JP3310662B2 - プローブポリマー作製用プローブ、プローブポリマーの作製方法及びその利用 - Google Patents
プローブポリマー作製用プローブ、プローブポリマーの作製方法及びその利用Info
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Description
3)有する一対のプローブポリマー作製用プローブ、そ
のプローブを使用するプローブポリマーの作製方法、及
び該方法を利用するターゲット遺伝子の検出方法に関す
る。
伝子および病原遺伝子の探索、遺伝的疾患、癌疾患、感
染症の診断等に非常に有用な手段である。ターゲット遺
伝子の増幅・解析法として、ポリメラーゼ連鎖反応方法
(PCR法)が汎用されている(USP 4683195, 468320
2)。別の手段として、逆転写PCR法(RT−PCR
法、Trends in Biotechnology,10,146-152,1992)、リ
ガーゼ連鎖反応(LCR,ligase chain reaction、EP
320308)法などがある。これら手法は、二本鎖DNAの
一本鎖への解離、プライマーからの相補鎖の合成などの
ステップを含むため高温と低温の反応を何回も繰り返す
必要がある。そのために、厳密な温度制御装置を必要と
し、温度設定に時間を要することにより時間のロスが生
じていた。さらに高価な酵素を必要とする。
等温条件でのDNA増幅法が開発された。例えば、鎖置
換型増幅法(SDA,strand displacement amplificat
ion、Nucleic Acid Res., 20, 1691-1696, 1992)、核
酸配列増幅法(NASBA,nucleic acid sequence ba
sed amplification, Nature, 350, 91-92, 1991)、Q
βレプリカーゼ法(BioTechnology,6, 1197-1202, 198
8)などがある。これらの手法は、等温で実施できると
いう利点を有するが、DNAポリメラーゼ、制限エンド
ヌクレアーゼ等の高価な酵素を必要としている。
や操作の点でいくつか問題を有するが、酵素を使用しな
い低コストで簡便な手法による核酸増幅法、核酸検出法
の確立が望まれている。
の増幅は、枝分かれした高分子の一本鎖DNAプローブ
をあらかじめ合成しておき、ターゲット遺伝子にハイブ
リダイゼーションさせることにより、ターゲット遺伝子
を検出する方法であるが、枝分かれした高分子の一本鎖
DNAプローブをターゲット遺伝子にハイブリダイゼー
ションさせるためには、分岐DNAプローブが高分子で
あるため時間がかかり、また、枝分かれした高分子の分
岐DNAプローブの大きさに限界があるため、ターゲッ
ト遺伝子の検出には限界があった。
使用しない新規な等温核酸増幅法(プローブポリマーの
作製方法)を既に提案した(EP 1002877A)。この方法
は、3個所の領域から構成される一対のプローブ(Hone
yComb Probe、以下HCPと称する)を用いる方法であ
り、第1プローブと第2プローブの各々の3個所の領域
はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた
場合、領域の1個所のみとハイブリダイズする様に各領
域の塩基配列を工夫したものである。この工夫により、
複数の一対のプローブを反応させた場合、お互いにハイ
ブリダイズしプローブのポリマーを形成させることがで
きる(Probe alternation link self-assembly reactio
n、以下、PALSAR法と称する)。
を利用することによって、検体試料中のターゲット遺伝
子の検出が可能となり、酵素を使用せず等温操作という
画期的、簡潔かつ安価な手法が実現される。
法についてさらに検討を加え、プローブポリマーをさら
に安定なポリマーとする事により、該手法の更なる改良
を試みたものである。
らは鋭意研究の結果、お互いに相補的塩基配列領域を3
カ所以上の数から構成される一対(2つ一組)のプロー
ブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブ
リダイゼーションさせることにより、二本鎖のプローブ
ポリマーが等温で容易に形成される知見に加え、PAL
SAR法で使用する一対のプローブにおいて、互い違い
に交差してハイブリダイゼーションする時のそれぞれの
領域における分岐点(両端)の塩基配列をG(グアニ
ン)とC(シトシン)の結合にすることにより、各領域
の分岐点における塩基対間の結合力がA(アデニン)と
T(チミン)に比べて強固になるため、この領域全体の
塩基のπ電子による特殊な相互作用が今まで以上に強く
なることを見出し本発明を完成するに至った。
間の結合力をより強固とすることによって、より安定し
たプローブポリマーを作製することができるとともに、
核酸合成酵素や枝分かれしたDNAを用いずに、等温で
効率よくプローブを重合させプローブポリマーを形成さ
せることができ、その上、形成されるポリマーの塩基の
積み重ねが規則的な高次構造をとることから、260n
mにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロ
ミズム」という淡色効果を発現させてポリマーの状態を
確認することが可能であり、さらには、ポリマーの塩基
の積み重ねの間に安価な蛍光物質を挿入させて、その蛍
光強度の変化からポリマーの状態を確認できるために、
今までになく低コストでしかも簡便に遺伝子を検出する
ことができる、プローブポリマー作製用プローブ、その
プローブを用いるプローブポリマーの作製方法、その方
法によって作製されたプローブポリマー、そのプローブ
ポリマーを用いるターゲット遺伝子の測定方法、及びタ
ーゲット遺伝子の検出試薬を提供することを目的とす
る。
ブは、下記(a)(b)(c)の特性を具備した、一対
の第1プローブ及び第2プローブを有するものである。 (a)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をn個所(n≧
3)有する形で構成され、第1プローブの5′端部から
順に設けられた、X1領域、X2領域、X3領域、・・Xn
領域は、第2プローブの5′端部から順に設けられた、
X′1領域、X′2領域、X′3領域、・・X′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 (b)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、両
者を反応させた場合、X1領域はX′1領域とだけハイブ
リダイズし、X2領域はX′2領域とだけハイブリダイズ
し、X3領域はX′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Xn領域はX′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第1プローブ及び第2プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 (c)上記一対の第1プローブ及び第2プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも1つのG(グア
ニン)またはC(シトシン)を配置させ、上記一対の第
1プローブ及び第2プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも1つのC−G結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。
上記(a)(b)(c)の特性を有する複数の一対の第
1プローブ及び第2プローブを重合させてプローブポリ
マーを作製するものである。
ブの相補領域の分岐点(両端)の塩基配列をG(グアニ
ン)またはC(シトシン)を配置させ、ハイブリダイズ
した際にC−G結合を形成させることにより、塩基の積
み重ね(stacking of base)により塩基のπ電子の特殊
な相互作用を生じさせ、安定した二本鎖のポリマーを形
成させることも含む。
(b)(c)の特性を有する複数の一対の第1プローブ
及び第2プローブを重合させることにより得られるもの
である。
製法を利用して、試料中に含まれる微量のターゲット遺
伝子の測定方法を包含するものである。
1の様態は、下記(1)(2)(3)の工程からなるも
のである。 (1)重合用プローブとして前記(a)(b)(c)の
特性を有する一対の第1プローブ及び第2プローブを用
い、両プローブのうち、相補的塩基配列領域の一つがタ
ーゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域を
保有する、いずれか一方のプローブと試料とを反応させ
該プローブと該試料中のターゲット遺伝子と結合させ
る。 (2)次いで、上記複数の重合用プローブを反応させ、
ターゲット遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させ
る。 (3)使用した重合用プローブのうちから未反応プロー
ブを洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量
を測定する。
2の様態は、下記(1)(2)(3)の工程からなるも
のである。 (1)重合用プローブとして前記(a)(b)(c)の
特性を有する一対の第1プローブ及び第2プローブを用
い、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域と、重合用プローブのいずれか一つの領域と相補的
塩基配列を有する領域との二つの領域から構成される、
少なくとも1つのターゲット遺伝子捕捉用プローブを試
料と反応させ、ターゲット遺伝子と結合させる。 (2)次いで、上記重合用プローブを反応させ、上記捕
捉用プローブと該重合用プローブを結合させ、ターゲッ
ト遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させる。 (3)使用した重合プローブのうちから未反応プローブ
を洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量を
測定する。
いては、前記プローブポリマーに蛍光物質を結合させ、
発光により蛍光量を測定することにより、又は紫外線に
対する光学的な吸収の変化を利用して該プローブポリマ
ーの量を測定するのが好適である。
1の様態は、重合用プローブとして前記(a)(b)
(c)に加えて下記(d)の特性を有する一対の第1プ
ローブ及び第2プローブを必須の構成成分とする。 (d)上記一対の第1プローブ及び第2プローブのう
ち、いずれか一方のプローブの相補的塩基配列領域の一
つがターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域を保有している。
2の様態は、重合用プローブとして前記(a)(b)
(c)の特性を有する一対の第1プローブ及び第2プロ
ーブを用い、少なくとも二つの領域から構成され、ター
ゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域と、
上記重合用プローブのいずれか一つの領域と相補的塩基
配列を有する領域とから構成される、少なくとも1つの
ターゲット遺伝子捕捉用プローブと、上記複数の重合用
プローブを必須の構成成分とするものである。
の各々の相補的塩基配列領域数nは、3、4、5、又は
6が好ましい。該相補的塩基配列領域の塩基数は、それ
ぞれ少なくとも8個からなるのが好適である。該第1及
び第2プローブは、DNA、RNA又はPNAのいずれ
かから選ばれる塩基から構成される。
完全に相補である塩基配列であることを意味するが、ス
トリンゼントな条件でハイブリダイズする塩基配列であ
って、プローブポリマーを形成する能力を有する塩基配
列をも意味する。
対1でハイブリダイゼーションする時に必ず3ヵ所以上
の相補的な塩基配列領域の中で、1ヵ所の領域同士のみ
が特異的にハイブリダイゼーションするように構成され
る。
するDNAプローブの一例を示す模式図である。同図に
おいて、No.1のDNAプローブは、X1領域、X2領
域及びX3領域を有し、No.2のDNAプローブは、
X′1領域、X′2領域及びX′3領域を有している。こ
のNo.1のDNAプローブとNo.2のDNAプロー
ブは、両者をハイブリダイゼーションさせたとき、X1
領域はX′1領域とだけ結合し、X2領域はX′2領域と
だけ結合し、X3領域はX′3領域とだけ結合するような
構成とされている(図2)。
3カ所の数から構成される一対のDNAプローブ同士を
用いた場合、互い違いに交差するようにハイブリダイゼ
ーションさせた場合は、図2に示したように、X1領域
はX′1領域とだけ結合し、X2領域はX′2領域とだけ
結合し、X3領域はX′3領域とだけ結合し、3つの結合
パターンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼ
ーションする。
り、2本のプローブが互い違いに結合する。具体的に
は、図3に示したように、No.1のDNAプローブ及
びNo.2のDNAプローブが立体的に互い違いに結合
し、プローブポリマーを形成する。つまり、図2に示し
た3つの結合パターンで互い違いにハイブリダイゼーシ
ョンした一対のプローブの複数対は、図3に模式的な一
例を示したように二本鎖のプローブポリマーを形成させ
ることができる。図3の模式図を立体的な概念構造の一
例を示すと図4のように示される。図5は図3の結合パ
ターンを変えた模式図で、図5の模式図の立体的な概念
構造の一例は図6に示される。
から構成される一対のDNAプローブの一例を示す模式
図である。同図において、No.3のDNAプローブ
は、X1領域、X2領域、X3領域及びX4領域を有し、N
o.4のDNAプローブは、X′1領域、X′2領域、
X′3領域及びX′4領域を有している。このNo.3の
DNAプローブとNo.4のDNAプローブは、両者を
ハイブリダイゼーションさせたとき、X1領域はX′1領
域とだけ結合し、X2領域はX′2領域とだけ結合し、X
3領域はX′3領域とだけ結合し、X4領域はX′4領域と
だけ結合するような構成とされている(図8)。
4カ所の数から構成される一対のDNAプローブ同士を
用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーシ
ョンさせた場合は、図8に示したように、X1領域は
X′1領域とだけ結合し、X2領域はX′2領域とだけ結
合し、X3領域はX′3領域とだけ結合し、X4領域は
X′4領域とだけ結合し、4つの結合パターンで一対の
プローブが互い違いにハイブリダイゼーションする。
り、2本のプローブが互い違いに結合する。具体的に
は、図9に示したようにNo.3のDNAプローブ及び
No.4のDNAプローブが立体的に互い違いに結合
し、プローブポリマーを形成する。
一対のDNAプローブの相補的な部分が4ヵ所、5ヵ所
及び6ヵ所の数から構成される一対のプローブをハイブ
リダイゼーションさせる方法をもってすれば、理論的に
はそれ以上の相補的塩基配列領域を増すことが可能であ
る。
(n≧3)の数から構成される一対のDNAプローブの
さらに別の例を示す模式図である。同図において、N
o.9のDNAプローブは、X1領域、X2領域、X3領
域……Xn-1領域、Xn領域を有し、No.10のDNA
プローブは、X′1領域、X′2領域、X′3領域……
X′n-1領域、X′n領域を有している。
0のDNAプローブは、両者をハイブリダイゼーション
させたとき、X1領域はX′1領域とだけ結合し、X2領
域はX′2領域とだけ結合し、X3領域はX′3領域とだ
け結合し、Xn-1領域はX′n-1とだけ結合し、Xn領域
はX′n領域とだけ結合するような構成とされている
(図14)。
nカ所の数から構成される一対のDNAプローブ同士を
用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーシ
ョンさせた場合は、図14に示したように、X1領域は
X′1領域とだけ結合し、X2領域はX′2領域とだけ結
合し、X3領域はX′3領域とだけ結合し、Xn-1領域は
X′n-1領域とだけ結合し、Xn領域はX′n領域とだけ
結合し、n個の結合パターンで一対のプローブが互い違
いにハイブリダイゼーションする。
NAプローブ同士、PNAプローブ同士、PNAプロー
ブとDNAプローブ、又はPNAプローブとRNAプロ
ーブの場合も、そのハイブリダイゼーションの原理は、
図8、図11、図13および図14に示したDNAプロ
ーブ同士の場合と同様である。
は、それら一対のプローブが重合してプローブポリマー
を形成し得るものであれば特に限定されないが、費用と
効率を考慮すれば3〜5個所が適当である。
る一対のプローブが、互い違いに交差してハイブリダイ
ゼーションする時の分岐点の塩基配列をG(グアニン)
とC(シトシン)の結合にすることにより、塩基の積み
重ね(stacking of base)により塩基のπ電子の特殊な
相互作用を生じさせ、安定した二本鎖のポリマーを形成
させる方法である。
らせん構造の中で、塩基はその中心付近にあり、A(ア
デニン)とT(チミン)と, G(グアニン)とC(シ
トシン)と特異的に水素結合して塩基対を形成してい
る。2本の水素結合でつながっているAとT〔図15
(a)〕よりも、3本の水素結合でつながっているGと
C〔図15(b)〕の方が強く結合することが、図16
の図表に示したHatim T. Allawiら(Biochemistry 36,
10581-10594. 1997.)のNearest-Neighbor Thermodynam
ic Parametersを用いた成績からも明らかであることか
ら、図17(a)と図17(b)に示したように、PA
LSAR法では、理論的に3箇所の領域でハイブリダイ
ゼーションを行うために、この使用する一対のプローブ
の互い違いに交差する円形で示した部分の結合をGとC
にすることにより、ポリマーの形成を安定化させること
が可能になる。
がほぼ長方形の板のような形をなしているために、この
平面は二重らせん軸に対してほぼ直角に配置している。
したがって、各塩基対はみな互いに平行に位置すること
になり、その間隔は3.4Å〔図15(c)〕である。
の塩基の積み重ね(stacking of base)によって塩基の
π電子による特殊な相互作用が生じて、これが二重らせ
ん構造安定化の大きい要因となっている。また、この塩
基の積み重ねがDNA、またはオリゴヌクレオチドの2
60nmにおける紫外部の吸収帯の強度が30%ほど低
下する「ハイポクロミズム」という淡色効果の発現が知
られている。
点の結合力が弱いとその分岐点にはさまれている領域の
ハイブリダイゼーションが不安定になることから、領域
全体の塩基のπ電子による特殊な相互作用から生じる塩
基の積み重ね(stacking of base)効果の強さを増すこ
とにより、PALSAR法で互い違いに交差する各領域
のハイブリダイゼーション反応をより強固にさせること
を考案したものである。
ーの塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることか
ら、260nmにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる
「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させてポリ
マーの状態を確認し、さらにはポリマーの塩基の積み重
ねの間に蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化か
らポリマーの状態を確認する方法を可能にするものであ
る。
使用する一対のプローブの互い違いに交差してハイブリ
ダイゼーションする時の領域はおよそ20塩基(20ba
se)であるが、円形で示した分岐点の結合を強固にする
ことによって、積み重ね効果(stacking effect)が増
し、結果的にその分岐点にはさまれている20塩基の領
域のハイブリダイゼーションが安定すると考えられる。
たはGの数は少なくとも1塩基であり、複数個であって
も差し支えない。各相補領域の塩基配列を考慮し適宜選
択することができる。複数個のCまたはGを配置させる
場合、図19に記載されるように、C、Gの順序は特に
限定されず自由に組み合わせることができる。また、下
記に記載されるターゲット遺伝子の検出法において、タ
ーゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列をプローブの
一領域として採用する場合も、相補領域の端部にCまた
はGを配置するように選択することが可能である。
り、試料中の微量の標的遺伝子を検出することができ
る。たとえば、一対の重合用プローブの相補領域の一つ
をターゲット遺伝子の一部分と相補的である塩基配列を
採用し、該プローブと試料を反応させて後、一対のプロ
ーブを反応させる。次いで、ターゲット遺伝子と結合し
ているプローブポリマーの量を測定することにより、タ
ーゲット遺伝子を測定することができる。
伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域と、重合用プ
ローブの一領域と相補的塩基配列を有する領域、の二つ
の領域からなる捕捉用プローブを採用し、上記と同様な
方法でターゲット遺伝子の量を測定することができる。
捕捉用プローブは少なくとも一種類であり、ターゲット
遺伝子の相補部位を幾種類か選択することに応じて、複
数種の捕捉用プローブを採用することもできる。
るだけでなく、間接的にターゲット物質を測定すること
も可能である。すなわち、ターゲット遺伝子を結合させ
た測定を目的とする物質(ターゲット物質)にヌクレオ
チドを結合させ、該ヌクレオチドをターゲット遺伝子と
して上記の方法に準じて測定することができる。
ブの場合は、リン酸と糖と塩基(アデニン・チミン・グ
アニン・シトシン)を成分とする一本鎖断片であり、R
NAプローブの場合は、塩基がアデニン・ウラシル・グ
アニン・シトシンを成分とする一本鎖断片である。PN
Aは、DNAの「リン酸と糖」の骨格が、「N−(2−
アミノエチル)グリシン誘導体」に置き換わった構造
で、塩基の成分はDNA及びRNAと同じである。
は、通常DNA又はRNAで構成されるが、核酸類似体
でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド
核酸(PNA、WO 92/20702)が挙げられる。また、一
対のプローブは、通常、同じ種類の核酸で構成される
が、たとえばDNAプローブとRNAプローブが一対に
なっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類は
DNA、RNAまたは核酸類似体(たとえばPNA)か
ら選択することができる。又、一つのプローブ内での核
酸組成は一種類、たとえばDNAのみから構成される必
要はなく、必要に応じて、たとえば、DNAとRNAか
ら構成されるプローブ(キメラプローブ)を使用するこ
とも可能であり、本発明に含まれる。
は、塩基数にして、少なくとも5塩基であり、好ましく
は少なくとも8塩基、さらに好ましくは10塩基〜10
0塩基、さらに好ましくは15〜30塩基である。
ることができる。たとえばDNAプローブの場合、アプ
ライドバイオシステムズ社(Applied Biosystem Inc.
)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホ
アミダイド法により合成することができる。また、別法
としてリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法等が
あるが、いかなる方法で合成されたものであってもよ
い。
3)有する一対のプローブを使用し、両者を等温で酵素
不在の条件下で反応させることによりプローブポリマー
を形成させるものである。使用するプローブの本数は、
特に限定されないが、102〜1015本の範囲で用いら
れる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸
増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。p
Hも常用の範囲で好適であり、好ましくはpH7.0〜
pH9.0の範囲のものが使用できる。反応温度は40
〜80℃、好ましくは55〜65℃である。これら条件
は特に限定されない。
のターゲット遺伝子の検出に応用することができる。
ば、一本のプローブの中でお互いに相補的塩基配列領域
の長さ(塩基の数)は、同一であっても異なってもよ
く、たとえば、図20に示されるようにDNAプローブ
同士の場合、No.11プローブとNo.12プローブ
をハイブリダイゼーションさせたとき、X1領域とX′1
領域は24塩基でハイブリダイゼーションし、X2領域
とX′2領域は22塩基でハイブリダイゼーションし、
X3領域とX′3領域は20塩基でハイブリダイゼーショ
ンし、プローブポリマーを形成する(図21)。
ば、図19ののDNAプローブ同士の場合は、図22
に示したように、No.13プローブとNo.14プロ
ーブをハイブリダイゼーションさせたとき、制限酵素に
よる切断部位(下線の部分がHae IIIという酵素
で切断される)ができるように構成することもできる。
に結合し高分子になった後、その後の別の実験操作にそ
の高分子がクロスコンタミネーションしないように、制
限酵素を用いて防止することができる(図23)。
の交差してハイブリダイゼーションする時の分岐点の塩
基配列をG(グアニン)とC(シトシン)の結合にする
ことにより、塩基の積み重ね(stacking of base)によ
り塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、安定した
二本鎖のポリマーを形成させる方法である。一例とし
て、図17に一対のプローブが、X1領域はX′1領域
と、X2領域はX′2領域と、X3領域はX′3領域と互い
違いに交差してハイブリダイゼーションする、3個所の
相補的塩基配列領域を有する場合について図示した。
がn(n≧3)個所の数から構成される一対のプローブ
(HCP)の複数対を用いて、互い違いに交差するよう
にハイブリダイゼーションさせることにより、2本鎖の
高分子を形成させるプローブポリマーの作製方法及びそ
の利用(PALSAR法)で使用する一対のプローブを
図示した。
の分岐点の塩基をG−C結合にすることにより、ポリマ
ーの形成を安定化するものである。また、この分岐点の
G−Cの種類、数は、図19の〜に示したように、
自由に組合せできるものであり、G−Cの塩基配列であ
れば特に限定されるものではない。
の態様は、たとえば、図24および図25に示したよう
に、一対のプローブのうち、一方のプローブの一つの相
補領域の塩基配列をターゲット遺伝子の一部と相補的な
塩基配列となるように構成し、まず、該プローブとター
ゲット遺伝子とを反応させた後、一対のプローブの複数
対をハイブリダイゼーションさせることにより、ターゲ
ット遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させる。該
複合体を適切な手法で分離した後、プローブポリマーの
量を測定することによりターゲット遺伝子量を測定する
ことができる。
の態様は、たとえば、図26に示したように、一対のプ
ローブとは別に、一対のプローブのうちどちらか一方の
プローブの領域と同じ塩基配列とターゲット遺伝子の一
部分と相補的な塩基配列からなるプローブ(捕捉用プロ
ーブ)を用いて、あらかじめ該捕捉用プローブとターゲ
ット遺伝子とハイブリダイゼーションさせた後、上記し
たプローブポリマーの作製方法で一対のプローブの複数
対をハイブリダイゼーションさせ、二本鎖のポリマーを
形成させてプローブを増幅して検出するものである。
る捕捉用プローブとは、ターゲット遺伝子の一部分と相
補的な塩基配列を有する領域と、重合用プローブの一領
域と相補的な塩基配列を有する領域の、少なくとも二つ
の領域から構成されるが、たとえば、重合用プローブの
他の相補的塩基領域をさらに附加すること、等は自由で
ある。しかし、捕捉用プローブとしての機能が阻害され
ないことが条件であることは言うまでもない。ターゲッ
ト遺伝子を検出する際、使用する捕捉用プローブは少な
くとも1種類使用し、必要に応じて、ターゲット遺伝子
に相補的な塩基配列を複数領域選択することにより複数
種類の捕捉用プローブを使用することが可能である。
形成されたプローブポリマーの測定は下記の方法等が挙
げられる。たとえば、得られたプローブポリマーに、エ
チジウムブロミド、Oligreen、SYBR Gr
een I等のインターカレーティング色素を結合させ
て増幅したポリマーを蛍光により検出することができ
る。
らかじめ検出のための標識物質として、125Iや32P等
のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウ
ム・エステル等の発光・発色物質、アビジンに結合した
蛍光・発光・発色物質等を利用するためのビオチン、も
しくは蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用する
ためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加さ
せておき、ターゲット遺伝子を検出することも可能であ
る。標識物質は特に限定されない。
ーブ同士、DNAプローブとRNAプローブ、又はRN
Aプローブ同士、PNAプローブ同士、PNAプローブ
とDNAプローブ、又はPNAプローブとRNAプロー
ブをあげることができる。
またはRNAなどの一種類の塩基に限定されず、たとえ
ば、DNAとPNAからなる、いわゆるキメラプローブ
であっても本発明は実施可能である。
な部分の塩基の種類は、C(シトシン)、T(チミ
ン)、G(グアニン)、A(アデニン)、U(ウラシ
ル)等から任意に選択することができ、特に限定される
ものではない。また、1本のプローブ内にある相補的な
部分同士の長さはそれぞれ等しくても、異なっていても
かまわない。上記した一対のプローブをハイブリダイゼ
ーションさせ、二本鎖のポリマーを形成させるために使
用するプローブの本数は、好ましくは102〜1015本
の範囲で用いられる。
的手法は、たとえば、まず最初に検体試料と少なくとも
1種類の捕捉用プローブを反応させ、ターゲット遺伝子
と捕捉用プローブを結合させる。この際、少なくとも一
種類のビオチン化捕捉用プローブを使用する。次いで、
一対の重合用プローブの一方を添加し反応させた後、も
う一方の重合用プローブを反応させてターゲット遺伝子
・プローブポリマー複合体を形成させる。次いで、アビ
ジン化磁性体粒子(磁性体ビーズ)を反応させ該複合体
と結合させ、ビーズの性質を利用して該複合体を未反応
物質から分離する。最後に、エチジウムブロミドを反応
させ、紫外線照射によりプローブポリマーの量を定量す
ることにより、検体試料中のターゲット遺伝子量を測定
する。形成させたプローブポリマーの分離を容易にする
ために、磁気ビーズを使用することもできる。
遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレ
オチドを固相化したウェルを使用することができる。ま
ず検体試料をウェルに添加し試料中のターゲット遺伝子
と、固相化したターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチドを結合させる。次い
で、上記の方法に準じて、重合用プローブを順次添加す
ることにより、プローブポリマーが形成され結合するこ
とになる。未反応物質との分離は、ウェルを洗浄するこ
とにより容易にでき、最後にプローブポリマー量を測定
することによりターゲット遺伝子を測定できる。
用も可能である。
またはRNA)測定用試料は、該核酸を含む可能性のあ
らゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より
適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されな
い。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織
液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カ
ビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げら
れる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で
増幅したDNAまたはRNA等の核酸も使用できる。タ
ーゲット遺伝子が二本鎖DNAの場合は、公知の方法に
より一本鎖にすることにより使用することができる。
ット遺伝子を検出するキットをも提供する。一例として
は、本キットは、少なくとも1種類のターゲット遺伝子
捕捉用プローブ(少なくとも1種類のビオチン化捕捉用
プローブを含む)、一対の重合用プローブ、アビジン化
磁性体粒子、エチジウムブロミドを必須の構成成分とす
るものである。ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を
含む重合用プローブを使用する際は、捕捉用プローブを
省略することができる。
の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド
を固相化した固相体(たとえばウェル)を必須の構成成
分とすることも可能である。その他に、プローブポリマ
ー検出用試薬、反応用緩衝液、希釈液、標準品、吸着防
止剤等が含まれることは自由であり、特に限定されな
い。
ック(たとえば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチ
レン、ポリプロピレン等)、金属等であり、担体の形
は、カップ型、平板型等、特に限定されない。
これらの実施例に限定されるものでないことは勿論であ
る。
プローブ。
CV−RNAと各種DNAプローブ。C型肝炎ウイルス
の5′-noncoding領域を合成したHCV−RNA(以
下、合成HCV−RNAと略称する)。
用いて、ハイブリダイゼーションの温度による重合の効
果を証明した。
3M−C6H5O7Na3・2H2O,pH 7.0)を使
用。
ー/μLに調製したプローブ1とプローブ2をそれぞれ
5μLずつ加え、40μLの20×SSCを加えて蓋を
した後、94℃で30秒間煮沸し、50℃,52℃,5
4℃,56℃,58℃,60℃,62℃,64℃,66
℃,68℃,70℃,でそれぞれ30分間加温した。
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効
果を確認した。
V,30分間の電気泳動による実施例1の成績を写真を
用いて示したものである。
さによって分けることができるゲルで、一般的に0.5
%のアガロースゲルは、30,000〜40,000塩
基対のDNA分子の分離に用いられるものである。
がハイブリダイゼーションの温度に依存して互い違いに
正確に二本鎖の高分子を形成した結果として、温度の上
昇とともに0.5%のアガロースゲルではもはや泳動で
きないほどに大きくなった高分子が示されている。
重合されたポリマーが制限酵素によって切断されること
を証明した。
製)を使用。 3)制限酵素用緩衝液としてM−Buffer(タカラ
酒造社製)を使用。 4)緩衝液として20×SSCを使用。
ー/μLに調製したプローブ3とプローブ4をそれぞれ
5μLずつ加え、5μLの20×SSCと35μLの滅
菌蒸留水を加えて蓋をした反応液を94℃で30秒間煮
沸し、62℃でそれぞれ30分間加温した。
Bufferと5μLのHae IIIを加えて、37
℃で24時間反応させ、2%のアガロースゲルを用いて
電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合された
ポリマーの制限酵素による切断を確認した。
V,30分間の電気泳動による実施例2の成績を写真を
用いて示したものである。
した一対のDNAプローブが制限酵素によって最小単位
にまで切断されたことが示されている。
させた磁性体ビーズを使用。(商品名:Strepta
vidin MagneSphere/Promega
社製)。 3)緩衝液として20×SSCと0.5×SSC(20
×SSCの40倍希釈液)を使用。
ー/10μL,102コピー/10μL,103コピー/
10μL,104コピー/10μL,105コピー/10
μL,106コピー/10μL,107コピー/10μ
L,108コピー/10μL,109コピー/10μL,
1010コピー/10μLとなるように調製した合成HC
V−RNAをそれぞれ10μLずつ加え、次に1013コ
ピー/μLに調製したHCV−RNA捕捉用プローブ
B、捕捉用プローブC、捕捉用プローブD、捕捉用プロ
ーブEをそれぞれ1μL、1013コピー/μLに調製し
たプローブ5を10μL、及び20×SSCを25μL
を加える。マイクロチューブの蓋を閉めてミキサーで混
和した後、62℃で60分間加温する。
イクロチューブに1013コピー/μLに調製したプロー
ブ6を5μLずつ加えて、マイクロチューブの蓋を閉め
てミキサーで混和した後、62℃で60分間加温する。
イクロチューブに10μLのStreptavidin
MagneSphere(以下、磁性体ビーズ)を加
え、37℃で30分間反応する。反応後、磁石を用いて
磁性体ビーズをトラップし、上清を除去した後、0.5
×SSCを50μLと100μg/mLに調製したエチ
ジウムブロミド(和光純薬社製)を10μL加えて、室
温で20分間反応させる。
ップし、上清を除去した後、0.5×SSCを50μL
加え、直ちに磁石を用いて磁性体ビーズをトラップし、
上清を除去した後、0.5×SSCを50μL加えて、
全量を平底の96ウェルプレートに移して下から紫外線
を照射し、エチジウムブロミドのインタカレーションに
よって蛍光を発するようになったプローブポリマーを写
真撮影する。
し、エチジウムブロミドの蛍光を写真で撮影した状態を
示すものである。
10コピー/10μLで一番強い蛍光が認められ、合成H
CV−RNAの量に応じて、段階的に蛍光が弱くなって
いった。
用。(商品名:NucleoLinkTM/Nunc社
製) 3)Peroxidase Conjugated Streptavidinとして、「H
RP−Streptavidin/ZYMED LAB
ORATORIES,INC.」を使用。 4)発色試薬として、「ペルオキシダーゼ用発色キット
T/住友ベークライト社製」を使用。 5)酵素反応停止液として、2N−H2SO4を使用。 6)緩衝液として20×SSCと0.5×SSCを使
用。
だし、特別なブロッキング処理は施していない)してい
る96ウェルプレート(NucleoLinkTM/Nu
nc社製)の各ウェルに、0コピー/10μL,103
コピー/10μL,104コピー/10μL,105コピ
ー/10μL,106コピー/10μL,107コピー/
10μLとなるように調製した合成HCV−RNAをそ
れぞれ10μLずつ加え、次に1011コピー/μLに調
製した捕捉用プローブC、捕捉用プローブD、捕捉用プ
ローブEをそれぞれ10μL、1011コピー/μLに調
製したプローブ5を10μL、及び20×SSCを60
μLを加える。
加熱し、62℃で60分間加温する。
イクロチューブに1011コピー/μLに調製したプロー
ブ5を10μL、プローブ7を20μLずつ加える。ピ
ペットで混和した後、94℃で30秒間加熱し、62℃
で60分間加温する。
ween20を含む0.5×SSCで4回洗浄し、各ウ
ェルに「HRP−Streptavidin」を100
μL加え、37℃で20分間加温する。各ウェルの液を
吸引除去した後、0.1%−Tween20を含む0.
5×SSCで4回洗浄する。
トT」を100μL加えて、暗所(室温)で10分間反
応させる。反応後、酵素反応停止液を100μL加え、
波長450nmでの吸光度を測定する。
本鎖のポリマーを形成した一対のDNAプローブのう
ち、一方に標識されていた Peroxidase Conjugated Str
eptavidin が発色することによって、加えた103〜1
07コピーまでの合成HCV−RNAの量に応じて発色
が確認された。
れるDNAプローブを用いて、ハイブリダイゼーション
の温度による重合の効果を証明した。
ー/μLに調製したプローブ8とプローブ9をそれぞれ
5μLずつ加え、40μLの20×SSCを加えて蓋を
した後、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、6
4℃、66℃、70℃、でそれぞれ30分間加温した。
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効
果を確認した。
V、30分間の電気泳動による実施例5の成績を用いて
示したものである。それぞれの温度に依存して形成され
た二本鎖のポリマーを確認した。
れるDNAプローブを用いて、ハイブリダイゼーション
の温度による重合の効果を証明した。
ー/μLに調製したプローブ10とプローブ11をそれ
ぞれ5μLずつ加え、40μLの20×SSCを加えて
蓋をした後、54℃、56℃、58℃、60℃、62
℃、64℃、66℃、70℃、でそれぞれ30分間加温
した。加温後、0.5%のアガロースゲルを用いて電気
泳動し、エチジウムブロミド染色により重合の効果を確
認した。
V、30分間の電気泳動による実施例6の成績を用いて
示したものである。それぞれの温度に依存して形成され
た二本鎖の高分子を確認した。
ローブを通常の方法で合成した。
すべてがG−C結合、半分がG−C結合、そして、すべ
てがA−T結合となるように設計して合成し、各HCP
は一対の相補的な2本のオリゴヌクレオチド・プローブ
からなっており、それぞれをHCP−1、HCP−2、
HCP−3と命名した。
Lになるように滅菌超純水で溶解して、以下の実験に供
した。
mol/μL)のオリゴヌクレオチド対を1μL、HC
P−2(100pmol/μL)のオリゴヌクレオチド
対を1μL、HCP−3(100pmol/μL)のオ
リゴヌクレオチド対を1μLを加え、各反応チューブに
20×SSCを12μL、DW2を6μL分注し、全量
を20μLとし、ボルテックスで混和後、スピンダウン
した。
し、それぞれ「94℃10秒、62℃30分」、「94
℃10秒、64℃30分」、「94℃10秒、66℃3
0分」、「94℃10秒、68℃30分」、「94℃1
0秒、70℃30分」の温度で反応させた。
5℃まで下げ、電気泳動まで4℃でstockした。
(ブロムチモールブルー)を2μL混和したサンプル
を、0.5%アガロースゲル(Nusive−3:1/
タカラ社製)を用いて、100v、35分間の電気泳動
を行った。
マーの形成が開始しているが、HCP−2ではラダー状
の生成物が多く、ポリマーの形成が不十分である。ま
た、HCP−3では62℃の反応温度では、非特異的な
結合も含まれてレーン全体がラダー状になっている。
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をG(グアニン)とC(シトシン)
の結合にしたHCP−1では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより低い反応温度で効率的に形成されることが確認
された。
mol/μL)のオリゴヌクレオチド対を1.5μL、
HCP−2(100pmol/μL)のオリゴヌクレオ
チド対を1.5μL、HCP−3(100pmol/μ
L)のオリゴヌクレオチド対を1.5μLを加え、各反
応チューブに20×SSCを36μL、DW2を21μ
L分注し、全量を60μLとし、ボルテックスで混和
後、スピンダウンした。
し、それぞれ「94℃10秒、64℃0時間(on ic
e)」、「94℃10秒、64℃0.5時間」、「94
℃10秒、64℃3時間」、「94℃10秒、64℃1
6時間」、「94℃10秒、64℃16時間(vibratio
n)」の反応時間でポリマーを形成させた。
5℃まで下げ、電気泳動まで4℃でstockした。
(ブロムチモールブルー)2μLを混和したサンプル
を、0.5%アガロースゲル(Nusive−3:1/
タカラ社製)を用いて、100v、35分間の電気泳動
を行った。
ポリマーの形成が開始しており、3時間反応でも未反応
プローブ(レーン下部のバンド)の量が少なく、大部分
がポリマー形成に消費されていることがわかる。一方、
HCP−2ではラダー状の生成物が多く、0.5時間反
応ではポリマーの形成が不十分である。また、HCP−
3では0.5時間反応では、ポリマーが全く形成されて
いない。
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をG(グアニン)とC(シトシン)
の結合にしたHCP−1では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより短時間で効率的に形成されることが確認され
た。
ド・プローブの濃度がそれぞれ「10pmol/μ
L」、「5.0pmol/μL」、「2.5pmol/
μL」となるように、HCP−1,HCP−2,HCP
−3の各オリゴヌクレオチド対を2μLずつ加え、20
×SSCを12μL、DW2を6μL分注し、全量を2
0μLとした混和液をボルテックスで混和後、スピンダ
ウンした。
分」で反応させた。
5℃まで下げ、電気泳動まで4℃でstockした。
(ブロムチモールブルー)2μLを混和したサンプル
を、0.5%アガロースゲル(Nusive−3:1/
タカラ社製)を用いて、100v、35分間の電気泳動
を行った。
いて、HCP−1ではすでにポリマーが形成されている
が、HCP−2ではラダー状の生成物があり、ポリマー
の形成が不十分である。また、HCP−3では「2.5
pmol/μL」のプローブ濃度ではポリマーが形成さ
れていない。
い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の分岐
点における塩基配列をG(グアニン)とC(シトシン)
の結合にしたHCP−1では、安定した二本鎖のポリマ
ーがより低いプローブ濃度で効率的に形成されることが
確認された。
l/μL」となるように、HCP−1、HCP−2、及
びHCP−3の各オリゴヌクレオチド対を1μL、20
×SSCを12μL、DW2を7μL分注し、全量を2
0μLとした混和液を各HCPについて調製し、ボルテ
ックスで混和後、スピンダウンした。
分」で反応させた。
5℃まで下げ、電気泳動まで4℃でstockした。
(ブロムチモールブルー)2μLを混和したサンプル
を、0.5%アガロースゲル(Nusive−3:1/
タカラ社製)を用いて、100v、35分間の電気泳動
を行った。
い「2.5pmol/μL」において、HCP−1では
すでにポリマーが形成されているが、HCP−2ではラ
ダー状の生成物が多く、ポリマーの形成が不十分であ
る。また、HCP−3ではレーン全体がラダー状にな
り、ポリマーが形成されていない。
い反応時間においても互い違いに交差してハイブリダイ
ゼーションする時の分岐点における塩基配列をG(グア
ニン)とC(シトシン)の結合にしたHCP−1では、
安定した二本鎖のポリマーが低いプローブ濃度で効率的
に形成されることが確認された。
/μL)、HCP−2(100pmol/μL)、及び
HCP−3(100pmol/μL)をそれぞれ1.5
μL加え、20×SSCを36μL、DW2を21μ
L、を分注し、全量を60μLとし、ボルテックスで混
和後、スピンダウンした。
し、それぞれ3本ずつ「94℃10秒、64℃0時間
(on ice)」、「94℃10秒、64℃3時間」、「9
4℃10秒、64℃16時間」の反応時間でポリマーを
形成させた。
げ、その後4℃でstockしておいた。
により紫外部吸収を測定した。
マー形成率が増えるに従って260nmにおける紫外部
吸収の値が低くなった。これは、塩基の積み重ねが規則
的な高次構造をとることにより、DNA、またはオリゴ
ヌクレオチドの260nmにおける紫外部の吸収帯の強
度が減ずる「ハイポクロミズム」という淡色効果の発現
によるものである。そこで、より多くのポリマーが形成
される「94℃10秒、64℃16時間」の反応におい
て、HCP−1を用いた場合の紫外部吸収が大きく減少
しているということは、すなわちHCP−1を用いるこ
とによってより規則正しい安定した高次構造のポリマー
が形成されたことが示され、同時に、紫外部吸収の変化
によって、ポリマーの状態を確認することができた。
の紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用してポリマ
ーの存在を検出する方法が示された。
/μL)、HCP−2(100pmol/μL)、及び
HCP−3(100pmol/μL)を2.5μL、2
0×SSCを60μL、DW2を35μL分注し、全量
を100μLとし、ボルテックスで混和後、スピンダウ
ンした。
し、それぞれ3本ずつ「94℃10秒、64℃0時間
(on ice)」、「94℃10秒、64℃0.5時間」、
「94℃10秒、64℃1時間」、「94℃10秒、6
4℃3時間」、「94℃10秒、64℃5時間」、「9
4℃10秒、64℃16時間」の反応時間でポリマーを
形成させた。
げ、その後4℃でstockしておいた。
性質を有するSYBR GreenI(Takara)
1μLをTE buffer(10mM, 1mM,
pH8.0)10mLで溶解し1/10000希釈液を
調製した。(1)においてポリマーを形成させた各チュ
ーブにSYBR GreenI(1/10000希釈
液)を5μLずつ添加し、ボルテックスで混和後、スピ
ンダウンした。
を反応させた。
化させると、反応時間が長く二本鎖の形成率が増えるに
従って蛍光強度が増加し、その現象はHCP−1におい
て最も短時間で現れた。これは、反応時間の早い段階に
おいて、より効率良くHCP−1の二本鎖が形成された
ことを示している〔図38(a)(b)(c)〕。
ねの間に蛍光物質であるSYBR GreenIをイン
ターカレートさせてポリマーの状態を確認することがで
きた。
/μL)、HCP−2(100pmol/μL)、及び
HCP−3(100pmol/μL)を1.5μL、2
0×SSCを36μL、DW2を21μLを分注し、全
量を60μLとし、ボルテックスで混和後、スピンダウ
ンした。
し、それぞれ4本ずつ「94℃10秒、64℃0時間
(on ice)」、「94℃10秒、64℃0.5時間」、
「94℃10秒、64℃3時間」、「94℃10秒、6
4℃16時間」の反応時間でポリマーを形成させた。
リーダーの「n=3」用とした。各反応は64℃の反応
後、15℃まで下げ、その後4℃でstockしておいた。
ールブルー)2μLを混和したサンプルを、0.5%ア
ガロースゲル(Nusive−3:1/タカラ社製)を
用いて、100v、35分間の電気泳動を行った。
ara)1μLを0.5mLのDW2で溶解し1/50
0希釈液を調製した。上記(1)においてポリマーを形
成させた各チューブにSYBR GreenI(1/5
00希釈液)を5μLずつ添加し、ボルテックスで混和
後、スピンダウンした。
蛍光物質を反応させた後、1.5mLチューブに移し変
えて定法に従ってエタノール沈殿を行い、−20℃で一
晩放置した。
pm×15min(室温)で遠心分離を行い、上清を除
去後、ペレットを風乾させ、60μLのDW2で溶解
し、蛍光リーダーにて測定した。
塩基対にインターカレートする蛍光色素で、エタノール
沈殿を行えば、核酸と結合した色素を除去することがで
きる。
せず、そのまま蛍光リーダーで測定しているが、図39
では蛍光物質をインターカレートさせた後、エタノール
沈殿によりポリマーを精製している。
を変化させると、HCP−1では反応時間が長くポリマ
ー形成率が増えるに従って蛍光強度が増加した。これ
は、HCP−1のポリマーは規則正しい高次構造をとっ
ている為、エタノール沈殿でも蛍光物質が除去されにく
く、そのポリマーの形成率が増える程、より高次な構造
を形成する為に蛍光物質が更に除去されにくくなってい
ることが示された。
間に依存していなかった。これは、全てがダブルストラ
ンドを形成せずにシングルストランドの部分も残る不規
則なポリマーが形成された為、蛍光物質をインターカレ
ートした後にエタノール沈殿を行うと、蛍光物質が除去
されやすい不安定な状態になっていることを示してい
る。
ーカレートさせた後、エタノールで精製したポリマーを
蛍光リーダーで測定することによって、そのポリマーの
状態を確認できることが示された。
おける塩基対間の結合力を強固とすることにより安定し
たプローブポリマーを作製することができるとともに、
核酸合成酵素や枝分かれしたDNAを用いずに、効率よ
くターゲット遺伝子の検出を行うことができ、その上、
形成されるポリマーの塩基の積み重ねが規則的な高次構
造をとることから、260nmにおける紫外部の吸収帯
の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を
発現させてポリマーの状態を確認することが可能であ
り、さらには、ポリマーの塩基の積み重ねの間に安価な
蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化からポリマ
ーの状態を確認できるために、今までになく低コストで
しかも簡便に遺伝子を検出することができるという顕著
な効果を奏することができる。
式図である。
模式図である。
イゼーションした場合にできるポリマーの形成を示した
模式図である。
模式図である。
模式図である。
の一例を示す模式図である。
の一例を示す模式図である。
いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマー
の形成の一例を示す模式図である。
ブの一例を示す模式図である。
態様の一例を示す模式図である。
違いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマ
ーの形成の一例を示す模式図である。
態様の一例を示す模式図である。
ーブの結合態様の一例を示す模式図である。
素結合の状態を示す図である。
-10594. 1997.)のNearest-Neighbor Thermodynamic Pa
rametersを示す図表である。
定化の原理を示す模式図である。
ョンの安定化の原理を示す模式図である。
(1塩基以上を置換した場合)を示す模式図である。
部分の長さが異なる一対(2本)のDNAプローブの一
例を示す模式図である。
違いにハイブリダイゼーションした場合にできるポリマ
ーの形成を示した模式図である。
本)のDNAプローブの一例を示す模式図である。
ポリマーになった後、制限酵素を用いて切断した場合の
一例を示す模式図である。
ゲット遺伝子を直接検出する方法を示した模式図で、ま
ずターゲット遺伝子に対して、ターゲット遺伝子と本発
明の一対のDNAプローブ(図中の重合用プローブ)に
相補的な領域を持つプローブをハイブリダイゼーション
させ、その後、本発明の一対のDNAプローブ(図中の
重合用プローブ1と重合用プローブ2)を加えることに
より、本発明の一対のDNAプローブは、ターゲット遺
伝子にハイブリダイゼーションした状態で二本鎖のポリ
マーを形成するため、容易にターゲット遺伝子を検出す
ることができることを示した図面である。
ーブの一部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺
伝子となるように構成したDNAプローブ(図中の重合
用プローブ1)とそのDNAプローブに対して対をなす
DNAプローブ(図中の重合用プローブ2)を用いて、
ターゲット遺伝子と一対のプローブの複数対をハイブリ
ダイゼーションさせ、二本鎖のポリマーを形成させ、タ
ーゲット遺伝子を検出する方法を示す模式図である。
部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子とな
るように構成したDNAプローブ(図中の重合用プロー
ブ1)とそのDNAプローブに対して対をなすDNAプ
ローブ(図中の重合用プローブ2)を用いて、ターゲッ
ト遺伝子と一対のプローブの複数対をハイブリダイゼー
ションさせ、二本鎖のポリマーを形成させ、ターゲット
遺伝子を検出する方法を示す模式図である。
示す図である。
リマーの形成において、反応温度によるポリマー形成の
影響を示す図である。
リマーの形成において、反応時間によるポリマー形成の
影響を示す図である。
リマーの形成において、HCPの濃度によるポリマーの
形成の影響を示す図である。
リマーの形成において、短い反応時間におけるHCPの
濃度によるポリマーの形成の影響を示す図である。
す図である。
おいて、蛍光物質をインターカレートさせた状態でポリ
マーを検出した場合を示す図である。
おいて、蛍光物質をインターカレートさせた後、EtO
Hでポリマーを精製して検出した場合を示す図である。
(1塩基を置換した場合)を示す模式図である。
Claims (22)
- 【請求項1】 下記(a)(b)(c)の特性を具備し
た、一対の第1プローブ及び第2プローブを有するプロ
ーブポリマー作製用プローブ。 (a)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をn個所(n≧
3)有する形で構成され、第1プローブの5′端部から
順に設けられた、X1領域、X2領域、X3領域、・・Xn
領域は、第2プローブの5′端部から順に設けられた、
X′1領域、X′2領域、X′3領域、・・X′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 (b)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、両
者を反応させた場合、X1領域はX′1領域とだけハイブ
リダイズし、X2領域はX′2領域とだけハイブリダイズ
し、X3領域はX′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Xn領域はX′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第1プローブ及び第2プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 (c)上記一対の第1プローブ及び第2プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも1つのG(グア
ニン)またはC(シトシン)を配置させ、上記一対の第
1プローブ及び第2プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも1つのC−G結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 - 【請求項2】 前記一対の第1プローブ及び第2プロー
ブの各々の相補的塩基配列領域数nが、3、4、5、又
は6である、請求の範囲第1項記載のプローブ。 - 【請求項3】 前記一対の第1プローブ及び第2プロー
ブの相補的塩基配列領域の塩基数は、それぞれ少なくと
も8個からなる、請求の範囲第1項又は第2項記載のプ
ローブ。 - 【請求項4】 前記一対の第1プローブ及び第2プロー
ブが、DNA、RNAまたはPNAのいずれかから選ば
れる塩基から構成される、請求の範囲第1項又は第2項
記載の一対のプローブ。 - 【請求項5】 下記(a)(b)(c)の特性を有する
複数の一対の第1プローブ及び第2プローブを重合させ
てプローブポリマーを作製する方法。 (a)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をn個所(n≧
3)有する形で構成され、第1プローブの5′端部から
順に設けられた、X1領域、X2領域、X3領域、・・Xn
領域は、第2プローブの5′端部から順に設けられた、
X′1領域、X′2領域、X′3領域、・・X′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 (b)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、両
者を反応させた場合、X1領域はX′1領域とだけハイブ
リダイズし、X2領域はX′2領域とだけハイブリダイズ
し、X3領域はX′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Xn領域はX′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第1プローブ及び第2プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 (c)上記一対の第1プローブ及び第2プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも1つのG(グア
ニン)またはC(シトシン)を配置させ、上記一対の第
1プローブ及び第2プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも1つのC−G結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 - 【請求項6】 前記一対の第1プローブ及び第2プロー
ブの各々の相補的塩基配列領域数nが、3、4、5、又
は6である、請求の範囲第5項記載の方法。 - 【請求項7】 前記一対の第1プローブ及び第2プロー
ブの相補的塩基配列領域の塩基数は、それぞれ少なくと
も8個からなる、請求の範囲第5項又は第6項記載の方
法。 - 【請求項8】 前記一対の第1プローブ及び第2プロー
ブが、DNA、RNAまたはPNAのいずれかから選ば
れる塩基から構成される、請求の範囲第5項又は第6項
記載の方法。 - 【請求項9】 下記(a)(b)(c)の特性を有する
複数の一対の第1プローブ及び第2プローブを重合させ
ることにより得られるプローブポリマー。 (a)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をn個所(n≧
3)有する形で構成され、第1プローブの5′端部から
順に設けられた、X1領域、X2領域、X3領域、・・Xn
領域は、第2プローブの5′端部から順に設けられた、
X′1領域、X′2領域、X′3領域、・・X′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 (b)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、両
者を反応させた場合、X1領域はX′1領域とだけハイブ
リダイズし、X2領域はX′2領域とだけハイブリダイズ
し、X3領域はX′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Xn領域はX′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第1プローブ及び第2プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 (c)上記一対の第1プローブ及び第2プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも1つのG(グア
ニン)またはC(シトシン)を配置させ、上記一対の第
1プローブ及び第2プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも1つのC−G結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 - 【請求項10】 前記一対の第1プローブ及び第2プロ
ーブの各々の相補的塩基配列領域数nが、3、4、5、
又は6である、請求の範囲第9項記載のプローブポリマ
ー。 - 【請求項11】 前記一対の第1プローブ及び第2プロ
ーブの相補的塩基配列領域の塩基数は、それぞれ少なく
とも8個からなる、請求の範囲第9項又は第10項記載
のプローブポリマー。 - 【請求項12】 前記一対の第1プローブ及び第2プロ
ーブが、DNA、RNAまたはPNAのいずれかから選
ばれる塩基から構成される、請求の範囲第9項又は第1
0項記載のプローブポリマー。 - 【請求項13】 下記(1)(2)(3)の工程からな
る、重合用プローブを用いる、試料中のターゲット遺伝
子の測定方法。 (1)重合用プローブとして下記(a)(b)(c)の
特性を有する一対の第1プローブ及び第2プローブを用
い、両プローブのうち、相補的塩基配列領域の一つがタ
ーゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する領域を
保有する、いずれか一方のプローブと試料とを反応させ
該プローブと該試料中のターゲット遺伝子と結合させ
る。 (a)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をn個所(n≧
3)有する形で構成され、第1プローブの5′端部から
順に設けられた、X1領域、X2領域、X3領域、・・Xn
領域は、第2プローブの5′端部から順に設けられた、
X′1領域、X′2領域、X′3領域、・・X′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 (b)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、両
者を反応させた場合、X1領域はX′1領域とだけハイブ
リダイズし、X2領域はX′2領域とだけハイブリダイズ
し、X3領域はX′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Xn領域はX′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第1プローブ及び第2プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 (c)上記一対の第1プローブ及び第2プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも1つのG(グア
ニン)またはC(シトシン)を配置させ、上記一対の第
1プローブ及び第2プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも1つのC−G結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 (2)次いで、上記複数の重合用プローブを反応させ、
ターゲット遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させ
る。 (3)使用した重合用プローブのうちから未反応プロー
ブを洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量
を測定する。 - 【請求項14】 下記(1)(2)(3)の工程からな
る、重合用プローブを用いる、試料中のターゲット遺伝
子の測定方法。 (1)重合用プローブとして下記(a)(b)(c)の
特性を有する一対の第1プローブ及び第2プローブを用
い、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域と、重合用プローブのいずれか一つの領域と相補的
塩基配列を有する領域との二つの領域から構成される、
少なくとも1つのターゲット遺伝子捕捉用プローブを試
料と反応させ、ターゲット遺伝子と結合させる。 (a)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をn個所(n≧
3)有する形で構成され、第1プローブの5′端部から
順に設けられた、X1領域、X2領域、X3領域、・・Xn
領域は、第2プローブの5′端部から順に設けられた、
X′1領域、X′2領域、X′3領域、・・X′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 (b)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、両
者を反応させた場合、X1領域はX′1領域とだけハイブ
リダイズし、X2領域はX′2領域とだけハイブリダイズ
し、X3領域はX′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Xn領域はX′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第1プローブ及び第2プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 (c)上記一対の第1プローブ及び第2プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも1つのG(グア
ニン)またはC(シトシン)を配置させ、上記一対の第
1プローブ及び第2プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも1つのC−G結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 (2)次いで、上記重合用プローブを反応させ、上記捕
捉用プローブと該重合用プローブを結合させ、ターゲッ
ト遺伝子・プローブポリマー複合体を形成させる。 (3)使用した重合プローブのうちから未反応プローブ
を洗浄除去した後、作製されたプローブポリマーの量を
測定する。 - 【請求項15】 前記プローブポリマーに蛍光物質を結
合させ、発光により蛍光量を測定することにより該プロ
ーブポリマーの量を測定する、請求の範囲第13項又は
第14項記載のターゲット遺伝子の測定方法。 - 【請求項16】 前記プローブポリマーの量を、紫外線
に対する光学的な吸収の変化を利用して測定する、請求
の範囲第13項又は第14項記載のターゲット遺伝子の
測定方法。 - 【請求項17】 前記重合用プローブの各々の相補的塩
基配列領域数nが、3、4、5、又は6である、請求の
範囲第13項又は第14項記載のターゲット遺伝子の測
定方法。 - 【請求項18】 重合用プローブとして下記(a)
(b)(c)(d)の特性を有する一対の第1プローブ
及び第2プローブを必須の構成成分とする、試料中のタ
ーゲット遺伝子の検出試薬。 (a)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をn個所(n≧
3)有する形で構成され、第1プローブの5′端部から
順に設けられた、X1領域、X2領域、X3領域、・・Xn
領域は、第2プローブの5′端部から順に設けられた、
X′1領域、X′2領域、X′3領域、・・X′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 (b)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、両
者を反応させた場合、X1領域はX′1領域とだけハイブ
リダイズし、X2領域はX′2領域とだけハイブリダイズ
し、X3領域はX′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Xn領域はX′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第1プローブ及び第2プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 (c)上記一対の第1プローブ及び第2プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも1つのG(グア
ニン)またはC(シトシン)を配置させ、上記一対の第
1プローブ及び第2プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも1つのC−G結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 (d)上記一対の第1プローブ及び第2プローブのう
ち、いずれか一方のプローブの相補的塩基配列領域の一
つがターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域を保有している。 - 【請求項19】 重合用プローブとして下記(a)
(b)(c)の特性を有する一対の第1プローブ及び第
2プローブを用い、少なくとも二つの領域から構成さ
れ、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を有する
領域と、上記重合用プローブのいずれか一つの領域と相
補的塩基配列を有する領域とから構成される、少なくと
も1つのターゲット遺伝子捕捉用プローブと、上記複数
の重合用プローブを必須の構成成分とする、試料中のタ
ーゲット遺伝子の検出試薬。 (a)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、そ
れぞれ、お互いに相補的塩基配列領域をn個所(n≧
3)有する形で構成され、第1プローブの5′端部から
順に設けられた、X1領域、X2領域、X3領域、・・Xn
領域は、第2プローブの5′端部から順に設けられた、
X′1領域、X′2領域、X′3領域、・・X′n領域と、
それぞれ相補的塩基配列を有する。 (b)上記一対の第1プローブ及び第2プローブは、両
者を反応させた場合、X1領域はX′1領域とだけハイブ
リダイズし、X2領域はX′2領域とだけハイブリダイズ
し、X3領域はX′3領域とだけハイブリダイズし、・・
Xn領域はX′n領域とだけハイブリダイズする性質を有
し、両者が結合する場合は、いずれか一つの領域同士の
みがハイブリダイズし、さらに、当該一つの領域で結合
した複数の上記一対の第1プローブ及び第2プローブ
は、お互いにハイブリダイズしてプローブポリマーを形
成する。 (c)上記一対の第1プローブ及び第2プローブの相補
的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも1つのG(グア
ニン)またはC(シトシン)を配置させ、上記一対の第
1プローブ及び第2プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも1つのC−G結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成する。 - 【請求項20】 前記一対の第1プローブ及び第2プロ
ーブの各々の相補領域数nが3、4、5、又は6であ
る、請求の範囲第18項又は第19項記載のターゲット
遺伝子の検出試薬。 - 【請求項21】 前記一対の第1プローブ及び第2プロ
ーブの相補的塩基配列領域の塩基数は、それぞれ少なく
とも8個からなる、請求の範囲第18項又は第19項記
載のターゲット遺伝子の検出試薬。 - 【請求項22】 前記一対の第1プローブ及び第2プロ
ーブが、DNA、RNAまたはPNAのいずれかから選
ばれる塩基から構成される、請求の範囲第18項又は第
19項記載のターゲット遺伝子の検出試薬。
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