JPWO2007108378A1 - シグナルプローブポリマーの形成方法 - Google Patents
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Abstract
ポリマーを効率的且つ定量的に形成することができるシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法で形成されるシグナルプローブポリマー、該方法で用いられるオリゴヌクレオチド・プローブ、及び高感度で定量性に優れた標的分析物の検出方法を提供する。５’端部から順に核酸領域Ｘ、Ｙ及びＺが設けられた３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、５’端部から順に核酸領域Ｘ’、Ｙ’及びＺ’が設けられた３箇所の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を反応させてポリマーを形成させる方法であって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３〜１５塩基であるようにした。
Description
本発明は、効果的にオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合体（ポリマー）を形成させ、標的分析物の検出の安定性と感度を向上させることができるシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法により形成されるポリマー、該方法を利用した標的分析物の検出方法、及び該方法に用いられる一対のプローブに関する。
本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法（プローブ自己集合体の形成方法）を提案した（特許文献１〜４）。図１〜図３は特許文献１記載の方法の概略説明図である。例えば、特許文献１記載の方法は、図１に示したように３個所の領域から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブ１８（HoneyComb Probe、以下、ＨＣＰと称する。）を用いる方法であり、第１ＨＣＰ１８ａ（Ｘ領域，Ｙ領域及びＺ領域）と第２ＨＣＰ１８ｂ（Ｘ’領域，Ｙ’領域及びＺ’領域）の各々の３個所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に各領域の塩基配列を工夫したものである（図２）。この工夫により、複数の一対のＨＣＰを反応させた場合、互いにハイブリダイズしてプローブの自己集合体２０（ポリマー）を形成させることができる（図３）。本明細書において、これらオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合反応（Probe alternation link self-assembly reaction）によるポリマーの形成法を、パルサー法（PALSAR法）と称する。
また、特許文献２記載の方法は、前記一対のＨＣＰの各領域の末端にグアニン又はシトシンを配置し、一対のＨＣＰがハイブリダイズした際にＣ−Ｇ結合を各領域の端部に形成することにより、より安定したポリマーを効率的に形成させる方法であり、特許文献２の実施例では各領域の塩基数が２０であり各領域の端部にＧ又はＣを配置させたＨＣＰが開示されている。
また、本発明者らは、パルサー法を利用することにより、ターゲット遺伝子の検出感度を向上させることができることを見出した（特許文献５）。図４に、パルサー法を利用したマイクロプレートにおけるシグナル増幅方法の一例を示す。図４（ａ）に示した如く、マイクロプレート１０等の反応機材に標的核酸１２を捕捉可能なキャプチャープローブ１４（捕捉用プローブ）を結合させ、次に図４（ｂ）に示した如く、標的核酸１２を捕捉した後、図４（ｃ）に示した如く、ＨＣＰと標的核酸に相補的な領域を持つアシストプローブ１６を加え、更に、図４（ｅ）に示した如く、複数対のＨＣＰ１８を加えて、自己集合反応により自己集合体２０を形成させ、シグナルを増幅させることができるものである。
なお、本明細書中でシグナルプローブポリマー（単にポリマーとも称する）とは、ＨＣＰにより形成される前記自己集合体を言う。またアシストプローブとは、検出する標的分析物と特異的に結合可能であり、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方のオリゴヌクレオチド・プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するプローブを言い、標的分析物とシグナルプローブポリマーをつなぐ働きをする。
特許第３２６７５７６号公報
特許第３３１０６６２号公報
国際公開第０２／３１１９２号公報
特開２００２−３５５０８１号公報
国際公開第０３／０２９４４１号公報
本発明は、ポリマーを効率的且つ定量的に形成することができるシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法で形成されるシグナルプローブポリマー、該方法で用いられるオリゴヌクレオチド・プローブ、及び高感度で定量性に優れた標的分析物の検出方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、パルサー法を利用した標的分析物の検出における検出感度を向上させるべく鋭意研究を重ねた結果、ＨＣＰの各領域の塩基の長さを工夫し、場合によっては各核酸領域の端部の塩基をグアニン又はシトシンとすることにより、各領域が２０塩基である場合と比較して極めて効率的にポリマーを形成することができ、更に標的分析物の検出の安定性と感度を著しく向上させることができることを見出し、本発明に到達したものである。
即ち、本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、５’端部から順に核酸領域Ｘ、Ｙ及びＺが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、
５’端部から順に核酸領域Ｘ’、Ｙ’及びＺ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブと、
（前記化学式（１）及び（２）において、ＸとＸ’、ＹとＹ’、ＺとＺ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域である）
からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を反応させてポリマーを形成させる方法であって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３〜１５塩基であることを特徴とする。
からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を反応させてポリマーを形成させる方法であって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３〜１５塩基であることを特徴とする。
本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法において、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１４又は１５であることが好ましく、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが全て１４塩基であることがより好ましい。
前記各核酸領域の端部全ての塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。
前記各核酸領域の端部全ての塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。
前記オリゴヌクレオチド・プローブが、標識物質で標識されていることが好適である。前記標識物質が、アクリジニウムエステル、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることが好ましい。
本発明のシグナルプローブポリマーは、前記本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法で形成されることを特徴とする。
本発明の標的分析物の検出方法は、試料内の標的分析物の存在を検出する方法であって、前記本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法によりポリマーを形成させ、該ポリマーを検出することにより標的分析物を検出することを特徴とする。
前記標的分析物と特異的に結合可能であり、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方のオリゴヌクレオチド・プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するアシストプローブを用い、前記標的分析物と前記アシストプローブと前記ポリマーとを含む複合体を形成し、該複合体を分析することにより前記標的分析物を検出することが好ましい。
前記標的分析物としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー及び糖質からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
前記標的分析物としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー及び糖質からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
前記標的分析物が核酸の場合、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方が、前記標的核酸（ターゲット遺伝子）の一部に相補的な配列を有することが好ましい。また、前記ターゲット遺伝子と前記ポリマーを繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と前記オリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシストプローブを用いることが好適である。
本発明の一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、５’端部から順に核酸領域Ｘ、Ｙ及びＺが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、
５’端部から順に核酸領域Ｘ’、Ｙ’及びＺ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブと、
（前記化学式（１）及び（２）において、ＸとＸ’、ＹとＹ’、ＺとＺ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域である）
からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブであって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３〜１５塩基であることを特徴とする。
からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブであって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３〜１５塩基であることを特徴とする。
本発明の一対のオリゴヌクレオチド・プローブにおいて、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１４又は１５であることが好ましく、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが全て１４塩基であることがより好ましい。
前記各核酸領域の端部全ての塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。
前記各核酸領域の端部全ての塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。
前記オリゴヌクレオチド・プローブが、標識物質で標識されていることが好適である。前記標識物質が、アクリジニウムエステル、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることが好ましい。
本発明によれば、簡便に標的分析物の検出感度を著しく向上することができる。
１０：マイクロプレート、１２：標的核酸、１４：キャプチャープローブ、１６：アシストプローブ、１８：一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（一対のＨＣＰ）、１８ａ：第１プローブ（第１ＨＣＰ）、１８ｂ：第２プローブ（第２ＨＣＰ）、２０：自己集合体、シグナルプローブポリマー、３０：支持体、３２：標的抗原、３４、３５：抗体、３６：アシストプローブ、３８：複合体、４０：ポリマー。
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
図１は、一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（一対のＨＣＰ）を示す概略説明図である。図２は、図１のＨＣＰの結合態様を示す概略説明図である。図３は、図１のＨＣＰの複数対により形成された自己集合体を示す概略説明図である。
本発明の一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、図１に示した如く、５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブ（第１ＨＣＰ）１８ａと、５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブ（第２ＨＣＰ）１８ｂと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（一対のＨＣＰ）であって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３〜１５塩基であることを特徴とする。
前記一対のＨＣＰにおいて、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域であり、図２に示した如く、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’が結合し、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’が結合し、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’が結合する。本発明の一対のＨＣＰは、各領域の両末端部にグアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）が配置されており、一対のＨＣＰがハイブリダイズした際に各領域の端部にＣ−Ｇ結合が形成されることが好ましい。
前記ＨＣＰの各領域の長さは、それぞれ塩基数１３〜１５、好ましくは１４又は１５に設定されるものであり、１プローブ中の３領域の長さは同じであっても異なっていてもよい。前記ＨＣＰの各領域の長さが全て１４又は全て１５であることがより好ましい。
上記オリゴヌクレオチド・プローブは、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類
似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、国際公開第９２／２０７０２号公報等参照）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998.54,3607-3630., Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120,13252-13253., Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633-5638.等参照）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、国際公開第９２／２０７０２号公報等参照）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998.54,3607-3630., Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120,13252-13253., Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633-5638.等参照）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、前記本発明の一対のＨＣＰの複数対を反応させてシグナルプローブポリマーを形成させるものである。図３に示した如く、前記一対のＨＣＰの複数対をハイブリダイゼーション反応させることにより、プローブの濃度に応じて効率的にＨＣＰの自己集合体であるシグナルプローブポリマー２０を形成させることができる。
使用するＨＣＰの本数は特に限定されないが、１０2〜１０15本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。ハイブリダイゼーション反応の温度条件も特に限定されず、通常の温度条件でよいが、反応温度は好ましくは４０〜８０℃であり、より好ましくは５５〜６５℃である。更に、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成させ、当該反応温度領域において自己集合反応を行わせるようにすることが好ましい（国際公開第２００５／１０６０３１号公報）。部分的な反応温度領域に適用される反応温度は４０〜８０℃が好ましく、より好ましくは５５〜６５℃である。
本発明のシグナルポリマーの形成方法を利用して標的分析物を検出することにより、標的分析物の検出の安定性と感度を向上させることができる。
本発明の標的分析物の検出方法は、前記本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法を利用してポリマーを形成させ、該ポリマーを検出することにより試料中の標的分析物の存在を検出するものである。前記標的分析物の検出方法としては、具体的には、標的分析物とポリマーの複合体を形成させ、ポリマーの検出により標的分析物を検出する方法（例えば、特許文献５）、及び標的分析物が存在する場合にのみポリマーが形成される方法を用いてポリマーを形成させ、ポリマーの検出により標的分析物を検出する方法（例えば、国際公開第０２／１８６４２号、国際公開第２００４／０７４４８０号、国際公開第２００４／０７２３０２号）が挙げられる。
本発明の標的分析物の検出方法は、前記本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法を利用してポリマーを形成させ、該ポリマーを検出することにより試料中の標的分析物の存在を検出するものである。前記標的分析物の検出方法としては、具体的には、標的分析物とポリマーの複合体を形成させ、ポリマーの検出により標的分析物を検出する方法（例えば、特許文献５）、及び標的分析物が存在する場合にのみポリマーが形成される方法を用いてポリマーを形成させ、ポリマーの検出により標的分析物を検出する方法（例えば、国際公開第０２／１８６４２号、国際公開第２００４／０７４４８０号、国際公開第２００４／０７２３０２号）が挙げられる。
本発明における標的分析物測定用試料は、該標的分析物を含む可能性のあるあらゆる試料が適用でき、例えば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、喀痰、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。
前記標的分析物としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー、糖質及びそれらの組み合わせからなるものが挙げられる。該標的分析物は試料より適宜調製または単離したものでもよい。また、試料中の標的核酸を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。前記標的核酸（ターゲット遺伝子）として、一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、並びに二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。また、前記標的核酸にＳＮＰｓ（一塩基多形）を用いることができる。
前記標的分析物としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー、糖質及びそれらの組み合わせからなるものが挙げられる。該標的分析物は試料より適宜調製または単離したものでもよい。また、試料中の標的核酸を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。前記標的核酸（ターゲット遺伝子）として、一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、並びに二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。また、前記標的核酸にＳＮＰｓ（一塩基多形）を用いることができる。
本発明の検出方法において、前記本発明の一対のＨＣＰの一方（即ち、第１プローブ又は第２プローブ）の一部又は全てと同じ核酸領域を有し、且つ標的分析物に特異的に結合可能なアシストプローブを用いることが好ましい。前記アシストプローブを用いて、標的分析物とアシストプローブとポリマーとを含む複合体を形成し、該複合体を分析することにより前記標的分析物を検出することにより、より簡便に標的分析物を検出することができる。
前記アシストプローブは、標的分析物に応じて適宜選択可能である。例えば、標的分析物が核酸の場合、該標的核酸の１領域に相補的な配列を有するアシストプローブを用い、ハイブリダイゼーションにより結合させることが好ましい。
標的分析物が抗原の場合、化学的結合により抗体を結合させたアシストプローブ、例えば、予め抗体にアミノ基とカルボキシル基等の結合によりコンジュゲートさせたものを用いることが好ましい。また、ビオチン化した抗体を、ストレプトアビジンを用いて結合させたアシストプローブを用いてもよい。
標的分析物が抗原の場合、化学的結合により抗体を結合させたアシストプローブ、例えば、予め抗体にアミノ基とカルボキシル基等の結合によりコンジュゲートさせたものを用いることが好ましい。また、ビオチン化した抗体を、ストレプトアビジンを用いて結合させたアシストプローブを用いてもよい。
また、標的分析物が核酸の場合、前記一対のＨＣＰの一方を前記標的核酸の一部に相補的な配列を有するように構成し、該一対のＨＣＰを用いて標的核酸とポリマーの複合体を形成させ、ポリマーの検出により、標的核酸を検出することができる。
また、本発明の検出方法において、標的分析物検出用の反応機材で標的分析物を捕捉する工程を含むことが好ましい。本発明は、標的分析物検出の為の種々の反応機材に適用可能であるが、特に、ＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（Marshall,A.,Hodgson,J.DNA chips:an array of possibilities.Nat Biotechnol.16,27-31,1998.等参照）、マイクロプレート、及び磁性体粒子等に好適に用いられる。
標的分析物を反応機材で捕捉する方法は特に限定されないが、標的分析物に特異的に結合可能な捕捉用物質を結合させた反応機材を用い、該捕捉用物質と標的分析物の結合により反応機材と標的分析物を結合させることが好ましい。
該捕捉用物質は標的分析物に応じて適宜選択すればよく特に限定されない。標的分析物が核酸の場合、捕捉用物質として、該標的核酸の１領域（アシストプローブに相補的な領域を除く）に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（キャプチャープローブ）を用いることが好ましい。標的分析物が抗原又は抗体の場合、捕捉用物質として標的分析物に特異的に結合する抗体又は抗原を用いることが好ましい。また、標的分析物が糖質の場合、捕捉用物質として標的分析物に特異的に結合するレクチンを用いることが好ましい。
該捕捉用物質は標的分析物に応じて適宜選択すればよく特に限定されない。標的分析物が核酸の場合、捕捉用物質として、該標的核酸の１領域（アシストプローブに相補的な領域を除く）に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（キャプチャープローブ）を用いることが好ましい。標的分析物が抗原又は抗体の場合、捕捉用物質として標的分析物に特異的に結合する抗体又は抗原を用いることが好ましい。また、標的分析物が糖質の場合、捕捉用物質として標的分析物に特異的に結合するレクチンを用いることが好ましい。
以下、標的分析物（標的物質）として核酸又は抗原を検出する場合を例に、本発明の標的分析物の検出方法をより具体的に説明する。
図４は、パルサー法を利用した標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図である。図４において、１０は反応機材としてのマイクロプレート、１２は標的核酸、１４は標的核酸に相補的な塩基配列を有するキャプチャープローブ、１８は一対のＨＣＰ［第１ＨＣＰ（核酸領域ＸＹＺ）、及び第２ＨＣＰ（核酸領域Ｘ’Ｙ’Ｚ’）］、１６は第１ＨＣＰと同じ核酸領域（ＸＹＺ）を有し且つ標的核酸１２に相補的な核酸領域Ｔを有するアシストプローブである。
図４は、パルサー法を利用した標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図である。図４において、１０は反応機材としてのマイクロプレート、１２は標的核酸、１４は標的核酸に相補的な塩基配列を有するキャプチャープローブ、１８は一対のＨＣＰ［第１ＨＣＰ（核酸領域ＸＹＺ）、及び第２ＨＣＰ（核酸領域Ｘ’Ｙ’Ｚ’）］、１６は第１ＨＣＰと同じ核酸領域（ＸＹＺ）を有し且つ標的核酸１２に相補的な核酸領域Ｔを有するアシストプローブである。
図４（ａ）〜（ｄ）に示した如く、マイクロプレート１０に固定化されたキャプチャープローブ１４及びアシストプローブ１６を標的核酸１２に結合させ、マイクロプレート１０上に、アシストプローブ１６、標的核酸１２及びキャプチャープローブ１４からなる複合体を形成した後、一対のＨＣＰ１８の複数対を添加し［図４（ｅ）］、該アシストプローブ１６と前記複数対のＨＣＰを反応させてポリマー２０を形成させ、アシストプローブ１６を介して標的核酸１２とポリマー２０を結合させ［図４（ｆ）］、該ポリマーを分析することにより試料中の標的核酸の存在を確定することができる。なお、図４においては、キャプチャープローブと標的核酸を反応させた後［図４（ｂ）］、標的核酸とアシストプローブを反応させたが［図４（ｄ）］、キャプチャープローブと標的核酸との反応、及び標的核酸とアシストプローブとの反応の順序は特に限定されず、いずれを先に行ってもよく、また同時に行ってもよい。
図５〜図７は、パルサー法を利用した標的抗原の検出方法の一例を示す概略説明図であり、該標的抗原と特異的に結合させる為に抗体を用いる。図５〜７中、３０は支持体、３２は標的抗原、３４は標的抗原に特異的な抗体、３６は第１ＨＣＰと同じ核酸領域（ＸＹＺ）を有し、且つ標的抗原に特異的な抗体３５を結合させたアシストプローブである。
図５及び図６に示した如く、サンドイッチイムノアッセイ法により、予め抗体３４を固定した支持体３０、及びアシストプローブ３６に含まれる抗体３５が、標的抗原３２を捕捉し複合体３８が形成される。その後、一対のＨＣＰ［第１ＨＣＰ（符号１８ａ）及び第２ＨＣＰ（符号１８ｂ）］の複数対を添加し、図７に示した如く、該アシストプローブ３６と前記複数対のＨＣＰを反応させて前記複合体３８上にポリマー４０を形成させ、該ポリマーを分析することにより試料中の標的核酸の存在を確定することができる。
図５及び図６に示した如く、サンドイッチイムノアッセイ法により、予め抗体３４を固定した支持体３０、及びアシストプローブ３６に含まれる抗体３５が、標的抗原３２を捕捉し複合体３８が形成される。その後、一対のＨＣＰ［第１ＨＣＰ（符号１８ａ）及び第２ＨＣＰ（符号１８ｂ）］の複数対を添加し、図７に示した如く、該アシストプローブ３６と前記複数対のＨＣＰを反応させて前記複合体３８上にポリマー４０を形成させ、該ポリマーを分析することにより試料中の標的核酸の存在を確定することができる。
本発明において、シグナルプローブポリマーの検出方法としては、特に限定はないが、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（第１及び第２プローブ）の一方、又は両方を予め標識物質で標識し、該標識物質を利用して検出することが好ましい。前記標識物質が、アクリジニウムエステル、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることが好ましく、操作性、定量性及び感度の点からアクリジニウムエステルが特に好ましい。具体的には、あらかじめ一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方又は両方を蛍光物質で標識し、ポリマーの存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。また、あらかじめ一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方又は両方を発色系酵素又は発光系酵素で標識し、ポリマーの存在を光化学的な変化により検出することが可能である。さらにまた、あらかじめ一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方又は両方をラジオアイソトープで標識し、ポリマーの存在をラジオアイソトープにより検出することが可能である。
また、前記形成されたポリマーに対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせてポリマーの存在を検出することが可能である。標識プローブとしては、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識したものを用いることができる。また、前記形成されたポリマーに対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記ポリマーの存在を検出することが可能である。蛍光物質としては、２本鎖の塩基対の中に挿入する性質を持った蛍光物質が好ましい。蛍光物質としては、例えば、SYBR Green I stain、SYBR Green II stain、SYBR Green Gold stain、Vistra Green stain、Gelstar stain、Radlant Red stain、PicoGreen、RiboGreen、OliGreen、Hoechst33258(Bis-Benzimide)、Propidium lodide、YO-PRO-1 lodide、YO-PRO-3 lodide（以上、Molecular Probes社製）、臭化エチジウム、Distamycin A、TOTO、Psoralen、アクリジニウムエステル、アクリニジウムオレンジ（Acridine Orange）、AOAO (homodimer)等が好ましい。
また、本発明のポリマーは、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果の発現が極めて大きい為、波長２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定することにより、ポリマーの状態を確認することが可能である。
（実施例１〜７及び実験例１〜６）
１．目的
ＨＣＰによるポリマーの形成において、ＨＣＰの各領域の塩基数の違いによるポリマーの形成効率を、様々な塩基数のＨＣＰを用いて比較した。
１．目的
ＨＣＰによるポリマーの形成において、ＨＣＰの各領域の塩基数の違いによるポリマーの形成効率を、様々な塩基数のＨＣＰを用いて比較した。
２．各溶液の調製方法
（２−１）ＨＣＰ溶液の調製
表１又は表２に示した如く各領域の塩基数が異なる一対のＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）をそれぞれ用い、反応開始時の２６０ｎｍにおける吸光度が１．２〜１．５になるように各ＨＣＰの濃度を調整して、反応溶液［4XSSC、0.2%SDS］に該一対のＨＣＰを溶解し、ＨＣＰ溶液を調製した。表１は実施例１〜７で用いたＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）の各領域（Ｘ−Ｙ−Ｚ）の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を示す表であり、表２は実験例１〜６で用いたＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）の各領域（Ｘ−Ｙ−Ｚ）の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を示す表である。
（２−１）ＨＣＰ溶液の調製
表１又は表２に示した如く各領域の塩基数が異なる一対のＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）をそれぞれ用い、反応開始時の２６０ｎｍにおける吸光度が１．２〜１．５になるように各ＨＣＰの濃度を調整して、反応溶液［4XSSC、0.2%SDS］に該一対のＨＣＰを溶解し、ＨＣＰ溶液を調製した。表１は実施例１〜７で用いたＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）の各領域（Ｘ−Ｙ−Ｚ）の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を示す表であり、表２は実験例１〜６で用いたＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）の各領域（Ｘ−Ｙ−Ｚ）の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を示す表である。
（２−２）対照溶液の調製
ポリマーの形成効率を比較する為に、第１プローブのみを添加した溶液（第１プローブの濃度：前記ＨＣＰ溶液に添加した第１プローブの２倍量）をそれぞれ調製し、対照とした。
ポリマーの形成効率を比較する為に、第１プローブのみを添加した溶液（第１プローブの濃度：前記ＨＣＰ溶液に添加した第１プローブの２倍量）をそれぞれ調製し、対照とした。
３．反応
０．２ｍＬチューブに前記調製したＨＣＰ溶液を１００μＬずつ分注し、９４℃で１分加熱後、直ちに氷上で冷却した。次に、氷上で冷却したＨＣＰ溶液が設定温度より高温度域を経由しないように、予め各反応温度[５５．０、５６．２、５７．５、５９．２、６１．４、６３．９、６６．１、６７．７、６８．９又は７０．０℃］に到達した状態でチューブをセットし、２時間反応させた。反応後、ＨＣＰ溶液中のＳＤＳによる白濁を防ぐ為、２８℃で保存し、下記分析を行った。また、前記調製した対照溶液に対しても、ＨＣＰ溶液と同様に実験を行った。
０．２ｍＬチューブに前記調製したＨＣＰ溶液を１００μＬずつ分注し、９４℃で１分加熱後、直ちに氷上で冷却した。次に、氷上で冷却したＨＣＰ溶液が設定温度より高温度域を経由しないように、予め各反応温度[５５．０、５６．２、５７．５、５９．２、６１．４、６３．９、６６．１、６７．７、６８．９又は７０．０℃］に到達した状態でチューブをセットし、２時間反応させた。反応後、ＨＣＰ溶液中のＳＤＳによる白濁を防ぐ為、２８℃で保存し、下記分析を行った。また、前記調製した対照溶液に対しても、ＨＣＰ溶液と同様に実験を行った。
４．分析
（４−１）吸光度測定
前記反応後のＨＣＰ溶液及び対照溶液に対して波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照に対するＨＣＰ溶液の各反応温度の吸光度比を計算した。対照に対するＨＣＰ溶液の各反応温度の吸光度比を表３及び４に示す。各反応温度に対する吸光度比のグラフを図８に示す。
（４−１）吸光度測定
前記反応後のＨＣＰ溶液及び対照溶液に対して波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照に対するＨＣＰ溶液の各反応温度の吸光度比を計算した。対照に対するＨＣＰ溶液の各反応温度の吸光度比を表３及び４に示す。各反応温度に対する吸光度比のグラフを図８に示す。
表３及び表４に示したように各領域の塩基数が全て１３のＨＣＰ、全て１４のＨＣＰ、全て１５のＨＣＰ及び１４と１５からなるＨＣＰを用いた実施例１〜７は、各領域の塩基数が全て１２、１６、１７、１８、１９又は２０のＨＣＰを用いた実験例１〜６に比べて対照に対する吸光度比が小さくなり、特に１４のＨＣＰを用いた場合に最小であった。
核酸は規則的な高次構造をとることにより、吸収強度が減少する「淡色効果」という現象を示す。すなわち、吸光度比の変化を淡色効果として比較することは、ポリマーの形成効率やその構造の規則性の高さの指標となる。このことより、各領域の塩基数が全て１３のＨＣＰ、全て１４のＨＣＰ、全て１５のＨＣＰ及び１４と１５からなるＨＣＰはポリマーの形成効率が高く、中でも淡色効果が顕著である各領域の塩基数が全て１４のＨＣＰは、規則正しいポリマーの形成効率が特に高いことがわかった。
核酸は規則的な高次構造をとることにより、吸収強度が減少する「淡色効果」という現象を示す。すなわち、吸光度比の変化を淡色効果として比較することは、ポリマーの形成効率やその構造の規則性の高さの指標となる。このことより、各領域の塩基数が全て１３のＨＣＰ、全て１４のＨＣＰ、全て１５のＨＣＰ及び１４と１５からなるＨＣＰはポリマーの形成効率が高く、中でも淡色効果が顕著である各領域の塩基数が全て１４のＨＣＰは、規則正しいポリマーの形成効率が特に高いことがわかった。
（４−２）電気泳動法
淡色効果がおきている温度のサンプル（表３及び表４に示したサンプル）を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。図９は実施例１−３及び実験例１〜６の電気泳動法の結果を示す写真である。図９において、レーン番号は各領域の塩基数であり、レーン１３〜１５は実施例１〜３のサンプル、レーン１、１６〜２０は実験例１〜６のサンプル、レーンＭは分子サイズマーカーである。図１０は実施例４〜７の電気泳動法の結果を示す写真であり、レーン１〜４はそれぞれ実施例６，７，４及び５のサンプル、レーンＭは分子サイズマーカーである。また、図９及び図１０中、ポリマーのバンドをＡで示し、未反応プローブのバンドをＢで示した。
淡色効果がおきている温度のサンプル（表３及び表４に示したサンプル）を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。図９は実施例１−３及び実験例１〜６の電気泳動法の結果を示す写真である。図９において、レーン番号は各領域の塩基数であり、レーン１３〜１５は実施例１〜３のサンプル、レーン１、１６〜２０は実験例１〜６のサンプル、レーンＭは分子サイズマーカーである。図１０は実施例４〜７の電気泳動法の結果を示す写真であり、レーン１〜４はそれぞれ実施例６，７，４及び５のサンプル、レーンＭは分子サイズマーカーである。また、図９及び図１０中、ポリマーのバンドをＡで示し、未反応プローブのバンドをＢで示した。
図９及び図１０に示した如く、各領域の塩基数が全て１３のＨＣＰ、全て１４のＨＣＰ、全て１５のＨＣＰ及び１４と１５からなるＨＣＰを用いた実施例１〜７は、各領域の塩基数が全て１２、１６、１７、１８、１９又は２０のＨＣＰを用いた実験例１〜６に比べてレーン上のラダーバンドやレーン下部の未反応プローブ（図中のＢ）が少なく、ポリマーの形成効率が高いことがわかった。特に各領域の塩基数が全て１４のＨＣＰを用いた場合はラダーバンドや未反応プローブが最も少ないことから反応に供したＨＣＰのほとんどが効率よく自己集合反応に関与していると考えられ、規則正しいポリマーの形成効率が特に高いことがわかった。
（実施例８〜１１及び実験例７〜１２）
１．目的
ＨＣＰによるポリマー形成を利用したターゲット遺伝子の検出において、ＨＣＰの塩基数の違いによるターゲット遺伝子の検出効率を、様々な塩基数のＨＣＰを用いて比較した。
１．目的
ＨＣＰによるポリマー形成を利用したターゲット遺伝子の検出において、ＨＣＰの塩基数の違いによるターゲット遺伝子の検出効率を、様々な塩基数のＨＣＰを用いて比較した。
２．マイクロプレートの調製
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のｒＲＮＡと同じ塩基配列を有するターゲットオリゴＤＮＡ（配列番号２７）に相補的な配列を有するキャプチャープローブ（配列番号２８）を各々ストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレート上に固定し、実験に用いた。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のｒＲＮＡと同じ塩基配列を有するターゲットオリゴＤＮＡ（配列番号２７）に相補的な配列を有するキャプチャープローブ（配列番号２８）を各々ストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレート上に固定し、実験に用いた。
３．各溶液の調製方法
（３−１）第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液の調製
第１ハイブリダイゼーション溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］に表５及び６に示すアシストプローブを２４ｐｍｏｌ／ｍＬになるように溶解し、これをターゲットｒＲＮＡとキャプチャープローブのハイブリダイゼーションに使用する第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液とした。なお、用いたアシストプローブは、それぞれ第１プローブと同じ塩基配列及びターゲットオリゴＤＮＡに相補的な塩基配列を有する。
（３−１）第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液の調製
第１ハイブリダイゼーション溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］に表５及び６に示すアシストプローブを２４ｐｍｏｌ／ｍＬになるように溶解し、これをターゲットｒＲＮＡとキャプチャープローブのハイブリダイゼーションに使用する第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液とした。なお、用いたアシストプローブは、それぞれ第１プローブと同じ塩基配列及びターゲットオリゴＤＮＡに相補的な塩基配列を有する。
（３−２）第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液の調製
第２ハイブリダイゼーション溶液［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］に表５及び６に示した如く各領域の塩基数が異なる５'末端がＤＩＧラベルされた一対のＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）を５００ｐｍｏｌ／ｍＬになるように溶解し、これを第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液とした。表５は実施例８〜１１で用いたＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）の各領域（Ｘ−Ｙ−Ｚ）の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を示す表であり、表６は実験例７〜１２で用いたＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）の各領域（Ｘ−Ｙ−Ｚ）の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を示す表である。
第２ハイブリダイゼーション溶液［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］に表５及び６に示した如く各領域の塩基数が異なる５'末端がＤＩＧラベルされた一対のＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）を５００ｐｍｏｌ／ｍＬになるように溶解し、これを第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液とした。表５は実施例８〜１１で用いたＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）の各領域（Ｘ−Ｙ−Ｚ）の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を示す表であり、表６は実験例７〜１２で用いたＨＣＰ（第１プローブ及び第２プローブ）の各領域（Ｘ−Ｙ−Ｚ）の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を示す表である。
４．反応
（４−１）第１ハイブリダイゼーション
前記調製したストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートに各濃度のターゲットオリゴＤＮＡ（配列番号２７）（０．０５，０．１，０．５，１又は１０ｆｍｏｌ／ｍＬ）を５０μＬ、第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液を５０μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールし、マイクロプレートの上部２０℃、下部４５℃に設定した条件下で１時間反応させた。反応後、洗浄液［50mM-Tris, 0.3M-NaCl, 0.01％-TritonX-100, pH 7.6］で洗浄した。
（４−１）第１ハイブリダイゼーション
前記調製したストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートに各濃度のターゲットオリゴＤＮＡ（配列番号２７）（０．０５，０．１，０．５，１又は１０ｆｍｏｌ／ｍＬ）を５０μＬ、第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液を５０μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールし、マイクロプレートの上部２０℃、下部４５℃に設定した条件下で１時間反応させた。反応後、洗浄液［50mM-Tris, 0.3M-NaCl, 0.01％-TritonX-100, pH 7.6］で洗浄した。
（４−２）第２ハイブリダイゼーション（ＨＣＰのポリマー形成反応）
洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートへ第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液を１００μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールした。マイクロプレートの上部２０℃、下部５５℃に設定した条件下で３０分間反応させた。
洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートへ第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液を１００μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールした。マイクロプレートの上部２０℃、下部５５℃に設定した条件下で３０分間反応させた。
５．検出
マイクロプレートウェルを洗浄後、15mU/mLのALP標識抗ジゴキシゲニン(100mM Tris, pH 7.5)を１００μＬ加え、３７℃のインキュベーターで反応させた。洗浄液で洗浄後、発光基質液（CDP-Star、TROPIX製）を１００μＬ加え、暗所で２０分反応後、ルミノメーター（Centro LB960、Berthold製）で発光強度（RLU）を測定した。結果を表７及び図１１に示す。
マイクロプレートウェルを洗浄後、15mU/mLのALP標識抗ジゴキシゲニン(100mM Tris, pH 7.5)を１００μＬ加え、３７℃のインキュベーターで反応させた。洗浄液で洗浄後、発光基質液（CDP-Star、TROPIX製）を１００μＬ加え、暗所で２０分反応後、ルミノメーター（Centro LB960、Berthold製）で発光強度（RLU）を測定した。結果を表７及び図１１に示す。
表７及び図１１に示したように、各領域の塩基数が全て１３のＨＣＰ、全て１４のＨＣＰ、全て１５のＨＣＰ及び１４と１５からなるＨＣＰを用いた実施例８〜１１は、各領域の塩基数が全て１２、１６、１７、１８、１９又は２０のＨＣＰを用いた実験例７〜１２に比べて高い測定値が得られた。
Claims (17)
- ５’端部から順に核酸領域Ｘ、Ｙ及びＺが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、
からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を反応させてポリマーを形成させる方法であって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３〜１５塩基であることを特徴とするシグナルプローブポリマーの形成方法。 - 前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１４又は１５塩基であることを特徴とする請求項１記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
- 前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが全て１４塩基であることを特徴とする請求項１記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
- 前記各核酸領域の端部全ての塩基がグアニン又はシトシンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
- 前記オリゴヌクレオチド・プローブが、標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
- 前記標識物質が、アクリジニウムエステル、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることを特徴とする請求項５記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
- 請求項１〜６のいずれか１項記載の方法で形成されることを特徴とするシグナルプローブポリマー。
- 試料内の標的分析物の存在を検出する方法であって、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法によりポリマーを形成させ、該ポリマーを検出することにより標的分析物を検出することを特徴とする標的分析物の検出方法。
- 前記標的分析物と特異的に結合可能であり、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方のオリゴヌクレオチド・プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するアシストプローブを用い、前記標的分析物と前記アシストプローブと前記ポリマーとを含む複合体を形成し、該複合体を分析することにより前記標的分析物を検出することを特徴とする請求項８記載の標的分析物の検出方法。
- 前記標的分析物が核酸であり、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方が、前記標的核酸の一部に相補的な配列を有することを特徴とする請求項８記載の標的分析物の検出方法。
- 前記標的分析物が、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー及び糖質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項８又は９記載の標的分析物の検出方法。
- ５’端部から順に核酸領域Ｘ、Ｙ及びＺが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、
からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブであって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３〜１５塩基であることを特徴とする一対のオリゴヌクレオチド・プローブ。 - 前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１４又は１５塩基であることを特徴とする請求項１２記載の一対のオリゴヌクレオチド・プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが全て１４塩基であることを特徴とする請求項１２記載の一対のオリゴヌクレオチド・プローブ。
- 前記各核酸領域の端部全ての塩基がグアニン又はシトシンであることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項記載の一対のオリゴヌクレオチド・プローブ。
- 前記オリゴヌクレオチド・プローブが、標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか１項記載の一対のオリゴヌクレオチド・プローブ。
- 前記標識物質が、アクリジニウムエステル、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることを特徴とする請求項１６記載の一対のオリゴヌクレオチド・プローブ。
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