JPH10337186A - 核酸配列の増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、ＰＣＲ法における特異性と増幅生成
物の検出操作の改善を課題としている。 【構成】標的核酸配列の複数の領域に対応するプライマ
ーを連結したマルチリンクプライマー（ＭＬＰ）をハイ
ブリダイズさせ、これを複製起点として相補鎖合成を行
ってマトリクス状の構造を持つ増幅産物を生成させる核
酸配列の増幅方法。 【効果】複数の領域を対象とすることにより非特異的な
増幅による偽陽性結果の可能性が下がる。マトリクス状
の増幅生成物は、他の試薬や特殊な装置を用いなくても
追跡することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡの増幅方法に関す
るものである。ＤＮＡの増幅反応は遺伝子の塩基配列を
特異的に増幅させる反応である。ＤＮＡの増幅反応は、
感染症の原因となる病原体の高感度な検出方法や遺伝子
のクローニング等に応用されている。

【０００２】

【従来の技術】標的核酸配列を増幅する方法の一つとし
てＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 法[ 1]が知られ
ている。ＰＣＲ法は、in vitroにおける核酸の増幅技術
として最も一般的な方法である。ＰＣＲ法は以下のよう
な原理に基づいている。すなわち増幅の対象とする配列
の両端に相補的なプライマーを用意し、その３’末端を
ＤＮＡポリメラーゼの起点として１本鎖の標的配列を鋳
型として相補鎖合成を行わせる。反応後に生成する２本
鎖を加熱によって１本鎖に変性させ、再びプライマーの
アニールと相補鎖合成を行わせる。一連の反応を繰りか
えすことによって、理論的には１つの１本鎖から２ⁿ本
の増幅生成物を得る事ができる。

【０００３】ＰＣＲ法は、遺伝子のクローニングや検出
において広い範囲で応用されている優れた増幅方法であ
るが、遺伝子の検出に利用する場合にはいくつかの問題
点を持っていた。第１に、ＰＣＲ法のような高度な増幅
を行なう反応には、非特異的なノイズも同じように増幅
されるという危険性が常にともなう。つまり標的配列が
存在しないのにもかかわらずプライマーの非特異的なア
ニールによって１本でも増幅生成物が生じれば、そのノ
イズは以降の反応で鋳型として機能するため結果として
プラスと判定されてしまう事になる。一般には、できる
だけ非特異的なアニールが生じないように特異的な配列
をプライマーに設定し、しかもＴｍすなわち２本鎖ＤＮ
Ａが１本鎖に融解する温度に近い高温条件下でアニール
させることでノイズを防ぐように努力されている。しか
し常に望ましい特異性を維持できるとは限らないので、
非特異反応の危険性を否定する事はできない。

【０００４】ＰＣＲ法における非特異反応の対策として
提案されたのが入れ子式のＰＣＲ法(nested PCR)[ 2]で
ある。この方法では、ある領域の内側に位置する領域を
増幅することができる２組目のプライマーセットを組み
合わせてＰＣＲ法を行う。すなわち、まず外側に位置す
る１組のプライマーセット(outer primer)でＰＣＲ法を
行って増幅産物を得、この増幅産物の一部分を増幅する
ことができる２組目のプライマーセット(inner primer)
によって再びＰＣＲ法を行う。この方法によれば、たと
え１組目のプライマーセットが誤った配列を増幅して
も、その産物には２組目のプライマーがアニールできな
いので誤った結果にはつながらない。その上、増幅産物
を鋳型として利用することから高い増幅効率を期待でき
るので感度向上につながるとされている。しかし増幅産
物を直接的に確認できないという特徴（後述）は、基本
となっているＰＣＲ法と同じである。

【０００５】ＰＣＲ法の非特異的な反応としては、コン
タミネーションによる偽陽性反応も指摘されている。増
幅生成物が鋳型として機能するＰＣＲ法では、増幅生成
物を含む反応液が他の反応系にわずかでも混入すると、
それが鋳型となって陽性結果をもたらすことになる。コ
ンタミネーションの影響は、増幅反応の基質としてｄＵ
ＴＰを用い、ＰＣＲ法に先だってウラシルグルコシダー
ゼで反応液を処理することで防止できる。しかし検出対
象であるＤＮＡにはｄＵＴＰが取りこまれていないので
ウラシルグルコシダーゼで分解することができない。し
たがって、検出対象であるＤＮＡが多量に存在する時に
はこの方法は無力である。また付加的な操作が必要にな
るので簡便な方法とは言いにくい。

【０００６】特異性の改善を意図したものではないが、
複数の領域を同時に増幅しその変異を分析する、いわゆ
る多重ＰＣＲ(Multiplex PCR)法によって遺伝子診断を
行った報告がある。すなわち、ジストロフィン遺伝子の
欠失変異を、９つの領域に対応する１８種類のプライマ
ーによるＰＣＲ法で検出する試みである[ 3]。この試み
は、複数の領域について増幅を行う点で本発明と共通す
るが、特異性の向上や増幅生成物の直接的な検出を目的
とするものではない。複数の領域を増幅する技術は、プ
ライマーの混合物を使ったＰＣＲ法(Mixed oligonucleo
tide primed amplification;MOPAC)[ 4]においても応用
されている。この方法は、ＰＣＲ法をｃＤＮＡのクロー
ニングに応用したもので、増幅生成物の検出を目的とす
る本発明とは技術分野を異にしている。いずれにせよ、
これらの複数の領域を増幅する技術では、通常のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いているので生じる
増幅生成物はやはり単なるＤＮＡであり直接的な検出は
困難である。

【０００７】ＰＣＲ法の第２の問題点は、増幅生成物の
検出方法である。ＰＣＲ法の増幅生成物は単なるＤＮＡ
なので、それを直接検出する事は難しい。通常は電気泳
動によって予想される長さのＤＮＡが増幅されているか
どうか、あるいはどの程度の量が増幅されたかを検出し
ている。ＤＮＡの電気泳動像は、エチジウムブロマイド
等で染色すれば比較的容易に確認することはできる。と
はいえ、電気泳動操作は多量の検体を迅速に処理するに
は不向きな分析技術である。このような問題点は、増幅
反応に当たって予め標識したプライマーを利用する事で
改善することができる。たとえば、ビオチン化したプラ
イマー[ 5]や蛍光物質標識したプライマー[ 6]が公知で
ある。この反応系によって生成する増幅産物は、ビオチ
ンや蛍光物質を備えている。ビオチン部分は固相化アビ
ジンで捕捉する事ができる。標識には蛍光物質のみなら
ず、酵素、発光物質、あるいは放射性同位元素などが利
用できる。またハプテン標識を利用し、これを標識した
抗ハプテン抗体で検出する方法も公知である。

【０００８】しかしこの種の標識を利用すると、未反応
のプライマーを分離するステップを要求するので反応の
進行をリアルタイムに監視することはできない。蛍光−
消光物質の組み合わせのように標識の組み合わせによっ
ては分離を不要とするいわゆる均一系（ホモジニアス）
な検出反応を可能とする測定原理も知られてはいる。だ
が蛍光−消光物質の組み合わせを利用した反応は増幅生
成物の大きさや塩基の配列などに制限を受けるので、広
い範囲に応用しにくい。

【０００９】ＰＣＲ法による増幅産物を凝集によって確
認できることを示唆している報告[7]もある。すなわ
ち、1組のプライマーが粒子表面に結合するとき相補鎖
の合成にともなって粒子の凝集が期待できるというもの
である。この方法によって増幅産物の直接的な追跡は可
能かもしれないが、使用しているプライマーは一組なの
でいぜんとして非特異的な反応による誤った結果につな
がる可能性は否定できない。粒子上に多くのプローブを
結合させてハイブリダイゼーションアッセイを粒子凝集
として捉えようとした試み[ 8][ 9]がある。しかしこの
報告では単にプローブとしてのオリゴヌクレオチドを開
示するにとどまり、これをプライマーとして利用するこ
とはできない。プライマーとして利用するには相補鎖の
複製起点として利用できる３’末端を持たなくてはなら
ないが、この報告では粒子上のオリゴヌクレオチドの方
向性は考慮されていない。

【００１０】粒子ではなく、ヌクレオチド鎖の中に分岐
構造を取り入れることで、やはりハイブリダイゼーショ
ンアッセイの高感度化を意図した技術[10][11][12][13]
も公知である。分岐構造は本発明におけるマルチリンク
プライマーに共通するが、これらの先行技術はプライマ
ーとしての利用を開示していない。そのため先に説明し
た粒子上に固定したものと同じようにオリゴヌクレオチ
ドの方向性が考慮されていない。したがって、これらの
先行技術に開示された分岐構造を持つオリゴヌクレオチ
ドの接合体は、ポリメラーゼによる複製起点として機能
する３’末端を持つことが要求されない。あるいはその
合成方法では２種類のオリゴヌクレオチドを繰り返し連
結した構造は実現できるが、３種類以上のオリゴヌクレ
オチドを構成比や構造を制御しつつ連結することは困難
である。言い換えればいずれもプローブとしての利用し
か考慮していないので、ヌクレオチド鎖の構成比や構造
はプライマーとして利用する条件とは違っているのであ
る。

【００１１】ＰＣＲ法の進行は、ＤＮＡポリメラーゼの
作用による相補鎖合成にともなって生成するピロリン酸
を指標として追跡することも可能である。ピロリン酸の
検出方法には酵素的な方法[14][15]等が知られている。
これらの方法ではピロリン酸を検出するための試薬成分
を用意し、ＰＣＲ法とは別の反応を行わせる必要がある
ので、簡便な方法とは言いがたい。

【００１２】酵素反応ではなく染色剤を利用してＰＣＲ
の進行をモニターしようとする試み[16]も知られてい
る。エチジウムブロマイドをはじめとする２本鎖ＤＮＡ
の染色剤の存在下でＰＣＲを行い、特定の波長における
蛍光強度の変化をトレースする。２本鎖ＤＮＡに吸着し
て蛍光特性が変化する色素を染色剤に用いれば、反応を
リアルタイムに追跡することができる。しかしもともと
ＤＮＡを分離後に染色するための色素であるエチジウム
ブロマイドでは、２本鎖ＤＮＡに結合しなかったものの
蛍光シグナルとの識別が困難であった。エチジウムブロ
マイドに代えてピリリニウム塩化合物のような２本鎖Ｄ
ＮＡのシグナルを識別し易い染色剤の利用も報告されて
いる[17]。しかしＰＣＲ法に基づいているこれらのモニ
タリング技術では、ＰＣＲ法自身が持っている特異性に
関する問題点は改善できない。

【００１３】ＰＣＲ法が加熱による２本鎖の変性操作を
伴うのに対して、鎖置換増幅反応（Strand Displacemen
t Amplification、ＳＤＡ法）[18]では、２本鎖部分を
解離させながら相補鎖合成を行う特殊なＤＮＡポリメラ
ーゼを用いることによって増幅反応サイクルを実現して
いる。また隣接する２つの領域にハイブリダイズするプ
ローブをライゲーションし、その産物を検出するＬＣＲ
法(Ligase Cycling Reaction)[19]も公知である。これ
らの増幅反応においても、非特異的な反応を生じる可能
性や増幅生成物を直接検出することができない点はＰＣ
Ｒ法と共通である。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＰＣＲ法に
おける特異性と増幅生成物の検出操作の改善を課題とし
ている。具体的には、たとえプライマーが非特異的にア
ニールしたとしてもノイズにつながりにくい増幅原理を
提案する。また検出操作については、反応の進行をリア
ルタイムに監視することができる新しい技術の提供を課
題としている。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、複数のオリゴ
ヌクレオチドが相互に連結した新規な構造を持つプライ
マーの利用によって前記課題を解決するものである。す
なわち本発明は、核酸配列の増幅すべき領域（以下標的
核酸配列と省略）に対しプライマーをハイブリダイズさ
せ、このプライマーを複製起点として相補鎖合成反応に
よって遺伝子を増幅する方法において、相補鎖合成を妨
げない部位において互いに連結された３分子以上のオリ
ゴヌクレオチドであって少なくとも２つの異なる標的核
酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから構成されるプ
ライマーを用いることを特徴とする方法である。本発明
は、この増幅方法によってもたらされるマトリクス状の
構造を持つ増幅生成物（図７）を指標とする核酸配列の
検出方法、並びに反応に必要な複数のプライマーを相互
に連結した新規なプライマーを提供する。なお本発明が
提供する相互に連結されたプライマーを、本明細書では
マルチリンクプライマー（multi link primer、以下Ｍ
ＬＰと省略する）と呼ぶ。

【００１６】本発明による核酸配列の増幅方法で増幅の
対象となる複数の領域とは、単一の遺伝子上の複数の領
域であっても良いし、あるいは複数の遺伝子に分かれて
存在するものであっても構わない。増幅対象が、たとえ
ばウイルスのように１本のＤＮＡあるいはＲＮＡから構
成されているときには、この１本の核酸の配列上で複数
の領域を選択する。複数の領域は、互いに重複しない独
立した領域を選択するのが望ましい。複数の領域が相互
に重複していても本発明を実施することは可能である。
しかし領域が重複すると、重複部分のみの増幅生成物が
同時に生成するために結果として増幅効率の低下につな
がる可能性がある。一方複数の遺伝子上から複数の領域
を選択するケースとしては、たとえば異なる染色体上の
遺伝子配列を増幅対象とする時、細菌のプラスミド等を
増幅対象とする時、また複数種のｒＲＮＡの配列を増幅
対象とする時等が挙げられる。あるいは１本の核酸で構
成されるウイルスの遺伝子配列を増幅対象とする場合で
あっても、複数種のウイルスに対して同時増幅を試みる
場合には異なる核酸上に増幅対象を求めることになる。
たとえば、最近報告されたヒトＧ型肝炎ウイルス（ＨＧ
Ｖ）は、遺伝学的には異なる肝炎ウイルスであるヒトＣ
型肝炎（ＨＣＶ）との重複感染の可能性が高いことが指
摘されている[20]。本発明の複数の増幅対象領域をこれ
らのウイルスの遺伝子配列上に求め、同時に増幅を行う
ことによって重複感染の検出に利用することが可能であ
る。ＨＧＶとＨＣＶのように近縁のウイルス間で同時検
出を試みる時には、次のような標的配列を選択すること
もできる。まず３つの標的配列のうち、２つは２種のウ
イルスにそれぞれ特徴的な配列を設定する。残る１つと
して、両者の間で保存性の高い領域を選んで標的配列と
するのである。種を越えて保存されている遺伝子は多く
知られているので、特殊なウイルス間に限らず同様の手
法で様々な検出対象の同時検出が可能である。

【００１７】本発明においては、直接的な検出対象のみ
ならず増幅反応を監視するための対照を増幅のための領
域に選ぶこともできる。すなわち、たとえば３つの増幅
対象領域を組み合わせる場合に、３つのうちの２つは検
出対象である遺伝子から増幅対象領域を設定する。一方
残る１つの増幅対象領域として、増幅反応を正常に実施
したかどうかを確認することができる配列（内部標準）
を選択する。このような目的で利用される配列に、ヒト
のβアクチン遺伝子などが知られている。βアクチン遺
伝子は全てのヒト細胞に見られる遺伝子なので、そのた
めのプライマーを加えているのにもかかわらずもしも遺
伝子の増幅が観察されない場合には、操作ミスや反応条
件が不適切であった可能性が疑われる。

【００１８】本発明の増幅対象とする複数の領域とは、
２以上、好ましくは３つ以上の領域である。中でも３つ
の領域に対して本発明を適用する時には、ＭＬＰを構成
するプライマーとして各領域に対するプライマーを１つ
づつとすることができ、均等な増幅効率を得やすい。ま
た３つの領域が揃って増幅された時にのみマトリクス状
の増幅生成物を与えることから、特異性の面でも有利で
ある。なぜなら例えば非特異的な増幅生成物が生じたと
しても、それが２つの領域までであればマトリクス状の
増幅生成物を構成できず陽性結果にはつながらないため
である。

【００１９】一方３より多くの領域に対して本発明を適
用することも可能である。たとえば６つの領域を選ぶの
であれば、６つの領域に対するプライマーを設定し相互
に連結してＭＬＰとする。このＭＬＰによって核酸配列
の増幅を行えば、６つの領域のうち少なくとも３つの領
域が増幅できればマトリクス状の増幅生成物を与える。
このような組み合わせが有利なケースとして、単一の試
料で複数の病原体の分析を行う場合を挙げることができ
る。尿試料に含まれるナイセリアとクラミジアを同時分
析する場合を例に取ると、ナイセリア用のプライマーを
３組、クラミジア用のプライマーを３組、合計６つの領
域に対するプライマーを利用して本発明によるＭＬＰを
用意する。このＭＬＰによってＰＣＲ法を行うと、ナイ
セリアとクラミジアのいずれかが存在する時に陽性結果
をもたらすことになるので、一度の操作で２種の病原体
に対するスクリーニングを実施できる。近縁の微生物を
同時にスクリーニングする時にはプライマーのうちの一
部を共用することもできるであろう。逆に種としては１
種でありながら、いくつかのサブタイプが存在している
ことがわかっており、いずれかのサブタイプが存在する
ことを確認したい時には、各サブタイプに対して特異的
な標的配列を選び対応するプライマーを連結して本発明
のＭＬＰとすることもできる。このような使い方をする
時には、サブタイプ間で保存されている領域と特異的な
領域とを適宜組み合わせて、どのサブタイプが存在して
もマトリクス状の増幅生成物を与えるように設計する。
逆に３以下、すなわち２つの領域に対して本発明を適用
するには、ＭＬＰを構成するプライマーとして領域Ａに
対するものと領域Ｂに対するものの、少なくとも一方を
複数としなければならない。プライマーを一つづつ連結
したのでは本発明の必須要件であるマトリクス状の構造
を持つ増幅生成物を与えず、単なる線状の増幅生成物を
もたらすためである。この種の構造は、３以上の違う配
列を持つオリゴヌクレオチドを連結するよりも合成操作
は単純であることが多い。

【００２０】前記複数の領域に対して相補鎖合成反応の
複製起点として機能するプライマーとは、たとえばＰＣ
Ｒ法でプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドを
指す。ＰＣＲ法のためのプライマーは、増幅対象領域の
５’末端に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
と、３’末端と同じ配列（つまり相補鎖にアニールする
ことができる配列）を持つオリゴヌクレオチドの組み合
わせを１セットとするプライマーセットである。ここで
５’側のプライマーはセンス側、３’側のプライマーは
アンチセンス側と呼ぶこともある。相補鎖合成反応をＤ
ＮＡポリメラーゼで行う時、オリゴヌクレオチドが複製
起点となるためには、その３’末端は必ず増幅対象とな
るＤＮＡにハイブリダイズして２本鎖のＤＮＡを構成で
きるものでなければならない。また３’末端はＤＮＡポ
リメラーゼによる次のヌクレオチドの付加が可能なよう
に活性な−ＯＨ基を備えている必要がある。他方、各オ
リゴヌクレオチドの３’末端以外の部分は、増幅対象と
なる塩基配列に対して全体としてハイブリダイズするこ
とができる程度のホモロジーを備えていれば良い。つま
り、必ずしも目的とする増幅対象配列に完全に相補的で
ある必要はない。通常の相補鎖合成反応の条件下では、
７０−１００%のホモロジーを備えていれば特異的なハ
イブリダイズを維持できる。ＰＣＲ法においては、一般
にホモロジーが１%下がるとＴｍが１℃低下するとされ
ている。したがって７０%以下のホモロジーしか備えて
いない場合にはＴｍが３０℃以上も低下することにな
り、通常の温度条件ではアニールすることができなくな
ってしまう。逆に多少の不整合を伴いながらもハイブリ
ダイズが可能な範囲にアニール温度を調節することによ
って、一定の配列を持つオリゴヌクレオチドで幅広い変
異を持つ配列に対しても増幅を行うことができるように
なる。

【００２１】本発明におけるオリゴヌクレオチドプライ
マーは、塩基数で少なくとも６以上、好ましくは１０〜
５０、特に好ましくは１５〜３０程度とする。６未満で
は通常の条件ではハイブリダイズしにくいばかりでな
く、確率的にも非特異的な反応につながる可能性が増
す。これに対して必要以上に長いプライマーを用いる
と、プライマー間あるいはプライマー内の水素結合によ
る２本鎖が形成されやすくなり非特異的な反応につなが
る可能性が大きくなる。また塩基数が大きくなるのにし
たがって化学的に合成する時に収率が低下していく。各
オリゴヌクレオチドは、相補鎖に対する親和性が同じ程
度となるように配列の長さを調整するのが望ましい。相
補鎖のハイブリダイズの強さは、構成塩基のＧ／Ｃ含量
によって左右されるので、構成塩基の数と共にその構成
によって相補鎖とのハイブリダイズ効率には差が生じ
る。一方本発明では、ＭＬＰを構成するオリゴヌクレオ
チドのハイブリダイズ効率をできるだけ等しくすること
がバランスの良いマトリクス構造につながる。したがっ
て、例えば他のオリゴヌクレオチドに対してＧ／Ｃ含量
の極端に低い配列を使う時には、構成塩基数を増やして
やるといった調整を行う。通常は、アニール温度を変え
ることで配列間のハイブリダイズ効率を調整するが、本
発明ではＭＬＰとして全てのオリゴヌクレオチドを同じ
環境で遺伝子増幅に利用するので配列そのものによる調
整が求められる。

【００２２】こうして選択したプライマーセットは、相
補鎖合成を妨げない部位において相互に連結される。相
補鎖合成を妨げない部位とは、オリゴヌクレオチドの
５’末端やオリゴヌクレオチドの側鎖のような、複製起
点となる３’末端以外の部分である。また本発明におい
ては、この連結されたプライマーセットを起点とする分
岐した増幅生成物が相互にハイブリダイズしたマトリク
ス状の構造を持つことが特徴である。したがって、プラ
イマーセットを構成するオリゴヌクレオチドの組み合わ
せも増幅生成物がマトリクス状の構造を取るように連結
する必要がある。以下に３つの重複しない領域に対する
プライマーセットを連結し、本発明に基づいてＰＣＲ法
による核酸配列の増幅を試みる場合に可能な組み合わせ
を示す。なお各プライマーセットは、３つの領域Ａ、
Ｂ、およびＣに対してそれぞれの５’側、３’側をＡＦ
／ＡＲ、ＢＦ／ＢＲ、並びにＣＦ／ＣＲで示した。連結
後のプライマーをＭＬＰ１、ＭＬＰ２、ＭＬＰ３、およ
びＭＬＰ４とし、各ＭＬＰを構成するオリゴヌクレオチ
ドの組み合わせを表１にまとめた。

【００２３】

【表１】

【００２４】表１の組み合わせから明らかなようにＭＬ
Ｐを構成するプライマーは３’側用と５’側用のものを
任意に組み合わせることができる。３つのオリゴヌクレ
オチドが互いに異なるようにすれば、どのように組み合
わせても本発明のＭＬＰとして機能する。またマトリク
ス状の生成物を生成させるには、１分子のＭＬＰ内に同
一の領域に対する３’側と５’側のプライマーがともに
存在しないように設定することも本発明のＭＬＰの条件
である。１分子内に同一の標的配列に対するプライマー
がともに存在すると、ＭＬＰ１分子内部だけで相補的な
２本鎖を形成してしまうため、他のＭＬＰ分子との連結
を阻害しマトリクス状の生成物の形成を妨害する結果に
つながる。表１の組み合わせのうち、３つのオリゴヌク
レオチドを連結したもののみでＭＬＰを構成する場合
（すなわちcaseＡ−Ｄ）は、本発明におけるもっとも望
ましい態様である。これらの組み合わせでは、各プライ
マーの間でハイブリダイズする機会、増幅反応の効率と
いった条件が等しくなり、結果としてバランスの良いマ
トリクス状の増幅生成物につながりやすいためである。

【００２５】表１の組み合わせの他にもマトリクス状の
増幅生成物をもたらすプライマーの組み合わせは考えら
れる。たとえば、同じ領域に対するプライマー（たとえ
ばＡＦとＡＲのセット）とが１つの分子となるように連
結した場合がそうである。プライマーセットのうち少な
くともいずれか一方を複数連結しておけば、これをプラ
イマーとして得られた増幅生成物はマトリクス状の構造
を与える。しかしこのような組み合わせでは、１つの増
幅対象領域に由来する増幅生成物で陽性の結果につなが
ることから公知のＰＣＲと同じ程度の特異性が期待でき
るに過ぎないことになる。したがって本発明における望
ましいＭＬＰは、少なくともある増幅対象領域のプライ
マーセットの一方のみで構成され、複数のＭＬＰを用い
て初めてマトリクス状の増幅生成物を生じるように組み
合わされたものと言うことができる。このようなＭＬＰ
を用いることで、従来のＰＣＲでは達成できない特異性
を実現できるのである。

【００２６】ここまではＭＬＰをＰＣＲ法に利用するケ
ースを想定して説明した。しかし本発明によって提供さ
れる核酸配列の増幅方法は、ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅
反応へも応用することができる。たとえばリガーゼを利
用したＬＣＲ法[19]、あるいはその改良法[21]、そして
ＴＭＡ法(Transcription-Mediated Amplification)[22]
へもＭＬＰを利用することが可能である。ＬＣＲ法で
は、１つの増幅対象領域に対して４つのプライマーが必
要となる。ＬＣＲ法を本発明によるＭＬＰを使って実現
するためには、３つの領域Ａ、Ｂ、およびＣのそれぞれ
に４つのプライマー（センス鎖とアンチセンス鎖に対し
てそれぞれ３’側と５’側のプライマー）が必要なこと
から、合計４種類のＭＬＰを用意することになる。一方
ＬＣＲ法と同じく遺伝子の増幅反応として知られている
ＳＤＡ法[18]では、増幅生成物にニックを生じて切り出
す反応が基本になっていることから、本発明に応用する
ことはできない。増幅生成物がマトリクス状の構造をも
たらさないためである。

【００２７】一方、ＴＭＡ法ではＲＮＡポリメラーゼの
ためのプロモーター配列を付加した第１プライマー、そ
して標的配列のアンチセンス側の合成起点となる第２プ
ライマーを用い、ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素を組
み合わせて標的配列に相補的なＲＮＡとＤＮＡを増幅す
る。ＲＮＡを標的配列とするとき、第一段階ではＲＮＡ
にハイブリダイズした第１プライマーを合成起点として
逆転写酵素により相補的な配列を持つＤＮＡが合成され
る。次いで標的配列であるＲＮＡがＲＮａｓｅＨによっ
て消化分解され、残ったＤＮＡ（１本鎖）に対して第２
プライマーがハイブリダイズしてこれを合成起点とする
相補鎖合成が行われる。続く第二段階は、第一段階で生
成したＤＮＡ（２本鎖）を鋳型として進行するＲＮＡポ
リメラーゼによる転写反応である。第一段階で生成した
ＤＮＡ（２本鎖）は、第１プライマーに由来するプロモ
ーター部分が２本鎖となっているので、ＲＮＡポリメラ
ーゼがこれを認識して標的配列に対応するＲＮＡが転写
される。こうして生じたＲＮＡはＤＮＡ増幅のための鋳
型として機能できるとともに、ＲＮａｓｅＨにより酵素
的に分解できることから、ＰＣＲのような加熱変性工程
が不要となり結果的に等温条件のもとで増幅が実現す
る。したがって、第１プライマーと第２プライマーのそ
れぞれを、ＭＬＰとしておけば本発明に基づくマトリク
ス構造を持つ増幅生成物を与える。ＴＭＡの増幅対象と
する標的配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても良
い。特にｒＲＮＡを標的配列として選んだ場合には、も
ともと１本鎖の状態で存在しているので変性工程が不要
であり、更に１細胞中に数百コピー存在していることか
ら感度的にも有利である。ＴＭＡ法と同様にＲＮＡポリ
メラーゼを利用した遺伝子増幅方法としてＮＡＳＢＡ法
(Nucleic Acid Basedsequence Amplification)が知られ
ているが、この方法に本発明によるＭＬＰを組み合わせ
ることも可能である。

【００２８】本発明に必要なＭＬＰは、β−シアノエチ
ルアミダイト法[23]のような通常の方法によって合成し
た各オリゴヌクレオチドを適当な方法で連結することに
よって得ることができる。たとえば、トリスアミンと呼
ばれる一群の３官能性試薬によってオリゴヌクレオチド
の５’末端を連結すれば３つのオリゴヌクレオチドを連
結することができる。トリスアミンを用いた合成方法の
詳細については後に述べる。

【００２９】４つのオリゴヌクレオチドを連結するに
は、まず２つのオリゴヌクレオチドを５’側で連結し、
得られた連結オリゴヌクレオチドを更に結合する方法を
利用する。５’側で２つのオリゴヌクレオチドが連結し
た構造はＩＬＯ (inverse linkage oligonucleotides)
として公知である[24]。ＩＬＯは、通常の固相ホスホル
アミダイト法により得ることができる固相−３’−５’
というオリゴヌクレオチド[25]をもとに、更に逆ホスホ
ルアミダイト法[26]に基づいて５’→３’方向へオリゴ
ヌクレオチドを付加していくことで製造することができ
る。こうして得られるＩＬＯにアミノ基やチオール基を
導入し、ヘテロ２官能性試薬によって架橋すれば４種類
のオリゴヌクレオチドを１分子づつ連結し、しかもそれ
ぞれのオリゴヌクレオチドがプライマーとして相補鎖合
成の起点となりうるＭＬＰとすることができる。

【００３０】ＭＬＰは修飾されていないオリゴヌクレオ
チドを連結したものであっても良いが、検出のために標
識しておくこともできる。好ましい標識成分としては、
蛍光物質や発光物質、あるいはこれらの標識物質の間接
的な結合を可能とする結合性リガンドを示すことができ
る。

【００３１】本発明による核酸配列の増幅方法は、プラ
イマーとしてＭＬＰを利用する他は、公知のＰＣＲ法と
同じ条件の基で実施することができる。すなわち、相補
鎖合成を触媒するＤＮＡポリメラーゼに必要な補助的な
成分、活性の発現に好適なｐＨを維持する緩衝液や保護
剤、ＤＮＡ合成に必要なヌクレオチド類を加えて温度サ
イクルを行えば良い。ＭＬＰは増幅対象となる遺伝子の
予想される量に対して大過剰となるように加える。プラ
イマーを過剰とすることで、鋳型との間でハイブリダイ
ズが促進され、結果として増幅効率の向上につながる。

【００３２】本発明による核酸配列の増幅方法は、遺伝
子の検出に応用することができる。本発明によって生成
するマトリクス状の構造を持つ増幅産物は、単なる２本
鎖のＤＮＡとは異なり光学的な手法などによって直接的
に検出することが可能である。マトリクス状の構造を持
つ増幅生成物は、アグリゲートとして光学的に追跡する
ことができる。したがって、相補鎖合成を行いながらリ
アルタイムで反応の進行を監視することができる。

【００３３】本発明に基づいて遺伝子の検出を行う時、
検出対象は、その塩基配列が既知のポリヌクレオチドで
ある。本発明の検出対象は、動物、植物、細菌、酵母、
糸状菌、マイコプラズマ、リケッチア、ウイルス他あら
ゆるものに由来するポリヌクレオチドにおよぶ。またポ
リヌクレオチドとしては、ゲノミック核酸はもちろん、
ＲＮＡウイルスやｍＲＮＡから逆転写酵素によって誘導
されたｃＤＮＡを検出対象とすることも可能である。

【００３４】本発明に基づく遺伝子の検出方法に必要な
各種成分は、予め組み合せた試薬の形で供給することが
できる。あらためて本発明による塩基配列検出用試薬の
構成を次に示す。以下に示す試薬には、反応液を構成す
る緩衝剤、あるいは陰性や陽性の対照等の任意の成分を
組み合せてキットの形とすることもできる。

【００３５】本発明に基づく遺伝子の検出方法に必要な
成分； １．ＭＬＰ ２．ＤＮＡポリメラーゼ ３．ｄＮＴＰ

【００３６】

【発明の実施の形態】本発明の核酸配列の増幅方法を、
ある遺伝子の検出に応用する場合を例に具体的な実施の
形態を説明する。まず増幅対象領域には、検出対象であ
る遺伝子の３つの重複しない領域に設定する。ここで選
択した３つの領域をそれぞれ標的配列Ａ、Ｂ、そしてＣ
と呼ぶ。標的配列の３’末端、５’末端に対応してＰＣ
Ｒ法において複製起点となるプライマーセットを設計す
る。各プライマーは、必要な塩基配列を持つオリゴヌク
レオチドを化学的に合成することによって容易に得るこ
とができる。合成したオリゴヌクレオチドは、それぞれ
ＡＦ／ＡＲ、ＢＦ／ＢＲ、そしてＣＦ／ＣＲと名付けら
れる。

【００３７】合成された各オリゴヌクレオチドをもと
に、［ＡＦ＋ＢＦ＋ＣＦ］、そして［ＡＲ＋ＢＲ＋Ｃ
Ｒ］という構成を持つ２つのＭＬＰを製造する。本発明
のＭＬＰを図１に示した。３官能性試薬にはトリスアミ
ンと呼ばれる試薬を利用すると良い。合成操作を図２に
まとめた。トリスアミンとしてはトリス（２−アミノエ
チル）アミン(Tris(2-aminoethyl)amine)等が好適であ
る。連結には次のような操作を行なえば簡便である。つ
まり、１本目のオリゴヌクレオチドをトリスアミンと結
合した後に、残りの２種類を同時に結合させるのであ
る。１本目のオリゴヌクレオチドは選択的に結合させる
ことができるから、残りの２本についてランダムに結合
させてしまうことになる。この結果得られる生成物は、
３つの異なる配列を持つオリゴヌクレオチドが１本づつ
連結されたものと、１本目のオリゴヌクレオチドに対し
て２本の同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを連結して
しまったものとの混合物である。いずれの生成物も分子
量がほとんど変わらないことから、これらの混合物の精
製は通常の技術では困難である。本発明者らは、オリゴ
ヌクレオチドの相補鎖をハイブリダイズさせ、非変性条
件下で電気泳動による分離を行なえば、各生成物を確実
に分離できることを見出した。この分離技術の原理を以
下に説明する。３つの異なる配列を持つオリゴヌクレオ
チドＡ、Ｂ、およびＣを連結するとき、まずＡを３官能
性試薬に結合する。このときの結合は条件設定によって
特異的に行なうことができるので、たとえばＡだけが複
数本結合してしまうことはない。次いでＢとＣを同時に
結合させる。このときの結合はランダムに生じることか
ら、反応生成物はＡＢＣ、ＡＢＢ、そしてＡＣＣの３種
類の混合物である。この混合物に、たとえばＢの相補配
列を持つオリゴヌクレオチドＢ−ＡＳを加えると、各反
応生成物に対して以下のような割合でＢ−ＡＳがハイブ
リダイズする。 ＡＢＣ←Ｂ−ＡＳ×１ ＡＢＢ←Ｂ−ＡＳ×２ ＡＣＣ←Ｂ−ＡＳ×０ したがってハイブリダイズの後に非変性条件下で分子量
に基づく分離を行なえば、３つの生成物は確実に分離す
ることができる。分離後に加熱やアルカリ変性すれば相
補鎖は外れ、目的とするＭＬＰの精製を行なうことが可
能である。出発原料に対する収率の面では必ずしも効率
的な方法とは言えないが、合成ステップが簡単なため実
施例ではこの方法を採用している。

【００３８】またシステイン骨格を利用してＭＬＰを合
成することも可能である。システインのチオール基（Ｓ
Ｈ基）部分、アミノ基部分、そしてカルボキシル基部分
に、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、および
Ｃを連結した構造を合成することができる。具体的に
は、次のような操作に基づいて合成する。すなわち５’
末端をアミノ基で修飾したオリゴヌクレオチド（Ａ）と
システインのＳＨ基をスルホサクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethy
l)cyclohexane-1-carboxylate、ＰＩＥＲＣＥ製、以下
Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣと省略する）のような２官能性試
薬を介して結合させる。このシステインのアミノ基に更
にＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを導入する一方、シスタミン化
したオリゴヌクレオチド（Ｂ）と混合して両者を結合さ
せる。得られた生成物のシステインが持つカルボキシル
基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccin
imide)でスクシンイミド化し、次いで５’をアミノ化し
たオリゴヌクレオチド（Ｃ）を加えれば、Ａ、Ｂそして
Ｃが連結した構造となる。

【００３９】３官能性試薬を利用して各オリゴヌクレオ
チドの５’末端を連結するには、以下のような方法を採
用することもできる。合成操作は図３−図４に示した。
すなわち、ＭＬＰを構成するオリゴヌクレオチドを１本
づつ連結していくのである。具体的には以下のような方
法を用いる。トリスアミンが持つ３つのアミノ基のうち
のひとつに保護基を導入しておき、第１のオリゴヌクレ
オチドをイミダゾール存在下で結合する。第２のオリゴ
ヌクレオチドはアミノ基に２官能性試薬であるマレイミ
ドによって結合させる。マレイミドは残る２つのアミノ
基のうちの一方にしか導入できないので、第２のオリゴ
ヌクレオチドを１分子だけ連結することが可能である。
２つのオリゴヌクレオチドが連結した状態のトリスアミ
ンを最後に脱保護し、再びマレイミドを介して第３のオ
リゴヌクレオチドを結合させれば、３つのオリゴヌクレ
オチドが１本づつその５’末端で連結されたＭＬＰが完
成する。合成したＭＬＰは、ゲルろ過等の方法によって
精製しポリメラーゼによる相補鎖合成に用いる。

【００４０】いずれの方法を用いるにしても、これらの
方法で得ることができるＭＬＰは、３つのオリゴヌクレ
オチドの全てがＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成に
必要な３’−ＯＨを備えている。またその連結構造は高
温でも安定なので、加熱操作を要求されるＰＣＲ法にも
応用することができる。

【００４１】本発明による核酸配列の増幅方法は、プラ
イマーとしてＭＬＰを用いる他は一般的なＰＣＲ法と同
じ操作に基づいて実施される。本発明に基く遺伝子の増
幅反応を図５、図６、そして図７に示した。すなわち、
増幅対象となるＤＮＡを含む試料に対して、ＭＬＰ、Ｔ
ａｑポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼ、そして
相補鎖合成に必要なｄＮＴＰを加え、温度サイクルを行
えば良い。反応液には、酵素活性の発現に必要なＭｇ等
の金属イオン、反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素
の反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイル、反応効率
を向上させるためのポリエチレングリコールやゼラチン
等の補助的な成分を加えておく。以下に一般的なＰＣＲ
法のための反応液組成を例示する。ＭＬＰの使用量は予
想される増幅対象ＤＮＡの量に対して過剰になるように
設定する。具体的には、ＭＬＰを０．１−１μM程度の
濃度で用いれば多くの場合十分である。

【００４２】５０mMのＫＣｌ １０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４） １．５mMのＭｇＣｌ₂ ５０００unit/mLのＴａｑポリメラーゼ ２５μM ｄＮＴＰ ５０μg/mL 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す） １０mM ジチオスレイトール

【００４３】温度サイクルは、プライマーとして用いる
配列の長さ、添加するＭｇイオンの濃度、使用するＤＮ
Ａポリメラーゼの種類などによって変動する。ＤＮＡポ
リメラーゼにＴａｑポリメラーゼを使った場合、一般的
には次のような温度サイクルが利用されている。なお反
応開始前に９３℃で数分間の変性ステップの後にＤＮＡ
ポリメラーゼを添加するとよい結果を得られる。伸長に
必要な時間は、増幅対象配列１０００塩基あたり１分程
度を目安として設定されている。なお変性とアニールの
条件は、ＤＮＡポリメラーゼの種類にかかわらず、主と
して先に例示した反応液中の塩濃度と、用いるプライマ
ーの相補鎖に対する親和性や特異性に大きく左右され
る。 変性(denature)：９０−９５℃で２０秒−１分 アニール(anneale)：４０−６０℃で２０秒−１分 伸長(extention)：７０−７５℃で３０秒−１分

【００４４】この反応によって生成する増幅産物は、Ｍ
ＬＰを構成する３つのオリゴヌクレオチドの全てが伸長
したものと、１ないし２つが伸長し未反応のオリゴヌク
レオチドが残っているものが生じる。３つ全てが伸長し
たものは他のＭＬＰ伸長生成物と相互に２本鎖を構成
し、マトリクス状の構造をもたらす。このマトリクス状
の構造を、ろ過によって回収したり、あるいは散乱光分
析方法によって追跡すればＰＣＲの増幅生成物の測定が
可能となる。

【００４５】本発明によるＭＬＰを使った核酸配列の増
幅方法を、分岐プローブの製造に応用することもでき
る。先に先行技術として紹介したように、分岐構造を持
つプローブを利用した核酸配列の高感度検出方法が公知
である。本発明による分岐構造を持つ増幅生成物は、そ
のままこれらの高感度ハイブリダイゼーションアッセイ
用のプローブとする事が可能である。ＰＣＲ反応を行な
う時に蛍光物質、ハプテン、あるいはビオチン等で標識
したヌクレオチドを利用すれば簡単に標識プローブとす
ることができる。また、化学合成では製造が困難な長い
塩基配列であっても、簡単に合成することができる。ハ
イブリダイゼーションアッセイ用のプローブとするとき
には、ＭＬＰやその増幅生成物の塩基配列の少なくとも
一部が検出対象となる塩基配列とハイブリダイズできる
ように設定する。本発明に基づいて製造した分岐構造の
プローブを利用するには、たとえば固相サンドイッチ法
のような反応系を応用する。すなわち、ある検出対象配
列に対して、その一部とハイブリダイズする捕捉プロー
ブを用意する。これに検出対象配列を含む核酸を接触さ
せて捕捉し、次いで捕捉プローブとは異なる部分で検出
対象配列に対してハイブリダイズする本発明による分岐
構造を持ったプローブと接触させる。この状態で固相を
洗浄すれば、検出対象配列を介して分岐構造を持ったプ
ローブが固相上に捕捉された状態（サンドイッチ）とな
る。分岐構造を持つプローブはマトリクス状態となって
いることから多くの標識を持っており、結果として１分
子の検出対象配列に対して多分子の標識を結合させられ
るため高い感度を実現することができる。

【００４６】

【作用】本発明における重要なポイントは、ＭＬＰであ
る。これまでにも分岐した構造を持つオリゴヌクレオチ
ドの存在は知られていた。しかし公知の分岐構造は、も
っぱらハイブリダイゼーションアッセイにおいて、より
多くのシグナルを結合することを意図して設計されたも
のである。これに対して本発明におけるＭＬＰは、遺伝
子の増幅産物にマトリクス状の特殊な構造を与えること
を目的としている。このような特殊な構造が複数の領域
に対するプライマーを連結したＭＬＰによって実現でき
ることはまったく新規な知見である。

【００４７】更に本発明におけるＭＬＰが複数の領域に
対応していることは、遺伝子の増幅精度の向上に貢献す
るものである。たとえば１つの領域のみの増幅反応で
は、予想に反してプライマーに類似した配列が存在する
時に誤って増幅生成物が生じる可能性がある。これに対
して複数の領域を同時に増幅対象として選択する本発明
では、対象となる全ての領域が同時に存在していない限
りマトリクス状の増幅生成物を生じない。たとえ１つの
領域が非特異的に増幅されてしまっても、マトリクス状
の増幅生成物は生じないので誤った結果にはつながりに
くいと言うことができる。

【００４８】

【発明の効果】本発明によって、単一の領域をＰＣＲ法
で増幅するケースでは期待できなかった高い特異性を容
易に実現することができる。すなわち複数の領域で増幅
反応がもたらされるため、確率論的にいって非特異的な
反応が疑陽性につながる危険性が小さくなるのである。

【００４９】また本発明では、公知のＰＣＲ法では困難
であった増幅生成物の直接的な検出、あるいはリアルタ
イムに反応を監視することが可能となる。より具体的に
は、たとえば本発明に基く増幅反応によってもたらされ
るマトリクス状の構造を持つ増幅生成物は、これまでの
遺伝子増幅反応では得ることができなかった新規な構造
を持つものである。このような新規な特徴により、本発
明に固有の検出方法を採用することができるのである。
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

【実施例】

【００５０】［１］オリゴヌクレオチドの合成 ＭＬＰを構成する各オリゴヌクレオチドは、β−シアノ
エチルアミダイト法[23]に従って合成した。ＤＮＡ合成
機としてＣｙｃｌｏｎｅ（登録商標）ＰｌｕｓＤＮＡ／
ＲＮＡシンセサイザー（日本ミリポアリミテッド）を用
いた。合成したホスホロチオエート化オリゴヌクレオチ
ドは、常法に従いＨＰＬＣで精製して使用した。合成し
た配列は配列１−９に示す９種類である。これらの配列
のうち実際にＰＣＲによる増幅反応に用いるのは、以下
の６種類で、Ｍ１３ファージｍｐ１８の遺伝子配列にお
いて３つの重複しない異なる領域Ａ、Ｂ、およびＣを規
定するプライマーである。 ＡＦ（配列１） ＢＦ（配列２） ＣＦ（配列３） ＡＲ（配列４） ＢＲ（配列５） ＣＲ２（配列６） 以下に示す残りの３種は、合成後のＭＬＰの分離のため
に用意したＢＦ、ＣＦ、およびＣＲ２の相補鎖である。 ＢＦ−ＡＳ（配列７） ＣＦ−ＡＳ（配列８） ＣＲ２−ＡＳ（配列９）

【００５１】［２］同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
接合体の合成 ［２］−１ ５’チオール化オリゴヌクレオチド まず本発明のモデルとして、同じ塩基配列を持つオリゴ
ヌクレオチド３本をその５’で連結した接合体を合成し
た。基本的には、オリゴヌクレオチドの５’末端にチオ
ール基を導入し、これを３官能性試薬とマレイミド基を
介して結合することにより上記接合体とした。具体的な
操作は次のとおりである。オリゴヌクレオチドとしては
ＣＦ（配列３）とＣＲ２（配列６）を用いた。４０nmol
の５’リン酸化したＣＦまたはＣＲ２を０．１Mの１−
メチルイミダゾール（1-methylimidazole、ｐＨ７．
５）と０．１Mのシスタミン２塩酸塩（cystamine）を含
む溶液に溶解した。これに５mgの１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethy
l-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、ＥＤＣと
省略する、ナカライテスク）を加えて室温で一晩反応さ
せた。反応液は精製水で平衡化したSephadexG-25 fine
５mL カラム（商品名、ファルマシア製）にて脱塩後、
真空乾燥した。得られた生成物は２００μLの精製水で
再溶解し、ジチオスレイトール（以下ＤＴＴと省略す
る）２mgを添加して３７℃で１時間還元した。脱気した
精製水で平衡化したSephadexG-25 fine ５mLカラムにて
脱塩後、真空乾燥して５’をチオール化したオリゴヌク
レオチドを得た。

【００５２】［２］−２ ＴＡＥＡのマレイミド化 ３５０nmolのトリス（２−アミノエチル）アミン（N(CH
₂CH₂NH₂)₃、東京化成製、以下ＴＡＥＡと省略する）を
含む０．１Mのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２００μLに
５μmolのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを添加し、室温で1時間
反応後に、マイクロ遠心機で遠心分離した（１５０００
rpm、４℃、３０分間）。回収した沈殿を５００μLの精
製水で２回遠心洗浄して最終的にマレイミド化したＴＡ
ＥＡを得た。得られたマレイミド化ＴＡＥＡは精製水３
５０μLで再懸濁後、２０μLづつ分注して凍結乾燥し−
８０℃に保存した。

【００５３】［２］−３ 同じ配列を持つオリゴヌクレ
オチド接合体 ［２］−１の還元したチオール化オリゴヌクレオチドＣ
Ｆ、およびＣＲ２はそれぞれ０．１Mのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．９）で０．２５nmol/μLに再溶解し、マレイ
ミド化ＴＡＥＡ（［２］−２）の１nmol/μLジメチルフ
ォルムアミド（以下ＤＭＦと省略する）溶液とモル比で
３：１となるように混合し、室温で一晩反応させた。反
応後に逆相ＨＰＬＣカラムＷａｋｏｐａｋ ＷＳ−ＤＮ
Ａ（和光純薬工業製、商品名）へアプライし、リニアグ
ラジエントにて溶出した。溶出条件は、次のとおりであ
る。 溶出条件： 溶出液Ａ：０．１Mのtriethylamine-acetate（ｐＨ７．
１） 溶出液Ｂ：０．１Mのtriethylamine-acetate（ｐＨ７．
１）＋７０%のacetonitrilegradient0-40% B in 27min. ＤＮＡによる紫外部の吸収を追跡して各ピークフラクシ
ョンを分取し、各フラクションを７M尿素を含む１０％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。オリゴヌ
クレオチド３本分が結合した分子量を持つ接合体を含む
ピークを確認し、そのフラクションを最終合成物とし
た。このフラクションは脱塩後、真空乾燥後に精製水で
溶解した。

【００５４】［３］本発明によるＭＬＰの合成 ３つの異なる配列を持つオリゴヌクレオチドが５‘末端
で結合した構造を持つ、本発明によるＭＬＰを合成し
た。結合させる組み合わせは、ＡＦ−ＢＦ−ＣＦ、なら
びにＡＲ−ＢＲ−ＣＲ２とした。基本的には、まず３つ
の異なる塩基配列を持つオリゴヌクレオチドのうちの１
本を３官能性試薬に結合し、次いで他の２本を同時に結
合させる。この操作によって３本の異なる塩基配列で構
成されるＭＬＰの他に、２本の同じ塩基配列を結合して
しまったものも生じる。これらの混合物を相補配列との
ハイブリダイズ特性の違いを利用して分離し、最終的に
３本の異なるオリゴヌクレオチドを連結したＭＬＰを精
製する。 ＡＦ ＢＦ ＣＦ ＡＲ ＢＲ ＣＲ２ 以下にＡＦ−ＢＦ−ＣＦの合成について述べるが、ＡＲ
−ＢＲ−ＣＲ２についても原料となるオリゴヌクレオチ
ドが違う他はまったく同じ操作によって本発明によるＭ
ＬＰを得た。 ［３］−１ ５’ＴＡＥＡ結合オリゴヌクレオチド ６０nmolの５’−リン酸化したＡＦを、それぞれ０．１
μmolのＴＡＥＡを含む０．１Mの１−メチルイミダゾー
ル（ｐＨ７．５）に加え５００μLとした。これに１５m
gのＥＤＣを添加して室温で一晩反応させて５’ＴＡＥ
Ａ結合ＡＦとした。 ［３］−２ ＴＡＥＡ−ＡＦとＢＦのマレイミド化 ５’ＴＡＥＡ結合ＡＦとＢＦを１００μLの精製水で再
溶解し、３０μLの１Mリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加
え、更に精製水で２２０μLとした。精製水で溶解した
０．１MのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを８０μL添加し、室温
で２時間反応させた。精製水で平衡化したSephadexG-25
fine６mLカラムにて脱塩後、真空乾燥してマレイミド
化したＴＡＥＡ−ＡＦとＢＦを得た。

【００５５】［３］−３ ５’をチオール化したＢＦと
ＣＦ ５’−リン酸化ＢＦ（またはＣＦ）のそれぞれ６０nmol
を、０．１Mの１−メチルイミダゾール（ｐＨ７．５）
および０．１Mの塩酸シスタミン２塩酸塩を含む反応液
に添加し精製水で５００μLとした。これに、１５mgの
ＥＤＣを添加し、室温で一晩反応させた。反応後に精製
水で平衡化したSephadexG-25 fine ６mLカラムにて脱塩
後、真空乾燥した。得られた生成物はそれぞれ２００μ
Lの精製水で再溶解し、４mgのＤＴＴを添加して３７℃
で１時間還元した。脱気した精製水で平衡化したSephad
exG-25 fine ６mLカラムにて脱塩後、真空乾燥して５’
をチオール化したＢＦ（またはＣＦ）を得た。

【００５６】［３］−４ ＭＬＰの合成と分離 ５’チオール化ＢＦ（またはＣＦ）（［３］−３）を、
それぞれ脱気した０．１Mのリン酸緩衝液（ｐＨ６．
９）で０．５nmol/μLとなるように再溶解した。一方、
マレイミド化ＴＡＥＡ−ＡＦも同じ緩衝液で０．５nmol
/μLとなるように再溶解した。３者をモル比で１：１：
１となるように混合し、室温で一晩反応させた。この反
応により３者が１本ずつ結合したＡＦ−ＢＦ−ＣＦとい
う構成のＭＬＰが生じるが、同時にＡＦ−ＢＦ−ＢＦ
（あるいはＡＦ−ＣＦ−ＣＦ）という３つのうちの２つ
は同じ配列を持つもので構成されたＭＬＰも生じる。し
たがって、このあとの相補鎖を組み合わせた精製方法に
より目的とするＭＬＰ、すなわちＡＦ−ＢＦ−ＣＦとい
う構造のＭＬＰを分離する。

【００５７】［３］−５ ＭＬＰの確認と分離 １μLの合成反応液（［３］−４）にＢＦに対する相補
鎖ＢＦ−ＡＳ２００pmol/μLを添加し、６５℃で５分加
温後室温まで徐冷してハイブリダイズさせた。ハイブリ
ダイズ後の反応液を１２%のポリアクリルアミドゲルに
て泳動した。この操作によってＢＦ部分が２本鎖となる
ため、ＡＦ−ＢＦ−ＣＦ（目的とするＭＬＰ）と、ＡＦ
−ＢＦ−ＢＦやＡＦ−ＣＦ−ＣＦといった２つの同じオ
リゴヌクレオチドを含む目的外のＭＬＰとの間で構成塩
基数に違いができてくる。結果として、それぞれ異なっ
た移動度を示すはずである。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動の結果、相補鎖を添加しないときは得られたＭＬ
Ｐの混合物は十分に分離できないのに対して、相補鎖を
添加することにより３本のバンドに分離可能であった。
したがって、この原理を応用して以下の精製操作を行な
うこととした。

【００５８】［３］−６ ＭＬＰの精製 ［３］−５の条件にしたがってＭＬＰの混合物を含む反
応液（［３］−４）に２００pmol/μLとなるようにＣＦ
の相補鎖ＣＦ−ＡＳを添加し、相補鎖をＭＬＰにハイブ
リダイズさせた。ハイブリダイズ後の反応液は、いった
ん非変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より目的とするＭＬＰをＣＦ−ＡＳとハイブリダイズし
た状態で分離後、そのまま変性条件下のポリアクリルア
ミドゲルで泳動することでＣＦ−ＡＳとの分離を行なっ
た。すなわち、下段に７M尿素を含む１２%ポリアクリル
アミドゲルを、上段に７M尿素を含まない１２%ポリアク
リルアミドゲルを積層した２段ゲルを調製し、上記相補
鎖結合反応液をアプライして上段でＭＬＰを分離後、下
段で相補鎖との分離を行なった。泳動後のゲルより、目
的とするＭＬＰに相当するバンドを切り出し精製して最
終的に本発明によるＭＬＰを回収した。

【００５９】［４］同じ配列のオリゴヌクレオチド３本
の接合体による増幅実験 本発明のモデルとして、［２］で合成した同じ配列のオ
リゴヌクレオチド３本の接合体による増幅実験を試み
た。下記組成の反応液２０μLを９５℃で５分の前処理
後、９５℃／３０秒→５５℃／２分→７２℃ ／２分を
１サイクルとして３５サイクル反応させてＰＣＲ法を行
なった。また対照として、ＣＦとＣＲ２のモノマーを用
いて同条件で反応を行った。

【００６０】反応液の組成： １０mM トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３） ５０mM ＫＣｌ １．５mM ＭｇＣｌ₂ ２００μM ｄＮＴＰｓ ２．５U Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １fmol Ｍ１３ファージｍｐ１８ ２．５pmol ＣＦトリマー ２．５pmol ＣＲ２トリマー 反応液は、０．７%のアガロースゲル（０．５×ＴＢ
Ｅ）、および同ゲル（５０mMのＮａＯＨ＋１mMのＥＤＴ
Ａ）で泳動しエチジウムブロマイド（以下ＥｔＢｒと省
略）にて染色して確認した。０．５×ＴＢＥ（前者）で
はλファージのEcoRI/HindIII二重消化断片を、またＮ
ａＯＨ＋ＥＤＴＡ（後者）ではＸＩＶ（１００ｂｐラダ
ー、ベーリンガーマンハイム社製、商品名）を分子量マ
ーカーとした。前者では２本鎖が変性しないので、ハイ
ブリダイズした状態のまま泳動される。

【００６１】電気泳動の結果を図８として模式的に示
す。この結果から以下のようなことが確認できた。 −０．５×ＴＢＥ− モノマーのみでＰＣＲを行なった対照では、プライマー
によって規定される約４００bpの位置に１本の単一バン
ドが得られた。一方、トリマーを用いた場合には約１０
kbp程度の位置までに明瞭に識別できない幅広いバンド
（スメアなバンド）が得られた。 −５０mMのＮａＯＨ＋１mMのＥＤＴＡ− このアルカリゲルでもモノマーのみによる対照は約４０
０baseに単一バンドが得られる。しかしトリマーを用い
た場合は、４００b、８００b、そして１２００bの３本
のバンドが得られた。それぞれ、トリマーを構成するオ
リゴヌクレオチドの１つ、２つ、そして３つ全てから伸
長した産物に対応する。これらの結果から、本合成プラ
イマー（トリマー）の使用により高分子のマトリクスが
形成されることが判明した。

【００６２】［５］異なる３つのオリゴヌクレオチドで
構成される本発明のＭＬＰによる増幅実験 プライマーとして異なる３つのオリゴヌクレオチドで構
成される本発明のＭＬＰ（ＡＦ−ＢＦ−ＣＦとＡＲ−Ｂ
Ｒ−ＣＲ２）を各２pmolとする他は［４］と同じ条件で
ＰＣＲ法を行なった。また対照として、ＡＦとＡＲ、Ｂ
ＦとＢＲ、およびＣＦとＣＲ２の単独の組み合わせを用
いて同じ条件で反応を行った。反応後の反応液は、
［４］と同じ条件で電気泳動した。

【００６３】電気泳動分析の結果を図９として模式的に
示す。この結果から以下のようなことが確認できた。 −０．５×ＴＢＥ− モノマーのみでＰＣＲを行なった対照では、プライマー
によって規定される約４００bpの位置にそれぞれ１本の
単一バンドが得られた。一方、ＭＬＰトリマーを用いた
場合には約２０kbp程度の位置までの明瞭に識別できな
い幅広いバンド（スメアなバンド）が得られた。３つの
異なる配列を連結したＭＬＰを用いたことにより、同じ
配列を持つオリゴヌクレオチド３本による接合体をプラ
イマーとした［４］よりも大きなマトリクス構造ができ
ていることが推測された。 −５０mMのＮａＯＨ＋１mMのＥＤＴＡ− このアルカリゲルでもモノマーのみによる対照は約４０
０baseに単一バンドが得られる。しかしＭＬＰトリマー
を用いた場合は、４００b、８００b、そして１２００b
の３本のバンドが得られた。それぞれ、トリマーを構成
するオリゴヌクレオチドの１つ、２つ、そして３つ全て
から伸長した産物に対応する。これらの結果から、本合
成プライマー（トリマー）の使用により高分子のマトリ
クスが形成されることが判明した。

【００６４】引用文献： [ 1] Science,230,1350-1354,1985 [ 2] J.Clin.Microbiol.,28,1560-1564,1990 [ 3] Nucleic Acids Res.,16,11141-11156,1988 [ 4] Science,239,1288-1291,1988 [ 5] Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6230-6234,1989 [ 6] Nucleic Acid Res.17,2517,1989 [ 7] 特開平1-98499 [ 8] 特開平6-78797 [ 9] 特許2560003 [10] 特開平2-109999 [11] 特開平5-260972 [12] J.Am.Chem.Soc.115：2119-2124;1993 [13] 公表平9-500378(WO95/01365) [14] J.Immunological Methods,156,55-60 (1992) [15] Anal.Biochem.94,117-120 (1979) [16] 特開平5-184397 [17] 特開平7-163399 [18] Proc.Natl.Acad.Sci.89：392-396;1992 [19] EP-320308 [20] SCIENCE, Vol.231,505-508,1996 [21] 特開平4-229200 [22] J.Clin.Microbiol.31:3270-3274 (1993) [23] J.Am.Chem.Soc.112,1253-1254(1990) [24] USP 5462854 (公表平8-509129) [25] Tetrahedron Letters,Vol.22,No.20,1859-1862,19
81 [26] Tetrahedron Letters,No.33,2861-2863,1974

【００６５】

【配列表】

出願人氏名：栄研化学株式会社 発明の名称：核酸配列の増幅方法 整理番号：Ｐ−０００３７８ 出願日：平成９年６月６日 配列の数：９ 配列番号：１ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ ファージｍｐ１８ 配列 TCCTTTCTAT TCTCACTCCG CTGAA

【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ファージｍｐ１８ 配列 CCGCTCCTTC TGGTGGTTTC T

【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ファージｍｐ１８ 配列 CCGGCTCGTA TGTTGTGTGG A

【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ファージｍｐ１８ 配列 AAGTGCCGTC GAGAGGGTTG A

【００６９】配列番号：５ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ファージｍｐ１８ 配列 ATAAAACAGA GGTGAGGCGG TCA

【００７０】配列番号：６ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ファージｍｐ１８ 配列 TCTGCCAGTT TGAGGGGACG A

【００７１】配列番号：７ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ファージｍｐ１８ 配列 AGAAACCACC AGAAGGAGCG G

【００７２】配列番号：８ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ファージｍｐ１８ 配列 TCCACACAAC ATACGAGCCG G

【００７３】配列番号：９ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍ１３ファージｍｐ１８ 配列 TCGTCCCCTC AAACTGGCAG A

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるＭＬＰの構造

【図２】本発明によるＭＬＰの合成フロー

【図３】本発明によるＭＬＰの別の合成フロー（図４へ
続く）

【図４】本発明によるＭＬＰの別の合成フロー（図３の
続き）

【図５】本発明のＭＬＰに基く遺伝子の増幅反応を示す
模式図（図６へ続く）

【図６】本発明のＭＬＰに基く遺伝子の増幅反応を示す
模式図（図７へ続く）

【図７】本発明のＭＬＰに基く遺伝子の増幅反応を示す
模式図（図７の続き）

【図８】同じ配列を持つオリゴヌクレオチドの接合体を
プライマーとしたＰＣＲによる増幅生成物の電気泳動像
を模式的に示す図

【図９】本発明のＭＬＰをプライマーとしたＰＣＲによ
る増幅生成物の電気泳動像を模式的に示す図

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】標的核酸配列に対しプライマーをハイブリ
   ダイズさせ、このプライマーを複製起点として相補鎖合
   成反応によって遺伝子を増幅する方法において、相補鎖
   合成を妨げない部位において互いに連結された３分子以
   上のオリゴヌクレオチドであって少なくとも２つの異な
   る標的核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから構成
   されるプライマーを用いることを特徴とする方法
2. 【請求項２】相補鎖合成を妨げない部位において互いに
   連結された３分子のオリゴヌクレオチドであって３つの
   異なる標的核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドから
   構成されるプライマーを用いることを特徴とする請求項
   １の核酸配列の増幅方法
3. 【請求項３】プライマーを構成する３分子以上のオリゴ
   ヌクレオチドが互いに５’末端で連結されている、請求
   項１または２の核酸配列の増幅方法
4. 【請求項４】標的核酸配列が、複数の遺伝子の配列から
   選択されるものである、請求項１から３いずれかに記載
   の核酸配列の増幅方法
5. 【請求項５】請求項１から４のいずれかに記載された方
   法によってもたらされるマトリクス状の構造を有する増
   幅生成物を指標とする、標的遺伝子の検出方法
6. 【請求項６】マトリクス状の構造を持つ増幅産物を光学
   的な手段によって追跡する請求項５の標的核酸配列の検
   出方法
7. 【請求項７】複数の標的核酸配列に対応する複数のプラ
   イマーセットを、相補鎖合成を妨げない部位において互
   いに連結したマルチリンクプライマー
8. 【請求項８】標的核酸配列の少なくとも３つの領域Ａ、
   Ｂ、およびＣに対応するプライマーセットを構成するオ
   リゴヌクレオチドＡＦ−ＡＲ、ＢＦ−ＢＲ、およびＣＦ
   −ＣＲの３つのセットから１つづつを選択して連結した
   請求項７のマルチリンクプライマー
9. 【請求項９】少なくとも３以上の１本鎖ＤＮＡが連結し
   たＤＮＡ接合体を構成単位とし、この構成単位を構成す
   るＤＮＡが異なる構成単位の間で相補対を形成すること
   によって構成されたマトリクス構造を持つＤＮＡ