分割するビーム分割手段
   と、 反応液を通過する光ビームと反応液を通過しない光ビー
   ムとを結合するビーム結合手段と、 反応液を通過する光ビームと反応液を通過しない光ビー
   ムの結合により生じる干渉縞を検出するための光検出器
   とを備えている、核酸増幅反応測定装置。
4. 【請求項４】 反応部は、反応液と接する面に、核酸増
   幅反応によって得られる産物と特異的に反応する試薬が
   固定されている、請求項３に記載の核酸増幅反応測定装
   置。