JP2002171999A

JP2002171999A - 核酸増幅反応測定方法及び装置

Info

Publication number: JP2002171999A
Application number: JP2000374775A
Authority: JP
Inventors: Seiji Kondo; 聖二近藤; Yasuyoshi Mori; 安義森
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd; Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd; Olympus Corp
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2002-06-18

Abstract

(57)【要約】【課題】増幅産物を高分子化する工程を含む核酸増幅反
応を継続的に測定する装置を提供する。【解決手段】核酸増幅反応測定装置１００は、反応部１
２０の温度を調節するための反応部温度調節部１４０
と、反応部１２０の上に配置されるプリズム１１２と、
反応部１２０に向けて光ビームを射出する光源部１０２
と、光源部１０２の前方に配置された偏光子１０４と、
反応部１２０で反射された光ビームを受ける光検出部１
０６とを備えている。プリズム１１２は高屈折率液体１
１４を介して反応部１２０に結合されている。反応部１
２０は閉鎖型セルで、筐体１２２の内面に導電性薄膜１
３２を有しており、その内部では、ＬＡＭＰ法による核
酸増幅反応が行なわれる。光源部１０２は、パスＰsに
沿って移動可能に支持されており、光検出部１０６は、
パスＰdに沿って移動可能に支持されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸を測定す
る技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝学的検査にとってＤＮＡまたはＲＮ
Ａのような核酸の増幅反応は重要であり、中でもＰＣＲ
(Polymerase Chain Reaction)法が広く利用されてい
る。核酸の増幅反応を測定する従来技術は、蛍光色素の
ような標識物質を用いて、電気泳動のような分離技術と
組み合わせたり、標識化された結合試薬との結合反応を
行なう工程を付加することによって、定量的な測定を可
能にしている。標識物質を用いない測定技術も幾つか提
案されており、特表２０００−５０８１６８号は、目的
の核酸と競合の核酸を個体支持体に固定化させ、目的の
核酸および競合の核酸と特異的に結合する核酸配列を反
応させる。このときの反応を表面プラズモン共鳴法を用
いて測定することで目的の核酸の有無および量を決定し
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来の核酸増幅反応の
測定技術は、標識物質を用いる場合に実用的な水準で、
定量的な測定を可能にしているので、広く利用されてい
る。しかしながら、標識物質は、Ｓ/Ｎ比を改善するた
めに余分な標識化試薬を除去する工程を要求する。ま
た、標識物質は、時間とともに、あるいは使用環境によ
り標識性能が低下するように変化する可能性がある。ま
た、標識物質は、一般に高価であるとともに、人体もし
くは自然環境に対して有害であり得る。また一般に、目
的の核酸と特異的に結合する核酸配列は塩基配列が７〜
２４の大きさであり、特異的に結合する核酸配列が結合
することによる個体支持体上の重量変化は非常に小さ
く、感度の点で問題がある。

【０００４】本発明の目的は、標識物質を用いずに実用
的な水準で標的核酸を定量的に測定する方法と装置を提
供することである。

【０００５】また、本発明の別の目的は、サンプルを高
感度に測定できる高精度な測定方法と測定装置を提供す
ることである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＷＯ０
０/２８０８２およびＥＰ−１０２０５３４Ａ１や Nucl
eic Acids Research Vol. 28, No. 12, e63(2000) にお
いて、ＬＡＭＰ法と呼ばれる新規な核酸増幅反応技術を
提案している。この核酸増幅反応技術によると、その反
応は増幅すべき核酸塩基配列を繰り返し増幅しながら延
長する作用を有しているために従来のＰＣＲ法などと比
べると個々の増幅産物はより一層の高分子化が生じてお
り、ＰＣＲ法による産物に比べ分子量が遙かに高くな
る。上述したようなより一層の高分子化とそれいに伴う
高分子量化は、反応液の光学的特性(例えば屈折率)を変
化させる。この光学的特性の変化は、反応液を通る光と
反応液を通らない参照光との干渉を調べることにより、
より詳しくは、干渉により形成される干渉縞の移動を測
定することにより検出することができる。

【０００７】本発明は、ひとつの面においては、増幅産
物を高分子化する工程を含む核酸増幅反応を測定するた
めの核酸増幅反応測定方法であり、反応部に光ビームを
照射する工程と、反応部と反応液の界面による全反射に
基づいて、高分子化された増幅産物に起因する反応液の
屈折率の変化を継続的に測定する工程とを含んでいる。
核酸増幅反応測定方法は、好ましくは、核酸増幅反応に
よって得られる産物と特異的に反応する試薬を反応液と
接する面に固定する工程を更に含んでいる。全反射は、
一例においては、反応部と反応液の界面で反射された光
の強度の入射角に対する特性を調べることにより検出さ
れ、別の一例においては、反応部を透過した光の強度の
入射角に対する特性を調べることにより検出される。

【０００８】本発明は、別の面においては、増幅産物を
高分子化する工程を含む核酸増幅反応を測定するための
核酸増幅反応測定装置であり、反応部の温度を制御する
ための反応部温度制御手段と、反応部に照射される光ビ
ームを発する光源部と、反応部と反応液の界面による全
反射を検出するための光検出部とを備えており、高分子
化された増幅産物に起因する反応液の屈折率を継続的に
測定する。好ましくは、反応部は、反応液と接する面
に、核酸増幅反応によって得られる産物と特異的に反応
する試薬が固定されている。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の実施の形態について説明する。

【００１０】［第一の実施の形態］本実施形態は、表面
プラズモン共鳴を利用した核酸増幅反応測定であり、図
１に示されるように、その核酸増幅反応測定装置１００
は、反応部１２０の温度を調節するための反応部温度調
節部１４０と、反応部１２０の上に配置されるプリズム
１１２と、反応部１２０に向けて光ビームを射出する光
源部１０２と、光源部１０２の前方に配置された偏光子
１０４と、反応部１２０で反射された光を受ける光検出
部１０６と、光源部１０２と光検出部１０６を制御する
ためのコントローラー１０８と、反応部温度調節部１４
０を制御するためのコントローラー１１０とを備えてい
る。

【００１１】反応部１２０は、エアー吸引や押し付け等
の手段により、反応部温度調節部１４０に固定されてい
る。反応部温度調節部１４０は、反応部１２０を所望の
一定温度に保温することができる。反応部温度調節部１
４０は、ペルチェ素子や抵抗やランプなどによって加熱
を行ない、放熱や水冷や空冷によって冷却を行なう。

【００１２】プリズム１１２は、プリズム１１２または
反応部１２０の屈折率と同等以上の屈折率を有する光学
的に透明な高屈折率液体１１４を介して、反応部１２０
と光学的に結合されている。

【００１３】光源部１０２の前方に配置された偏光子１
０４は、反応部１２０の入射面に対して０°の直線偏光
のビームを作り出す。ここで用いる「入射面」という用語
は、入射光線と入射法線によって決まる平面であり、よ
り具体的には、反応部に入射する光の波面法線と反応部
の表面に立てた法線を含む平面をいう。

【００１４】反応部１２０は、図１と図２に示されるよ
うに、被検物質や試薬等を含む反応液を収容するための
空間部１３０を有する閉鎖型セルである。図２に示され
るように、反応部１２０は、反応液を空間部１３０に注
入するための反応液注入口１２８を有している。反応液
注入口１２８は、反応液１５０の注入後に、例えば、ゴ
ム栓やセプタムによって封止される。あるいは、粘着テ
ープや接着剤や粘度などによって密閉さてもよい。

【００１５】反応部１２０の筐体１２２は、少なくとも
光ビームの照射される部分は、光学的に透明で、反応液
１５０よりも高い屈折率を有しており、例えばホウ珪酸
ガラスや石英ガラスで作られている。また、光ビームが
照射されない部分は、反応液１５０と化学反応を起こさ
ず、反応部温度調節部１４０による加熱に対して耐久性
を有してさえいれば、その材質は問わない。しかし、反
応液１５０を速やかに均一に加熱するため、ガラスや金
属等の熱伝導率の高い材質が好ましい。

【００１６】反応部１２０は、図１と図２に示されるよ
うに、筐体１２２の内側の面に形成された導電性薄膜１
３２を有している。導電性薄膜１３２は、少なくとも、
光ビームが照射される部分に形成されている。導電性薄
膜１３２の材質は、導電性でありさえすれば何であって
もよいが、光ビームエネルギーを効率良く表面プラズモ
ンに変換する銀や金などが好ましい。導電性薄膜１３２
は、好ましくは０.１〜１０００ｎｍの均一な膜厚を有
し、より好ましくは１〜１００ｎｍの均一な膜厚を有し
ている。

【００１７】さらに、反応部１２０は、導電性薄膜１３
２の表面に、被検物質に対する抗体やターゲットＤＮＡ
等と特異的に反応する特異親和性結合試薬(プローブや
プライマー)が、物理的あるいは化学的に結合されてい
る。つまり、反応部１２０は、導電性薄膜１３２の表面
に固相化された試薬を有している。試薬は、導電性薄膜
１３２の全面に結合されていても、あるいは導電性薄膜
１３２の一部の領域のみに結合されていてもよい。

【００１８】続いて、核酸増幅反応の測定手順について
説明する。

【００１９】まず、生物学的材料(被検物質)と特定の試
薬を混合して反応液を用意する。次に、十分な量の反応
液を反応部１２０の空間部１３０内に入れた後、反応部
１２０を反応部温度調節部１４０に設置する。反応液
は、反応部１２０を反応部温度調節部１４０に設置した
後に、反応部１２０の空間部１３０内に入れられてもよ
い。

【００２０】反応部温度調節部１４０によって反応部１
２０を所定の温度に加熱して、ＬＡＭＰ法による核酸増
幅反応を行なう。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は等
温、例えば試料溶液を６５℃に保持することで繰り返し
延長しながら高分子量化反応が進行する。ここで、反応
が進行する温度が従来のＰＣＲ法と比べて低温であるた
め耐熱性を有する試薬、例えば耐熱性ポリメラーゼを用
いる必要がない。また、温度制御部が簡易になる利点が
ある。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については、特開
平１０−３３７１８６号や日経バイオテク第４４８号第
１１頁〜第１３頁に詳しく示されている。これらの文献
は参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【００２１】図５と図６はそれぞれ反応部１２０内にお
けるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の前後の状態を模式
的に示されている。

【００２２】図５に示されるように、反応部１２０に収
容された反応液１５０には、目的のＤＮＡ１５２、目的
以外のＤＮＡ１５４、プライマー(ＮＤＡ合成開始用試
薬)１５６、ｄＮＴＰ(ＤＮＡ合成用試薬)１５８、ＤＮ
Ａ合成酵素１６０などが含まれている。また、反応部１
２０の内面に形成された導電性薄膜１３２に、増幅産物
と特異的に反応する試薬(プローブやプライマー)１３４
が固定(固相化)されている。つまり、反応部１２０は固
相化された試薬１３４を有している。

【００２３】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の結果、図
６に示されるように、試薬１３４と結合した高分子化し
た目的のＤＮＡ１６４から成る増幅産物を含む領域とし
ての膜１７０が形成される。この増幅産物の膜１７０の
構成する高分子化した目的のＤＮＡ１６４は、高分子化
した目的のＤＮＡ１６４が試薬１３４に結合したもの、
高分子化の途中で試薬１３４に結合したもの、試薬１３
４に結合して高分子化したものを含んでいる。

【００２４】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応では、目的
以外のＤＮＡ１５４は高分子化せずに、目的のＤＮＡ１
５２だけが高分子量化する。また、高分子量化した産物
同士は、反応部１２０の内部、特に試薬１３４が配置さ
れた二次元領域において、お互いに密集することによ
り、増幅産物の膜１７０の高密度化にも寄与する。後述
するように、増幅産物の膜１７０の界面に照射された光
は、表面プラズモン共鳴により、特定の角度の方向には
反射されないが、前述の増幅産物の膜１７０の高密度化
は、この光が反射されない角度を変化させ、さらに高分
子量化による個々の産物の三次元的な体積増加は、この
角度の変化を増大させる。

【００２５】前述したように、試薬１３４は、導電性薄
膜１３２の全面に結合されていても、あるいはその一部
の領域のみに結合されていてもよいが、後者の方が好ま
しいと考えられる。それは、試薬１３４の存在する領域
が減る分、限られた領域に位置する試薬１３４に、高分
子化の前後最中を問わず目的のＤＮＡが結合する割合が
増し、増幅産物の膜１７０の形成効率が高まると予想さ
れるからである。

【００２６】図１において、光源部１０２から射出され
た光のビームは、特定の成分のみが偏光子１０４を通過
することにより、反応部１２０の入射面に対して０°の
傾きを持つ直線偏光のビームとなる。この直線偏光のビ
ームは、プリズム１１２と高屈折率液体１１４を透過
し、反応部１２０に入射する。

【００２７】反応部１２０へ入射した光ビームは、ある
特定の入射角で入射する場合を除いて、筐体１２２と導
電性薄膜１３２の界面で全反射される。反応部１２０で
反射された光は、光検出部１０６によって受光され、そ
の光強度が検出される。

【００２８】また、反応部１２０に特定の入射角で入射
した光ビームは、界面で反射されず、そのエネルギーが
導電性薄膜１３２の表面プラズモン波に変換される。こ
の現象は、表面プラズモン共鳴と呼ばれている。

【００２９】表面プラズモン共鳴が生じる光ビームの入
射角は、導電性薄膜１３２の膜厚や材質、光の波長によ
っても変化するが、反応部１２０の内部の反応液１５０
の屈折率、とりわけ導電性薄膜１３２の表面に形成され
る増幅産物の膜１７０の屈折率に大きく依存する。

【００３０】従って、反応液１５０の屈折率あるいは増
幅産物の膜１７０の屈折率は、表面プラズモン共鳴が生
じる光ビームの入射角を求めることにより測定される。
表面プラズモン共鳴が生じる光ビームの入射角は、反応
部１２０で反射された光の強度の入射角に対する特性
(反射光強度特性)を調べることにより求めることができ
る。

【００３１】光源部１０２は、パスＰsに沿って移動可
能に支持されており、これにより、反応部１２０への光
ビームの入射角を変化させることができる。また、光検
出部１０６は、パスＰdに沿って移動可能に支持されて
おり、光源部１０２の移動により変えられる任意の入射
角の光ビームに対して、反応部１２０で反射された光を
受けることができる。

【００３２】光源部３０２をパスＰsに沿って移動させ
るとともに、これに応じて光検出部３０６をパスＰdに
沿って移動させ、反応部１２０に入射する光ビームの入
射角の変化に対する、反応部１２０で反射される光の強
度の変化を測定する。

【００３３】光源部１０２をパスＰsに沿って移動させ
るとともに、これに応じて光検出部１０６をパスＰdに
沿って移動させ、反応部１２０に入射する光ビームの入
射角の変化に対する、反応部１２０で反射される光の強
度の変化を測定する。図３は、このようにして得られる
入射角に対する反射光強度の分布、つまり入射角に対す
る反射光強度特性を示している。図３に示されるよう
に、反射光強度は、ある特定の入射角において、急激に
減少しており、この特定の入射角において、表面プラズ
モン共鳴が生じていることが分かる。

【００３４】このように、入射角に対する反射光強度特
性を測定することにより、表面プラズモン共鳴が生じる
入射角が求められ、これに基づいて、反応液１５０の屈
折率、とりわけ増幅産物の膜１７０の屈折率が高精度で
リアルタイムに測定される。

【００３５】以上の説明から分かるように、反応部１２
０は、核酸増幅反応の際も、常に反応部温度調節部１４
０の上に配置されたままである。言い換えれば、核酸増
幅反応測定装置１００に載置されたままで、核酸増幅反
応が行なわれる。つまり、反応部１２０は、核酸増幅反
応測定装置１００から外されることなく、所定の位置に
配置されたままであり、その間の核酸増幅反応を継続的
に測定を行なうことができる。その結果、反応部の移動
や温度の変化による反応液の屈折率変化の影響が除外さ
れた高精度な測定を行なうことができる。

【００３６】本実施形態によれば、電気泳動法では測定
できない増幅産物が高分子化する反応であっても測定で
きる。また、蛍光色素などの検出用の化合物を添加する
ことなく核酸増幅産物を測定できる。さらに、核酸増幅
反応を開始させてから継続的に測定することで、増幅の
初期段階で検出し、その変化の単位時間あたりの変化量
から最終的な変化量を算出することができる。加えて、
測定は核酸増幅反応のあいだ継続的に行なえるので、反
応部の移動や温度の変化に起因する反応液の屈折率変化
の影響を受けていない高精度な測定結果を得ることがで
きる。従って、これまでにない高速で高感度で低価格な
核酸増幅反応の測定方法と測定装置が提供される。

【００３７】また、反応部１２０の空間部１３０に反応
液を充填することにより、液量が一定となり、反応結果
を正確に測定できるばかりでなく、屈折率の測定に重要
な光学的条件を一定に保つことができるとともに、反応
液の蒸発や零れによる反応条件の変動や外部への汚染等
も有効に回避できる。

【００３８】上述した実施形態では、反応部１２０は、
導電性薄膜１３２に固相化された試薬(プローブやプラ
イマー)１３４を有しているが、必ずしも、このような
試薬を有している必要はない。本実施形態の核酸増幅反
応測定装置は、このような試薬を持たない反応部を用い
ても、十分に測定可能である。

【００３９】図７と図８はそれぞれこのような反応部１
２０Ａ内におけるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の前後
の状態を模式的に示されている。

【００４０】図７に示されるように、反応部１２０Ａ
は、固相化された試薬(プローブやプライマー)を有して
いない。これに収容された反応液１５０には、前述した
ように、目的のＤＮＡ１５２、目的以外のＤＮＡ１５
４、プライマー１５６、ｄＮＴＰ１５８、ＤＮＡ合成酵
素１６０などが含まれている。

【００４１】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の結果、図
８に示されるように、高分子化した目的のＤＮＡ１６４
が生成される。反応部１２０Ａは固相化された試薬を有
していないので、高分子化した目的のＤＮＡ１６４は反
応液１５０中を浮遊し続ける。

【００４２】高分子化した目的のＤＮＡ１６４は反応液
１５０の例えば屈折率を変化させる。この光学的特性の
変化は、やはり、前述した手法に従って、表面プラズモ
ン共鳴が生じる入射角を調べることにより測定される。

【００４３】［変形例］本実施形態の変形例について図
４を参照して説明する。図４において、図１と同一の参
照符号が付された部材は、同等の部材であり、その詳し
い説明は省略する。

【００４４】図４に示されるように、本変形例の核酸増
幅反応装置１００Ａは、光源部１０２の代わりに、大径
の平行光ビームを射出する光源部１０２Ａを有し、光検
出部１０６の代わりに、複数の検出素子を含む光検出部
１０６Ａを有し、偏光子１０４の前方に配置された集光
レンズ１８２と、光検出部１０６Ａの手前に配置された
レンズ１８４とを備えている。他の構成は、図１の装置
と同じである。

【００４５】複数の検出素子を含む光検出部１０６Ａ
は、受光する光の強度分布を検出できるものであり、例
えばＣＣＤイメージセンサーやＣＭＯＳイメージセンサ
ーやＣＣＤラインセンサーがあるが、これらに限定され
ない。光源部１０２Ａは、大径の平行光ビームを発する
光源そのものであっても、小径の平行光ビームを発する
光源とビーム径を拡大するビームエキスパンダーを含ん
でいてもよい。

【００４６】光源部１０２Ａから射出された大径の光ビ
ームは、偏光子１０４を通過した後、集光レンズ１８２
によって収束性の光ビームに変えられ、反応部１２０の
筐体１２２と導電性薄膜１３２の界面に集光される。反
応部１２０で反射された発散性の光ビームは、レンズ１
８４によってほぼ平行な光ビームに変えられ、光検出部
１０６Ａによって検出される。

【００４７】本変形例では、反応部１２０の筐体１２２
と導電性薄膜１３２の界面に照射される収束性の光ビー
ムは、入射角の異なる複数の光線を含んでおり、それら
に対応する反射光線が、それぞれ、光検出部１０６Ａの
複数の検出素子によって検出される。これにより、光源
部１０２Ａと光検出部１０６Ａを移動させることなく、
入射角に対する反射光強度特性を得ることができる。こ
れに基づいて、表面プラズモン共鳴が生じる入射角を求
めることにより、反応部１２０が固相化された試薬１３
４を有する場合には、反応液１５０の屈折率、とりわけ
増幅産物の膜１７０の屈折率が、また、反応部１２０が
固相化された試薬１３４を有していない場合には、反応
液１５０の屈折率が測定される。

【００４８】［別の変形例］本実施形態では、表面プラ
ズモン共鳴を利用して核酸増幅反応を測定しているが、
ほぼ同じ手法に従い、ブリュースター角を利用して核酸
増幅反応を測定することもできる。この場合、反応部１
２０は導電性薄膜１３２を有しておらず、それ以外の構
成は全く同じである。

【００４９】ブリュースター角は、反応部１２０の入射
面に対して０°の直線偏光が、反応部１２０と反応液１
５０の界面で反射される光の強度が０になる入射角をい
う。やはり、ブリュースター角も、増幅産物の膜１７０
あるいは反応液１５０の光学特性(屈折率)に依存してお
り、同様の手法に従って得られる入射角に対する反射光
強度特性に基づいて、ブリュースター角を求めることに
より、反応部１２０が固相化された試薬１３４を有する
場合には、反応液１５０の屈折率、とりわけ増幅産物の
膜１７０の屈折率が、また、反応部１２０が固相化され
た試薬１３４を有していない場合には、反応液１５０の
屈折率が測定される。

【００５０】［第二の実施の形態］本実施形態は、一般
的に知られているピュルフリッヒ法による屈折率測定を
利用した核酸増幅反応測定であり、図９に示されるよう
に、その核酸増幅反応測定装置２００は、反応部２２０
の温度を調節するための反応部温度調節部２４０と、反
応部２２０の上に配置されるプリズム２１２と、反応部
２２０に向けて光ビームを射出する光源部２０２と、光
源部２０２の前方に配置された集光レンズ２０４と、反
応部２２０で反射された光を受ける光検出部２０６と、
光源部２０２と光検出部２０６を制御するためのコント
ローラー２０８と、反応部温度調節部２４０を制御する
ためのコントローラー２１０とを備えている。

【００５１】反応部２２０は、エアー吸引や押し付け等
の手段により、反応部温度調節部２４０に固定されてい
る。反応部温度調節部２４０は、反応部２２０を所望の
一定温度に保温することができる。反応部温度調節部２
４０は、ペルチェ素子や抵抗やランプなどによって加熱
を行ない、放熱や水冷や空冷によって冷却を行なう。

【００５２】プリズム２１２は、プリズム２１２または
反応部２２０の屈折率と同等以上の屈折率を有する光学
的に透明な高屈折率液体２１４を介して、反応部２２０
と光学的に結合されている。

【００５３】反応部２２０は、図９と図１０に示される
ように、被検物質や試薬等を含む反応液１５０を収容す
るための空間部２３０を有する閉鎖型セルである。図１
０に示されるように、反応部２２０は、反応液を空間部
２３０に注入するための反応液注入口２２８を有してい
る。反応液注入口２２８は、反応液１５０の注入後に、
例えば、ゴム栓やセプタムによって封止される。あるい
は、粘着テープや接着剤や粘度などによって密閉さても
よい。

【００５４】反応部２２０は、少なくとも光ビームの照
射される部分は、光学的に透明で、反応液１５０よりも
高い屈折率を有しており、例えばホウ珪酸ガラスや石英
ガラスで作られている。また、光ビームが照射されない
部分は、反応液１５０と化学反応を起こさず、反応部温
度調節部１４０による加熱に対して耐久性を有してさえ
いれば、その材質は問わない。しかし、反応液１５０を
速やかに均一に加熱するため、ガラスや金属等の熱伝導
率の高い材質が好ましい。

【００５５】反応部２２０は、好ましくは、光ビームが
照射される内面に、増幅産物と特異的に反応する試薬
(プローブやプライマー)が固定されているが、このよう
な試薬を有していなくてもよい。

【００５６】測定は、第一の実施の形態と同様の手順で
行なわれる。すなわち、まず、被検物質と特定の試薬を
混合して反応液を用意し、これを反応部２２０に十分な
量を入れた後、反応部２２０を反応部設置部２４２に設
置する。反応部温度調節部２４４によって反応部２２０
を所定の温度に加熱して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反
応を行なう。

【００５７】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の結果、反
応部２２０が固相化された試薬を有している場合には、
第一実施形態で説明したように、反応部下板の上面に固
定された試薬(プローブやプライマー)と結合した高分子
化した目的のＤＮＡから成る増幅産物の膜が形成され
る。また、反応部２２０が固相化された試薬を有してい
ない場合には、第一実施形態で説明したように、反応液
中に高分子化した目的のＤＮＡが生成される。

【００５８】図９において、光源部２０２から射出され
た光ビームは、集光レンズ２０４によって収束性の光ビ
ームに変えられ、プリズム２１２と高屈折率液体２１４
を透過して、反応部２２０と反応液１５０の界面に達す
る。この界面では、特定の角度を越える入射角の光ビー
ムは全反射される。反応部２２０と反応液１５０の界面
で全反射された光は、光検出部２０６に達する。

【００５９】反応部２２０と反応液１５０の界面におい
て全反射が生じ始める光ビームの入射角は、反応部２２
０の内部の増幅産物の膜の屈折率や反応液１５０の屈折
率に大きく依存する。従って、反応液１５０の屈折率あ
るいは増幅産物の膜の屈折率は、反応部２２０と反応液
１５０の界面で全反射が生じ始める角度を求めることに
より測定される。

【００６０】光検出部２０６は、パスＰdに沿って移動
され、例えば、光検出部２０６の受光面に形成される像
が、図１１に示されるようになるように配置される。つ
まり、光検出部２０６は、反応部２２０と反応液１５０
の界面で全反射された光が、光検出部２０６の受光面の
丁度半分を占める位置に配置される。これにより、全反
射が生じる入射角が求められ、それに基づいて、反応部
２２０が固相化された試薬を有している場合には、反応
液１５０の屈折率、とりわけ増幅産物の膜の屈折率が、
また、反応部２２０が固相化された試薬を有していない
場合には、反応液１５０の屈折率が測定される。

【００６１】このように本実施形態においても、第一実
施形態と同様に、電気泳動法では測定できない増幅産物
が高分子化する反応であっても測定できる。また、蛍光
色素などの検出用の化合物を添加することなく核酸増幅
産物を測定できる。さらに、核酸増幅反応を開始させて
から継続的に測定することで、増幅の初期段階で検出
し、その変化の単位時間あたりの変化量から最終的な変
化量を算出することができる。加えて、測定は核酸増幅
反応のあいだ継続的に行なえるので、反応部の移動や温
度の変化に起因する反応液の屈折率変化の影響を受けて
いない高精度な測定結果を得ることができる。従って、
これまでにない高速で高感度で低価格な核酸増幅反応の
測定方法と測定装置が提供される。

【００６２】［第三の実施の形態］本実施形態は、一般
的に知られているアッベ法による屈折率測定を利用した
核酸増幅反応測定であり、図１２に示されるように、そ
の核酸増幅反応測定装置３００は、反応液１５０を収容
した反応部３２０の上下に配置される一対のプリズム３
１２，３１６と、反応部３２０に向けて光ビームを射出
する光源部３０２と、反応部２２０を透過した光ビーム
を受ける光検出部３０６と、反応部３２０の温度を調節
するための一対の反応部温度調節部３４２，３４４と、
光源部３０２と光検出部３０６を制御するためのコント
ローラー３０８と、反応部温度調節部３４０を制御する
ためのコントローラー３１０とを備えている。

【００６３】プリズム３１２は、プリズム３１２または
反応部３２０の屈折率と同等以上の屈折率を有する光学
的に透明な高屈折率液体３１４を介して、反応部３２０
と光学的に接合されており、また、プリズム３１６は、
プリズム３１６または反応部３２０の屈折率と同等以上
の屈折率を有する光学的に透明な高屈折率液体を介し
て、反応部３２０と光学的に接合されている。プリズム
３１２，３１６には、それぞれ、反応部温度調節部３４
２，３４４が取り付けられており、反応部温度調節部３
４２，３４４は、プリズム３１２，３１６を介して、反
応部３２０の温度を制御する。

【００６４】反応部３２０は、第二実施形態で説明した
反応部２２０と同じ構造体であり、好ましくは、増幅産
物と特異的に反応する固相化された試薬(プローブやプ
ライマー)を有しているが、固相化された試薬は有して
いなくてもよい。

【００６５】測定は、第一の実施の形態と同様の手順で
行なわれる。すなわち、まず、被検物質と特定の試薬を
混合して反応液を用意し、これを反応部３２０に十分な
量を入れた後、反応部３２０を反応部設置部３４２に設
置する。反応部温度調節部３４４によって反応部３２０
を所定の温度に加熱して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反
応を行なう。

【００６６】ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の結果、反
応部３２０が固相化された試薬を有している場合には、
第一実施形態で説明したように、反応部下板の上面に固
定された試薬(プローブやプライマー)と結合した高分子
化した目的のＤＮＡから成る増幅産物の膜が形成され
る。また、反応部３２０が固相化された試薬を有してい
ない場合には、第一実施形態で説明したように、反応液
中に高分子化した目的のＤＮＡが生成される。

【００６７】図１２において、光源部３０２から射出さ
れた光ビームは、プリズム３１２と高屈折率液体３１４
を透過して、反応部３２０と反応液１５０の界面に達す
る。この界面では、特定の角度を越える入射角の光ビー
ムは全反射される。反応部３２０と反応液１５０の界面
で全反射されない光は、反応部３２０を通り抜け、高屈
折率液体３１８とプリズム３１６を透過し、光検出部３
０６に達する。

【００６８】反応部３２０と反応液１５０の界面におい
て全反射が生じ始める光ビームの入射角は、反応部３２
０の内部の反応液１５０の屈折率や増幅産物の膜の屈折
率の屈折率に大きく依存する。従って、反応液１５０の
屈折率あるいは増幅産物の膜の屈折率は、全反射が生じ
始める入射角を求めることにより測定される。全反射が
生じ始める入射角は、反応部３２０を透過した光の強度
の入射角に対する特性(透過光強度特性)を調べることに
より求めることができる。

【００６９】光源部３０２は、パスＰsに沿って移動可
能に支持されており、これにより、反応部３２０への光
ビームの入射角を変えることができる。また、光検出部
３０６は、パスＰdに沿って移動可能に支持されてお
り、光源部３０２の移動によって変えられる任意の入射
角の光ビームに対して、反応部３２０を透過した光を受
けることができる。

【００７０】光源部３０２をパスＰsに沿って移動させ
るとともに、これに応じて光検出部３０６をパスＰdに
沿って移動させ、反応部３２０に入射する光ビームの入
射角の変化に対する、反応部３２０を透過する光の強度
の変化を測定し、入射角に対する透過光強度特性を得
る。この入射角に対する透過光強度特性から、全反射が
生じる入射角が求められ、これに基づいて、反応部３２
０が固相化された試薬を有している場合には、反応液１
５０の屈折率、とりわけ増幅産物の膜の屈折率が、ま
た、反応部３２０が固相化された試薬を有していない場
合には、反応液１５０の屈折率が測定される。

【００７１】このように本実施形態においても、第一実
施形態と同様に、電気泳動法では測定できない増幅産物
が高分子化する反応であっても測定できる。また、蛍光
色素などの検出用の化合物を添加することなく核酸増幅
産物を測定できる。さらに、核酸増幅反応を開始させて
から継続的に測定することで、増幅の初期段階で検出
し、その変化の単位時間あたりの変化量から最終的な変
化量を算出することができる。加えて、測定は核酸増幅
反応のあいだ継続的に行なえるので、反応部の移動や温
度の変化に起因する反応液の屈折率変化の影響を受けて
いない高精度な測定結果を得ることができる。従って、
これまでにない高速で高感度で低価格な核酸増幅反応の
測定方法と測定装置が提供される。

【００７２】これまで、いくつかの実施の形態について
図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上
述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨
を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。

【００７３】

【発明の効果】本発明によれば、電気泳動法では測定で
きない増幅産物が高分子化する反応であっても測定でき
る。また、蛍光色素などの検出用の化合物を添加するこ
となく核酸増幅産物を測定できる。さらに、核酸増幅反
応を開始させてから継続的に測定することで増幅の初期
段階で検出し、その変化の単位時間あたりの変化量から
最終的な変化量を算出することができる。すなわち、レ
ートアッセイと呼ばれる測定方法が、非標識、非プロー
ブで可能になる。従って、今までに類を見ない高速で高
感度で低価格な核酸増幅反応の測定方法と測定装置が提
供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第一の実施の形態による核酸増幅反応
測定装置を示している。

【図２】図１に示される反応部の斜視図である。

【図３】反応部に入射する光ビームの入射角に対する、
反応部で反射された光の強度特性を示している。

【図４】第一の実施の形態の核酸増幅反応測定装置の変
形例を示している。

【図５】固相化された試薬を有する反応部内におけるＬ
ＡＭＰ法による核酸増幅反応の前の状態を模式的に示し
ている。

【図６】固相化された試薬を有する反応部内におけるＬ
ＡＭＰ法による核酸増幅反応の後の状態を模式的に示し
ている。

【図７】固相化された試薬を持たない別の反応部内にお
けるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の前の状態を模式的
に示している。

【図８】固相化された試薬を持たない別の反応部内にお
けるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の後の状態を模式的
に示している。

【図９】本発明の第二の実施の形態による核酸増幅反応
測定装置を示している。

【図１０】図９に示される反応部の斜視図である。

【図１１】図９の光検出部の受光面に形成される像を示
している。

【図１２】本発明の第三の実施の形態による核酸増幅反
応測定装置を示している。

【符号の説明】

１００核酸増幅反応測定装置１０２光源部１０４偏光子１０６光検出部１１２プリズム１２０反応部１３２導電性薄膜１４０反応部温度調節部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者森安義栃木県大田原市下石上1381−３栄研化学株式会社那須事業所内Ｆターム(参考） 2G045 BB50 DA12 DA13 FA11 GC11 4B024 AA11 AA19 CA01 HA11 HA19 4B029 AA07 AA11 AA12 AA23 FA12 4B063 QA01 QQ42 QR08 QR32 QR42 QS25 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】増幅すべき核酸配列を繰り返し延長しな
がら高分子量化する工程を含む核酸増幅反応を測定する
ための核酸増幅反応測定方法であり、反応部に光ビーム
を照射する工程と、増幅すべき核酸配列を繰り返しなが
ら高分子量化した産物を含む領域を有する反応液と反応
部の界面による全反射に基づいて測定する工程とを含ん
でいる、核酸増幅反応測定方法。
【請求項２】核酸増幅反応によって得られる産物と特
異的に反応する試薬を反応液と接する面に固定する工程
を更に含んでいる、請求項１に記載の核酸増幅反応測定
方法。
【請求項３】反応部と反応液の界面で反射された光の
強度の入射角に対する特性を求める工程を含んでいる、
請求項１に記載の核酸増幅反応測定方法。
【請求項４】反応部を透過した光の強度の入射角に対
する特性を求める工程を含んでいる、請求項１に記載の
核酸増幅反応測定方法。
【請求項５】増幅すべき核酸配列を繰り返し延長しな
がら高分子量化する工程を含む核酸増幅反応を測定する
ための核酸増幅反応測定装置であり、反応部の温度を制御するための反応部温度制御手段と、反応部に照射される光ビームを発する光源部と、反応部と反応液の界面による全反射を検出するための光
検出部とを備えており、高分子化された増幅産物に起因
する反応液の屈折率を継続的に測定する、核酸増幅反応
測定装置。
【請求項６】反応部は、反応液と接する面に、核酸増
幅反応によって得られる産物と特異的に反応する試薬が
固定されている、請求項５に記載の核酸増幅反応測定装
置。
【請求項７】光検出部は、反応部と反応液の界面で全
反射された光を受ける、請求項５に記載の核酸増幅反応
測定装置。
【請求項８】光源部は移動可能に支持されており、光
ビームの反応部に対する入射角は光源部の移動によって
変えられる、請求項７に記載の核酸増幅反応測定装置。
【請求項９】光源部は大径の光ビームを射出し、反応
部に照射される光ビームを収束性の光ビームに変えるた
めの集光レンズを更に備えている、請求項７に記載の核
酸増幅反応測定装置。
【請求項１０】光検出部は、反応部を透過した光を受
ける、請求項５に記載の核酸増幅反応測定装置。
【請求項１１】光源部は移動可能に支持されており、
光ビームの反応部に対する入射角は光源部の移動によっ
て変えられる、請求項１０に記載の核酸増幅反応測定装
置。