JP3310662B2 - プローブポリマー作製用プローブ、プローブポリマーの作製方法及びその利用 - Google Patents
プローブポリマー作製用プローブ、プローブポリマーの作製方法及びその利用Info
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Description
【０００１】（技術分野） 本発明は、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する一対のプローブポリマー作製用プローブ、そ
のプローブを使用するプローブポリマーの作製方法、及
び該方法を利用するターゲット遺伝子の検出方法に関す
る。
３）有する一対のプローブポリマー作製用プローブ、そ
のプローブを使用するプローブポリマーの作製方法、及
び該方法を利用するターゲット遺伝子の検出方法に関す
る。
【０００２】（背景技術） 遺伝子工学の分野におけるＤＮＡの解析方法は、新規遺
伝子および病原遺伝子の探索、遺伝的疾患、癌疾患、感
染症の診断等に非常に有用な手段である。ターゲット遺
伝子の増幅・解析法として、ポリメラーゼ連鎖反応方法
（ＰＣＲ法）が汎用されている（USP 4683195, 468320
2）。別の手段として、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ
法、Trends in Biotechnology,10,146-152,1992）、リ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，ligase chain reaction、EP
320308）法などがある。これら手法は、二本鎖ＤＮＡの
一本鎖への解離、プライマーからの相補鎖の合成などの
ステップを含むため高温と低温の反応を何回も繰り返す
必要がある。そのために、厳密な温度制御装置を必要と
し、温度設定に時間を要することにより時間のロスが生
じていた。さらに高価な酵素を必要とする。
伝子および病原遺伝子の探索、遺伝的疾患、癌疾患、感
染症の診断等に非常に有用な手段である。ターゲット遺
伝子の増幅・解析法として、ポリメラーゼ連鎖反応方法
（ＰＣＲ法）が汎用されている（USP 4683195, 468320
2）。別の手段として、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ
法、Trends in Biotechnology,10,146-152,1992）、リ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，ligase chain reaction、EP
320308）法などがある。これら手法は、二本鎖ＤＮＡの
一本鎖への解離、プライマーからの相補鎖の合成などの
ステップを含むため高温と低温の反応を何回も繰り返す
必要がある。そのために、厳密な温度制御装置を必要と
し、温度設定に時間を要することにより時間のロスが生
じていた。さらに高価な酵素を必要とする。
【０００３】その後、温度制御の問題を解決するために
等温条件でのＤＮＡ増幅法が開発された。例えば、鎖置
換型増幅法（ＳＤＡ，strand displacement amplificat
ion、Nucleic Acid Res., 20, 1691-1696, 1992）、核
酸配列増幅法（ＮＡＳＢＡ，nucleic acid sequence ba
sed amplification, Nature, 350, 91-92, 1991）、Ｑ
βレプリカーゼ法（BioTechnology,6, 1197-1202, 198
8）などがある。これらの手法は、等温で実施できると
いう利点を有するが、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンド
ヌクレアーゼ等の高価な酵素を必要としている。
等温条件でのＤＮＡ増幅法が開発された。例えば、鎖置
換型増幅法（ＳＤＡ，strand displacement amplificat
ion、Nucleic Acid Res., 20, 1691-1696, 1992）、核
酸配列増幅法（ＮＡＳＢＡ，nucleic acid sequence ba
sed amplification, Nature, 350, 91-92, 1991）、Ｑ
βレプリカーゼ法（BioTechnology,6, 1197-1202, 198
8）などがある。これらの手法は、等温で実施できると
いう利点を有するが、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンド
ヌクレアーゼ等の高価な酵素を必要としている。
【０００４】これら等温核酸増幅法は、プライマーの数
や操作の点でいくつか問題を有するが、酵素を使用しな
い低コストで簡便な手法による核酸増幅法、核酸検出法
の確立が望まれている。
や操作の点でいくつか問題を有するが、酵素を使用しな
い低コストで簡便な手法による核酸増幅法、核酸検出法
の確立が望まれている。
【０００５】一方、分岐ＤＮＡプローブ法による遺伝子
の増幅は、枝分かれした高分子の一本鎖ＤＮＡプローブ
をあらかじめ合成しておき、ターゲット遺伝子にハイブ
リダイゼーションさせることにより、ターゲット遺伝子
を検出する方法であるが、枝分かれした高分子の一本鎖
ＤＮＡプローブをターゲット遺伝子にハイブリダイゼー
ションさせるためには、分岐ＤＮＡプローブが高分子で
あるため時間がかかり、また、枝分かれした高分子の分
岐ＤＮＡプローブの大きさに限界があるため、ターゲッ
ト遺伝子の検出には限界があった。
の増幅は、枝分かれした高分子の一本鎖ＤＮＡプローブ
をあらかじめ合成しておき、ターゲット遺伝子にハイブ
リダイゼーションさせることにより、ターゲット遺伝子
を検出する方法であるが、枝分かれした高分子の一本鎖
ＤＮＡプローブをターゲット遺伝子にハイブリダイゼー
ションさせるためには、分岐ＤＮＡプローブが高分子で
あるため時間がかかり、また、枝分かれした高分子の分
岐ＤＮＡプローブの大きさに限界があるため、ターゲッ
ト遺伝子の検出には限界があった。
【０００６】上記の問題点に鑑み、本出願人は、酵素を
使用しない新規な等温核酸増幅法（プローブポリマーの
作製方法）を既に提案した（EP 1002877A）。この方法
は、３個所の領域から構成される一対のプローブ（Hone
yComb Probe、以下ＨＣＰと称する）を用いる方法であ
り、第１プローブと第２プローブの各々の３個所の領域
はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた
場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に各領
域の塩基配列を工夫したものである。この工夫により、
複数の一対のプローブを反応させた場合、お互いにハイ
ブリダイズしプローブのポリマーを形成させることがで
きる（Probe alternation link self-assembly reactio
n、以下、ＰＡＬＳＡＲ法と称する）。
使用しない新規な等温核酸増幅法（プローブポリマーの
作製方法）を既に提案した（EP 1002877A）。この方法
は、３個所の領域から構成される一対のプローブ（Hone
yComb Probe、以下ＨＣＰと称する）を用いる方法であ
り、第１プローブと第２プローブの各々の３個所の領域
はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた
場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に各領
域の塩基配列を工夫したものである。この工夫により、
複数の一対のプローブを反応させた場合、お互いにハイ
ブリダイズしプローブのポリマーを形成させることがで
きる（Probe alternation link self-assembly reactio
n、以下、ＰＡＬＳＡＲ法と称する）。
【０００７】この提案済のプローブポリマーの作製方法
を利用することによって、検体試料中のターゲット遺伝
子の検出が可能となり、酵素を使用せず等温操作という
画期的、簡潔かつ安価な手法が実現される。
を利用することによって、検体試料中のターゲット遺伝
子の検出が可能となり、酵素を使用せず等温操作という
画期的、簡潔かつ安価な手法が実現される。
【０００８】（発明の開示） 本発明は、上記した提案済のプローブポリマーの作製方
法についてさらに検討を加え、プローブポリマーをさら
に安定なポリマーとする事により、該手法の更なる改良
を試みたものである。
法についてさらに検討を加え、プローブポリマーをさら
に安定なポリマーとする事により、該手法の更なる改良
を試みたものである。
【０００９】上記した課題を解決するために、本発明者
らは鋭意研究の結果、お互いに相補的塩基配列領域を３
カ所以上の数から構成される一対（２つ一組）のプロー
ブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブ
リダイゼーションさせることにより、二本鎖のプローブ
ポリマーが等温で容易に形成される知見に加え、ＰＡＬ
ＳＡＲ法で使用する一対のプローブにおいて、互い違い
に交差してハイブリダイゼーションする時のそれぞれの
領域における分岐点（両端）の塩基配列をＧ（グアニ
ン）とＣ（シトシン）の結合にすることにより、各領域
の分岐点における塩基対間の結合力がＡ（アデニン）と
Ｔ（チミン）に比べて強固になるため、この領域全体の
塩基のπ電子による特殊な相互作用が今まで以上に強く
なることを見出し本発明を完成するに至った。
らは鋭意研究の結果、お互いに相補的塩基配列領域を３
カ所以上の数から構成される一対（２つ一組）のプロー
ブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブ
リダイゼーションさせることにより、二本鎖のプローブ
ポリマーが等温で容易に形成される知見に加え、ＰＡＬ
ＳＡＲ法で使用する一対のプローブにおいて、互い違い
に交差してハイブリダイゼーションする時のそれぞれの
領域における分岐点（両端）の塩基配列をＧ（グアニ
ン）とＣ（シトシン）の結合にすることにより、各領域
の分岐点における塩基対間の結合力がＡ（アデニン）と
Ｔ（チミン）に比べて強固になるため、この領域全体の
塩基のπ電子による特殊な相互作用が今まで以上に強く
なることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１０】本発明は、各領域の分岐点における塩基対
間の結合力をより強固とすることによって、より安定し
たプローブポリマーを作製することができるとともに、
核酸合成酵素や枝分かれしたＤＮＡを用いずに、等温で
効率よくプローブを重合させプローブポリマーを形成さ
せることができ、その上、形成されるポリマーの塩基の
積み重ねが規則的な高次構造をとることから、２６０ｎ
ｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロ
ミズム」という淡色効果を発現させてポリマーの状態を
確認することが可能であり、さらには、ポリマーの塩基
の積み重ねの間に安価な蛍光物質を挿入させて、その蛍
光強度の変化からポリマーの状態を確認できるために、
今までになく低コストでしかも簡便に遺伝子を検出する
ことができる、プローブポリマー作製用プローブ、その
プローブを用いるプローブポリマーの作製方法、その方
法によって作製されたプローブポリマー、そのプローブ
ポリマーを用いるターゲット遺伝子の測定方法、及びタ
ーゲット遺伝子の検出試薬を提供することを目的とす
る。
間の結合力をより強固とすることによって、より安定し
たプローブポリマーを作製することができるとともに、
核酸合成酵素や枝分かれしたＤＮＡを用いずに、等温で
効率よくプローブを重合させプローブポリマーを形成さ
せることができ、その上、形成されるポリマーの塩基の
積み重ねが規則的な高次構造をとることから、２６０ｎ
ｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロ
ミズム」という淡色効果を発現させてポリマーの状態を
確認することが可能であり、さらには、ポリマーの塩基
の積み重ねの間に安価な蛍光物質を挿入させて、その蛍
光強度の変化からポリマーの状態を確認できるために、
今までになく低コストでしかも簡便に遺伝子を検出する
ことができる、プローブポリマー作製用プローブ、その
プローブを用いるプローブポリマーの作製方法、その方
法によって作製されたプローブポリマー、そのプローブ
ポリマーを用いるターゲット遺伝子の測定方法、及びタ
ーゲット遺伝子の検出試薬を提供することを目的とす
る。
【００１１】本発明のプローブポリマーの作製用プロー
ブは、下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特性を具備した、一対
の第１プローブ及び第２プローブを有するものである。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。
ブは、下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特性を具備した、一対
の第１プローブ及び第２プローブを有するものである。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。
【００１２】本発明のプローブポリマーの作製方法は、
上記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特性を有する複数の一対の第
１プローブ及び第２プローブを重合させてプローブポリ
マーを作製するものである。
上記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特性を有する複数の一対の第
１プローブ及び第２プローブを重合させてプローブポリ
マーを作製するものである。
【００１３】本発明は、さらに、使用する一対のプロー
ブの相補領域の分岐点（両端）の塩基配列をＧ（グアニ
ン）またはＣ（シトシン）を配置させ、ハイブリダイズ
した際にＣ−Ｇ結合を形成させることにより、塩基の積
み重ね（stacking of base）により塩基のπ電子の特殊
な相互作用を生じさせ、安定した二本鎖のポリマーを形
成させることも含む。
ブの相補領域の分岐点（両端）の塩基配列をＧ（グアニ
ン）またはＣ（シトシン）を配置させ、ハイブリダイズ
した際にＣ−Ｇ結合を形成させることにより、塩基の積
み重ね（stacking of base）により塩基のπ電子の特殊
な相互作用を生じさせ、安定した二本鎖のポリマーを形
成させることも含む。
【００１４】本発明のプローブポリマーは、前記（ａ）
（ｂ）（ｃ）の特性を有する複数の一対の第１プローブ
及び第２プローブを重合させることにより得られるもの
である。
（ｂ）（ｃ）の特性を有する複数の一対の第１プローブ
及び第２プローブを重合させることにより得られるもの
である。
【００１５】本発明は、さらに、該プローブポリマー作
製法を利用して、試料中に含まれる微量のターゲット遺
伝子の測定方法を包含するものである。
製法を利用して、試料中に含まれる微量のターゲット遺
伝子の測定方法を包含するものである。
【００１６】本発明のターゲット遺伝子の測定方法の第
１の様態は、下記（１）（２）（３）の工程からなるも
のである。 （１）重合用プローブとして前記（ａ）（ｂ）（ｃ）の
特性を有する一対の第１プローブ及び第２プローブを用
い、両プローブのうち、相補的塩基配列領域の一つがタ
ーゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域を
保有する、いずれか一方のプローブと試料とを反応させ
該プローブと該試料中のターゲット遺伝子と結合させ
る。 （２）次いで、上記複数の重合用プローブを反応させ、
ターゲット遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させ
る。 （３）使用した重合用プローブのうちから未反応プロー
ブを洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量
を測定する。
１の様態は、下記（１）（２）（３）の工程からなるも
のである。 （１）重合用プローブとして前記（ａ）（ｂ）（ｃ）の
特性を有する一対の第１プローブ及び第２プローブを用
い、両プローブのうち、相補的塩基配列領域の一つがタ
ーゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域を
保有する、いずれか一方のプローブと試料とを反応させ
該プローブと該試料中のターゲット遺伝子と結合させ
る。 （２）次いで、上記複数の重合用プローブを反応させ、
ターゲット遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させ
る。 （３）使用した重合用プローブのうちから未反応プロー
ブを洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量
を測定する。
【００１７】本発明のターゲット遺伝子の測定方法の第
２の様態は、下記（１）（２）（３）の工程からなるも
のである。 （１）重合用プローブとして前記（ａ）（ｂ）（ｃ）の
特性を有する一対の第１プローブ及び第２プローブを用
い、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域と、重合用プローブのいずれか一つの領域と相補的
塩基配列を有する領域との二つの領域から構成される、
少なくとも１つのターゲット遺伝子捕捉用プローブを試
料と反応させ、ターゲット遺伝子と結合させる。 （２）次いで、上記重合用プローブを反応させ、上記捕
捉用プローブと該重合用プローブを結合させ、ターゲッ
ト遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させる。 （３）使用した重合プローブのうちから未反応プローブ
を洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量を
測定する。
２の様態は、下記（１）（２）（３）の工程からなるも
のである。 （１）重合用プローブとして前記（ａ）（ｂ）（ｃ）の
特性を有する一対の第１プローブ及び第２プローブを用
い、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域と、重合用プローブのいずれか一つの領域と相補的
塩基配列を有する領域との二つの領域から構成される、
少なくとも１つのターゲット遺伝子捕捉用プローブを試
料と反応させ、ターゲット遺伝子と結合させる。 （２）次いで、上記重合用プローブを反応させ、上記捕
捉用プローブと該重合用プローブを結合させ、ターゲッ
ト遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させる。 （３）使用した重合プローブのうちから未反応プローブ
を洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量を
測定する。
【００１８】本発明のターゲット遺伝子の測定方法にお
いては、前記プローブポリマーに蛍光物質を結合させ、
発光により蛍光量を測定することにより、又は紫外線に
対する光学的な吸収の変化を利用して該プローブポリマ
ーの量を測定するのが好適である。
いては、前記プローブポリマーに蛍光物質を結合させ、
発光により蛍光量を測定することにより、又は紫外線に
対する光学的な吸収の変化を利用して該プローブポリマ
ーの量を測定するのが好適である。
【００１９】本発明のターゲット遺伝子の検出試薬の第
1の様態は、重合用プローブとして前記（ａ）（ｂ）
（ｃ）に加えて下記（ｄ）の特性を有する一対の第１プ
ローブ及び第２プローブを必須の構成成分とする。 （ｄ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブのう
ち、いずれか一方のプローブの相補的塩基配列領域の一
つがターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域を保有している。
1の様態は、重合用プローブとして前記（ａ）（ｂ）
（ｃ）に加えて下記（ｄ）の特性を有する一対の第１プ
ローブ及び第２プローブを必須の構成成分とする。 （ｄ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブのう
ち、いずれか一方のプローブの相補的塩基配列領域の一
つがターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域を保有している。
【００２０】本発明のターゲット遺伝子の検出試薬の第
２の様態は、重合用プローブとして前記（ａ）（ｂ）
（ｃ）の特性を有する一対の第１プローブ及び第２プロ
ーブを用い、少なくとも二つの領域から構成され、ター
ゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域と、
上記重合用プローブのいずれか一つの領域と相補的塩基
配列を有する領域とから構成される、少なくとも１つの
ターゲット遺伝子捕捉用プローブと、上記複数の重合用
プローブを必須の構成成分とするものである。
２の様態は、重合用プローブとして前記（ａ）（ｂ）
（ｃ）の特性を有する一対の第１プローブ及び第２プロ
ーブを用い、少なくとも二つの領域から構成され、ター
ゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域と、
上記重合用プローブのいずれか一つの領域と相補的塩基
配列を有する領域とから構成される、少なくとも１つの
ターゲット遺伝子捕捉用プローブと、上記複数の重合用
プローブを必須の構成成分とするものである。
【００２１】前記一対の第１プローブ及び第２プローブ
の各々の相補的塩基配列領域数ｎは、３、４、５、又は
６が好ましい。該相補的塩基配列領域の塩基数は、それ
ぞれ少なくとも８個からなるのが好適である。該第１及
び第２プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡのいずれ
かから選ばれる塩基から構成される。
の各々の相補的塩基配列領域数ｎは、３、４、５、又は
６が好ましい。該相補的塩基配列領域の塩基数は、それ
ぞれ少なくとも８個からなるのが好適である。該第１及
び第２プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡのいずれ
かから選ばれる塩基から構成される。
【００２２】本発明における「相補的塩基配列」とは、
完全に相補である塩基配列であることを意味するが、ス
トリンゼントな条件でハイブリダイズする塩基配列であ
って、プローブポリマーを形成する能力を有する塩基配
列をも意味する。
完全に相補である塩基配列であることを意味するが、ス
トリンゼントな条件でハイブリダイズする塩基配列であ
って、プローブポリマーを形成する能力を有する塩基配
列をも意味する。
【００２３】本発明の一対のプローブの塩基構成は、１
対１でハイブリダイゼーションする時に必ず３ヵ所以上
の相補的な塩基配列領域の中で、１ヵ所の領域同士のみ
が特異的にハイブリダイゼーションするように構成され
る。
対１でハイブリダイゼーションする時に必ず３ヵ所以上
の相補的な塩基配列領域の中で、１ヵ所の領域同士のみ
が特異的にハイブリダイゼーションするように構成され
る。
【００２４】図１は、３個所の相補的塩基配列領域を有
するＤＮＡプローブの一例を示す模式図である。同図に
おいて、Ｎｏ．１のＤＮＡプローブは、Ｘ1領域、Ｘ2領
域及びＸ3領域を有し、Ｎｏ．２のＤＮＡプローブは、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域及びＸ′3領域を有している。こ
のＮｏ．１のＤＮＡプローブとＮｏ．２のＤＮＡプロー
ブは、両者をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ1
領域はＸ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域と
だけ結合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけ結合するような
構成とされている（図２）。
するＤＮＡプローブの一例を示す模式図である。同図に
おいて、Ｎｏ．１のＤＮＡプローブは、Ｘ1領域、Ｘ2領
域及びＸ3領域を有し、Ｎｏ．２のＤＮＡプローブは、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域及びＸ′3領域を有している。こ
のＮｏ．１のＤＮＡプローブとＮｏ．２のＤＮＡプロー
ブは、両者をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ1
領域はＸ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域と
だけ結合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけ結合するような
構成とされている（図２）。
【００２５】つまり、本発明のお互いに相補的な部分が
３カ所の数から構成される一対のＤＮＡプローブ同士を
用いた場合、互い違いに交差するようにハイブリダイゼ
ーションさせた場合は、図２に示したように、Ｘ1領域
はＸ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけ
結合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけ結合し、３つの結合
パターンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼ
ーションする。
３カ所の数から構成される一対のＤＮＡプローブ同士を
用いた場合、互い違いに交差するようにハイブリダイゼ
ーションさせた場合は、図２に示したように、Ｘ1領域
はＸ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけ
結合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけ結合し、３つの結合
パターンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼ
ーションする。
【００２６】上記した構成のプローブを用いることによ
り、２本のプローブが互い違いに結合する。具体的に
は、図３に示したように、Ｎｏ．１のＤＮＡプローブ及
びＮｏ．２のＤＮＡプローブが立体的に互い違いに結合
し、プローブポリマーを形成する。つまり、図２に示し
た３つの結合パターンで互い違いにハイブリダイゼーシ
ョンした一対のプローブの複数対は、図３に模式的な一
例を示したように二本鎖のプローブポリマーを形成させ
ることができる。図３の模式図を立体的な概念構造の一
例を示すと図４のように示される。図５は図３の結合パ
ターンを変えた模式図で、図５の模式図の立体的な概念
構造の一例は図６に示される。
り、２本のプローブが互い違いに結合する。具体的に
は、図３に示したように、Ｎｏ．１のＤＮＡプローブ及
びＮｏ．２のＤＮＡプローブが立体的に互い違いに結合
し、プローブポリマーを形成する。つまり、図２に示し
た３つの結合パターンで互い違いにハイブリダイゼーシ
ョンした一対のプローブの複数対は、図３に模式的な一
例を示したように二本鎖のプローブポリマーを形成させ
ることができる。図３の模式図を立体的な概念構造の一
例を示すと図４のように示される。図５は図３の結合パ
ターンを変えた模式図で、図５の模式図の立体的な概念
構造の一例は図６に示される。
【００２７】図７はお互いに相補的な部分が４カ所の数
から構成される一対のＤＮＡプローブの一例を示す模式
図である。同図において、Ｎｏ．３のＤＮＡプローブ
は、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域及びＸ4領域を有し、Ｎ
ｏ．４のＤＮＡプローブは、Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、
Ｘ′3領域及びＸ′4領域を有している。このＮｏ．３の
ＤＮＡプローブとＮｏ．４のＤＮＡプローブは、両者を
ハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ1領域はＸ′1領
域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけ結合し、Ｘ
3領域はＸ′3領域とだけ結合し、Ｘ4領域はＸ′4領域と
だけ結合するような構成とされている（図８）。
から構成される一対のＤＮＡプローブの一例を示す模式
図である。同図において、Ｎｏ．３のＤＮＡプローブ
は、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域及びＸ4領域を有し、Ｎ
ｏ．４のＤＮＡプローブは、Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、
Ｘ′3領域及びＸ′4領域を有している。このＮｏ．３の
ＤＮＡプローブとＮｏ．４のＤＮＡプローブは、両者を
ハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ1領域はＸ′1領
域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけ結合し、Ｘ
3領域はＸ′3領域とだけ結合し、Ｘ4領域はＸ′4領域と
だけ結合するような構成とされている（図８）。
【００２８】つまり、本発明のお互いに相補的な部分が
４カ所の数から構成される一対のＤＮＡプローブ同士を
用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーシ
ョンさせた場合は、図８に示したように、Ｘ1領域は
Ｘ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけ結
合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけ結合し、Ｘ4領域は
Ｘ′4領域とだけ結合し、４つの結合パターンで一対の
プローブが互い違いにハイブリダイゼーションする。
４カ所の数から構成される一対のＤＮＡプローブ同士を
用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーシ
ョンさせた場合は、図８に示したように、Ｘ1領域は
Ｘ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけ結
合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけ結合し、Ｘ4領域は
Ｘ′4領域とだけ結合し、４つの結合パターンで一対の
プローブが互い違いにハイブリダイゼーションする。
【００２９】上記した構成のプローブを用いることによ
り、２本のプローブが互い違いに結合する。具体的に
は、図９に示したようにＮｏ．３のＤＮＡプローブ及び
Ｎｏ．４のＤＮＡプローブが立体的に互い違いに結合
し、プローブポリマーを形成する。
り、２本のプローブが互い違いに結合する。具体的に
は、図９に示したようにＮｏ．３のＤＮＡプローブ及び
Ｎｏ．４のＤＮＡプローブが立体的に互い違いに結合
し、プローブポリマーを形成する。
【００３０】図８、図１１及び図１３に示したように、
一対のＤＮＡプローブの相補的な部分が４ヵ所、５ヵ所
及び６ヵ所の数から構成される一対のプローブをハイブ
リダイゼーションさせる方法をもってすれば、理論的に
はそれ以上の相補的塩基配列領域を増すことが可能であ
る。
一対のＤＮＡプローブの相補的な部分が４ヵ所、５ヵ所
及び６ヵ所の数から構成される一対のプローブをハイブ
リダイゼーションさせる方法をもってすれば、理論的に
はそれ以上の相補的塩基配列領域を増すことが可能であ
る。
【００３１】図１４はお互いに相補的な部分がｎカ所
（ｎ≧３）の数から構成される一対のＤＮＡプローブの
さらに別の例を示す模式図である。同図において、Ｎ
ｏ．９のＤＮＡプローブは、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領
域……Ｘn-1領域、Ｘn領域を有し、Ｎｏ．１０のＤＮＡ
プローブは、Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域……
Ｘ′n-1領域、Ｘ′n領域を有している。
（ｎ≧３）の数から構成される一対のＤＮＡプローブの
さらに別の例を示す模式図である。同図において、Ｎ
ｏ．９のＤＮＡプローブは、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領
域……Ｘn-1領域、Ｘn領域を有し、Ｎｏ．１０のＤＮＡ
プローブは、Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域……
Ｘ′n-1領域、Ｘ′n領域を有している。
【００３２】このＮｏ．９のＤＮＡプローブとＮｏ．１
０のＤＮＡプローブは、両者をハイブリダイゼーション
させたとき、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領
域はＸ′2領域とだけ結合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだ
け結合し、Ｘn-1領域はＸ′n-1とだけ結合し、Ｘn領域
はＸ′n領域とだけ結合するような構成とされている
（図１４）。
０のＤＮＡプローブは、両者をハイブリダイゼーション
させたとき、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領
域はＸ′2領域とだけ結合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだ
け結合し、Ｘn-1領域はＸ′n-1とだけ結合し、Ｘn領域
はＸ′n領域とだけ結合するような構成とされている
（図１４）。
【００３３】つまり、本発明のお互いに相補的な部分が
ｎカ所の数から構成される一対のＤＮＡプローブ同士を
用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーシ
ョンさせた場合は、図１４に示したように、Ｘ1領域は
Ｘ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけ結
合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけ結合し、Ｘn-1領域は
Ｘ′n-1領域とだけ結合し、Ｘn領域はＸ′n領域とだけ
結合し、ｎ個の結合パターンで一対のプローブが互い違
いにハイブリダイゼーションする。
ｎカ所の数から構成される一対のＤＮＡプローブ同士を
用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーシ
ョンさせた場合は、図１４に示したように、Ｘ1領域は
Ｘ′1領域とだけ結合し、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけ結
合し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけ結合し、Ｘn-1領域は
Ｘ′n-1領域とだけ結合し、Ｘn領域はＸ′n領域とだけ
結合し、ｎ個の結合パターンで一対のプローブが互い違
いにハイブリダイゼーションする。
【００３４】ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブ、又はＲ
ＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプロー
ブとＤＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプロ
ーブの場合も、そのハイブリダイゼーションの原理は、
図８、図１１、図１３および図１４に示したＤＮＡプロ
ーブ同士の場合と同様である。
ＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプロー
ブとＤＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプロ
ーブの場合も、そのハイブリダイゼーションの原理は、
図８、図１１、図１３および図１４に示したＤＮＡプロ
ーブ同士の場合と同様である。
【００３５】プローブ内の相補的塩基配列領域数ｎの数
は、それら一対のプローブが重合してプローブポリマー
を形成し得るものであれば特に限定されないが、費用と
効率を考慮すれば３〜５個所が適当である。
は、それら一対のプローブが重合してプローブポリマー
を形成し得るものであれば特に限定されないが、費用と
効率を考慮すれば３〜５個所が適当である。
【００３６】さらに本発明は、ＰＡＬＳＡＲ法で使用す
る一対のプローブが、互い違いに交差してハイブリダイ
ゼーションする時の分岐点の塩基配列をＧ（グアニン）
とＣ（シトシン）の結合にすることにより、塩基の積み
重ね（stacking of base）により塩基のπ電子の特殊な
相互作用を生じさせ、安定した二本鎖のポリマーを形成
させる方法である。
る一対のプローブが、互い違いに交差してハイブリダイ
ゼーションする時の分岐点の塩基配列をＧ（グアニン）
とＣ（シトシン）の結合にすることにより、塩基の積み
重ね（stacking of base）により塩基のπ電子の特殊な
相互作用を生じさせ、安定した二本鎖のポリマーを形成
させる方法である。
【００３７】ＤＮＡ、またはオリゴヌクレオチドの二重
らせん構造の中で、塩基はその中心付近にあり、Ａ（ア
デニン）とＴ（チミン）と， Ｇ（グアニン）とＣ（シ
トシン）と特異的に水素結合して塩基対を形成してい
る。２本の水素結合でつながっているＡとＴ〔図１５
（ａ）〕よりも、３本の水素結合でつながっているＧと
Ｃ〔図１５（ｂ）〕の方が強く結合することが、図１６
の図表に示したHatim T. Allawiら（Biochemistry 36,
10581-10594. 1997.）のNearest-Neighbor Thermodynam
ic Parametersを用いた成績からも明らかであることか
ら、図１７（ａ）と図１７（ｂ）に示したように、ＰＡ
ＬＳＡＲ法では、理論的に３箇所の領域でハイブリダイ
ゼーションを行うために、この使用する一対のプローブ
の互い違いに交差する円形で示した部分の結合をＧとＣ
にすることにより、ポリマーの形成を安定化させること
が可能になる。
らせん構造の中で、塩基はその中心付近にあり、Ａ（ア
デニン）とＴ（チミン）と， Ｇ（グアニン）とＣ（シ
トシン）と特異的に水素結合して塩基対を形成してい
る。２本の水素結合でつながっているＡとＴ〔図１５
（ａ）〕よりも、３本の水素結合でつながっているＧと
Ｃ〔図１５（ｂ）〕の方が強く結合することが、図１６
の図表に示したHatim T. Allawiら（Biochemistry 36,
10581-10594. 1997.）のNearest-Neighbor Thermodynam
ic Parametersを用いた成績からも明らかであることか
ら、図１７（ａ）と図１７（ｂ）に示したように、ＰＡ
ＬＳＡＲ法では、理論的に３箇所の領域でハイブリダイ
ゼーションを行うために、この使用する一対のプローブ
の互い違いに交差する円形で示した部分の結合をＧとＣ
にすることにより、ポリマーの形成を安定化させること
が可能になる。
【００３８】また、この塩基対は一平面を形成し、全体
がほぼ長方形の板のような形をなしているために、この
平面は二重らせん軸に対してほぼ直角に配置している。
したがって、各塩基対はみな互いに平行に位置すること
になり、その間隔は３．４Å〔図１５（ｃ）〕である。
がほぼ長方形の板のような形をなしているために、この
平面は二重らせん軸に対してほぼ直角に配置している。
したがって、各塩基対はみな互いに平行に位置すること
になり、その間隔は３．４Å〔図１５（ｃ）〕である。
【００３９】さらに、この塩基対平面の３．４Å間隔で
の塩基の積み重ね（stacking of base）によって塩基の
π電子による特殊な相互作用が生じて、これが二重らせ
ん構造安定化の大きい要因となっている。また、この塩
基の積み重ねがＤＮＡ、またはオリゴヌクレオチドの２
６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が３０％ほど低
下する「ハイポクロミズム」という淡色効果の発現が知
られている。
の塩基の積み重ね（stacking of base）によって塩基の
π電子による特殊な相互作用が生じて、これが二重らせ
ん構造安定化の大きい要因となっている。また、この塩
基の積み重ねがＤＮＡ、またはオリゴヌクレオチドの２
６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が３０％ほど低
下する「ハイポクロミズム」という淡色効果の発現が知
られている。
【００４０】ＰＡＬＳＡＲ法では、各領域における分岐
点の結合力が弱いとその分岐点にはさまれている領域の
ハイブリダイゼーションが不安定になることから、領域
全体の塩基のπ電子による特殊な相互作用から生じる塩
基の積み重ね（stacking of base）効果の強さを増すこ
とにより、ＰＡＬＳＡＲ法で互い違いに交差する各領域
のハイブリダイゼーション反応をより強固にさせること
を考案したものである。
点の結合力が弱いとその分岐点にはさまれている領域の
ハイブリダイゼーションが不安定になることから、領域
全体の塩基のπ電子による特殊な相互作用から生じる塩
基の積み重ね（stacking of base）効果の強さを増すこ
とにより、ＰＡＬＳＡＲ法で互い違いに交差する各領域
のハイブリダイゼーション反応をより強固にさせること
を考案したものである。
【００４１】また、ＰＡＬＳＡＲ法で形成されるポリマ
ーの塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることか
ら、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる
「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させてポリ
マーの状態を確認し、さらにはポリマーの塩基の積み重
ねの間に蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化か
らポリマーの状態を確認する方法を可能にするものであ
る。
ーの塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることか
ら、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる
「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させてポリ
マーの状態を確認し、さらにはポリマーの塩基の積み重
ねの間に蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化か
らポリマーの状態を確認する方法を可能にするものであ
る。
【００４２】図１８に示したように、ＰＡＬＳＡＲ法で
使用する一対のプローブの互い違いに交差してハイブリ
ダイゼーションする時の領域はおよそ２０塩基（２０ba
se）であるが、円形で示した分岐点の結合を強固にする
ことによって、積み重ね効果（stacking effect）が増
し、結果的にその分岐点にはさまれている２０塩基の領
域のハイブリダイゼーションが安定すると考えられる。
使用する一対のプローブの互い違いに交差してハイブリ
ダイゼーションする時の領域はおよそ２０塩基（２０ba
se）であるが、円形で示した分岐点の結合を強固にする
ことによって、積み重ね効果（stacking effect）が増
し、結果的にその分岐点にはさまれている２０塩基の領
域のハイブリダイゼーションが安定すると考えられる。
【００４３】上記の相補的領域分岐点に配置されるＣま
たはＧの数は少なくとも１塩基であり、複数個であって
も差し支えない。各相補領域の塩基配列を考慮し適宜選
択することができる。複数個のＣまたはＧを配置させる
場合、図１９に記載されるように、Ｃ、Ｇの順序は特に
限定されず自由に組み合わせることができる。また、下
記に記載されるターゲット遺伝子の検出法において、タ
ーゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列をプローブの
一領域として採用する場合も、相補領域の端部にＣまた
はＧを配置するように選択することが可能である。
たはＧの数は少なくとも１塩基であり、複数個であって
も差し支えない。各相補領域の塩基配列を考慮し適宜選
択することができる。複数個のＣまたはＧを配置させる
場合、図１９に記載されるように、Ｃ、Ｇの順序は特に
限定されず自由に組み合わせることができる。また、下
記に記載されるターゲット遺伝子の検出法において、タ
ーゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列をプローブの
一領域として採用する場合も、相補領域の端部にＣまた
はＧを配置するように選択することが可能である。
【００４４】上記の重合用プローブを使用することによ
り、試料中の微量の標的遺伝子を検出することができ
る。たとえば、一対の重合用プローブの相補領域の一つ
をターゲット遺伝子の一部分と相補的である塩基配列を
採用し、該プローブと試料を反応させて後、一対のプロ
ーブを反応させる。次いで、ターゲット遺伝子と結合し
ているプローブポリマーの量を測定することにより、タ
ーゲット遺伝子を測定することができる。
り、試料中の微量の標的遺伝子を検出することができ
る。たとえば、一対の重合用プローブの相補領域の一つ
をターゲット遺伝子の一部分と相補的である塩基配列を
採用し、該プローブと試料を反応させて後、一対のプロ
ーブを反応させる。次いで、ターゲット遺伝子と結合し
ているプローブポリマーの量を測定することにより、タ
ーゲット遺伝子を測定することができる。
【００４５】別の手法として、たとえば、ターゲット遺
伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域と、重合用プ
ローブの一領域と相補的塩基配列を有する領域、の二つ
の領域からなる捕捉用プローブを採用し、上記と同様な
方法でターゲット遺伝子の量を測定することができる。
捕捉用プローブは少なくとも一種類であり、ターゲット
遺伝子の相補部位を幾種類か選択することに応じて、複
数種の捕捉用プローブを採用することもできる。
伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域と、重合用プ
ローブの一領域と相補的塩基配列を有する領域、の二つ
の領域からなる捕捉用プローブを採用し、上記と同様な
方法でターゲット遺伝子の量を測定することができる。
捕捉用プローブは少なくとも一種類であり、ターゲット
遺伝子の相補部位を幾種類か選択することに応じて、複
数種の捕捉用プローブを採用することもできる。
【００４６】この手法はターゲット遺伝子を直接検出す
るだけでなく、間接的にターゲット物質を測定すること
も可能である。すなわち、ターゲット遺伝子を結合させ
た測定を目的とする物質（ターゲット物質）にヌクレオ
チドを結合させ、該ヌクレオチドをターゲット遺伝子と
して上記の方法に準じて測定することができる。
るだけでなく、間接的にターゲット物質を測定すること
も可能である。すなわち、ターゲット遺伝子を結合させ
た測定を目的とする物質（ターゲット物質）にヌクレオ
チドを結合させ、該ヌクレオチドをターゲット遺伝子と
して上記の方法に準じて測定することができる。
【００４７】上記したプローブの構成は、ＤＮＡプロー
ブの場合は、リン酸と糖と塩基（アデニン・チミン・グ
アニン・シトシン）を成分とする一本鎖断片であり、Ｒ
ＮＡプローブの場合は、塩基がアデニン・ウラシル・グ
アニン・シトシンを成分とする一本鎖断片である。ＰＮ
Ａは、ＤＮＡの「リン酸と糖」の骨格が、「Ｎ−（２−
アミノエチル）グリシン誘導体」に置き換わった構造
で、塩基の成分はＤＮＡ及びＲＮＡと同じである。
ブの場合は、リン酸と糖と塩基（アデニン・チミン・グ
アニン・シトシン）を成分とする一本鎖断片であり、Ｒ
ＮＡプローブの場合は、塩基がアデニン・ウラシル・グ
アニン・シトシンを成分とする一本鎖断片である。ＰＮ
Ａは、ＤＮＡの「リン酸と糖」の骨格が、「Ｎ−（２−
アミノエチル）グリシン誘導体」に置き換わった構造
で、塩基の成分はＤＮＡ及びＲＮＡと同じである。
【００４８】重合用プローブ（ＨＣＰ）を構成する核酸
は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体
でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド
核酸（ＰＮＡ、WO 92/20702）が挙げられる。また、一
対のプローブは、通常、同じ種類の核酸で構成される
が、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対に
なっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類は
ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡ）か
ら選択することができる。又、一つのプローブ内での核
酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必
要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡか
ら構成されるプローブ（キメラプローブ）を使用するこ
とも可能であり、本発明に含まれる。
は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体
でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド
核酸（ＰＮＡ、WO 92/20702）が挙げられる。また、一
対のプローブは、通常、同じ種類の核酸で構成される
が、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対に
なっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類は
ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡ）か
ら選択することができる。又、一つのプローブ内での核
酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必
要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡか
ら構成されるプローブ（キメラプローブ）を使用するこ
とも可能であり、本発明に含まれる。
【００４９】プローブの各相補的塩基配列領域の長さ
は、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましく
は少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１０
０塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。
は、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましく
は少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１０
０塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。
【００５０】これらプローブは公知の方法により合成す
ることができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプ
ライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.
）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホ
アミダイド法により合成することができる。また、別法
としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法等が
あるが、いかなる方法で合成されたものであってもよ
い。
ることができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプ
ライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.
）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホ
アミダイド法により合成することができる。また、別法
としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法等が
あるが、いかなる方法で合成されたものであってもよ
い。
【００５１】（発明を実施するための最良の形態） 本発明は、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する一対のプローブを使用し、両者を等温で酵素
不在の条件下で反応させることによりプローブポリマー
を形成させるものである。使用するプローブの本数は、
特に限定されないが、１０2〜１０15本の範囲で用いら
れる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸
増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐ
Ｈも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜
ｐＨ９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０
〜８０℃、好ましくは５５〜６５℃である。これら条件
は特に限定されない。
３）有する一対のプローブを使用し、両者を等温で酵素
不在の条件下で反応させることによりプローブポリマー
を形成させるものである。使用するプローブの本数は、
特に限定されないが、１０2〜１０15本の範囲で用いら
れる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸
増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐ
Ｈも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜
ｐＨ９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０
〜８０℃、好ましくは５５〜６５℃である。これら条件
は特に限定されない。
【００５２】このプローブポリマーの作製方法は試料中
のターゲット遺伝子の検出に応用することができる。
のターゲット遺伝子の検出に応用することができる。
【００５３】本発明の構成をさらに具体的な例でいえ
ば、一本のプローブの中でお互いに相補的塩基配列領域
の長さ（塩基の数）は、同一であっても異なってもよ
く、たとえば、図２０に示されるようにＤＮＡプローブ
同士の場合、Ｎｏ．１１プローブとＮｏ．１２プローブ
をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ1領域とＸ′1
領域は２４塩基でハイブリダイゼーションし、Ｘ2領域
とＸ′2領域は２２塩基でハイブリダイゼーションし、
Ｘ3領域とＸ′3領域は２０塩基でハイブリダイゼーショ
ンし、プローブポリマーを形成する（図２１）。
ば、一本のプローブの中でお互いに相補的塩基配列領域
の長さ（塩基の数）は、同一であっても異なってもよ
く、たとえば、図２０に示されるようにＤＮＡプローブ
同士の場合、Ｎｏ．１１プローブとＮｏ．１２プローブ
をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ1領域とＸ′1
領域は２４塩基でハイブリダイゼーションし、Ｘ2領域
とＸ′2領域は２２塩基でハイブリダイゼーションし、
Ｘ3領域とＸ′3領域は２０塩基でハイブリダイゼーショ
ンし、プローブポリマーを形成する（図２１）。
【００５４】本発明の構成をさらに具体的な例でいえ
ば、図１９ののＤＮＡプローブ同士の場合は、図２２
に示したように、Ｎｏ．１３プローブとＮｏ．１４プロ
ーブをハイブリダイゼーションさせたとき、制限酵素に
よる切断部位（下線の部分がＨａｅ ＩＩＩという酵素
で切断される）ができるように構成することもできる。
ば、図１９ののＤＮＡプローブ同士の場合は、図２２
に示したように、Ｎｏ．１３プローブとＮｏ．１４プロ
ーブをハイブリダイゼーションさせたとき、制限酵素に
よる切断部位（下線の部分がＨａｅ ＩＩＩという酵素
で切断される）ができるように構成することもできる。
【００５５】つまり、立体的にプローブ同士が互い違い
に結合し高分子になった後、その後の別の実験操作にそ
の高分子がクロスコンタミネーションしないように、制
限酵素を用いて防止することができる（図２３）。
に結合し高分子になった後、その後の別の実験操作にそ
の高分子がクロスコンタミネーションしないように、制
限酵素を用いて防止することができる（図２３）。
【００５６】本発明では、図１７に円形で示してあるこ
の交差してハイブリダイゼーションする時の分岐点の塩
基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の結合にする
ことにより、塩基の積み重ね（stacking of base）によ
り塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、安定した
二本鎖のポリマーを形成させる方法である。一例とし
て、図１７に一対のプローブが、Ｘ1領域はＸ′1領域
と、Ｘ2領域はＸ′2領域と、Ｘ3領域はＸ′3領域と互い
違いに交差してハイブリダイゼーションする、３個所の
相補的塩基配列領域を有する場合について図示した。
の交差してハイブリダイゼーションする時の分岐点の塩
基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の結合にする
ことにより、塩基の積み重ね（stacking of base）によ
り塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、安定した
二本鎖のポリマーを形成させる方法である。一例とし
て、図１７に一対のプローブが、Ｘ1領域はＸ′1領域
と、Ｘ2領域はＸ′2領域と、Ｘ3領域はＸ′3領域と互い
違いに交差してハイブリダイゼーションする、３個所の
相補的塩基配列領域を有する場合について図示した。
【００５７】図４０（ａ）には、お互いに相補的な部分
がｎ（ｎ≧３）個所の数から構成される一対のプローブ
（ＨＣＰ）の複数対を用いて、互い違いに交差するよう
にハイブリダイゼーションさせることにより、２本鎖の
高分子を形成させるプローブポリマーの作製方法及びそ
の利用（ＰＡＬＳＡＲ法）で使用する一対のプローブを
図示した。
がｎ（ｎ≧３）個所の数から構成される一対のプローブ
（ＨＣＰ）の複数対を用いて、互い違いに交差するよう
にハイブリダイゼーションさせることにより、２本鎖の
高分子を形成させるプローブポリマーの作製方法及びそ
の利用（ＰＡＬＳＡＲ法）で使用する一対のプローブを
図示した。
【００５８】つまり、図４０（ｂ）に示したように、そ
の分岐点の塩基をＧ−Ｃ結合にすることにより、ポリマ
ーの形成を安定化するものである。また、この分岐点の
Ｇ−Ｃの種類、数は、図１９の〜に示したように、
自由に組合せできるものであり、Ｇ−Ｃの塩基配列であ
れば特に限定されるものではない。
の分岐点の塩基をＧ−Ｃ結合にすることにより、ポリマ
ーの形成を安定化するものである。また、この分岐点の
Ｇ−Ｃの種類、数は、図１９の〜に示したように、
自由に組合せできるものであり、Ｇ−Ｃの塩基配列であ
れば特に限定されるものではない。
【００５９】本発明のターゲット遺伝子検出方法の第１
の態様は、たとえば、図２４および図２５に示したよう
に、一対のプローブのうち、一方のプローブの一つの相
補領域の塩基配列をターゲット遺伝子の一部と相補的な
塩基配列となるように構成し、まず、該プローブとター
ゲット遺伝子とを反応させた後、一対のプローブの複数
対をハイブリダイゼーションさせることにより、ターゲ
ット遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させる。該
複合体を適切な手法で分離した後、プローブポリマーの
量を測定することによりターゲット遺伝子量を測定する
ことができる。
の態様は、たとえば、図２４および図２５に示したよう
に、一対のプローブのうち、一方のプローブの一つの相
補領域の塩基配列をターゲット遺伝子の一部と相補的な
塩基配列となるように構成し、まず、該プローブとター
ゲット遺伝子とを反応させた後、一対のプローブの複数
対をハイブリダイゼーションさせることにより、ターゲ
ット遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させる。該
複合体を適切な手法で分離した後、プローブポリマーの
量を測定することによりターゲット遺伝子量を測定する
ことができる。
【００６０】本発明のターゲット遺伝子検出方法の第２
の態様は、たとえば、図２６に示したように、一対のプ
ローブとは別に、一対のプローブのうちどちらか一方の
プローブの領域と同じ塩基配列とターゲット遺伝子の一
部分と相補的な塩基配列からなるプローブ（捕捉用プロ
ーブ）を用いて、あらかじめ該捕捉用プローブとターゲ
ット遺伝子とハイブリダイゼーションさせた後、上記し
たプローブポリマーの作製方法で一対のプローブの複数
対をハイブリダイゼーションさせ、二本鎖のポリマーを
形成させてプローブを増幅して検出するものである。
の態様は、たとえば、図２６に示したように、一対のプ
ローブとは別に、一対のプローブのうちどちらか一方の
プローブの領域と同じ塩基配列とターゲット遺伝子の一
部分と相補的な塩基配列からなるプローブ（捕捉用プロ
ーブ）を用いて、あらかじめ該捕捉用プローブとターゲ
ット遺伝子とハイブリダイゼーションさせた後、上記し
たプローブポリマーの作製方法で一対のプローブの複数
対をハイブリダイゼーションさせ、二本鎖のポリマーを
形成させてプローブを増幅して検出するものである。
【００６１】ここで、ターゲット遺伝子の検出に使用す
る捕捉用プローブとは、ターゲット遺伝子の一部分と相
補的な塩基配列を有する領域と、重合用プローブの一領
域と相補的な塩基配列を有する領域の、少なくとも二つ
の領域から構成されるが、たとえば、重合用プローブの
他の相補的塩基領域をさらに附加すること、等は自由で
ある。しかし、捕捉用プローブとしての機能が阻害され
ないことが条件であることは言うまでもない。ターゲッ
ト遺伝子を検出する際、使用する捕捉用プローブは少な
くとも１種類使用し、必要に応じて、ターゲット遺伝子
に相補的な塩基配列を複数領域選択することにより複数
種類の捕捉用プローブを使用することが可能である。
る捕捉用プローブとは、ターゲット遺伝子の一部分と相
補的な塩基配列を有する領域と、重合用プローブの一領
域と相補的な塩基配列を有する領域の、少なくとも二つ
の領域から構成されるが、たとえば、重合用プローブの
他の相補的塩基領域をさらに附加すること、等は自由で
ある。しかし、捕捉用プローブとしての機能が阻害され
ないことが条件であることは言うまでもない。ターゲッ
ト遺伝子を検出する際、使用する捕捉用プローブは少な
くとも１種類使用し、必要に応じて、ターゲット遺伝子
に相補的な塩基配列を複数領域選択することにより複数
種類の捕捉用プローブを使用することが可能である。
【００６２】上記ターゲット遺伝子検出方法において、
形成されたプローブポリマーの測定は下記の方法等が挙
げられる。たとえば、得られたプローブポリマーに、エ
チジウムブロミド、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎ Ｉ等のインターカレーティング色素を結合させ
て増幅したポリマーを蛍光により検出することができ
る。
形成されたプローブポリマーの測定は下記の方法等が挙
げられる。たとえば、得られたプローブポリマーに、エ
チジウムブロミド、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎ Ｉ等のインターカレーティング色素を結合させ
て増幅したポリマーを蛍光により検出することができ
る。
【００６３】また、使用する一対の重合用プローブにあ
らかじめ検出のための標識物質として、125Ｉや32Ｐ等
のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウ
ム・エステル等の発光・発色物質、アビジンに結合した
蛍光・発光・発色物質等を利用するためのビオチン、も
しくは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する
ためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加さ
せておき、ターゲット遺伝子を検出することも可能であ
る。標識物質は特に限定されない。
らかじめ検出のための標識物質として、125Ｉや32Ｐ等
のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウ
ム・エステル等の発光・発色物質、アビジンに結合した
蛍光・発光・発色物質等を利用するためのビオチン、も
しくは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する
ためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加さ
せておき、ターゲット遺伝子を検出することも可能であ
る。標識物質は特に限定されない。
【００６４】上記一対のプローブとしては、ＤＮＡプロ
ーブ同士、ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブ、又はＲＮ
Ａプローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブ
とＤＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプロー
ブをあげることができる。
ーブ同士、ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブ、又はＲＮ
Ａプローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブ
とＤＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプロー
ブをあげることができる。
【００６５】また、一つのプローブの組成塩基はＤＮＡ
またはＲＮＡなどの一種類の塩基に限定されず、たとえ
ば、ＤＮＡとＰＮＡからなる、いわゆるキメラプローブ
であっても本発明は実施可能である。
またはＲＮＡなどの一種類の塩基に限定されず、たとえ
ば、ＤＮＡとＰＮＡからなる、いわゆるキメラプローブ
であっても本発明は実施可能である。
【００６６】上記した一対のプローブのお互いに相補的
な部分の塩基の種類は、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミ
ン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシ
ル）等から任意に選択することができ、特に限定される
ものではない。また、１本のプローブ内にある相補的な
部分同士の長さはそれぞれ等しくても、異なっていても
かまわない。上記した一対のプローブをハイブリダイゼ
ーションさせ、二本鎖のポリマーを形成させるために使
用するプローブの本数は、好ましくは１０2〜１０15本
の範囲で用いられる。
な部分の塩基の種類は、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミ
ン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシ
ル）等から任意に選択することができ、特に限定される
ものではない。また、１本のプローブ内にある相補的な
部分同士の長さはそれぞれ等しくても、異なっていても
かまわない。上記した一対のプローブをハイブリダイゼ
ーションさせ、二本鎖のポリマーを形成させるために使
用するプローブの本数は、好ましくは１０2〜１０15本
の範囲で用いられる。
【００６７】ターゲット遺伝子を検出する本発明の具体
的手法は、たとえば、まず最初に検体試料と少なくとも
１種類の捕捉用プローブを反応させ、ターゲット遺伝子
と捕捉用プローブを結合させる。この際、少なくとも一
種類のビオチン化捕捉用プローブを使用する。次いで、
一対の重合用プローブの一方を添加し反応させた後、も
う一方の重合用プローブを反応させてターゲット遺伝子
・プローブポリマー複合体を形成させる。次いで、アビ
ジン化磁性体粒子（磁性体ビーズ）を反応させ該複合体
と結合させ、ビーズの性質を利用して該複合体を未反応
物質から分離する。最後に、エチジウムブロミドを反応
させ、紫外線照射によりプローブポリマーの量を定量す
ることにより、検体試料中のターゲット遺伝子量を測定
する。形成させたプローブポリマーの分離を容易にする
ために、磁気ビーズを使用することもできる。
的手法は、たとえば、まず最初に検体試料と少なくとも
１種類の捕捉用プローブを反応させ、ターゲット遺伝子
と捕捉用プローブを結合させる。この際、少なくとも一
種類のビオチン化捕捉用プローブを使用する。次いで、
一対の重合用プローブの一方を添加し反応させた後、も
う一方の重合用プローブを反応させてターゲット遺伝子
・プローブポリマー複合体を形成させる。次いで、アビ
ジン化磁性体粒子（磁性体ビーズ）を反応させ該複合体
と結合させ、ビーズの性質を利用して該複合体を未反応
物質から分離する。最後に、エチジウムブロミドを反応
させ、紫外線照射によりプローブポリマーの量を定量す
ることにより、検体試料中のターゲット遺伝子量を測定
する。形成させたプローブポリマーの分離を容易にする
ために、磁気ビーズを使用することもできる。
【００６８】別の手法としては、たとえば、ターゲット
遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレ
オチドを固相化したウェルを使用することができる。ま
ず検体試料をウェルに添加し試料中のターゲット遺伝子
と、固相化したターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチドを結合させる。次い
で、上記の方法に準じて、重合用プローブを順次添加す
ることにより、プローブポリマーが形成され結合するこ
とになる。未反応物質との分離は、ウェルを洗浄するこ
とにより容易にでき、最後にプローブポリマー量を測定
することによりターゲット遺伝子を測定できる。
遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレ
オチドを固相化したウェルを使用することができる。ま
ず検体試料をウェルに添加し試料中のターゲット遺伝子
と、固相化したターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチドを結合させる。次い
で、上記の方法に準じて、重合用プローブを順次添加す
ることにより、プローブポリマーが形成され結合するこ
とになる。未反応物質との分離は、ウェルを洗浄するこ
とにより容易にでき、最後にプローブポリマー量を測定
することによりターゲット遺伝子を測定できる。
【００６９】この手法に準じれば、ＤＮＡチップへの応
用も可能である。
用も可能である。
【００７０】本発明におけるターゲット遺伝子（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあ
らゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より
適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されな
い。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織
液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カ
ビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げら
れる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で
増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。タ
ーゲット遺伝子が二本鎖ＤＮＡの場合は、公知の方法に
より一本鎖にすることにより使用することができる。
またはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあ
らゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より
適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されな
い。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織
液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カ
ビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げら
れる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で
増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。タ
ーゲット遺伝子が二本鎖ＤＮＡの場合は、公知の方法に
より一本鎖にすることにより使用することができる。
【００７１】本発明は、本発明の方法を利用するターゲ
ット遺伝子を検出するキットをも提供する。一例として
は、本キットは、少なくとも１種類のターゲット遺伝子
捕捉用プローブ（少なくとも１種類のビオチン化捕捉用
プローブを含む）、一対の重合用プローブ、アビジン化
磁性体粒子、エチジウムブロミドを必須の構成成分とす
るものである。ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を
含む重合用プローブを使用する際は、捕捉用プローブを
省略することができる。
ット遺伝子を検出するキットをも提供する。一例として
は、本キットは、少なくとも１種類のターゲット遺伝子
捕捉用プローブ（少なくとも１種類のビオチン化捕捉用
プローブを含む）、一対の重合用プローブ、アビジン化
磁性体粒子、エチジウムブロミドを必須の構成成分とす
るものである。ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を
含む重合用プローブを使用する際は、捕捉用プローブを
省略することができる。
【００７２】また、別の例としては、ターゲット遺伝子
の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド
を固相化した固相体（たとえばウェル）を必須の構成成
分とすることも可能である。その他に、プローブポリマ
ー検出用試薬、反応用緩衝液、希釈液、標準品、吸着防
止剤等が含まれることは自由であり、特に限定されな
い。
の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド
を固相化した固相体（たとえばウェル）を必須の構成成
分とすることも可能である。その他に、プローブポリマ
ー検出用試薬、反応用緩衝液、希釈液、標準品、吸着防
止剤等が含まれることは自由であり、特に限定されな
い。
【００７３】固相担体の材料の例は、ガラス、プラスチ
ック（たとえば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチ
レン、ポリプロピレン等）、金属等であり、担体の形
は、カップ型、平板型等、特に限定されない。
ック（たとえば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチ
レン、ポリプロピレン等）、金属等であり、担体の形
は、カップ型、平板型等、特に限定されない。
【００７４】（実施例） 以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明が
これらの実施例に限定されるものでないことは勿論であ
る。
これらの実施例に限定されるものでないことは勿論であ
る。
【００７５】１．実施例１と実施例２で使用したＤＮＡ
プローブ。
プローブ。
【００７６】２．実施例３と実施例４で使用した合成Ｈ
ＣＶ−ＲＮＡと各種ＤＮＡプローブ。Ｃ型肝炎ウイルス
の5′-noncoding領域を合成したＨＣＶ−ＲＮＡ（以
下、合成ＨＣＶ−ＲＮＡと略称する）。
ＣＶ−ＲＮＡと各種ＤＮＡプローブ。Ｃ型肝炎ウイルス
の5′-noncoding領域を合成したＨＣＶ−ＲＮＡ（以
下、合成ＨＣＶ−ＲＮＡと略称する）。
【００７７】（実施例１） １．目的 本発明の一対のＤＮＡプローブである重合用プローブを
用いて、ハイブリダイゼーションの温度による重合の効
果を証明した。
用いて、ハイブリダイゼーションの温度による重合の効
果を証明した。
【００７８】２．材料 １）重合にプローブ１、プローブ２を使用。 ２）緩衝液として２０×ＳＳＣ（３Ｍ−ＮａＣｌ，０．
３Ｍ−Ｃ6Ｈ5Ｏ7Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ，ｐＨ ７．０）を使
用。
３Ｍ−Ｃ6Ｈ5Ｏ7Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ，ｐＨ ７．０）を使
用。
【００７９】３．方法 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、１０13コピ
ー／μＬに調製したプローブ１とプローブ２をそれぞれ
５μＬずつ加え、４０μＬの２０×ＳＳＣを加えて蓋を
した後、９４℃で３０秒間煮沸し、５０℃，５２℃，５
４℃，５６℃，５８℃，６０℃，６２℃，６４℃，６６
℃，６８℃，７０℃，でそれぞれ３０分間加温した。
ー／μＬに調製したプローブ１とプローブ２をそれぞれ
５μＬずつ加え、４０μＬの２０×ＳＳＣを加えて蓋を
した後、９４℃で３０秒間煮沸し、５０℃，５２℃，５
４℃，５６℃，５８℃，６０℃，６２℃，６４℃，６６
℃，６８℃，７０℃，でそれぞれ３０分間加温した。
【００８０】加温後、０．５％のアガロースゲルを用い
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効
果を確認した。
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効
果を確認した。
【００８１】４．成績 図２７は、０．５％のアガロースゲルを用いて１００
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例１の成績を写真を
用いて示したものである。
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例１の成績を写真を
用いて示したものである。
【００８２】アガロースゲルは、ＤＮＡ分子をその大き
さによって分けることができるゲルで、一般的に０．５
％のアガロースゲルは、３０，０００〜４０，０００塩
基対のＤＮＡ分子の分離に用いられるものである。
さによって分けることができるゲルで、一般的に０．５
％のアガロースゲルは、３０，０００〜４０，０００塩
基対のＤＮＡ分子の分離に用いられるものである。
【００８３】図２７の写真には、一対のＤＮＡプローブ
がハイブリダイゼーションの温度に依存して互い違いに
正確に二本鎖の高分子を形成した結果として、温度の上
昇とともに０．５％のアガロースゲルではもはや泳動で
きないほどに大きくなった高分子が示されている。
がハイブリダイゼーションの温度に依存して互い違いに
正確に二本鎖の高分子を形成した結果として、温度の上
昇とともに０．５％のアガロースゲルではもはや泳動で
きないほどに大きくなった高分子が示されている。
【００８４】（実施例２） １．目的 本発明の一対のＤＮＡプローブである重合用プローブで
重合されたポリマーが制限酵素によって切断されること
を証明した。
重合されたポリマーが制限酵素によって切断されること
を証明した。
【００８５】２．材料 １）重合にプローブ３、プローブ４を使用。 ２）制限酵素として、Ｈａｅ ＩＩＩ（タカラ酒造社
製）を使用。 ３）制限酵素用緩衝液としてＭ−Ｂｕｆｆｅｒ（タカラ
酒造社製）を使用。 ４）緩衝液として２０×ＳＳＣを使用。
製）を使用。 ３）制限酵素用緩衝液としてＭ−Ｂｕｆｆｅｒ（タカラ
酒造社製）を使用。 ４）緩衝液として２０×ＳＳＣを使用。
【００８６】３．方法 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、１０13コピ
ー／μＬに調製したプローブ３とプローブ４をそれぞれ
５μＬずつ加え、５μＬの２０×ＳＳＣと３５μＬの滅
菌蒸留水を加えて蓋をした反応液を９４℃で３０秒間煮
沸し、６２℃でそれぞれ３０分間加温した。
ー／μＬに調製したプローブ３とプローブ４をそれぞれ
５μＬずつ加え、５μＬの２０×ＳＳＣと３５μＬの滅
菌蒸留水を加えて蓋をした反応液を９４℃で３０秒間煮
沸し、６２℃でそれぞれ３０分間加温した。
【００８７】加温後、４０μＬの反応液に５μＬのＭ−
Ｂｕｆｆｅｒと５μＬのＨａｅ ＩＩＩを加えて、３７
℃で２４時間反応させ、２％のアガロースゲルを用いて
電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合された
ポリマーの制限酵素による切断を確認した。
Ｂｕｆｆｅｒと５μＬのＨａｅ ＩＩＩを加えて、３７
℃で２４時間反応させ、２％のアガロースゲルを用いて
電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合された
ポリマーの制限酵素による切断を確認した。
【００８８】４．成績 図２８は、２．０％のアガロースゲルを用いて１００
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例２の成績を写真を
用いて示したものである。
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例２の成績を写真を
用いて示したものである。
【００８９】互い違いに正確に二本鎖のポリマーを形成
した一対のＤＮＡプローブが制限酵素によって最小単位
にまで切断されたことが示されている。
した一対のＤＮＡプローブが制限酵素によって最小単位
にまで切断されたことが示されている。
【００９０】（実施例３） １．材料 １）重合にプローブ５、プローブ６を使用。 ２）Ｂ／Ｆ分離用の固相に、ストレプトアビジンを結合
させた磁性体ビーズを使用。（商品名：Ｓｔｒｅｐｔａ
ｖｉｄｉｎ ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ／Ｐｒｏｍｅｇａ
社製）。 ３）緩衝液として２０×ＳＳＣと０．５×ＳＳＣ（２０
×ＳＳＣの４０倍希釈液）を使用。
させた磁性体ビーズを使用。（商品名：Ｓｔｒｅｐｔａ
ｖｉｄｉｎ ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ／Ｐｒｏｍｅｇａ
社製）。 ３）緩衝液として２０×ＳＳＣと０．５×ＳＳＣ（２０
×ＳＳＣの４０倍希釈液）を使用。
【００９１】２．方法 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、１０1コピ
ー／１０μＬ，１０2コピー／１０μＬ，１０3コピー／
１０μＬ，１０4コピー／１０μＬ，１０5コピー／１０
μＬ，１０6コピー／１０μＬ，１０7コピー／１０μ
Ｌ，１０8コピー／１０μＬ，１０9コピー／１０μＬ，
１０10コピー／１０μＬとなるように調製した合成ＨＣ
Ｖ−ＲＮＡをそれぞれ１０μＬずつ加え、次に１０13コ
ピー／μＬに調製したＨＣＶ−ＲＮＡ捕捉用プローブ
Ｂ、捕捉用プローブＣ、捕捉用プローブＤ、捕捉用プロ
ーブＥをそれぞれ１μＬ、１０13コピー／μＬに調製し
たプローブ５を１０μＬ、及び２０×ＳＳＣを２５μＬ
を加える。マイクロチューブの蓋を閉めてミキサーで混
和した後、６２℃で６０分間加温する。
ー／１０μＬ，１０2コピー／１０μＬ，１０3コピー／
１０μＬ，１０4コピー／１０μＬ，１０5コピー／１０
μＬ，１０6コピー／１０μＬ，１０7コピー／１０μ
Ｌ，１０8コピー／１０μＬ，１０9コピー／１０μＬ，
１０10コピー／１０μＬとなるように調製した合成ＨＣ
Ｖ−ＲＮＡをそれぞれ１０μＬずつ加え、次に１０13コ
ピー／μＬに調製したＨＣＶ−ＲＮＡ捕捉用プローブ
Ｂ、捕捉用プローブＣ、捕捉用プローブＤ、捕捉用プロ
ーブＥをそれぞれ１μＬ、１０13コピー／μＬに調製し
たプローブ５を１０μＬ、及び２０×ＳＳＣを２５μＬ
を加える。マイクロチューブの蓋を閉めてミキサーで混
和した後、６２℃で６０分間加温する。
【００９２】室温まで温度が下がったら、それぞれのマ
イクロチューブに１０13コピー／μＬに調製したプロー
ブ６を５μＬずつ加えて、マイクロチューブの蓋を閉め
てミキサーで混和した後、６２℃で６０分間加温する。
イクロチューブに１０13コピー／μＬに調製したプロー
ブ６を５μＬずつ加えて、マイクロチューブの蓋を閉め
てミキサーで混和した後、６２℃で６０分間加温する。
【００９３】室温まで温度が下がったら、それぞれのマ
イクロチューブに１０μＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ
ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（以下、磁性体ビーズ）を加
え、３７℃で３０分間反応する。反応後、磁石を用いて
磁性体ビーズをトラップし、上清を除去した後、０．５
×ＳＳＣを５０μＬと１００μｇ／ｍＬに調製したエチ
ジウムブロミド（和光純薬社製）を１０μＬ加えて、室
温で２０分間反応させる。
イクロチューブに１０μＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ
ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（以下、磁性体ビーズ）を加
え、３７℃で３０分間反応する。反応後、磁石を用いて
磁性体ビーズをトラップし、上清を除去した後、０．５
×ＳＳＣを５０μＬと１００μｇ／ｍＬに調製したエチ
ジウムブロミド（和光純薬社製）を１０μＬ加えて、室
温で２０分間反応させる。
【００９４】反応後、磁石を用いて磁性体ビーズをトラ
ップし、上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬ
加え、直ちに磁石を用いて磁性体ビーズをトラップし、
上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬ加えて、
全量を平底の９６ウェルプレートに移して下から紫外線
を照射し、エチジウムブロミドのインタカレーションに
よって蛍光を発するようになったプローブポリマーを写
真撮影する。
ップし、上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬ
加え、直ちに磁石を用いて磁性体ビーズをトラップし、
上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬ加えて、
全量を平底の９６ウェルプレートに移して下から紫外線
を照射し、エチジウムブロミドのインタカレーションに
よって蛍光を発するようになったプローブポリマーを写
真撮影する。
【００９５】３．成績 図２９は、９６ウェルプレートの下から紫外線を照射
し、エチジウムブロミドの蛍光を写真で撮影した状態を
示すものである。
し、エチジウムブロミドの蛍光を写真で撮影した状態を
示すものである。
【００９６】結果は図２９の写真に示したように、１０
10コピー／１０μＬで一番強い蛍光が認められ、合成Ｈ
ＣＶ−ＲＮＡの量に応じて、段階的に蛍光が弱くなって
いった。
10コピー／１０μＬで一番強い蛍光が認められ、合成Ｈ
ＣＶ−ＲＮＡの量に応じて、段階的に蛍光が弱くなって
いった。
【００９７】（実施例４） １．材料 １）重合にプローブ５、プローブ７を使用。 ２）Ｂ／Ｆ分離用の固相に、９６ウェルプレートを使
用。（商品名：ＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋTM／Ｎｕｎｃ社
製） ３）Peroxidase Conjugated Streptavidinとして、「Ｈ
ＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／ＺＹＭＥＤ ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．」を使用。 ４）発色試薬として、「ペルオキシダーゼ用発色キット
Ｔ／住友ベークライト社製」を使用。 ５）酵素反応停止液として、２Ｎ−Ｈ2ＳＯ4を使用。 ６）緩衝液として２０×ＳＳＣと０．５×ＳＳＣを使
用。
用。（商品名：ＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋTM／Ｎｕｎｃ社
製） ３）Peroxidase Conjugated Streptavidinとして、「Ｈ
ＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／ＺＹＭＥＤ ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．」を使用。 ４）発色試薬として、「ペルオキシダーゼ用発色キット
Ｔ／住友ベークライト社製」を使用。 ５）酵素反応停止液として、２Ｎ−Ｈ2ＳＯ4を使用。 ６）緩衝液として２０×ＳＳＣと０．５×ＳＳＣを使
用。
【００９８】２．方法 あらかじめＨＣＶ−ＲＮＡ捕捉用プローブＡが結合（た
だし、特別なブロッキング処理は施していない）してい
る９６ウェルプレート（ＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋTM／Ｎｕ
ｎｃ社製）の各ウェルに、０コピー／１０μＬ，１０3
コピー／１０μＬ，１０4コピー／１０μＬ，１０5コピ
ー／１０μＬ，１０6コピー／１０μＬ，１０7コピー／
１０μＬとなるように調製した合成ＨＣＶ−ＲＮＡをそ
れぞれ１０μＬずつ加え、次に１０11コピー／μＬに調
製した捕捉用プローブＣ、捕捉用プローブＤ、捕捉用プ
ローブＥをそれぞれ１０μＬ、１０11コピー／μＬに調
製したプローブ５を１０μＬ、及び２０×ＳＳＣを６０
μＬを加える。
だし、特別なブロッキング処理は施していない）してい
る９６ウェルプレート（ＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋTM／Ｎｕ
ｎｃ社製）の各ウェルに、０コピー／１０μＬ，１０3
コピー／１０μＬ，１０4コピー／１０μＬ，１０5コピ
ー／１０μＬ，１０6コピー／１０μＬ，１０7コピー／
１０μＬとなるように調製した合成ＨＣＶ−ＲＮＡをそ
れぞれ１０μＬずつ加え、次に１０11コピー／μＬに調
製した捕捉用プローブＣ、捕捉用プローブＤ、捕捉用プ
ローブＥをそれぞれ１０μＬ、１０11コピー／μＬに調
製したプローブ５を１０μＬ、及び２０×ＳＳＣを６０
μＬを加える。
【００９９】ピペットで混和した後、９４℃で３０秒間
加熱し、６２℃で６０分間加温する。
加熱し、６２℃で６０分間加温する。
【０１００】室温まで温度が下がったら、それぞれのマ
イクロチューブに１０11コピー／μＬに調製したプロー
ブ５を１０μＬ、プローブ７を２０μＬずつ加える。ピ
ペットで混和した後、９４℃で３０秒間加熱し、６２℃
で６０分間加温する。
イクロチューブに１０11コピー／μＬに調製したプロー
ブ５を１０μＬ、プローブ７を２０μＬずつ加える。ピ
ペットで混和した後、９４℃で３０秒間加熱し、６２℃
で６０分間加温する。
【０１０１】室温まで温度が下がったら、０．１％−Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含む０．５×ＳＳＣで４回洗浄し、各ウ
ェルに「ＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」を１００
μＬ加え、３７℃で２０分間加温する。各ウェルの液を
吸引除去した後、０．１％−Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．
５×ＳＳＣで４回洗浄する。
ｗｅｅｎ２０を含む０．５×ＳＳＣで４回洗浄し、各ウ
ェルに「ＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」を１００
μＬ加え、３７℃で２０分間加温する。各ウェルの液を
吸引除去した後、０．１％−Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．
５×ＳＳＣで４回洗浄する。
【０１０２】各ウェルに「ペルオキシダーゼ用発色キッ
トＴ」を１００μＬ加えて、暗所（室温）で１０分間反
応させる。反応後、酵素反応停止液を１００μＬ加え、
波長４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
トＴ」を１００μＬ加えて、暗所（室温）で１０分間反
応させる。反応後、酵素反応停止液を１００μＬ加え、
波長４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
【０１０３】３．成績 実施例４の成績を表１に示した。
【０１０４】互い違いにハイブリダイゼーションして二
本鎖のポリマーを形成した一対のＤＮＡプローブのう
ち、一方に標識されていた Peroxidase Conjugated Str
eptavidin が発色することによって、加えた１０3〜１
０7コピーまでの合成ＨＣＶ−ＲＮＡの量に応じて発色
が確認された。
本鎖のポリマーを形成した一対のＤＮＡプローブのう
ち、一方に標識されていた Peroxidase Conjugated Str
eptavidin が発色することによって、加えた１０3〜１
０7コピーまでの合成ＨＣＶ−ＲＮＡの量に応じて発色
が確認された。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】（実施例５） １．目的 本発明のお互いに相補的な部分が４ヵ所の数から構成さ
れるＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーション
の温度による重合の効果を証明した。
れるＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーション
の温度による重合の効果を証明した。
【０１０７】２．材料 重合には以下のプローブ８、プローブ９を使用した。 緩衝液として２０×ＳＳＣを使用した。
【０１０８】３．方法 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、１０13コピ
ー／μＬに調製したプローブ８とプローブ９をそれぞれ
５μＬずつ加え、４０μＬの２０×ＳＳＣを加えて蓋を
した後、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６
４℃、６６℃、７０℃、でそれぞれ３０分間加温した。
ー／μＬに調製したプローブ８とプローブ９をそれぞれ
５μＬずつ加え、４０μＬの２０×ＳＳＣを加えて蓋を
した後、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６
４℃、６６℃、７０℃、でそれぞれ３０分間加温した。
【０１０９】加温後、０．５％のアガロースゲルを用い
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効
果を確認した。
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効
果を確認した。
【０１１０】４．成績 図３０は、０．５％のアガロースゲルを用いて１００
Ｖ、３０分間の電気泳動による実施例５の成績を用いて
示したものである。それぞれの温度に依存して形成され
た二本鎖のポリマーを確認した。
Ｖ、３０分間の電気泳動による実施例５の成績を用いて
示したものである。それぞれの温度に依存して形成され
た二本鎖のポリマーを確認した。
【０１１１】（実施例６） １．目的 本発明のお互いに相補的な部分が５ヵ所の数から構成さ
れるＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーション
の温度による重合の効果を証明した。
れるＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーション
の温度による重合の効果を証明した。
【０１１２】２．材料 重合にはプローブ１０、プローブ１１を使用。 緩衝液として２０×ＳＳＣを使用。
【０１１３】３．方法 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、１０13コピ
ー／μＬに調製したプローブ１０とプローブ１１をそれ
ぞれ５μＬずつ加え、４０μＬの２０×ＳＳＣを加えて
蓋をした後、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２
℃、６４℃、６６℃、７０℃、でそれぞれ３０分間加温
した。加温後、０．５％のアガロースゲルを用いて電気
泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効果を確
認した。
ー／μＬに調製したプローブ１０とプローブ１１をそれ
ぞれ５μＬずつ加え、４０μＬの２０×ＳＳＣを加えて
蓋をした後、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２
℃、６４℃、６６℃、７０℃、でそれぞれ３０分間加温
した。加温後、０．５％のアガロースゲルを用いて電気
泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効果を確
認した。
【０１１４】４．成績 図３１は、０．５％のアガロースゲルを用いて１００
Ｖ、３０分間の電気泳動による実施例６の成績を用いて
示したものである。それぞれの温度に依存して形成され
た二本鎖の高分子を確認した。
Ｖ、３０分間の電気泳動による実施例６の成績を用いて
示したものである。それぞれの温度に依存して形成され
た二本鎖の高分子を確認した。
【０１１５】（合成例１） 図３２に示した塩基配列をもつオリゴヌクレオチド・プ
ローブを通常の方法で合成した。
ローブを通常の方法で合成した。
【０１１６】各領域の分岐点における塩基対は、上から
すべてがＧ−Ｃ結合、半分がＧ−Ｃ結合、そして、すべ
てがＡ−Ｔ結合となるように設計して合成し、各ＨＣＰ
は一対の相補的な２本のオリゴヌクレオチド・プローブ
からなっており、それぞれをＨＣＰ−１、ＨＣＰ−２、
ＨＣＰ−３と命名した。
すべてがＧ−Ｃ結合、半分がＧ−Ｃ結合、そして、すべ
てがＡ−Ｔ結合となるように設計して合成し、各ＨＣＰ
は一対の相補的な２本のオリゴヌクレオチド・プローブ
からなっており、それぞれをＨＣＰ−１、ＨＣＰ−２、
ＨＣＰ−３と命名した。
【０１１７】各プローブの濃度は、１００ｐｍｏｌ／μ
Ｌになるように滅菌超純水で溶解して、以下の実験に供
した。
Ｌになるように滅菌超純水で溶解して、以下の実験に供
した。
【０１１８】（実施例７） １．方法 ０．２ｍＬのチューブにそれぞれＨＣＰ−１（１００ｐ
ｍｏｌ／μＬ）のオリゴヌクレオチド対を１μＬ、ＨＣ
Ｐ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）のオリゴヌクレオチド
対を１μＬ、ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）のオ
リゴヌクレオチド対を１μＬを加え、各反応チューブに
２０×ＳＳＣを１２μＬ、ＤＷ2を６μＬ分注し、全量
を２０μＬとし、ボルテックスで混和後、スピンダウン
した。
ｍｏｌ／μＬ）のオリゴヌクレオチド対を１μＬ、ＨＣ
Ｐ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）のオリゴヌクレオチド
対を１μＬ、ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）のオ
リゴヌクレオチド対を１μＬを加え、各反応チューブに
２０×ＳＳＣを１２μＬ、ＤＷ2を６μＬ分注し、全量
を２０μＬとし、ボルテックスで混和後、スピンダウン
した。
【０１１９】この混和液を各ＨＣＰについて５本調製
し、それぞれ「９４℃１０秒、６２℃３０分」、「９４
℃１０秒、６４℃３０分」、「９４℃１０秒、６６℃３
０分」、「９４℃１０秒、６８℃３０分」、「９４℃１
０秒、７０℃３０分」の温度で反応させた。
し、それぞれ「９４℃１０秒、６２℃３０分」、「９４
℃１０秒、６４℃３０分」、「９４℃１０秒、６６℃３
０分」、「９４℃１０秒、６８℃３０分」、「９４℃１
０秒、７０℃３０分」の温度で反応させた。
【０１２０】この時、各加熱反応チューブは最終的に１
５℃まで下げ、電気泳動まで４℃でstockした。
５℃まで下げ、電気泳動まで４℃でstockした。
【０１２１】反応後の液１０μＬに染色液であるＢＰＢ
（ブロムチモールブルー）を２μＬ混和したサンプル
を、０．５％アガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／
タカラ社製）を用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動
を行った。
（ブロムチモールブルー）を２μＬ混和したサンプル
を、０．５％アガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／
タカラ社製）を用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動
を行った。
【０１２２】２．結果 ６２℃の反応温度において、ＨＣＰ−１ではすでにポリ
マーの形成が開始しているが、ＨＣＰ−２ではラダー状
の生成物が多く、ポリマーの形成が不十分である。ま
た、ＨＣＰ−３では６２℃の反応温度では、非特異的な
結合も含まれてレーン全体がラダー状になっている。
マーの形成が開始しているが、ＨＣＰ−２ではラダー状
の生成物が多く、ポリマーの形成が不十分である。ま
た、ＨＣＰ−３では６２℃の反応温度では、非特異的な
結合も含まれてレーン全体がラダー状になっている。
【０１２３】よって、図３３の写真に示したように、互
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）
の結合にしたＨＣＰ−１では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより低い反応温度で効率的に形成されることが確認
された。
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）
の結合にしたＨＣＰ−１では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより低い反応温度で効率的に形成されることが確認
された。
【０１２４】（実施例８） １．方法 ０．２ｍＬのチューブにそれぞれＨＣＰ−１（１００ｐ
ｍｏｌ／μＬ）のオリゴヌクレオチド対を１．５μＬ、
ＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）のオリゴヌクレオ
チド対を１．５μＬ、ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μ
Ｌ）のオリゴヌクレオチド対を１．５μＬを加え、各反
応チューブに２０×ＳＳＣを３６μＬ、ＤＷ2を２１μ
Ｌ分注し、全量を６０μＬとし、ボルテックスで混和
後、スピンダウンした。
ｍｏｌ／μＬ）のオリゴヌクレオチド対を１．５μＬ、
ＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）のオリゴヌクレオ
チド対を１．５μＬ、ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μ
Ｌ）のオリゴヌクレオチド対を１．５μＬを加え、各反
応チューブに２０×ＳＳＣを３６μＬ、ＤＷ2を２１μ
Ｌ分注し、全量を６０μＬとし、ボルテックスで混和
後、スピンダウンした。
【０１２５】この混和液を各ＨＣＰについて５本調製
し、それぞれ「９４℃１０秒、６４℃０時間（on ic
e）」、「９４℃１０秒、６４℃０．５時間」、「９４
℃１０秒、６４℃３時間」、「９４℃１０秒、６４℃１
６時間」、「９４℃１０秒、６４℃１６時間（vibratio
n）」の反応時間でポリマーを形成させた。
し、それぞれ「９４℃１０秒、６４℃０時間（on ic
e）」、「９４℃１０秒、６４℃０．５時間」、「９４
℃１０秒、６４℃３時間」、「９４℃１０秒、６４℃１
６時間」、「９４℃１０秒、６４℃１６時間（vibratio
n）」の反応時間でポリマーを形成させた。
【０１２６】この時、各加熱反応チューブは最終的に１
５℃まで下げ、電気泳動まで４℃でstockした。
５℃まで下げ、電気泳動まで４℃でstockした。
【０１２７】反応後の液１０μＬに染色液であるＢＰＢ
（ブロムチモールブルー）２μＬを混和したサンプル
を、０．５％アガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／
タカラ社製）を用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動
を行った。
（ブロムチモールブルー）２μＬを混和したサンプル
を、０．５％アガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／
タカラ社製）を用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動
を行った。
【０１２８】２．結果 ０．５時間の反応時間において、ＨＣＰ−１ではすでに
ポリマーの形成が開始しており、３時間反応でも未反応
プローブ（レーン下部のバンド）の量が少なく、大部分
がポリマー形成に消費されていることがわかる。一方、
ＨＣＰ−２ではラダー状の生成物が多く、０．５時間反
応ではポリマーの形成が不十分である。また、ＨＣＰ−
３では０．５時間反応では、ポリマーが全く形成されて
いない。
ポリマーの形成が開始しており、３時間反応でも未反応
プローブ（レーン下部のバンド）の量が少なく、大部分
がポリマー形成に消費されていることがわかる。一方、
ＨＣＰ−２ではラダー状の生成物が多く、０．５時間反
応ではポリマーの形成が不十分である。また、ＨＣＰ−
３では０．５時間反応では、ポリマーが全く形成されて
いない。
【０１２９】よって、図３４の写真に示したように、互
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）
の結合にしたＨＣＰ−１では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより短時間で効率的に形成されることが確認され
た。
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）
の結合にしたＨＣＰ−１では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより短時間で効率的に形成されることが確認され
た。
【０１３０】（実施例９） １．方法 ０．２ｍＬの反応チューブにそれぞれオリゴヌクレオチ
ド・プローブの濃度がそれぞれ「１０ｐｍｏｌ／μ
Ｌ」、「５．０ｐｍｏｌ／μＬ」、「２．５ｐｍｏｌ／
μＬ」となるように、ＨＣＰ−１，ＨＣＰ−２，ＨＣＰ
−３の各オリゴヌクレオチド対を２μＬずつ加え、２０
×ＳＳＣを１２μＬ、ＤＷ2を６μＬ分注し、全量を２
０μＬとした混和液をボルテックスで混和後、スピンダ
ウンした。
ド・プローブの濃度がそれぞれ「１０ｐｍｏｌ／μ
Ｌ」、「５．０ｐｍｏｌ／μＬ」、「２．５ｐｍｏｌ／
μＬ」となるように、ＨＣＰ−１，ＨＣＰ−２，ＨＣＰ
−３の各オリゴヌクレオチド対を２μＬずつ加え、２０
×ＳＳＣを１２μＬ、ＤＷ2を６μＬ分注し、全量を２
０μＬとした混和液をボルテックスで混和後、スピンダ
ウンした。
【０１３１】この混和液を「９４℃１０秒、６４℃３０
分」で反応させた。
分」で反応させた。
【０１３２】この時、各加熱反応チューブは最終的に１
５℃まで下げ、電気泳動まで４℃でstockした。
５℃まで下げ、電気泳動まで４℃でstockした。
【０１３３】反応後の液１０μＬに染色液であるＢＰＢ
（ブロムチモールブルー）２μＬを混和したサンプル
を、０．５％アガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／
タカラ社製）を用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動
を行った。
（ブロムチモールブルー）２μＬを混和したサンプル
を、０．５％アガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／
タカラ社製）を用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動
を行った。
【０１３４】２．結果 プローブ濃度が一番低い「２．５ｐｍｏｌ／μＬ」にお
いて、ＨＣＰ−１ではすでにポリマーが形成されている
が、ＨＣＰ−２ではラダー状の生成物があり、ポリマー
の形成が不十分である。また、ＨＣＰ−３では「２．５
ｐｍｏｌ／μＬ」のプローブ濃度ではポリマーが形成さ
れていない。
いて、ＨＣＰ−１ではすでにポリマーが形成されている
が、ＨＣＰ−２ではラダー状の生成物があり、ポリマー
の形成が不十分である。また、ＨＣＰ−３では「２．５
ｐｍｏｌ／μＬ」のプローブ濃度ではポリマーが形成さ
れていない。
【０１３５】よって、図３５の写真に示したように、互
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）
の結合にしたＨＣＰ−１では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより低いプローブ濃度で効率的に形成されることが
確認された。
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）
の結合にしたＨＣＰ−１では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより低いプローブ濃度で効率的に形成されることが
確認された。
【０１３６】（実施例１０） １．方法 ０．２ｍＬのチューブにプローブ濃度が「２．５ｐｍｏ
ｌ／μＬ」となるように、ＨＣＰ−１、ＨＣＰ−２、及
びＨＣＰ−３の各オリゴヌクレオチド対を１μＬ、２０
×ＳＳＣを１２μＬ、ＤＷ2を７μＬ分注し、全量を２
０μＬとした混和液を各ＨＣＰについて調製し、ボルテ
ックスで混和後、スピンダウンした。
ｌ／μＬ」となるように、ＨＣＰ−１、ＨＣＰ−２、及
びＨＣＰ−３の各オリゴヌクレオチド対を１μＬ、２０
×ＳＳＣを１２μＬ、ＤＷ2を７μＬ分注し、全量を２
０μＬとした混和液を各ＨＣＰについて調製し、ボルテ
ックスで混和後、スピンダウンした。
【０１３７】この混和液を「９４℃１０秒、６４℃１０
分」で反応させた。
分」で反応させた。
【０１３８】この時、各加熱反応チューブは最終的に１
５℃まで下げ、電気泳動まで４℃でstockした。
５℃まで下げ、電気泳動まで４℃でstockした。
【０１３９】反応後の液１０μＬに染色液であるＢＰＢ
（ブロムチモールブルー）２μＬを混和したサンプル
を、０．５％アガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／
タカラ社製）を用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動
を行った。
（ブロムチモールブルー）２μＬを混和したサンプル
を、０．５％アガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／
タカラ社製）を用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動
を行った。
【０１４０】２．結果 １０分間の短い反応時間においても、プローブ濃度が低
い「２．５ｐｍｏｌ／μＬ」において、ＨＣＰ−１では
すでにポリマーが形成されているが、ＨＣＰ−２ではラ
ダー状の生成物が多く、ポリマーの形成が不十分であ
る。また、ＨＣＰ−３ではレーン全体がラダー状にな
り、ポリマーが形成されていない。
い「２．５ｐｍｏｌ／μＬ」において、ＨＣＰ−１では
すでにポリマーが形成されているが、ＨＣＰ−２ではラ
ダー状の生成物が多く、ポリマーの形成が不十分であ
る。また、ＨＣＰ−３ではレーン全体がラダー状にな
り、ポリマーが形成されていない。
【０１４１】よって、図３６の写真に示したように、短
い反応時間においても互い違いに交差してハイブリダイ
ゼーションする時の分岐点における塩基配列をＧ（グア
ニン）とＣ（シトシン）の結合にしたＨＣＰ−１では、
安定した二本鎖のポリマーが低いプローブ濃度で効率的
に形成されることが確認された。
い反応時間においても互い違いに交差してハイブリダイ
ゼーションする時の分岐点における塩基配列をＧ（グア
ニン）とＣ（シトシン）の結合にしたＨＣＰ−１では、
安定した二本鎖のポリマーが低いプローブ濃度で効率的
に形成されることが確認された。
【０１４２】（実施例１１） １．方法 ０．２ｍＬの各チューブにＨＣＰ−１（１００ｐｍｏｌ
／μＬ）、ＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）、及び
ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）をそれぞれ１．５
μＬ加え、２０×ＳＳＣを３６μＬ、ＤＷ2を２１μ
Ｌ、を分注し、全量を６０μＬとし、ボルテックスで混
和後、スピンダウンした。
／μＬ）、ＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）、及び
ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）をそれぞれ１．５
μＬ加え、２０×ＳＳＣを３６μＬ、ＤＷ2を２１μ
Ｌ、を分注し、全量を６０μＬとし、ボルテックスで混
和後、スピンダウンした。
【０１４３】この混和液を各ＨＣＰについて９本調製
し、それぞれ３本ずつ「９４℃１０秒、６４℃０時間
（on ice）」、「９４℃１０秒、６４℃３時間」、「９
４℃１０秒、６４℃１６時間」の反応時間でポリマーを
形成させた。
し、それぞれ３本ずつ「９４℃１０秒、６４℃０時間
（on ice）」、「９４℃１０秒、６４℃３時間」、「９
４℃１０秒、６４℃１６時間」の反応時間でポリマーを
形成させた。
【０１４４】各反応は６４℃の反応後、１５℃まで下
げ、その後４℃でstockしておいた。
げ、その後４℃でstockしておいた。
【０１４５】反応後、対照にＤＷ2をおき、分光光度計
により紫外部吸収を測定した。
により紫外部吸収を測定した。
【０１４６】２．結果 ６４℃の反応時間を変化させると、反応時間が長くポリ
マー形成率が増えるに従って２６０ｎｍにおける紫外部
吸収の値が低くなった。これは、塩基の積み重ねが規則
的な高次構造をとることにより、ＤＮＡ、またはオリゴ
ヌクレオチドの２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強
度が減ずる「ハイポクロミズム」という淡色効果の発現
によるものである。そこで、より多くのポリマーが形成
される「９４℃１０秒、６４℃１６時間」の反応におい
て、ＨＣＰ−１を用いた場合の紫外部吸収が大きく減少
しているということは、すなわちＨＣＰ−１を用いるこ
とによってより規則正しい安定した高次構造のポリマー
が形成されたことが示され、同時に、紫外部吸収の変化
によって、ポリマーの状態を確認することができた。
マー形成率が増えるに従って２６０ｎｍにおける紫外部
吸収の値が低くなった。これは、塩基の積み重ねが規則
的な高次構造をとることにより、ＤＮＡ、またはオリゴ
ヌクレオチドの２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強
度が減ずる「ハイポクロミズム」という淡色効果の発現
によるものである。そこで、より多くのポリマーが形成
される「９４℃１０秒、６４℃１６時間」の反応におい
て、ＨＣＰ−１を用いた場合の紫外部吸収が大きく減少
しているということは、すなわちＨＣＰ−１を用いるこ
とによってより規則正しい安定した高次構造のポリマー
が形成されたことが示され、同時に、紫外部吸収の変化
によって、ポリマーの状態を確認することができた。
【０１４７】よって、図３７に示したように、ポリマー
の紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用してポリマ
ーの存在を検出する方法が示された。
の紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用してポリマ
ーの存在を検出する方法が示された。
【０１４８】（実施例１２） １．方法 （１）ポリマーの形成 ０．２ｍＬの各チューブにＨＣＰ−１（１００ｐｍｏｌ
／μＬ）、ＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）、及び
ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を２．５μＬ、２
０×ＳＳＣを６０μＬ、ＤＷ2を３５μＬ分注し、全量
を１００μＬとし、ボルテックスで混和後、スピンダウ
ンした。
／μＬ）、ＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）、及び
ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を２．５μＬ、２
０×ＳＳＣを６０μＬ、ＤＷ2を３５μＬ分注し、全量
を１００μＬとし、ボルテックスで混和後、スピンダウ
ンした。
【０１４９】この混和液を各ＨＣＰについて１８本調製
し、それぞれ３本ずつ「９４℃１０秒、６４℃０時間
（on ice）」、「９４℃１０秒、６４℃０．５時間」、
「９４℃１０秒、６４℃１時間」、「９４℃１０秒、６
４℃３時間」、「９４℃１０秒、６４℃５時間」、「９
４℃１０秒、６４℃１６時間」の反応時間でポリマーを
形成させた。
し、それぞれ３本ずつ「９４℃１０秒、６４℃０時間
（on ice）」、「９４℃１０秒、６４℃０．５時間」、
「９４℃１０秒、６４℃１時間」、「９４℃１０秒、６
４℃３時間」、「９４℃１０秒、６４℃５時間」、「９
４℃１０秒、６４℃１６時間」の反応時間でポリマーを
形成させた。
【０１５０】各反応は６４℃の反応後、１５℃まで下
げ、その後４℃でstockしておいた。
げ、その後４℃でstockしておいた。
【０１５１】（２）ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩによる染色 自ら蛍光を発し、塩基対平面の３．４Å間隔に挿入する
性質を有するＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｔａｋａｒａ）
１μＬをＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ， １ｍＭ，
ｐＨ８．０）１０ｍＬで溶解し１／１００００希釈液を
調製した。（１）においてポリマーを形成させた各チュ
ーブにＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（１／１００００希釈
液）を５μＬずつ添加し、ボルテックスで混和後、スピ
ンダウンした。
性質を有するＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｔａｋａｒａ）
１μＬをＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ， １ｍＭ，
ｐＨ８．０）１０ｍＬで溶解し１／１００００希釈液を
調製した。（１）においてポリマーを形成させた各チュ
ーブにＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（１／１００００希釈
液）を５μＬずつ添加し、ボルテックスで混和後、スピ
ンダウンした。
【０１５２】これを暗所で１．５時間静置し、蛍光物質
を反応させた。
を反応させた。
【０１５３】２．結果 図３８の表と図に示したように、６４℃の反応時間を変
化させると、反応時間が長く二本鎖の形成率が増えるに
従って蛍光強度が増加し、その現象はＨＣＰ−１におい
て最も短時間で現れた。これは、反応時間の早い段階に
おいて、より効率良くＨＣＰ−１の二本鎖が形成された
ことを示している〔図３８（ａ）（ｂ）（ｃ）〕。
化させると、反応時間が長く二本鎖の形成率が増えるに
従って蛍光強度が増加し、その現象はＨＣＰ−１におい
て最も短時間で現れた。これは、反応時間の早い段階に
おいて、より効率良くＨＣＰ−１の二本鎖が形成された
ことを示している〔図３８（ａ）（ｂ）（ｃ）〕。
【０１５４】よって、形成された二本鎖の塩基の積み重
ねの間に蛍光物質であるＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩをイン
ターカレートさせてポリマーの状態を確認することがで
きた。
ねの間に蛍光物質であるＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩをイン
ターカレートさせてポリマーの状態を確認することがで
きた。
【０１５５】（実施例１３） １．方法 （１）ポリマーの形成 ０．２ｍＬの各チューブにＨＣＰ−１（１００ｐｍｏｌ
／μＬ）、ＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）、及び
ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を１．５μＬ、２
０×ＳＳＣを３６μＬ、ＤＷ2を２１μＬを分注し、全
量を６０μＬとし、ボルテックスで混和後、スピンダウ
ンした。
／μＬ）、ＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）、及び
ＨＣＰ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を１．５μＬ、２
０×ＳＳＣを３６μＬ、ＤＷ2を２１μＬを分注し、全
量を６０μＬとし、ボルテックスで混和後、スピンダウ
ンした。
【０１５６】この混和液を各ＨＣＰについて１６本調製
し、それぞれ４本ずつ「９４℃１０秒、６４℃０時間
（on ice）」、「９４℃１０秒、６４℃０．５時間」、
「９４℃１０秒、６４℃３時間」、「９４℃１０秒、６
４℃１６時間」の反応時間でポリマーを形成させた。
し、それぞれ４本ずつ「９４℃１０秒、６４℃０時間
（on ice）」、「９４℃１０秒、６４℃０．５時間」、
「９４℃１０秒、６４℃３時間」、「９４℃１０秒、６
４℃１６時間」の反応時間でポリマーを形成させた。
【０１５７】このうちの１本は電気泳動用、３本は蛍光
リーダーの「ｎ＝３」用とした。各反応は６４℃の反応
後、１５℃まで下げ、その後４℃でstockしておいた。
リーダーの「ｎ＝３」用とした。各反応は６４℃の反応
後、１５℃まで下げ、その後４℃でstockしておいた。
【０１５８】（２）電気泳動による確認 反応後の液１０μＬに染色液であるＢＰＢ（ブロムチモ
ールブルー）２μＬを混和したサンプルを、０．５％ア
ガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／タカラ社製）を
用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動を行った。
ールブルー）２μＬを混和したサンプルを、０．５％ア
ガロースゲル（Ｎｕｓｉｖｅ−３：１／タカラ社製）を
用いて、１００ｖ、３５分間の電気泳動を行った。
【０１５９】（３）ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩによる染色 実施例１２で使用したＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｔａｋ
ａｒａ）１μＬを０．５ｍＬのＤＷ2で溶解し１／５０
０希釈液を調製した。上記（１）においてポリマーを形
成させた各チューブにＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（１／５
００希釈液）を５μＬずつ添加し、ボルテックスで混和
後、スピンダウンした。
ａｒａ）１μＬを０．５ｍＬのＤＷ2で溶解し１／５０
０希釈液を調製した。上記（１）においてポリマーを形
成させた各チューブにＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（１／５
００希釈液）を５μＬずつ添加し、ボルテックスで混和
後、スピンダウンした。
【０１６０】これを暗所で０．５〜１時間静置によって
蛍光物質を反応させた後、１．５ｍＬチューブに移し変
えて定法に従ってエタノール沈殿を行い、−２０℃で一
晩放置した。
蛍光物質を反応させた後、１．５ｍＬチューブに移し変
えて定法に従ってエタノール沈殿を行い、−２０℃で一
晩放置した。
【０１６１】一晩放置後、室温に戻し、１２，０００ｒ
ｐｍ×１５ｍｉｎ（室温）で遠心分離を行い、上清を除
去後、ペレットを風乾させ、６０μＬのＤＷ2で溶解
し、蛍光リーダーにて測定した。
ｐｍ×１５ｍｉｎ（室温）で遠心分離を行い、上清を除
去後、ペレットを風乾させ、６０μＬのＤＷ2で溶解
し、蛍光リーダーにて測定した。
【０１６２】２．結果 「ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ」は核酸の二重らせん構造の
塩基対にインターカレートする蛍光色素で、エタノール
沈殿を行えば、核酸と結合した色素を除去することがで
きる。
塩基対にインターカレートする蛍光色素で、エタノール
沈殿を行えば、核酸と結合した色素を除去することがで
きる。
【０１６３】図３８で示したデータはエタノール沈殿を
せず、そのまま蛍光リーダーで測定しているが、図３９
では蛍光物質をインターカレートさせた後、エタノール
沈殿によりポリマーを精製している。
せず、そのまま蛍光リーダーで測定しているが、図３９
では蛍光物質をインターカレートさせた後、エタノール
沈殿によりポリマーを精製している。
【０１６４】図３９に示したように、６４℃の反応時間
を変化させると、ＨＣＰ−１では反応時間が長くポリマ
ー形成率が増えるに従って蛍光強度が増加した。これ
は、ＨＣＰ−１のポリマーは規則正しい高次構造をとっ
ている為、エタノール沈殿でも蛍光物質が除去されにく
く、そのポリマーの形成率が増える程、より高次な構造
を形成する為に蛍光物質が更に除去されにくくなってい
ることが示された。
を変化させると、ＨＣＰ−１では反応時間が長くポリマ
ー形成率が増えるに従って蛍光強度が増加した。これ
は、ＨＣＰ−１のポリマーは規則正しい高次構造をとっ
ている為、エタノール沈殿でも蛍光物質が除去されにく
く、そのポリマーの形成率が増える程、より高次な構造
を形成する為に蛍光物質が更に除去されにくくなってい
ることが示された。
【０１６５】一方、ＨＣＰ−３では、蛍光強度は反応時
間に依存していなかった。これは、全てがダブルストラ
ンドを形成せずにシングルストランドの部分も残る不規
則なポリマーが形成された為、蛍光物質をインターカレ
ートした後にエタノール沈殿を行うと、蛍光物質が除去
されやすい不安定な状態になっていることを示してい
る。
間に依存していなかった。これは、全てがダブルストラ
ンドを形成せずにシングルストランドの部分も残る不規
則なポリマーが形成された為、蛍光物質をインターカレ
ートした後にエタノール沈殿を行うと、蛍光物質が除去
されやすい不安定な状態になっていることを示してい
る。
【０１６６】このように、蛍光物質をポリマーにインタ
ーカレートさせた後、エタノールで精製したポリマーを
蛍光リーダーで測定することによって、そのポリマーの
状態を確認できることが示された。
ーカレートさせた後、エタノールで精製したポリマーを
蛍光リーダーで測定することによって、そのポリマーの
状態を確認できることが示された。
【０１６７】（産業上の利用可能性） 以上述べたごとく、本発明によれば、各領域の分岐点に
おける塩基対間の結合力を強固とすることにより安定し
たプローブポリマーを作製することができるとともに、
核酸合成酵素や枝分かれしたＤＮＡを用いずに、効率よ
くターゲット遺伝子の検出を行うことができ、その上、
形成されるポリマーの塩基の積み重ねが規則的な高次構
造をとることから、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯
の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を
発現させてポリマーの状態を確認することが可能であ
り、さらには、ポリマーの塩基の積み重ねの間に安価な
蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化からポリマ
ーの状態を確認できるために、今までになく低コストで
しかも簡便に遺伝子を検出することができるという顕著
な効果を奏することができる。
おける塩基対間の結合力を強固とすることにより安定し
たプローブポリマーを作製することができるとともに、
核酸合成酵素や枝分かれしたＤＮＡを用いずに、効率よ
くターゲット遺伝子の検出を行うことができ、その上、
形成されるポリマーの塩基の積み重ねが規則的な高次構
造をとることから、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯
の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を
発現させてポリマーの状態を確認することが可能であ
り、さらには、ポリマーの塩基の積み重ねの間に安価な
蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化からポリマ
ーの状態を確認できるために、今までになく低コストで
しかも簡便に遺伝子を検出することができるという顕著
な効果を奏することができる。
【０１６８】
［図面の簡単な説明］
【図１】一対（２本）のＤＮＡプローブの一例を示す模
式図である。
式図である。
【図２】一対のＤＮＡプローブの結合態様の一例を示す
模式図である。
模式図である。
【図３】一対のＤＮＡプローブが互い違いにハイブリダ
イゼーションした場合にできるポリマーの形成を示した
模式図である。
イゼーションした場合にできるポリマーの形成を示した
模式図である。
【図４】図３の模式図の立体的な概念構造の一例を示す
模式図である。
模式図である。
【図５】図３の結合パターンを変えた模式図である。
【図６】図５の模式図の立体的な概念構造の一例を示す
模式図である。
模式図である。
【図７】ｎ＝４の場合の一対（２本）のＤＮＡプローブ
の一例を示す模式図である。
の一例を示す模式図である。
【図８】図７に示した一対のＤＮＡプローブの結合態様
の一例を示す模式図である。
の一例を示す模式図である。
【図９】ｎ＝４の場合の一対のＤＮＡプローブが互い違
いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマー
の形成の一例を示す模式図である。
いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマー
の形成の一例を示す模式図である。
【図１０】ｎ＝５の場合の一対（２本）のＤＮＡプロー
ブの一例を示す模式図である。
ブの一例を示す模式図である。
【図１１】図１０に示した一対のＤＮＡプローブの結合
態様の一例を示す模式図である。
態様の一例を示す模式図である。
【図１２】ｎ＝５の場合の一対のＤＮＡプローブが互い
違いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマ
ーの形成の一例を示す模式図である。
違いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマ
ーの形成の一例を示す模式図である。
【図１３】ｎ＝６の場合の一対のＤＮＡプローブの結合
態様の一例を示す模式図である。
態様の一例を示す模式図である。
【図１４】相補部位がｎカ所の場合の一対のＤＮＡプロ
ーブの結合態様の一例を示す模式図である。
ーブの結合態様の一例を示す模式図である。
【図１５】２本鎖のオリゴヌクレオチドの塩基対間の水
素結合の状態を示す図である。
素結合の状態を示す図である。
【図１６】Hatim T.Allawiら（Biochemistry 36, 10581
-10594. 1997.）のNearest-Neighbor Thermodynamic Pa
rametersを示す図表である。
-10594. 1997.）のNearest-Neighbor Thermodynamic Pa
rametersを示す図表である。
【図１７】スタッキング効果によるポリマーの形成の安
定化の原理を示す模式図である。
定化の原理を示す模式図である。
【図１８】スタッキング効果によるハイブリダイゼーシ
ョンの安定化の原理を示す模式図である。
ョンの安定化の原理を示す模式図である。
【図１９】スタッキング効果を利用したＨＣＰの合成
（１塩基以上を置換した場合）を示す模式図である。
（１塩基以上を置換した場合）を示す模式図である。
【図２０】一本のプローブの中でお互いに相補的になる
部分の長さが異なる一対（２本）のＤＮＡプローブの一
例を示す模式図である。
部分の長さが異なる一対（２本）のＤＮＡプローブの一
例を示す模式図である。
【図２１】図２０に示した一対のＤＮＡプローブが互い
違いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマ
ーの形成を示した模式図である。
違いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマ
ーの形成を示した模式図である。
【図２２】制限酵素による切断部位を挿入した一対（２
本）のＤＮＡプローブの一例を示す模式図である。
本）のＤＮＡプローブの一例を示す模式図である。
【図２３】立体的にプローブどうしが互い違いに結合し
ポリマーになった後、制限酵素を用いて切断した場合の
一例を示す模式図である。
ポリマーになった後、制限酵素を用いて切断した場合の
一例を示す模式図である。
【図２４】本発明の一対のＤＮＡプローブを用いてター
ゲット遺伝子を直接検出する方法を示した模式図で、ま
ずターゲット遺伝子に対して、ターゲット遺伝子と本発
明の一対のＤＮＡプローブ（図中の重合用プローブ）に
相補的な領域を持つプローブをハイブリダイゼーション
させ、その後、本発明の一対のＤＮＡプローブ（図中の
重合用プローブ１と重合用プローブ２）を加えることに
より、本発明の一対のＤＮＡプローブは、ターゲット遺
伝子にハイブリダイゼーションした状態で二本鎖のポリ
マーを形成するため、容易にターゲット遺伝子を検出す
ることができることを示した図面である。
ゲット遺伝子を直接検出する方法を示した模式図で、ま
ずターゲット遺伝子に対して、ターゲット遺伝子と本発
明の一対のＤＮＡプローブ（図中の重合用プローブ）に
相補的な領域を持つプローブをハイブリダイゼーション
させ、その後、本発明の一対のＤＮＡプローブ（図中の
重合用プローブ１と重合用プローブ２）を加えることに
より、本発明の一対のＤＮＡプローブは、ターゲット遺
伝子にハイブリダイゼーションした状態で二本鎖のポリ
マーを形成するため、容易にターゲット遺伝子を検出す
ることができることを示した図面である。
【図２５】一対のｎ＝４のプローブのうち、一方のプロ
ーブの一部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺
伝子となるように構成したＤＮＡプローブ（図中の重合
用プローブ１）とそのＤＮＡプローブに対して対をなす
ＤＮＡプローブ（図中の重合用プローブ２）を用いて、
ターゲット遺伝子と一対のプローブの複数対をハイブリ
ダイゼーションさせ、二本鎖のポリマーを形成させ、タ
ーゲット遺伝子を検出する方法を示す模式図である。
ーブの一部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺
伝子となるように構成したＤＮＡプローブ（図中の重合
用プローブ１）とそのＤＮＡプローブに対して対をなす
ＤＮＡプローブ（図中の重合用プローブ２）を用いて、
ターゲット遺伝子と一対のプローブの複数対をハイブリ
ダイゼーションさせ、二本鎖のポリマーを形成させ、タ
ーゲット遺伝子を検出する方法を示す模式図である。
【図２６】一対のプローブのうち、一方のプローブの一
部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子とな
るように構成したＤＮＡプローブ（図中の重合用プロー
ブ１）とそのＤＮＡプローブに対して対をなすＤＮＡプ
ローブ（図中の重合用プローブ２）を用いて、ターゲッ
ト遺伝子と一対のプローブの複数対をハイブリダイゼー
ションさせ、二本鎖のポリマーを形成させ、ターゲット
遺伝子を検出する方法を示す模式図である。
部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子とな
るように構成したＤＮＡプローブ（図中の重合用プロー
ブ１）とそのＤＮＡプローブに対して対をなすＤＮＡプ
ローブ（図中の重合用プローブ２）を用いて、ターゲッ
ト遺伝子と一対のプローブの複数対をハイブリダイゼー
ションさせ、二本鎖のポリマーを形成させ、ターゲット
遺伝子を検出する方法を示す模式図である。
【図２７】実施例１の成績を示す写真である。
【図２８】実施例２の成績を示す写真である。
【図２９】実施例３の成績を示す写真である。
【図３０】実施例５の成績を示す写真である。
【図３１】実施例６の成績を示す写真である。
【図３２】スタッキング効果を利用したＨＣＰの合成を
示す図である。
示す図である。
【図３３】スタッキング効果を利用したＨＣＰによるポ
リマーの形成において、反応温度によるポリマー形成の
影響を示す図である。
リマーの形成において、反応温度によるポリマー形成の
影響を示す図である。
【図３４】スタッキング効果を利用したＨＣＰによるポ
リマーの形成において、反応時間によるポリマー形成の
影響を示す図である。
リマーの形成において、反応時間によるポリマー形成の
影響を示す図である。
【図３５】スタッキング効果を利用したＨＣＰによるポ
リマーの形成において、ＨＣＰの濃度によるポリマーの
形成の影響を示す図である。
リマーの形成において、ＨＣＰの濃度によるポリマーの
形成の影響を示す図である。
【図３６】スタッキング効果を利用したＨＣＰによるポ
リマーの形成において、短い反応時間におけるＨＣＰの
濃度によるポリマーの形成の影響を示す図である。
リマーの形成において、短い反応時間におけるＨＣＰの
濃度によるポリマーの形成の影響を示す図である。
【図３７】紫外線のポリマーに対する光化学的変化を示
す図である。
す図である。
【図３８】蛍光物質のポリマーに対する光化学的変化に
おいて、蛍光物質をインターカレートさせた状態でポリ
マーを検出した場合を示す図である。
おいて、蛍光物質をインターカレートさせた状態でポリ
マーを検出した場合を示す図である。
【図３９】蛍光物質のポリマーに対する光化学的変化に
おいて、蛍光物質をインターカレートさせた後、ＥｔＯ
Ｈでポリマーを精製して検出した場合を示す図である。
おいて、蛍光物質をインターカレートさせた後、ＥｔＯ
Ｈでポリマーを精製して検出した場合を示す図である。
【図４０】スタッキング効果を利用したＨＣＰの合成
（１塩基を置換した場合）を示す模式図である。
（１塩基を置換した場合）を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (22)
- 【請求項１】 下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特性を具備し
た、一対の第１プローブ及び第２プローブを有するプロ
ーブポリマー作製用プローブ。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 - 【請求項２】 前記一対の第１プローブ及び第２プロー
ブの各々の相補的塩基配列領域数ｎが、３、４、５、又
は６である、請求の範囲第１項記載のプローブ。 - 【請求項３】 前記一対の第１プローブ及び第２プロー
ブの相補的塩基配列領域の塩基数は、それぞれ少なくと
も８個からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のプ
ローブ。 - 【請求項４】 前記一対の第１プローブ及び第２プロー
ブが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡのいずれかから選ば
れる塩基から構成される、請求の範囲第１項又は第２項
記載の一対のプローブ。 - 【請求項５】 下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特性を有する
複数の一対の第１プローブ及び第２プローブを重合させ
てプローブポリマーを作製する方法。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 - 【請求項６】 前記一対の第１プローブ及び第２プロー
ブの各々の相補的塩基配列領域数ｎが、３、４、５、又
は６である、請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】 前記一対の第１プローブ及び第２プロー
ブの相補的塩基配列領域の塩基数は、それぞれ少なくと
も８個からなる、請求の範囲第５項又は第６項記載の方
法。 - 【請求項８】 前記一対の第１プローブ及び第２プロー
ブが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡのいずれかから選ば
れる塩基から構成される、請求の範囲第５項又は第６項
記載の方法。 - 【請求項９】 下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特性を有する
複数の一対の第１プローブ及び第２プローブを重合させ
ることにより得られるプローブポリマー。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 - 【請求項１０】 前記一対の第１プローブ及び第２プロ
ーブの各々の相補的塩基配列領域数ｎが、３、４、５、
又は６である、請求の範囲第９項記載のプローブポリマ
ー。 - 【請求項１１】 前記一対の第１プローブ及び第２プロ
ーブの相補的塩基配列領域の塩基数は、それぞれ少なく
とも８個からなる、請求の範囲第９項又は第１０項記載
のプローブポリマー。 - 【請求項１２】 前記一対の第１プローブ及び第２プロ
ーブが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡのいずれかから選
ばれる塩基から構成される、請求の範囲第９項又は第１
０項記載のプローブポリマー。 - 【請求項１３】 下記（１）（２）（３）の工程からな
る、重合用プローブを用いる、試料中のターゲット遺伝
子の測定方法。 （１）重合用プローブとして下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の
特性を有する一対の第１プローブ及び第２プローブを用
い、両プローブのうち、相補的塩基配列領域の一つがタ
ーゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域を
保有する、いずれか一方のプローブと試料とを反応させ
該プローブと該試料中のターゲット遺伝子と結合させ
る。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 （２）次いで、上記複数の重合用プローブを反応させ、
ターゲット遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させ
る。 （３）使用した重合用プローブのうちから未反応プロー
ブを洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量
を測定する。 - 【請求項１４】 下記（１）（２）（３）の工程からな
る、重合用プローブを用いる、試料中のターゲット遺伝
子の測定方法。 （１）重合用プローブとして下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の
特性を有する一対の第１プローブ及び第２プローブを用
い、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域と、重合用プローブのいずれか一つの領域と相補的
塩基配列を有する領域との二つの領域から構成される、
少なくとも１つのターゲット遺伝子捕捉用プローブを試
料と反応させ、ターゲット遺伝子と結合させる。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 （２）次いで、上記重合用プローブを反応させ、上記捕
捉用プローブと該重合用プローブを結合させ、ターゲッ
ト遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させる。 （３）使用した重合プローブのうちから未反応プローブ
を洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量を
測定する。 - 【請求項１５】 前記プローブポリマーに蛍光物質を結
合させ、発光により蛍光量を測定することにより該プロ
ーブポリマーの量を測定する、請求の範囲第１３項又は
第１４項記載のターゲット遺伝子の測定方法。 - 【請求項１６】 前記プローブポリマーの量を、紫外線
に対する光学的な吸収の変化を利用して測定する、請求
の範囲第１３項又は第１４項記載のターゲット遺伝子の
測定方法。 - 【請求項１７】 前記重合用プローブの各々の相補的塩
基配列領域数ｎが、３、４、５、又は６である、請求の
範囲第１３項又は第１４項記載のターゲット遺伝子の測
定方法。 - 【請求項１８】 重合用プローブとして下記（ａ）
（ｂ）（ｃ）（ｄ）の特性を有する一対の第１プローブ
及び第２プローブを必須の構成成分とする、試料中のタ
ーゲット遺伝子の検出試薬。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 （ｄ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブのう
ち、いずれか一方のプローブの相補的塩基配列領域の一
つがターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域を保有している。 - 【請求項１９】 重合用プローブとして下記（ａ）
（ｂ）（ｃ）の特性を有する一対の第１プローブ及び第
２プローブを用い、少なくとも二つの領域から構成さ
れ、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域と、上記重合用プローブのいずれか一つの領域と相
補的塩基配列を有する領域とから構成される、少なくと
も１つのターゲット遺伝子捕捉用プローブと、上記複数
の重合用プローブを必須の構成成分とする、試料中のタ
ーゲット遺伝子の検出試薬。 （ａ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をｎ個所（ｎ≧
３）有する形で構成され、第１プローブの５′端部から
順に設けられた、Ｘ1領域、Ｘ2領域、Ｘ3領域、・・Ｘn
領域は、第２プローブの５′端部から順に設けられた、
Ｘ′1領域、Ｘ′2領域、Ｘ′3領域、・・Ｘ′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 （ｂ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブは、両
者を反応させた場合、Ｘ1領域はＸ′1領域とだけハイブ
リダイズし、Ｘ2領域はＸ′2領域とだけハイブリダイズ
し、Ｘ3領域はＸ′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Ｘn領域はＸ′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第１プローブ及び第２プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 （ｃ）上記一対の第１プローブ及び第２プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グア
ニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記一対の第
１プローブ及び第２プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 - 【請求項２０】 前記一対の第１プローブ及び第２プロ
ーブの各々の相補領域数ｎが３、４、５、又は６であ
る、請求の範囲第１８項又は第１９項記載のターゲット
遺伝子の検出試薬。 - 【請求項２１】 前記一対の第１プローブ及び第２プロ
ーブの相補的塩基配列領域の塩基数は、それぞれ少なく
とも８個からなる、請求の範囲第１８項又は第１９項記
載のターゲット遺伝子の検出試薬。 - 【請求項２２】 前記一対の第１プローブ及び第２プロ
ーブが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡのいずれかから選
ばれる塩基から構成される、請求の範囲第１８項又は第
１９項記載のターゲット遺伝子の検出試薬。
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