CN1364199B - 探针聚合物制备用探针、探针聚合物的制备方法及其应用 - Google Patents

探针聚合物制备用探针、探针聚合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

提供不使用酶、在等温条件下测定目标基因的方法。通过使用复数个互补碱基序列区域为由n(n≥3)个部位构成的成对探针，相互交错杂交，使之形成双链的探针聚合物。通过使互补碱基序列区域的分支点的碱基序列为G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)的结合，使之形成稳定的双链探针聚合物。通过使探针互补区域的一个区域成为与一部分目标基因互补的碱基序列，使之形成目标基因·探针聚合物复合体，从而测定目标基因。

Description

探针聚合物制备用探针、探针聚合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及具有n(n≥3)个互补碱基序列区域的成对探针聚合物制备用探针、使用该探针的探针聚合物制备方法以及利用该方法检测目标基因的方法。 
背景技术
基因工程领域中的DNA解析方法是对新型基因和病原基因的探索、遗传疾病、癌症、感染的诊断等非常有用的方法。作为目标基因的扩增、解析方法，广泛使用聚合酶链式反应方法(PCR法)(USP4683195，4683202)。作为其它方法，有逆转录PCR法(RT-PCR法、Trends　inBiotechnology，10，146-152，1992)、连接酶链式反应(LCR，ligasechainreaction，EP320308)法等。由于这些方法包括对双链DNA的一条链进行解离、由引物合成互补链等步骤，所以必须反复进行几次高温和低温的反应。因此必须使用严格的温度控制装置，由于设定温度需要时间，即产生了时间上的损失。而且，还必须使用昂贵的酶。 
随后，为了解决温度控制的问题，开发了等温条件下的DNA扩增法。例如，链置换型扩增法(SDA，strand displacement amplification，Nucleic Acid Res.，20，1691-1696，1992)、核酸序列扩增法(NASBA，nucleic acid sequence based amplification，Nature，350，9-12，1991)、Qβ复制酶法(BioTechnology，6，1197-1202，1988)等。这些方法具有能够在等温条件下实施的优点，但必须使用DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等昂贵的酶。 
这些等温核酸扩增法在引物的数量和操作方面存在一些问题，因而希望确立采用不使用酶的低成本、简便方法的核酸扩增方法、核酸检测方法。
另一方面，采用分支DNA探针法的基因扩增是通过预先合成支化高分子的单链DNA探针，再使之与目标基因杂交，检测目标基因的方法，为了使支化高分子的单链DNA探针与目标基因杂交，由于分支DNA探针是高分子所以需要花费时间，另外由于支化高分子的分支DNA探针的大小有限度，所以目标基因的检测也有限度。 
鉴于上述问题，本发明者已经提出了不使用酶的新型等温核酸扩增法(探针聚合物的制备方法)(EP 1002877A)。该方法是使用由3个区域构成的成对探针(Honey Comb Probe，下面称作HCP)的方法，第1探针与第2探针各自的3个区域具有互补碱基序列，使二者发生反应时，为了仅与1个区域进行杂交，对各个区域的碱基序列进行了钻研。根据这些钻研，在使复数个成对的探针发生反应时，可以相互杂交，使之形成探针聚合物(Probe alternation link self-assembly reaction，下面称作PALSAR法)。 
通过利用该申请的探针聚合物的制备方法，可以检测出被测体试样中的目标基因，实现所谓不使用酶等温操作的划时代的、简便且廉价的方法。 
发明内容
本发明对上述已经申请的探针聚合物的制备方法进行了进一步的研究，通过将探针聚合物制成更稳定的聚合物，对于该方法的进一步改良进行了尝试。 
为了解决上述问题，本发明者进行了悉心的研究，结果在使用复数对由3个以上互补碱基序列区域构成的成对(2个一组)探针，使之杂交达到相互交错的状态，容易在等温条件下形成双链探针聚合物的基础上，发现对于PALSAR法中使用的成对探针，通过使相互交错进行杂交时各个区域中分支点(两端)的碱基序列成为G(鸟嘌呤)与C(胞嘧啶)的结合，由于各区域分支点中碱基对之间的结合力比A(腺嘌呤)与T(胸腺嘧啶)牢固，该区域全部碱基的π电子产生的特殊相互作用比现有的更强，从而完成了本发明。 
本发明的目的在于提供一种通过使各区域的分支点中碱基对之间的 结合力更加牢固，可以制备更稳定地探针聚合物，同时能够不使用核酸合成酶和支化DNA，在等温条件下高效率地使探针聚合形成探针聚合物，而且，由于形成的聚合物的碱基堆积形成规则的高次结构，表现出260nm处紫外吸收带强度减弱的所谓“减色性”的减色效应，可以确认聚合物状态，进而，在聚合物的碱基堆积之间插入廉价的荧光物质，根据其荧光强度的变化可以确认聚合物的状态，从而可以进行迄今为止尚未有过的低成本而且简便的基因检测的探针聚合物制备用探针、使用该探针的探针聚合物的制备方法、采用该方法制备的探针聚合物、使用该探针聚合物测定目标基因的方法以及目标基因的检测试剂。 
本发明的探针聚合物制备用探针的第1种方式含有具备下述(a)(b)(c)特性的成对的第1探针和第2探针。 
(a)上述成对的第1探针和第2探针分别以具有n为3个以上的互补碱基序列区域的形式构成，由第1探针5’端依次设定的X1区域、X2区域、X3区域、......Xn区域以及由第2探针5’端依次设定的X’1区域、X’2区域、X’3区域……X’n区域分别具有互补的碱基序列。 
(b)上述成对的第1探针和第2探针具有在使二者发生反应时，X1区域只与X’1区域杂交，X2区域只与X’2区域杂交，X3区域只与X’3区域杂交，……Xn区域只与X’n区域杂交的性质，二者结合时，只有其中任意一个区域之间进行杂交，而且通过这一区域结合的复数个上述成对的第1探针和第2探针相互杂交形成探针聚合物。 
(c)在上述成对的第1探针和第2探针的各互补碱基序列区域的两端都配置G(鸟嘌呤)或C(胞嘧啶)，在上述成对的第1探针和第2探针杂交时在互补碱基序列区域的端部至少形成1个胞嘧啶-鸟嘌呤结合。 
本发明的探针聚合物的制备方法是使具有上述(a)(b)(c)特性的复数个成对的第1探针和第2探针聚合制备探针聚合物的方法。 
而且，本发明还包括使用的成对探针互补区域的分支点(两端)的碱基序列通过配置G(鸟嘌呤)或C(胞嘧啶)，在杂交时形成C-G结合，由于碱基堆积(stacking of base)使碱基的π电子产生特殊的相互作用，使之形成稳定的双链聚合物。 
本发明的探针聚合物是通过使具有上述(a)(b)(c)特性的复数个 成对的第1探针和第2探针聚合得到的物质。 
另外，本发明还包括利用该探针聚合物的制备方法，测定试样中含有的微量目标基因的方法。 
本发明目标基因测定方法的第1种方式由下述(1)(2)(3)的步骤组成。 
(1)作为聚合用探针使用具有上述(a)(b)(c)特性的成对的第1探针和第2探针，使两个探针中保持有一个互补碱基序列区域与一部分目标基因具有互补碱基序列区域的任意一个探针与试样发生反应，使该探针与该试样中的目标基因结合。 
(2)接着，使上述复数个聚合用探针发生反应，使之形成目标基因·探针聚合物复合体。 
(3)由使用的聚合用探针中洗涤除去未反应的探针后，测定制备的探针聚合物的量。 
本发明目标基因测定方法的第2种方式由下述(1)(2)(3)的步骤组成。 
(1)作为聚合用探针使用具有上述(a)(b)(c)特性的成对的第1探针和第2探针，使至少一个目标基因捕获用探针与试剂发生反应，使之与目标基因结合，所述目标基因捕获用探针由两个区域构成，即具有与一部分目标基因互补的碱基序列的区域以及具有与聚合用探针中任意一个区域互补的碱基序列的区域。 
(2)接着，使上述聚合用探针发生反应，使上述捕获用探针与该聚合用探针结合，形成目标基因·探针聚合物复合体。 
(3)由使用的聚合探针中洗涤除去未反应的探针后，测定制备的探针聚合物的量。 
本发明的目标基因的测定方法适于通过使上述探针聚合物与荧光物质结合，由发光测定荧光量，或者利用对紫外线的光学吸收的变化，测定该探针聚合物的量。 
本发明的目标基因检测试剂的第1种方式是作为聚合用探针，以具有上述(a)(b)(c)特性之外还具有(d)特性的成对的第1探针和第2探针作为必要组成成分。
(d)上述成对的第1探针和第2探针中，任意一个探针的一个互补碱基序列区域保持有具有与一部分目标基因互补的碱基序列的区域。 
本发明的目标基因检测试剂的第2种方式是作为聚合用探针使用具有上述(a)(b)(c)特性的成对的第1探针和第2探针，将至少一个目标基因捕获用探针和上述复数个聚合用探针作为必要组成成分，所述目标基因捕获用探针由至少两个区域构成，即具有与一部分目标基因互补的碱基序列的区域以及具有与上述聚合用探针中任意一个区域互补的碱基序列的区域。 
本发明的探针聚合物制备用探针的第2种方式含有具备上述(a)(b)特性的成对的第1探针和第2探针。 
上述成对的第1探针和第2探针各自的互补碱基序列区域数n优选3、4、5或6。该互补碱基序列区域的碱基数优选分别至少由8个组成。该第1和第2探针由选自DNA、RNA、PNA中的任意一个碱基构成。 
本发明中所谓的“互补碱基序列”是指完全互补的碱基序列，也指在严紧条件下杂交的碱基序列中有形成探针聚合物能力的碱基序列。 
本发明的成对探针的碱基组成在1对1进行杂交时必须是3个以上的互补基因序列区域中，只有1个的区域之间进行特异杂交。 
图1是表示具有3个互补碱基序列区域的DNA探针的一个实例的模式图。在同一图中，No.1的DNA探针具有X1区域、X2区域和X3区域，No.2的DNA探针具有X’1区域、X’2区域和X’3区域。该No.1的DNA探针与No.2的DNA探针在二者进行杂交时，X1区域只与X’1区域结合，X2区域只与X’2区域结合，X3区域只与X’3区域结合(图2)。 
也就是，使用本发明的互补部分由3个部位构成的成对DNA探针的场合，在使之相互交错地进行杂交时，如图2所示，X1区域只与X’1区域结合，X2区域只与X’2区域结合，X3区域只与X’3区域结合，通过3种结合模式成对探针相互交错地进行杂交。 
通过使用上述结构的探针，2条探针相互交错地结合。具体的说，如图3所示，No.1的DNA探针与No.2的DNA探针立体地相互交错地结合，形成探针聚合物。即，通过如图2所示的3种结合模式相互交错杂交得到的成对探针的复数对能够形成图3所示的示意性的一个实例的双 链探针聚合物。将图3的模式图表示为立体概念结构的一个实例，则如图4所示。图5是改变图3结合模式的模式图，图5模式图的立体概念结构的一个实例如图6所示。 
图7是表示互补部分由4个部位构成的成对DNA探针的一个实例的模式图。在同一图中，No.3的DNA探针具有X1区域、X2区域、X3区域和X4区域，No.4的DNA探针具有X’1区域、X’2区域、X’3区域和X’4区域。该No.3的DNA探针与No.4的DNA探针在二者进行杂交时，X1区域只与X’1区域结合，X2区域只与X’2区域结合，X3区域只与X’3区域结合，X4区域只与X’4区域结合(图8)。 
也就是，使用本发明的互补部分由4个部位构成的成对DNA探针，在使之相互交错地进行杂交时，如图8所示，X1区域只与X’1区域结合，X2区域只与X’2区域结合，X3区域只与X’3区域结合，X4区域只与X’4区域结合，通过4种结合模式成对探针相互交错地进行杂交。 
通过使用上述结构的探针，2条探针相互交错地结合。具体的说，如图9所示，No.3的DNA探针与No.4的DNA探针立体地相互交错地结合，形成探针聚合物。 
如图8、图11和图13所示，如果具有使成对DNA探针的互补部分由4个部位、5个部位和6个部位构成的成对探针进行杂交的方法，在理论上可以增加互补碱基序列区域达到这一数目之上。 
图14是表示互补部分由n(n≥3)个部位构成的成对DNA探针的其它实例的模式图。在同一图中，No.9的DNA探针具有X1区域、X2区域、X3区域……Xn-1区域、Xn区域，No.10的DNA探针具有X’1区域、X’2区域、X’3区域……X’n-1区域、X’n区域。 
该No.9的DNA探针与No.10的DNA探针在二者进行杂交时，X1区域只与X’1区域结合，X2区域只与X’2区域结合，X3区域只与X’3区域结合，Xn-1区域只与X’n-1区域结合，Xn区域只与X’n区域结合(图14)。 
也就是，使用本发明的互补部分由n个部位构成的成对DNA探针，在相互交错地进行杂交时，如图14所示，X1区域只与X’1区域结合，X2区域只与X’2区域结合，X3区域只与X’3区域结合，Xn-1区域只与X’n-1区域结合，Xn区域只与X’n区域结合，通过n种结合模式，成对的探针相互 交错地进行杂交。 
DNA探针与RNA探针、或RNA探针之间、PNA探针之间、PNA探针与DNA探针、或PNA探针与RNA探针杂交的场合，其杂交原理与图8、图11、图13和图14所示的DNA探针之间杂交的场合相同。 
探针内互补碱基序列区域数n的数目，只要这些成对的探针可以聚合形成探针聚合物即可，并没有特别限定，但如果考虑费用和效率，3～5个部位比较合适。 
而且，本发明是通过使PALSAR法中使用的成对探针相互交错地杂交时分支点的碱基序列为G(鸟嘌呤)与C(胞嘧啶)的结合，由于碱基堆积(stacking of base)使碱基的π电子产生特殊的相互作用，从而形成稳定的双链聚合物的方法。 
DNA或低聚核苷酸的双螺旋结构中，碱基位于其中心附近，A(腺嘌呤)与T(胸腺嘧啶)和G(鸟嘌呤)与C(胞嘧啶)特异性地通过氢键结合形成碱基对。通过3个氢键连接的G与C〔图15(b)〕与通过2个氢键连接的A与T〔图15(a)〕相比，结合得较强，这一点从图16的图表所示的使用Hatim T.Allawi等(Biochemistry　36，10581-10594.1997.)的Nearest-Neighbor Thermodynamic Parameters的结果也可以看出，因此如图17(a)和图17(b)所示，在PALSAR法中，由于理论上在3个部位进行杂交，通过使所使用的成对探针相互交差的圆形所示部分的结合成为G与C，可以使聚合物的形成稳定化。 
另外，该碱基对形成一平面，由于几乎全部形成长方形板的形状，该平面对于双螺旋轴几乎成直角。因此，各碱基对均处于相互平行的位置，其间隔为3.4
Figure DEST_PATH_S01800501220040824D000031
〔图15(C)〕。 
而且，通过该碱基对平面间隔3.4
Figure DEST_PATH_S01800501220040824D000032
的碱基堆积(stacking of base)产生碱基π电子引起的特殊相互作用，这是双螺旋结构稳定化的重要原因。另外，已知该碱基堆积表现出DNA或低聚核苷酸在260nm处的紫外吸收带强度降低约30％的所谓“减色性”的减色效应。 
在PALSAR法中，各区域的分支点的结合力弱以及该分支点之间区域的杂交不稳定，因此设计通过增加由于区域中全部碱基π电子引起的特殊相互作用产生的碱基堆积(stacking of base)效果强度，使PALSAR法 中相互交错的各领域的杂交反应更加牢固。 
另外，由于PALSAR法中形成的聚合物的碱基堆积呈有规则的高次结构，使之表现出260nm处的紫外吸收带强度减弱的所谓“减色性”的减色效应，可以确认聚合物的状态，进而在聚合物的碱基堆积之间插入荧光物质，根据其荧光强度的变化确认聚合物状态。 
如图18所示，PALSAR法中使用的成对探针相互交错地进行杂交时的区域为约20个碱基(20base)，通过使圆形表示的分支点的结合牢固，增加堆积效果(stacking effect)，结果认为其分支点之间20个碱基的区域的杂交稳定。 
上述互补区域分支点上设置的C或G的数目至少为1个碱基，也可以是多数个。可以考虑各互补区域的碱基序列适当选择。设置多数个C或G时，如图19所示，C、G的顺序没有特别的限定，可以自由组合。另外，下述记载的目标基因的检测方法中，采用与一部分目标基因互补的碱基序列作为探针的一个区域时，也可以进行选择使互补区域的端部设置C或G。 
通过使用上述聚合用探针，可以检测出试样中微量的目标基因。例如，成对的聚合用探针的一个互补区域采用与一部分目标基因互补的碱基序列，使该探针与试样反应后，使成对的探针反应。其次，通过测定与目标基因结合的探针聚合物的量，可以测定目标基因。 
作为其它方法，例如可以采用由具有与一部分目标基因互补的碱基序列的区域以及具有与聚合用探针的一个区域互补的碱基序列的区域这2个区域构成的捕获用探针，按照与上述相同的方法测定目标基因的量。捕获用探针至少为1种，也可以根据选择几种目标基因的互补部位，采用多种捕获用探针。 
该方法不仅可以直接检测出目标基因，而且也可以间接地测定目标物质。也就是说，可以使需要与目标基因结合后进行测定的物质(目标物质)与核苷酸结合，以该核苷酸作为目标基因，按照上述方法进行测定。 
上述探针的构成在DNA探针的场合是以磷酸、糖与碱基(腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶)作为成分的单链片断，在RNA探针的场合 是以碱基腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶作为成分的单链片断。PNA是DNA的“磷酸和糖”的骨架替换为“N-(2-氨基乙基)甘氨酸衍生物”得到的结构，碱基成分与DNA和RNA相同。 
构成聚合用探针(HCP)的核酸通常由DNA或RNA构成，也可以是核酸类似体。作为核酸类似体，例如肽核酸(PNA，WO92/20702)。另外，成对的探针通常由同种的核酸构成，但是，例如DNA探针与RNA探针构成一对也可以。即，探针的核酸种类可以由DNA、RNA或核酸类似体(例如PNA)中选择。另外，一个探针内的核酸组成没有必要仅由一种——例如DNA——构成，必要时，也可以使用例如由DNA和RNA构成的探针(嵌合探针)，这也包括在本发明内。 
探针的各互补碱基序列区域的长度按碱基数计至少为5个碱基，优选至少为8个碱基，更优选10个碱基～100个碱基，进一步优选15～30个碱基。 
这些探针可以按照公知的方法合成。例如，DNA探针的场合，可以使用Applied Biosystem Inc.的DNA合成仪394型，按照亚磷酰胺(Phosphoramidite)法合成。另外，作为其它方法，有磷酸三酯法、H-膦酸酯法等，可以采用任何一种方法合成。 
附图说明
图1是表示一对(2根)DNA探针的一个实例的模式图。 
图2是表示一对DNA探针的结合方式的一个实例的模式图。 
图3是表示一对DNA探针相互交错地进行杂交时可能的聚合物形成的模式图。 
图4是表示图3模式图的立体概念结构的一个实例的模式图。 
图5是改变图3的结合模式的模式图。 
图6是表示图5模式图的立体概念结构的一个实例的模式图。 
图7是表示n＝4时一对(2根)DNA探针的一个实例的模式图。 
图8是表示图7所示一对DNA探针的结合方式的一个实例的模式图。 
图9是表示n＝4时一对DNA探针相互交错地进行杂交时可能的聚合物形成的一个实例的模式图。
图10是表示n＝5时一对(2根)DNA探针的一个实例的模式图。 
图11是表示图10所示一对DNA探针的结合方式的一个实例的模式图。 
图12是表示n＝5时一对DNA探针相互交错地进行杂交时可能的聚合物形成的一个实例的模式图。 
图13是表示n＝6时一对DNA探针的结合方式的一个实例的模式图。 
图14是表示互补部位为n处时一对DNA探针的结合方式的一个实例的模式图。 
图15是表示双链低聚核苷酸的碱基对之间氢键结合状态的图。 
图16是表示Hatim T.Allawi等(Biochemistry36，10581-10594.1997.)的Nearest-Neighbor Thermodynamic Parameters的图表。 
图17是表示堆积效果导致聚合物形成稳定化的原理的模式图。 
图18是表示堆积效果导致杂交稳定化的原理的模式图。 
图19是表示合成利用堆积效果的HCP(取代1个以上碱基时)的模式图。 
图20是表示一根探针中互补部分的长度不同的一对(2根)DNA探针的一个实例的模式图。 
图21是表示图20所示一对DNA探针相互交错地进行杂交时可能的聚合物形成的模式图。 
图22是表示插入用限制酶可切断的部位的一对(2根)DNA探针的一个实例的模式图。 
图23是表示探针之间立体地相互交错结合形成聚合物后，用限制酶切断时的一个实例的模式图。 
图24是表示使用本发明的一对DNA探针直接检测目标基因的方法的模式图，表示首先对于目标基因，使目标基因与本发明的一对DNA探针(图中的聚合用探针)上具有互补区域的探针进行杂交，之后通过加入本发明的一对DNA探针(图中的聚合用探针1和聚合用探针2)，本发明的一对DNA探针以与目标基因杂交的状态形成双链聚合物，因此可以容易地检测出目标基因的图。 
图25是表示使用一对n＝4的探针中一个探针的部分基因是与目标 基因互补的基因构成的DNA探针(图中的聚合用探针1)以及与该DNA探针成对的DNA探针(图中的聚合用探针2)，使目标基因与复数对成对的基因进行杂交，形成双链聚合物，检测目标基因的方法的模式图。 
图26是表示使用一对探针中一个探针的部分基因是与目标基因互补的基因构成的DNA探针(图中的聚合用探针1)以及与该DNA探针成对的DNA探针(图中的聚合用探针2)，使目标基因与复数对成对的基因进行杂交，形成双链聚合物，检测目标基因的方法的模式图。 
图27是表示实施例1的效果的照片。 
图28是表示实施例2的效果的照片。 
图29是表示实施例3的效果的照片。 
图30是表示实施例5的效果的照片。 
图31是表示实施例6的效果的照片。 
图32是表示合成利用堆积效果的HCP的图。 
图33是表示由利用堆积效果的HCP形成聚合物时，反应温度对聚合物形成的影响的图。 
图34是表示由利用堆积效果的HCP形成聚合物时，反应时间对聚合物形成的影响的图。 
图35是表示由利用堆积效果的HCP形成聚合物时，HCP浓度对聚合物形成的影响的图。 
图36是表示由利用堆积效果的HCP形成聚合物时，较短反应时间内HCP浓度对聚合物形成的影响的图。 
图37是表示紫外线对聚合物的光化学变化的图。 
图38是表示荧光物质对聚合物的光化学变化中，以插入荧光物质的状态检测聚合物时的图。 
图39是表示荧光物质对聚合物的光化学变化中，插入荧光物质后，用EtOH精制聚合物进行检测时的图。 
图40是表示合成利用堆积效果的HCP(取代一个碱基时)的模式图。 
具体实施方式
本发明是使用具有n(n≥3)个互补碱基序列区域的成对的探针， 使两者在等温且不存在酶的条件下进行反应，从而形成探针聚合物。使用的探针的根数没有特别的限定，可以在102～1015根的范围内使用。反应缓冲液的组成、浓度没有特别的限定，优选使用核酸扩增时惯用的通常的缓冲液。pH也是在常用的范围内较合适，优选使用pH7.0-pH9.0范围的缓冲液。反应温度为40-80℃，优选55-65℃。这些条件没特别的限定。 
该探针聚合物的制备方法可以应用于试样中目标基因的检测。 
如果用更具体的例子说明本发明的构成，一根探针中互补碱基序列区域的长度(碱基的数目)可以相同或不同，例如图20所示DNA探针之间的场合，使No.11探针和No.12探针进行杂交时，X1区域与X’1区域通过24个碱基杂交，X2区域与X’2区域通过22个碱基杂交，X3区域与X’3区域通过20个碱基杂交，形成探针聚合物(图21)。 
如果用更具体的例子说明本发明的构成，图19之①的DNA探针之间的场合，如图22所示，使No.13探针与No.14探针进行杂交时，也可以有限制酶可切断的部位(下划线部分被称作Hae III的酶切断)。 
总之，探针之间相互交错地立体结合形成高分子后，使用限制酶可以防止在之后的其他试验操作中该高分子交叉污染(图23)。 
本发明是通过使图17中用圆形表示的这种交叉杂交时分支点的碱基序列为G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)的结合，由于碱基堆积(stacking ofbase)使碱基的π电子产生特殊的相互作用，形成稳定的双链聚合物的方法。作为一个实例，图17中表示了一对探针具有X1区域与X’1区域，X2区域与X’2区域，X3区域与X’3区域进行杂交的3个互补碱基序列区域的场合。 
图40(a)中表示了使用复数对互补部分由n(n≥3)个部位构成的成对的探针(HCP)，通过使之相互交错地进行杂交，形成双链高分子的探针聚合物制备方法，以及应用(PALSAR法)该方法时使用的成对的探针。 
总之，如图40(b)，通过使该分支点的碱基为G-C结合，使聚合物的形成稳定化。另外，该分支点的G-C种类、数目如图19之①～⑤所示，可以自由组合，只要是G-C的碱基序列，没有特别的限定。
本发明的目标基因检测方法的第1种方式例如图24和图25所示，一对探针中一根探针的一个互补区域的碱基序列由与一部分目标基因互补的碱基序列构成，首先使该探针与目标基因反应后，使复数对成对的探针杂交，形成目标基因·探针聚合物复合体。用适当的方法分离该复合体后，通过测定探针聚合物的量可以测定目标基因量。 
本发明的目标基因检测方法的第2种方式例如图26所示，一对探针分别由与一对探针中任意一根探针的区域相同的碱基序列以及与一部分目标基因互补的碱基序列构成的探针(捕获用探针)，预先使该捕获用探针与目标基因进行杂交后，按照上述探针聚合物的制作方法使复数对成对的探针杂交，形成双链聚合物，使探针扩增进行检测。 
这里，目标基因的检测中使用的捕获用探针至少由二个领域构成，即具有与一部分目标基因互补的碱基序列的领域以及具有与聚合用探针的一个区域互补的碱基序列的领域，可以自由的进一步增添聚合用探针的其他互补碱基区域等。但是，不言而喻其条件是不妨碍作为捕获用探针的功能。检测目标基因时，使用的捕获用探针至少使用1种，必要时可以通过选择与目标基因互补的碱基序列多数个区域，使用多数种捕获用探针。 
在上述目标基因检测方法中，形成的探针聚合物的测定例如下述方法等。例如，使得到的探针聚合物与溴乙锭、Oligreen、SYBR Green I等插入色素结合，可以通过荧光检测扩增的聚合物。 
另外，也可以作为使用的成对聚合用探针中用于预先检测的标识物，增添125I或32P等放射性同位素、地高辛配基(digoxigenin)或吖啶翁·酯等发光·显色物质、用于利用抗生物素蛋白上结合的荧光·发光·显色物质等的生物素等、或用于利用荧光共振能转移(FRET)的供体荧光素和受体荧光素，检测目标基因。标识物质没有特别的限定。 
上述成对的探针例如DNA探针之间，DNA探针与RNA探针、或RNA探针之间、PNA探针之间、PNA探针与DNA探针、或PNA探针与RNA探针。
另外，一对探针的组成碱基并不限于DNA或RNA等的一种碱基，例如即使是DNA与PNA构成的所谓嵌合探针，本发明也可以实施。 
上述成对探针的互补部分的碱基种类可以从C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)、G(鸟嘌呤)、A(腺嘌呤)、U(尿嘧啶)等中任意选择，没有特别的限定。另外，1根探针中存在的互补部分之间的长度可以分别相等，也可以不同。使上述成对的探针杂交形成双链聚合物时使用的探针的根数优选在102～1015根的范围内使用。 
检测目标基因的本发明的具体方法例如首先使被测试样与至少1种捕获用探针反应，使目标基因与捕获用探针结合。这时，使用至少1种生物素化捕获用探针。其次，添加成对的聚合用探针中一方使之反应后，再使之与另一聚合用探针反应，形成目标基因·探针聚合物复合体。接着，使抗生物素蛋白化磁性体粒子(磁性体颗粒)反应，与该复合体结合，利用颗粒的性质由未反应物质中分离该复合体。最后，使之与溴乙锭反应，通过紫外线照射定量探针聚合物的量，从而测定被测试样中目标基因的量。由于形成的探针聚合物容易分离，也可以使用磁性颗粒。 
作为其它方法，例如可以使用将含有与一部分目标基因互补的碱基序列的低聚核苷酸固相化的孔。首先，将被测试样添加到孔中，使试样中的目标基因以及固相化的含有与一部分目标基因互补的碱基序列的低聚核苷酸结合。其次，按照上述方法，依次添加聚合用探针，形成探针聚合物进行结合。与未反应物质的分离可以通过洗涤孔很容易地进行，最后通过测定探针聚合物的量，可以测定目标基因。 
按照该方法，也可以应用于DNA芯片。 
本发明中的目标基因(DNA或RNA)测定用试样可以适用可能含有该核酸的所有试样。目标基因是可以从试样中适当制备或分离的物质即可，没有特别的限定。例如血液、血清、尿、粪便、脑髓积液、组织液、细胞培养物等来源于生物的试样，存在含有或感染病毒、细菌、霉菌等的可能性的试样等。另外，也可以使用按照公知方法使试样中的目标基因扩增的DNA或RNA等核酸。目标基因为双链DNA的场合，可以按照公知的方法制成单链后使用。 
本发明还提供利用本发明的方法检测目标基因的试剂盒。作为一个 实例，该试剂盒以至少1种目标基因捕获用探针(含有至少1种生物素化捕获用探针)、成对的聚合用探针、抗生物素蛋白化磁性体粒子、溴乙锭为必须构成成分。使用含有与目标基因互补的碱基序列的聚合用探针时，可以省略捕获用探针。 
另外，作为其它实例，也能够以将含有与一部分目标基因互补的碱基序列的低聚核苷酸固定化的固相体(例如孔)作为必须成分。此外，可以自由含有探针聚合物检测用试剂、反应用缓冲液、稀释液、标准品、吸附防止剂等，没有特别的限定。 
固相载体的材料例如玻璃、塑料(例如聚苯乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯等)、金属等，载体的形状如杯型、平板型等，没有特别的限定。实施例 
以下，例举本发明的实施例进行说明，但本发明并不只限于这些实施例，这是毋庸置疑的。 
1、实施例1和实施例2中使用的DNA探针 
探针1： 
5’—TgA CTT ACT TAA CCg gAA ACA T·AAg CAg gAT CCT CTA AgC CTgA· 
Figure S01800501219960403D000151
 AgT ATT TAA Cgg Tgg TAT 
Figure S01800501219960403D000152
探针2： 
3’— 
Figure S01800501219960403D000153
 TCA TAA ATT gCC ACC ATA 
Figure S01800501219960403D000154
 ·TTC gTC CTA ggA gAT TCg gAcT·ACT gAA TgA ATT ggC CTT TgT A—5’ 
探针3： 
5’—TgC CgA CCg gCg AgC 
Figure S01800501219960403D000155
 ·TAg CAT ggC CCT CTA 
Figure S01800501219960403D000156
 ·CTT ATC ggCCTC gAg A—3’ 
探针4： 
3’  TAg CCg gAg CTC T·ATC gTA CCg ggA gAT 
Figure S01800501219960403D000158
 ·ACg gCT ggCCgC TCg  5’ 
2、实施例3和实施例4中使用的合成HCV-RNA和各种DNA探针 
合成C型肝炎病毒5’—noncoding区域的HCV-RNA(下面简称为合成HCV—RNA) 
HCV—RNA捕获用探针A：
5’(磷酸化)—TAg AgC gTg CAg ATA gTC gAT·CCT CAC Agg ggA gTgATT CAT ggT—3’(无意义的碱基序列)(与HCV-RNA互补的碱基序列) 
HCV-RNA捕获用探针B： 
5’(生物素标识)—TAg AgCgTg CAg ATA gTC gAT·CCT CAC Agg ggAgTg ATT CAT ggT—3’(无意义的碱基序列)(与HCV-RNA互补的碱基序列) 
捕获用探针C： 
3’—TAC TTA gTg Agg ggA CAC TCC·gAA TAA gTC ATA gCT CAT—5’(与HCV—RNA互补的碱基序列)(与探针5互补的碱基序列) 
捕获用探针D： 
3’—gCC CAg gAA AgA ACC TAg TTg·gAA TAA gTC ATA gCT CAT—5’(与HCV—RNA互补的碱基序列)(与探针5互补的碱基序列) 
捕获用探针E： 
3’—gCC CAg gAA AgA ACC TAg TTg·gAA TAA gTC ATA gCT CAT—5’(与HCV—RNA互补的碱基序列)(与探针5互补的碱基序列) 
探针5： 
5’—CTT ATT CAg TAT CgA gTA·TAg CAg gAT CCC TCT AAg·TgC CggACC AgC gAg Cgg—3’ 
(与捕获用探针C·D·E互补的碱基序列) 
探针6： 
3’—ACg gCC Tgg TCg CTC gCC·ATC gTC CTA ggg AgA TTC·gAA TAAgTC ATA gCT CAT—5’ 
探针7： 
3’(生物素化)—ACg gCC Tgg TCg CTC gCC·ATC gTC CTA ggg AgATTC·gAA TAA gTC ATA gCT CAT—5’ 
(实施例1) 
1、目的 
使用本发明中成对的DNA探针——聚合用探针，证明杂交温度产生的聚合效果。 
2、材料
1)聚合时使用探针1、探针2。 
2)使用20×SSC(3M-NaCl，0.3M-C6H5O7Na3·2H2O，pH7.0)作为缓冲液。 
3、方法 
向0.2mL灭菌的微管中加入配制成1013模板/μL的探针1和探针2各5μL，加入40μL的20×SSC，盖上盖后，在94℃下煮沸30秒，分别在50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃下加热30分钟。 
加热后，使用0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，通过溴化乙锭染色确认聚合效果。 
4、效果 
图27用照片表示使用0.5％的琼脂糖凝胶，在100V下电泳30分钟的实施例1的效果。 
琼脂糖凝胶是能够根据其大小分离DNA分子的凝胶，一般地，0.5％的琼脂糖凝胶可以用于分离30,000～40,000个碱基对的DNA分子。 
图27的照片表示成对DNA探针依赖于杂交的温度相互交错准确地形成双链高分子的结果，即随着温度的上升，在0.5％琼脂糖凝胶中已经大到不能电泳的高分子。 
(实施例2) 
1、目的 
证明用本发明中成对的DNA探针——聚合用探针聚合得到的聚合物能够被限制酶切割。 
2、材料 
1)聚合时使用探针3、探针4。 
2)使用Hae III(Dacala酿酒公司制)作为限制酶。 
3)使用M-Buffer(Dacala酿酒公司制)作为限制酶用缓冲液。 
4)使用20×SSC作为缓冲液。 
3、方法 
向0.2mL灭菌的微管中加入配制成1013模板/μL的探针3和探针4各5μL，再加入5μL的20×SSC和35μL的灭菌蒸馏水，盖上盖得到反应液 A，同样加入配制成1013模板/μL的探针3和探针4各2.5μL，再加入5μL的20×SSC和40μL的灭菌蒸馏水，盖上盖得到反应液B，将反应液A和反应液B在94℃下煮沸30秒，分别在62℃下加热30分钟。 
加热后，向40μL的反应液中加入5μL的M－Buffer和5μL的Hae III，37℃下反应24小时，使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，通过溴化乙锭染色确认聚合得到的聚合物被限制酶切割。 
4、效果 
图28用照片表示使用2.0％的琼脂糖凝胶，在100V下电泳30分钟的实施例2的效果。 
表示相互交错准确地形成双链聚合物的一对DNA探针能够被限制酶切割成最小单位。 
(实施例3) 
1、材料 
1)聚合时使用探针5、探针6。 
2)B/F分离用固相使用结合有链球菌抗生物素蛋白的磁性颗粒。(商品名：Streptavidin MagneSphere/Promega公司制)。 
3)使用20×SSC和0.5×SSC(20×SSC的40倍稀释液)作为缓冲液。 
2、方法 
向0.2mL灭菌的微管中分别加入配制成101模板/10μL、102模板/10μL、103模板/10μL、104模板/10μL、105模板/10μL、106模板/10μL、107模板/10μL、108模板/10μL、109模板/10μL、1010模板/10μL的合成HCV－RNA各10μL，接着加入配制成1013模板/μL的HCV－RNA捕获用探针B、捕获用探针C、捕获用探针D、捕获用探针E各1μL，加入配制成1013模板/μL探针510μL以及20×SSC25μL。封闭微管的盖，用混合器混合后，62℃下加热60分钟。 
温度下降至室温后，向各微管中加入配制成1013模板/μL的探针6各5μL，封闭微管的盖，用混合器混合后，62℃下加热60分钟。 
温度下降至室温后，向各微管中加入10μL的StreptavidinMagneSphere(以下称作磁性颗粒)，37℃下反应30分钟。反应后，用磁铁捕集磁性颗粒，除去上清液后，加入0.5×SSC50μL和配制成10μg/mL 的溴化乙锭(和光纯药公司制)10μL，室温下使之反应20分钟。 
反应后用磁铁捕集磁性颗粒，除去上清液后，加入0.5×SSC50μL，立即用磁铁捕集磁性珠，除去上清液后，加入0.5×SSC50μL，将全部量转移至平底的96孔板中，由下面照射紫外线，拍摄因插入溴化乙锭而发出荧光的探针聚合物的照片。 
3、效果 
图29表示由96孔板的下面照射紫外线，将溴化乙锭的荧光拍摄成照片的状态。 
结果如图29的照片所示，确认在1010模板/10μL时荧光最强，相应于合成HCV－RNA的量，荧光逐渐变弱。 
(实施例4) 
1、材料 
1)聚合时使用探针5、探针7。 
2)B/F分离用固相使用96孔板。(商品名：nucleoLinkTM/Nunc公司制) 
3)使用“HRP－Streptavidin/ZYMED LABORATORIES，INC.”作为Peroxidase Conjugated Streptavidin。 
4)使用“过氧化物酶用显色试剂盒T/住友Bekelito公司制”作为显色试剂。 
5)使用2N－H2SO4作为酶反应停止液。 
6)使用20×SSC和0.5×SSC作为缓冲液。 
2、方法 
向预先结合有HCV－RNA捕获用探针A(但未实施特别的封闭处理)的96孔板(NucleoLinkTM/Nunc公司制)的各孔中分别加入配制成0模板/10μL、103模板/10μL、104模板/10μL、105模板/10μL、106模板/10μL、107模板/10μL的合成HCV－RNA各10μL，接着加入配制成1011模板/μL捕获用探针C、捕获用探针D、捕获用探针E各10μL、配制成1011模板/μL的探针510μL以及20×SSC60μL。 
用吸移管混合后，在94℃下加热30秒，62℃下加热60分钟。 
温度下降至室温后，向各微管中分别加入制备成1011模板/μL的探针 510μL、探针720μL。用吸移管混合后，在94℃下加热30秒，62℃下加热60分钟。 
温度下降至室温后，用含有0.1％-Tween20的0.5×SSC洗涤4次，向各孔中加入“HRP—Streptavidin”100μL，37℃下加热20分钟。吸去各孔的液体后，用含有0.1％-Tween20的0.5×SSC洗涤4次。 
向各孔中加入“过氧化物酶用显色试剂盒T”100μL，在暗处(室温)反应10分钟。反应后，加入酶反应停止液100μL，测定450nm处的吸光度。 
3、效果 
实施例4的效果如表1所示。 
相互交错杂交形成双链聚合物的成对DNA探针中，通过一方标识的Peroxidase Conjugated Streptavidin显色，根据加入103～107模板的合成HCV-RNA的量确认显色。 
表1 
Figure S01800501219960403D000201
(实施例5) 
1、目的 
使用本发明的互补部分由4个部位构成的DNA探针，证明杂交温度产生的聚合效果。 
2、材料 
聚合时使用下述探针8、探针9。 
探针8：
5’－CGGGTCCTTTCTTGG·CATCACAACCCAGCG·TTCCTGACCAGCGAG·AGCAGGATCCCTCT－3’ 
探针9： 
5’－CCAAGAAAGGACCCG·CGCTGGGTTGTGATG·CTCGCTGGTCAGGAA·AGAGGGATCCTGCTA－3’ 
使用20×SSC作为缓冲液。 
3、方法 
分别向0.2mL灭菌的微管中加入配制成1013模板/μL的探针8和探针9各5μL，加入40μL的20×SSC，盖上盖后，分别在54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、70℃下加热30分钟。 
加热后，使用0.5％琼脂糖凝胶进行电泳，通过溴化乙锭染色确认聚合效果。 
4、效果 
图30表示使用0.5％琼脂糖凝胶在100V下电泳30分钟的实施例5的效果。确认依赖于各种温度形成的双链聚合物。 
(实施例6) 
1、目的 
使用本发明的互补部分由5个部位构成的DNA探针，证明杂交温度产生的聚合效果。 
2、材料 
聚合时使用探针10、探针11。 
探针10： 
5’－CGGGTCCTTTCTTGG·CATCACAACCCAGCG·TTCCTGACCAGCGAG·TAGCAGGATCCCTCT·CTTATTCAGTATCGA－3’ 
探针11： 
5’－CCAAGAAAGGACCCG·CGCTGGGTTGTGATG·CTCGCTGGTCAGGAA·AGAGGGATCCTGCTA·TCGATACTGAATAAG－3’ 
使用20×SSC作为缓冲液。 
3、方法 
分别向0.2mL灭菌的微管中加入配制成1013模板/μL的探针10和探针 11各5μL，加入40μL的20×SSC，盖上盖后，分别在54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、70℃下加热30分钟。加热后，使用0.5％琼脂糖凝胶进行电泳，通过溴化乙锭染色确认聚合效果。 
4、效果 
图31表示使用0.5％琼脂糖凝胶在100V下电泳30分钟的实施例6的效果。确认依赖于各种温度形成的双链高分子。 
(合成例1) 
按照常规方法合成具有图32所示碱基序列的低聚核苷酸·探针。 
将各区域分支点的碱基对设计成由上开始全部为G-C结合、一半为G-C结合以及全部为A-T结合进行合成，各HCP由成对的互补的2条低聚核苷酸·探针组成，分别命名为HCP-1、HCP-2、HCP-3。 
用灭菌超纯水溶解使各探针的浓度达到100pmol/μL，用于下述试验。 
(实施例7) 
1、方法 
向0.2mL的管中分别加入HCP-1(100pmol/μL)的低聚核苷酸对1μL、HCP-2(100pmol/μL)的低聚核苷酸对1μL、HCP-3(100pmol/μL)的低聚核苷酸对1μL，向各反应管中分别注入20×SSC12μL、DW2(灭菌再蒸馏水)6μL，使总量达到20μL，通过涡流混合后，停止旋转。 
将该混合液配制成各HCP为5条，分别在“94℃10秒、62℃30分钟”、“94℃下10秒、64℃下30分钟”、“94℃下10秒、66℃下30分钟”、“94℃下10秒、68℃下30分钟”、“94℃下10秒、70℃下30分钟”的温度下进行反应。 
此时，将各加热反应管最终下降至15℃，在4℃下保存，留待电泳。 
使用0.5％琼脂糖凝胶(Nusive-3：1/Tacala公司制)，使反应后的液体10μL中混入染色——BPB(溴百里酚蓝)2μL得到的试样在100V下进行电泳35分钟。 
2、结果 
62℃的反应温度下，HCP-1已经开始形成聚合物，但HCP-2梯状的产物很多，聚合物的形成并不充分。另外，HCP-3在62℃的反应温度下，也包括非特异的结合，全部泳道(lane)为梯状。
因此，确认如图33的照片所示，使相互交错杂交时分支点的碱基序列为G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)结合的HCP-1，能够在更低的反应温度下有效地形成稳定的双链聚合物。 
(实施例8) 
1、方法 
向0.2mL的管中分别加入HCP-1(100pmol/μL)的低聚核苷酸对1.5μL、HCP-2(100pmol/μL)的低聚核苷酸对1.5μL、HCP-3(100pmol/μL)的低聚核苷酸对1.5μL，向各反应管中分别注入20×SSC36μL、DW221μL，使总量达到60μL，通过涡流混合后，停止旋转。 
将该混合液配制成各HCP为5条，分别以“94℃10秒、64℃0小时(on ice)”、“94℃下10秒、64℃下0.5小时”、“94℃下10秒、64℃下3小时”、“94℃下10秒、64℃下16小时”、“94℃下10秒、64℃下16小时(vibration)”的反应时间形成聚合物。 
此时，将各加热反应管最终下降至15℃，在4℃下保存，留待电泳。 
使用0.5％琼脂糖凝胶(Nusive-3：1/Tacala公司制)，使反应后的液体10μL中混入染色液——BPB(溴百里酚蓝)2μL得到的试样在100V下进行电泳35分钟。 
2、结果 
可以得知在0.5小时的反应时间内，HCP-1已经开始形成聚合物，反应3小时未反应探针(泳道下部的带)的量很少，大部分在形成聚合物时被消耗。另一方面，HCP-2梯状的产物很多，反应0.5小时聚合物的形成不充分。另外，HCP-3反应0.5小时根本不能形成聚合物。 
因此，确认如图34的照片所示，使相互交错杂交时分支点的碱基序列为G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)结合的HCP-1，能够在更短时间内有效地形成稳定的双链聚合物。 
(实施例9) 
1、方法 
向0.2mL的反应管中分别加入HCP-1、HCP-2、HCP-3的各低聚核苷酸对2μL，使各低聚核苷酸探针的浓度分别达到“10pmol/μL”、“5.0pmol/μL”、“2.5pmol/μL”，分别注入20×SSC12μL、DW26μL，使 总量达到20μL，将得到的混合液通过涡流混合后，停止旋转。 
使该混合液在“94℃下10秒、64℃下30分钟”下反应。 
此时，将各加热反应管最终下降至15℃，在4℃下保存，留待电泳。 
使用0.5％琼脂糖凝胶(Nusive-3：1/Tacala公司制)，使反应后的液体10μL中混入染色液——BPB(溴百里酚蓝)2μL得到的试样在100V下进行电泳35分钟。 
2、结果 
在探针浓度最低的“2.5pmol/μL”时，HCP-1已经形成聚合物，HCP-2有梯状的产物，聚合物的形成并不充分。另外，HCP-3在“2.5pmol/μL”的探针浓度下没有形成聚合物。 
因此，确认如图35的照片所示，使相互交错杂交时分支点的碱基序列为G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)结合的HCP-1，能够在更低的探针浓度下有效地形成稳定的双链聚合物。 
(实施例10) 
1、方法 
向0.2mL的管中分别注入HCP-1、HCP-2和HCP-3的各低聚核苷酸对各1μL、20×SSC12μL、DW27μL使探针浓度达到“2.5pmol/μL”，对于各HCP配制总量达到20μL的混合液，通过涡流混合后，停止旋转。 
使该混合液在“94℃下10秒、64℃下10分钟”下反应。 
此时，将各加热反应管最终下降至15℃，在4℃下保存，留待电泳。 
使用0.5％琼脂糖凝胶(Nusive-3：1/Tacala公司制)，使反应后的液体10μL中混入染色液——BPB(溴百里酚蓝)2μL得到的试样在100V下进行电泳35分钟。 
2、结果 
即使在10分钟较短的反应时间内，在探针浓度最低的“2.5pmol/μL”时，HCP-1已经形成聚合物，但是HCP-2梯状的产物多，聚合物的形成不充分。另外，HCP-3全部泳道为梯状，没有形成聚合物。 
因此，确认如图36的照片所示，即使在较短的反应时间内，使相互交错杂交时分支点的碱基序列为G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)结合的HCP-1，能够在更低的探针浓度下有效地形成稳定的双链聚合物。
(实施例11) 
1、方法 
向0.2mL的各管中分别加入HCP-1(100pmol/μL)、HCP-2(100pmol/μL)以及HCP-3(100pmol/μL)1.5μL，再分别注入20×SSC36μL、DW221μL，使总量达到60μL，通过涡流混合后，停止旋转。 
将该混合液配制成各HCP为9条，分别使每3条以“94℃下10秒、64℃下0小时(on ice)”、“94℃下10秒、64℃下3小时”、“94℃下10秒、64℃下16小时”的反应时间形成聚合物。 
各反应在64℃反应后，下降至15℃，然后在4℃下保存。 
反应后，以DW2为对照，用分光光度计测定紫外线的吸收。 
2、结果 
如果改变64℃下的反应时间，反应时间长聚合物的形成率增加，随之260nm处紫外线吸收的值变低。这是由于碱基堆积呈有规则的高次结构，表现出DNA或低聚核苷酸在260nm处紫外吸收带强度减弱的所谓“减色性”的减色效应。因此，表明在形成更多聚合物的“94℃下10秒、64℃下16小时”的反应中，使用HCP-1时的紫外线吸收大为减少，也就是说，通过使用HCP-1能够形成有规则、稳定的高次结构的聚合物，同时根据紫外吸收的变化，能够确认聚合物的状态。 
因而，如图37所示，表示利用聚合物对紫外线的光学吸收的变化，检测聚合物存在的方法。 
(实施例12) 
1、方法 
(1)聚合物的形成 
向0.2mL的各管中分别注入HCP-1(100pmol/μL)、HCP-2(100pmol/μL)以及HCP-3(100pmol/μL)2.5μL、20×SSC60μL、DW235μL，使总量达到100μL，通过涡流混合后，停止旋转。 
将该混合液配制成各HCP为18个，分别使每3个以“94℃下10秒、64℃下0小时(on ice)”、“94℃下10秒、64℃下0.5小时”、“94℃下10秒、64℃下1小时”、“94℃下10秒、64℃下3小时”、“94℃下10秒、64℃下5小时”、“94℃下10秒、64℃下16小时”的反应时间形成聚合物。 
将该混合液配制成各HCP为18个，分别使每3个以“94℃下10秒、64℃下0小时(on ice)”、“94℃下10秒、64℃下0.5小时”、“94℃下10秒、64℃下1小时”、“94℃下10秒、64℃下3小时”、“94℃下10秒、5小时”、“94℃下10秒、64℃下16小时”的反应时间形成聚合物。
各反应在64℃反应后，下降至15℃，然后在4℃下保存。(2)用SYBR Green I染色 
用TE buffer(10mM，1mM，pH8.0)10mL溶解具有自己产生荧光、可插入碱基对平面3.4A间隔之间的性质的SYBR Green I(Takara)1μL，配制成1/10000的稀释液。向(1)中形成聚合物的各管中添加SYBR GreenI(1/10000稀释液)各5μL，通过涡流混合后，停止旋转。 
将其在暗处静置1.5小时，使荧光物质发生反应。 
2、结果 
如图38的图和表所示，如果改变64℃下的反应时间，反应时间延长双链的形成率增加，随之荧光强度增加，在HCP-1中，该现象在最短的时间内出现。这表明在反应时间的早期阶段，能够更有效地形成HCP-1的双链[图38(a)(b)(c)]。 
因而，在形成的双链的碱基堆积之间插入荧光物——SYBR Green I，能够确认聚合物的状态。 
(实施例13) 
1、方法 
(1)聚合物的形成 
向0.2mL的各管中分别注入HCP-1(100pmol/μL)、HCP-2(100pmol/μL)以及HCP-3(100pmol/μL)1.5μL、20×SSC36μL、DW221μL，使总量达到60μL，通过涡流混合后，停止旋转。 
将该混合液配制成各HCP为16个，分别使每4个以“94℃下10秒、64℃下0小时(on ice)”、“94℃下10秒、64℃下0.5小时”、“94℃下10秒、64℃下3小时”、“94℃下10秒、64℃下16小时”的反应时间形成聚合物。 
其中1个用于电泳，3个用于荧光读数器的“n＝3”。 
各反应在64℃反应后，下降至15℃，然后在4℃下保存。 
(2)通过电泳确认 
使用0.5％琼脂糖凝胶(Nusive-3：1/Tacala公司制)，使反应后的液体10μL中混入染色液——BPB(溴百里酚蓝)2μL得到的试样在100V下进行电泳35分钟。
(3)通过SYBR Green I染色 
用0.5ml的DW2溶解实施例12中使用的SYBR Green I(Takara)1μL，配制成1/500的稀释液。向上述(1)中形成聚合物的各管中添加SYBR GreenI(1/500稀释液)各5μL，通过涡流混合后，停止旋转。 
通过将其在暗处静置0.5-1小时，使荧光物质发生反应后，移至1.5mL的管中，按照规定方法进行乙醇沉淀，-20℃下放置过夜。 
放置过夜后，返回室温，以12,000rpm×15min(室温)的速度进行离心分离，除去上清液后，使颗粒状物风干，用60μL的DW2溶解，用荧光读数器测定。 
2、结果 
“SYBR Green I”是在核酸双螺旋结构的碱基对中插入的荧光色素，如果进行乙醇沉淀，能够除去与核酸结合的色素。 
图38中所示的数据是未进行乙醇沉淀直接用荧光读数器测定得到的，图39中插入荧光物质后，通过乙醇沉淀精制聚合物。 
如图39所示，如果改变64℃的反应时间，HCP-1随着反应时间延长聚合物的形成率增加，荧光强度增加。这表明HCP-1的聚合物呈有规则的高次结构，因而即使进行乙醇沉淀也很难除去荧光物质，该聚合物的形成率越是增加，由于形成更高次的结构，荧光物质就越难除去。 
另一方面，HCP-3荧光强度不依赖于反应时间。这表明由于根本没有形成双链，而是形成残留有单链部分的不规则聚合物，插入荧光物质后如果进行乙醇沉淀，则出现荧光物质易于除去的不稳定状态。 
这样，表明在聚合物中插入荧光物质后，通过用荧光读数器测定用乙醇精制的聚合物，能够确认该聚合物的状态。 
工业实用性 
如上所述，按照本发明，通过使各区域分支点的碱基对之间的结合力变得牢固，能够制备稳定的探针聚合物，同时能够不使用核酸合成酶和支化DNA，有效地检测出目标基因，而且由于形成的聚合物的碱基堆积呈有规则的高次结构，表现出260nm处紫外吸收带强度减弱的所谓“减色性”的减色效应，从而可以确认聚合物的状态，进而，在聚合物的碱 基堆积之间插入廉价的荧光物质，由荧光强度的变化能够确认聚合物的状态，因而可以进行迄今为止没有的低成本且简便的基因检测，能够发挥显著的效果。
Figure IYZ000004144467800011
Figure IYZ000004144467800031
Figure IYZ000004144467800041
Figure IYZ000004144467800051
Figure IYZ000004144467800091

Claims (22)

1.一种探针聚合物制备用探针，含有具备下述(a)(b)(c)特性的成对第1探针和第2探针，
(a)上述成对的第1探针和第2探针分别以具有n为3个以上的互补碱基序列区域的形式构成，由第1探针5’端依次设定的X1区域、X2区域、X3区域、......Xn区域以及由第2探针5’端依次设定的X’1区域、X’2区域、X’3区域……X’n区域分别具有互补的碱基序列；
(b)上述成对的第1探针和第2探针具有在使二者发生反应时，X1区域只与X’1区域杂交，X2区域只与X’2区域杂交，X3区域只与X’3区域杂交，……Xn区域只与X’n区域杂交的性质，二者结合时，只任意一个区域之间进行杂交，而且通过这一区域结合的复数个上述成对的第1探针和第2探针相互杂交形成探针聚合物；
(c)在上述成对的第1探针和第2探针的各互补碱基序列区域的两端都配置1-3个鸟嘌呤或胞嘧啶，在上述成对的第1探针和第2探针杂交时在互补碱基序列区域的端部至少形成1个胞嘧啶-鸟嘌呤结合。
2.如权利要求1所述的探针，上述成对第1探针和第2探针的各个互补碱基序列的区域数n为3、4、5或6。
3.如权利要求1或2所述的探针，上述成对第1探针和第2探针的互补碱基序列区域的碱基数分别至少为8个。
4.如权利要求1或2所述的成对探针，上述成对第1探针和第2探针由选自DNA、RNA或PNA的任意碱基构成。
5.一种制备探针聚合物的方法，使具有下述(a)(b)(c)特性的复数个成对第1探针和第2探针聚合，
(a)上述成对的第1探针和第2探针分别以具有n为3个以上的互补碱基序列区域的形式构成，由第1探针5’端依次设定的X1区域、X2区域、X3区域、......Xn区域以及由第2探针5’端依次设定的X’1区域、X’2区域、X’3区域……X’n区域分别具有互补的碱基序列；
(b)上述成对的第1探针和第2探针具有在使二者发生反应时，X1区域只与X’1区域杂交，X2区域只与X’2区域杂交，X3区域只与X’3区域杂交，……Xn区域只与X’n区域杂交的性质，二者结合时，只有其中任意一个区域之间进行杂交，而且通过这一区域结合的复数个上述成对的第1探针和第2探针相互杂交形成探针聚合物；
(c)在上述成对的第1探针和第2探针的各互补碱基序列区域的两端都配置1-3个鸟嘌呤或胞嘧啶，在上述成对的第1探针和第2探针杂交时在互补碱基序列区域的端部至少形成1个胞嘧啶-鸟嘌呤结合。
6.如权利要求5所述的方法，上述成对第1探针和第2探针的各个互补碱基序列的区域数n为3、4、5或6。
7.如权利要求5或6所述的方法，上述成对第1探针和第2探针的互补碱基序列区域的碱基数分别至少为8个。
8.如权利要求5或6所述的方法，上述成对第1探针和第2探针由选自DNA、RNA或PNA的任意碱基构成。
9.一种探针聚合物，通过使具有下述(a)(b)(c)特性的复数个成对第1探针和第2探针聚合得到，
(a)上述成对的第1探针和第2探针分别以具有n为3个以上的互补碱基序列区域的形式构成，由第1探针5’端依次设定的X1区域、X2区域、X3区域、......Xn区域以及由第2探针5’端依次设定的X’1区域、X’2区域、X’3区域……X’n区域分别具有互补的碱基序列；
(b)上述成对的第1探针和第2探针具有在使二者发生反应时，X1区域只与X’1区域杂交，X2区域只与X’2区域杂交，X3区域只与X’3区域杂交，……Xn区域只与X’n区域杂交的性质，二者结合时，只任意一个区域之间进行杂交，而且通过这一区域结合的复数个上述成对的第1探针和第2探针相互杂交形成探针聚合物；
(c)在上述成对的第1探针和第2探针的各互补碱基序列区域的两端都配置1-3个鸟嘌呤或胞嘧啶，在上述成对的第1探针和第2探针杂交时在互补碱基序列区域的端部至少形成1个胞嘧啶-鸟嘌呤结合。
10.如权利要求9所述的探针聚合物，上述成对第1探针和第2探针的各个互补碱基序列的区域数n为3、4、5或6。
11.如权利要求9或10所述的探针聚合物，上述成对第1探针和第2探针的互补碱基序列区域的碱基数分别至少为8个。
12.如权利要求9或10所述的探针聚合物，上述成对第1探针和第2探针由选自DNA、RNA或PNA的任意碱基构成。
13.一种使用聚合用探针的试样中目标基因的测定方法，由下述(1)(2)(3)步骤组成，
(1)作为聚合用探针使用具有下述(a)(b)(c)特性的成对的第1探针和第2探针，使至少一个目标基因捕获用探针与试剂发生反应，使之与目标基因结合，所述目标基因捕获用探针由两个区域构成，即具有与一部分目标基因互补的碱基序列的区域以及具有与聚合用探针中任意一个区域互补的碱基序列的区域；
Figure FFW00000039615100031
上述成对的第1探针和第2探针分别以具有n为3个以上的互补碱基序列区域的形式构成，由第1探针5’端依次设定的X1区域、X2区域、X3区域、......Xn区域以及由第2探针5’端依次设定的X’1区域、X’2区域、X’3区域……X’n区域分别具有互补的碱基序列；
(b)上述成对的第1探针和第2探针具有在使二者发生反应时，X1区域只与X’1区域杂交，X2区域只与X’2区域杂交，X3区域只与X’3区域杂交，……Xn区域只与X’n区域杂交的性质，二者结合时，只任意一个区域之间进行杂交，而且通过这一区域结合的复数个上述成对的第1探针和第2探针相互杂交形成探针聚合物；
(c)在上述成对的第1探针和第2探针的各互补碱基序列区域的两端都配置1-3个鸟嘌呤或胞嘧啶，在上述成对的第1探针和第2探针杂交时在互补碱基序列区域的端部至少形成1个胞嘧啶-鸟嘌呤结合；
(2)接着，使上述聚合用探针发生反应，使上述捕获用探针与该聚合用探针结合，形成目标基因·探针聚合物复合体；
(3)由使用的聚合探针中洗涤除去未反应的探针后，测定制备的探针聚合物的量。
14.根据权利要求13所述的试样中目标基因的测定方法，把所述成对的第1探针和第2探针中保持有一个互补碱基序列区域与一部分目标基因具有互补碱基序列区域的探针作为捕获目标基因用探针。
15.如权利要求13或14所述的目标基因的测定方法，在上述探针聚合物中结合荧光物质，通过发光测定荧光量，从而测定该探针聚合物的量。
16.如权利要求13或14所述的目标基因的测定方法，利用对紫外线的光学吸收的变化测定上述探针聚合物的量。
17.如权利要求13或14所述的目标基因的测定方法，上述聚合用探针的各个互补碱基序列的区域数n为3、4、5或6。
18.一种试样中目标基因的检测试剂，作为聚合用探针使用具有下述(a)(b)(c)特性的成对的第1探针和第2探针，将至少一个目标基因捕获用探针和上述复数个聚合用探针作为必要组成成分，所述目标基因捕获用探针由至少两个区域构成，即具有与一部分目标基因互补的碱基序列的区域以及具有与上述聚合用探针中任意一个区域互补的碱基序列的区域，
(a)上述成对的第1探针和第2探针分别以具有n为3个以上的互补碱基序列区域的形式构成，由第1探针5’端依次设定的X1区域、X2区域、X3区域、......Xn区域以及由第2探针5’端依次设定的X’1区域、X’2区域、X’3区域……X’n区域分别具有互补的碱基序列；
(b)上述成对的第1探针和第2探针具有在使二者发生反应时，X1区域只与X’1区域杂交，X2区域只与X’2区域杂交，X3区域只与X’3区域杂交，……Xn区域只与X’n区域杂交的性质，二者结合时，只任意一个区域之间进行杂交，而且通过这一区域结合的复数个上述成对的第1探针和第2探针相互杂交形成探针聚合物；
(c)在上述成对的第1探针和第2探针的各互补碱基序列区域的两端都配置1-3个鸟嘌呤或胞嘧啶，在上述成对的第1探针和第2探针杂交时在互补碱基序列区域的端部至少形成1个胞嘧啶-鸟嘌呤结合。
19.根据权利要求18所述的试样中目标基因的检测试剂，把所述成对的第1探针和第2探针中保持有一个互补碱基序列区域与一部分目标基因具有互补碱基序列区域的探针作为捕获目标基因用探针。
20.如权利要求18或19所述的目标基因的检测试剂，上述成对第1探针和第2探针的各个互补区域数n为3、4、5或6。
21.如权利要求18或19所述的目标基因的检测试剂，上述成对第1探针和第2探针的互补碱基序列区域的碱基数分别至少为8个。
22.如权利要求18或19所述的目标基因的检测试剂，上述成对第1探针和第2探针由选自DNA、RNA或PNA的任意碱基构成。
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