DE60123626T2

DE60123626T2 - Verfahren zur konstruktion von selbstassemlbierenden sonden und verfahren zu ihrer detektion

Info

Publication number: DE60123626T2
Application number: DE60123626T
Authority: DE
Inventors: Mitsugu Abiko-shi Usui; Mari Kashiwa-shi MITSUKA; Chikako Kashiwa-shi HAKII
Original assignee: Sanko Junyaku Co Ltd
Current assignee: Sanko Junyaku Co Ltd
Priority date: 2000-10-11
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2021-10-06
Also published as: WO2002031192A1; US7122310B2; AU2001294199A1; US20030087262A1; EP1304386A1; ATE341647T1; DE60123626D1; EP1304386B1; EP1304386A4; ES2273892T3; JP3912595B2; JPWO2002031192A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vielzahl von Dimer-bildenden Sonden, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden, ein Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten („self-assembly") Substanz aus den Dimer-bildenden Sonden, eine gebildete sebst-zusammengelagerte Substanz und ein Verfahren zum Nachweisen der gebildeten selbst-zusammengelagerten Substanz.
Stand der Technik
In dem Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz aus Sonden, wobei eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird, indem eine Vielzahl von Paaren von Sonden bereitgestellt wird, umfassend n (n ≥ 3) Teile, welche zueinander komplementär sind (kann nachstehend als eine „waben-förmige Sonde" („HoneyComb Probe", „HCP") bezeichnet werden), und indem die Sonden hybridisiert werden, wobei sie abwechselnd miteinander gekreuzt werden (vgl. USP Nr. 6 261 846, JP A 00 201687 und Japanische Patentanmeldung Nr. 2000–98797, wobei dieses Verfahren nachstehend als ein „PALSAR"- („Probe alternation link selfassembly reaction", „Selbstzusammenbau-Reaktion durch Binden von Sonden in wechselseitiger Folge") Verfahren bezeichnet werden kann), wird ein Zielgen durch die Bildung einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz nachgewiesen, wobei nur ein Paar von Oligonucleotid-Sonden verwendet wird und die Sonden hybridisiert werden, wobei sie abwechselnd miteinander gekreuzt werden, da jedoch nur zwei Oligonucleotid-Sonden verwendet werden, gibt es mehrere Einschränkungen in Regionen der Oligonucleotid-Sonden, die zum Nachweisen eines Zielgens eingesetzt werden, und Regionen zum Markieren mit einem fluoreszierenden Farbstoff, einem Enzym oder einem Antikörper.
Da weiterhin zwei Oligonucleotid-Sonden miteinander abwechselnd reagieren, steht jede Region in Konkurrenz zu jeder anderen, weshalb eine ziemlich lange Reaktionszeit für das Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz erforderlich ist.
Als ein Paar von Oligonucleotid-Sonden, wie es in dem PALSAR-Verfahren verwendet wird, wird nur ein Paar von Oligonucleotid-Sonden eingesetzt, und die Sonden werden miteinander hybridisiert, wobei sie abwechselnd miteinander gekreuzt werden, wodurch eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz aus Sonden bereitzustellen, wobei nicht nur ein Paar von Oligonucleotid-Sonden, sondern jede Oligonucleotid-Sonde vorher als eine Vielzahl von Dimer-Sonden hergestellt wird und die Typen vermehrt werden, wodurch es möglich wird, die zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz erforderliche Reaktionszeit noch weiter zu verkürzen, und wobei es möglich wird, dass Regionen von Oligonucleotid-Sonden, die zum Nachweisen eines Zielgens verwendet werden können, und Regionen zum Markieren mit einem fluoreszierenden Farbstoff, einem Enzym oder einem Antikörper vermehrt werden, und ein Verfahren zum Nachweisen der selbst-zusammengelagerten Substanz bereitzustellen, die durch das Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gebildet wurde.
In den bisherigen Verfahren der genetischen Diagnose werden verschiedene Verfahren zum Nachweisen eines Zielgens eingesetzt, wobei als Beispiele hierfür ein EIA genannter Enzymimmuntest und eine fluoreszierende Markierung dienen können, wobei jedoch in solchen Verfahren die Verwendung eines teuren Enzyms, eines Antikörpers oder einer fluoreszierenden Markierung erforderlich ist und außerdem komplizierte Arbeitsgänge durchgeführt werden müssen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorstehend beschriebenen Probleme können gelöst werden, indem ein Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung in einem ersten Aspekt die Schritte umfasst: Bereitstellen einer ersten Gruppe und einer zweiten Gruppe, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und alle 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'- Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind; zuerst Bilden von Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden der ersten bzw. zweiten Gruppe; danach Hybridisieren der gebildeten Dimer-Sonden von jeder Gruppe; und Bilden einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz durch Selbst-Zusammenlagern der Oligonucleotide.
Ein Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst in einem zweiten Aspekt die Schritte: Bereitstellen einer ersten Gruppe und einer zweiten Gruppe, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimerbildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und alle 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind; zuerst Bilden von Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden der ersten bzw. zweiten Gruppe; danach Hybridisieren der gebildeten Dimer-Sonden von jeder Gruppe; und Bilden einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz durch Selbst-Zusammenlagern der Oligonucleotide.
Ein Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst in einem dritten Aspekt die Schritte: Bereitstellen mehrerer Gruppen aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und alle 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind; zuerst Bilden von Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden der ersten bzw. bis zur n. Gruppe; danach Hybridisieren der gebildeten Dimer-Sonden von jeder Gruppe; und Bilden einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz durch Selbst-Zusammenlagern der Oligonucleotide.
Ein Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend in einem vierten Aspekt die Schritte: Bereitstellen mehrerer Gruppen aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und alle 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind; zuerst Bilden von Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden der ersten bzw. bis zur n. Gruppe; danach Hybridisieren der gebildeten Dimer-Sonden von jeder Gruppe; und Bilden einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz durch Selbst-Zusammenlagern der Oligonucleotide.
Durch Anordnen von mindestens einem G (Guanin) oder C (Cytosin) an beiden Enden von jeder der drei Regionen der Dimer-bildenden Sonden und Bilden von mindestens einer G-C-Bindung an allen Enden der Regionen beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden wird es möglich gemacht, dass eine stabile doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird.
Eine Nucleinsäure, welche die Dimer-bildenden Sonden darstellt, besteht normalerweise aus DNA oder RNA, jedoch kann sie auch aus einem Nucleinsäure-Analogon bestehen. Das Nucleinsäure-Analogon umfasst z.B. eine Peptid-Nucleinsäure („Peptide Nucleic Acid", PNA, WO 92/20702) und „Locked Nucleic Acid" (LNA, Koshkin, A. A., et al., Tetrahedron, 1998, 54: 3607–3630; Koshkin, A. A., et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120: 13252–13253; Wahlestedt, C., et al., PNAS, 2000, 97: 5633–5638). Weiterhin besteht ein Paar der Dimer-bildenden Sonden normalerweise aus dem gleichen Typ von Nucleinsäuren, jedoch kann z.B. auch ein Paar von DNA- und RNA-Sonden verwendet werden. Das heißt, der Typ von Nucleinsäuren in den Sonden kann aus DNA, RNA oder Nucleinsäure-Analoga (z.B. PNA, LNA usw.) ausgewählt sein. Weiterhin ist es nicht erforderlich, dass die Nucleinsäurezusammensetzung in einer bestimmten Sonde aus nur einer Art von Nucleinsäuren (z.B. nur DNA) besteht, und, sofern es erforderlich ist, kann z.B. eine Sonde (eine chimäre Sonde) verwendet werden, die aus DNA und RNA besteht, wobei dies im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt.
Beim Hybridisieren einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden ist es bevorzugt, zuerst Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden zu bilden und danach die für jede Gruppe gebildeten Dimer-Sonden zu hybridisieren.
Eine selbst-zusammengelagerte Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch das Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz gebildet. Die aufgeschichteten Basen in der selbst-zusammengelagerten Substanz, die durch das Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurde, haben eine regelmäßige Struktur höherer Ordnung, wodurch ein hypochromer Effekt zustande kommt, der „Hypochromismus" genannt wird und der die Intensität einer Absorptionsbande im ultravioletten Bereich bei 260 nm abschwächt, wodurch der Zustand der selbst-zusammengelagerten Substanz bestätigt wird. Weiterhin wird eine billiger fluoreszierender Stoff zwischen die aufgeschichteten Basen der selbst-zusammengelagerten Substanz eingefügt, so dass eine Änderung der Fluoreszenzintensität bewirkt wird, wodurch der Zustand der selbst-zusammengelagerten Substanz bestätigt wird. Somit ist das Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung eine Technik, deren Kosten-Leistungs-Verhältnis außerordentlich gut ist und die es möglich macht, Gene mit bisher noch nicht dagewesenen niedrigen Kosten einfach nachzuweisen.
Eine selbst-zusammengelagerte Substanz, die durch das Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz gebildet wurde, kann nachgewiesen werden, indem eine Änderung in der photochemischen Absorption von ultraviolettem Licht der selbst-zusammengelagerten Substanz genutzt wird.
Eine selbst-zusammengelagerte Substanz, die durch das Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz gebildet wurde, kann nachgewiesen werden, indem eine fluoreszierende Substanz zugegeben wird, welche die Fähigkeit besitzt, an die Basenpaare einer Nucleinsäure der selbst-zusammengelagerten Substanz zu binden, und indem die photochemische Änderung der fluoreszierenden Substanz bestimmt wird.
Eine Gruppe von Dimer-Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung wird in einem ersten Aspekt durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden gebildet, gebildet aus einer ersten Gruppe bis zu einer zweiten Gruppe, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind.
Eine Gruppe von Dimer-Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung wird in einem zweiten Aspekt durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden gebildet, gebildet aus einer ersten Gruppe bis zu einer zweiten Gruppe, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind.
Eine Gruppe von Dimer-Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung wird in einem dritten Aspekt durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden gebil det, gebildet aus mehreren Gruppen aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind.
Eine Gruppe von Dimer-Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung wird in einem vierten Aspekt durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden gebildet, gebildet aus mehreren Gruppen aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind.
Vorzugsweise ist mindestens ein G (Guanin) oder C (Cytosin) an einem oder mehreren Enden der drei Regionen der Dimer-bildenden Sonden angeordnet.
Die Dimer-bildenden Sonden bestehen aus DNA, RNA, PNA und/oder LNA.
Eine Dimer-Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden gebildet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens von zwei Sätzen von Dimer-Sonden in dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei in dieser Figur in (a) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer ersten Gruppe bzw. in (b) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer zweiten Gruppe dargestellt ist.
2 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit den zwei Sätzen von Dimer-Sonden zeigt, die in 1 dargestellt sind, wobei in dieser Figur in (a) die zwei Sätze von Dimer-Sonden dargestellt sind bzw. in (b) eine gebildete selbst-zusammengelagerte Substanz dargestellt ist.
3 ist eine schematisches Darstellung, die ein weiteres Beispiel des Bildens von zwei Sätzen von Dimer-Sonden in dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei in dieser Figur in (a) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer ersten Gruppe bzw. in (b) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer zweiten Gruppe dargestellt ist.
4 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit den zwei Sätzen von Dimer-Sonden zeigt, die in 3 dargestellt sind, wobei in dieser Figur in (a) die zwei Sätze von Dimer-Sonden dargestellt sind bzw. in (b) eine gebildete selbst-zusammengelagerte Substanz dargestellt ist.
5 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens von drei Sätzen von Dimer-Sonden in dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei in dieser Figur in (a) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer ersten Gruppe, in (b) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer zweiten Gruppe bzw. in (c) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer dritten Gruppe dargestellt ist.
6 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit den drei Sätzen von Dimer-Sonden zeigt, die in 5 dargestellt sind, wobei in dieser Figur in (a) die drei Sätze von Dimer-Sonden dargestellt sind bzw. in (b) eine gebildete selbst-zusammengelagerte Substanz dargestellt ist.
7 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens von vier Sätzen von Dimer-Sonden in dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei in dieser Figur in (a) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer ersten Gruppe, in (b) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer zweiten Gruppe, in (c) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer dritten Gruppe bzw. in (d) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer vierten Gruppe dargestellt ist.
8 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit den vier Sätzen von Dimer-Sonden zeigt, die in 7 dargestellt sind, wobei in dieser Figur in (a) die vier Sätze von Dimer-Sonden dargestellt sind bzw. in (b) eine gebildete selbst-zusammengelagerte Substanz dargestellt ist.
9 ist eine schematische Darstellung, die ein weiteres Beispiel des Bildens von drei Sätzen von Dimer-Sonden in dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei in dieser Figur in (a) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden dargestellt ist, gebildet aus einer ersten Gruppe bis zu einer dritten Gruppe, bzw. in (b) eine selbst-zusammengelagerte Substanz dargestellt ist, gebildet mit den drei Sätzen von Dimer-Sonden.
10 ist eine schematische Darstellung, die ein weiteres Beispiel des Bildens von vier Sätzen von Dimer-Sonden in dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei in dieser Figur in (a) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer ersten Gruppe, in (b) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer zweiten Gruppe, in (c) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer dritten Gruppe bzw. in (d) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer vierten Gruppe dargestellt ist.
11 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit den vier Sätzen von Dimer-Sonden zeigt, die in 10 dargestellt sind, wobei in dieser Figur in (a) die vier Sätze von Dimer-Sonden dargestellt sind bzw. in (b) eine gebildete selbst-zusammengelagerte Substanz dargestellt ist.
12 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens von fünf Sätzen von Dimer-Sonden in dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei in die ser Figur in (a) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer ersten Gruppe, in (b) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer zweiten Gruppe, in (c) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer dritten Gruppe, in (d) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer vierten Gruppe bzw. in (e) das Bilden einer Dimer-Sonde mit einem Paar von Dimer-bildenden Sonden einer fünften Gruppe dargestellt ist.
13 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit den fünf Sätzen von Dimer-Sonden zeigt, die in 12 dargestellt sind, wobei in dieser Figur in (a) die fünf Sätze von Dimer-Sonden dargestellt sind, in (b) eine gebildete selbst-zusammengelagerte Substanz dargestellt ist bzw. in (c) ein Beispiel von Kombinationen der Hybridisierung von n Sätzen von Dimer-Sonden im Fall von n Gruppen dargestellt ist.
14 ist ein Foto, welches die Ergebnisse des Erfindungsbeispiels 1 zeigt.
15 ist ein Foto, welches die Ergebnisse des Erfindungsbeispiels 2 zeigt.
16 ist ein Foto, welches die Ergebnisse des Erfindungsbeispiels 3 zeigt.
17 ist ein Foto, welches die Ergebnisse der Versuchsbeispiele 1 bis 4 (Bahnen 1, 2, 4 und 5) und der Versuchsbeispiele 5 und 6 (Bahnen 3 und 6) zeigt.
Beste Art und Weise zum Durchführen der Erfindung
Nachstehend sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die angefügten Zeichnungen beschrieben, wobei nicht erwähnt werden muss, dass diese Ausführungsformen lediglich der Erläuterung dienen sollen und dass im Umfang des technischen Konzepts der vorliegenden Erfindung verschiedene Modifikationen möglich sind.
In der vorliegenden Erfindung werden mehrere Sätze von Paaren von Dimerbildenden Sonden verwendet, und die Sonden werden miteinander unter isothermen Bedingungen in Abwesenheit von Enzymen umgesetzt, wodurch eine selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird. Die Zahl der Dimer-bildenden Sonden, die verwendet werden sollen, ist nicht besonders eingeschränkt, sie liegt jedoch bevorzugt im Bereich von 10² bis 10¹⁵ Sonden. Die Zusammensetzung und die Konzentration der in der Reaktion verwendeten Pufferlösung sind nicht besonders eingeschränkt, wobei vorzugsweise eine Pufferlösung eingesetzt werden kann, die normalerweise in einem Verfahren zum Amplifizieren von Nucleinsäure verwendet wird. Der pH-Wert kann auch im gebräuchlichen Bereich liegen, vorzugsweise im Bereich von 7,0 bis 9,0. Die Reaktionstemperatur beträgt 40 bis 90°C, vorzugsweise 55 bis 65°C. Diese Bedingungen sind nicht besonders eingeschränkt.
Der Aufbau der vorliegenden Erfindung wird noch weiter erläutert, indem ein spezifischeres Beispiel verwendet wird, wobei die Länge (die Zahl der Basen) von jeder der Regionen in einer Dimer-bildenden Sonde gleich oder verschieden sein kann.
Dabei beträgt die Länge von jeder der Regionen in einer Dimer-bildenden Sonde, die als die Anzahl von Basen angegeben ist, mindestens fünf Basen, vorzugsweise mindestens acht Basen, am stärksten bevorzugt zehn bis 100 Basen und noch stärker bevorzugt 15 bis 30 Basen.
Nachstehend werden Beispiele des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit den Dimer-bildenden Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
1. Erstes Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit zwei Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Wie in 1(a) dargestellt, umfasst die erste Gruppe ein Paar von Dimerbildenden Sonden, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide zueinander komplementär sind, wodurch Dimer-Sonden der ersten Gruppe (α) gebildet werden, wobei die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen nicht zueinander komplementär sind. Genauso weist ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe und Dimer-Sonden davon (β) den Aufbau wie vorstehend beschrieben auf (1(b)).
In der Dimer-Sonde der ersten Gruppe (α) und der Dimer-Sonde der zweiten Gruppe (β), wie in 1 und in 2(a) dargestellt, weisen die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonden (β), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonden (β), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonden (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) bzw. die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonden (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β) Basensequenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-Sonden (α) und (β) miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird (2(b)).
2. Zweites Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit zwei Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Als zweites Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit zwei Sätzen von Dimer-bildenden Sonden ist es möglich, die 3'-Seitenregion oder die 5'-Seitenregion in dem Oligonucleotid Nr. 1 von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe durch die 3'-Seitenregion oder die 5'-Seitenregion in dem Oligonucleotid Nr. 2 davon zu ersetzen, wie in 3(b) dargestellt.
In der Dimer-Sonde der ersten Gruppe (α) und der Dimer-Sonde der zweiten Gruppe (β'), wie in 4(a) dargestellt, weisen die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 3 der Dimer-Sonde (β'), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 3 der Dimer-Sonde (β'), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 4 der Dimer-Sonde (β'), bzw. die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 4 der Dimer-Sonde (β') Basensequenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-Sonden (α) und (β') miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird (4(b)).
3. Erstes Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit n Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Mehrere Gruppen werden aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach gebildet, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind.
In den Dimer-bildenden Sonden weisen (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird.
Ein Beispiel von n = 3 in dem vorstehenden ersten Beispiel ist in 5 und 6 dargestellt, und ein Beispiel von n = 4 in dem vorstehenden ersten Beispiel ist in 7 und 8 dargestellt.
4. Erstes Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit drei Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Wie in 5(a) dargestellt, umfasst die erste Gruppe ein Paar von Dimerbildenden Sonden, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide zueinander komplementär sind, wodurch Dimer-Sonden der ersten Gruppe (α) gebildet werden, wobei die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen nicht zueinander komplementär sind. Genauso weist ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe und Dimer-Sonden davon (β), und ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der dritten Gruppe und Dimer-Sonden davon (γ) den Aufbau wie vorstehend beschrieben auf (5(b) und (c)).
In der Dimer-Sonde der ersten Gruppe (α), der Dimer-Sonde der zweiten Gruppe (β) und der Dimer-Sonde der dritten Gruppe (γ), wie in 5 und in 6(a) dargestellt, weisen die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α), bzw. die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) Basensequenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird (6(b)).
5. Erstes Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit vier Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Wie in 7(a) dargestellt, umfasst die erste Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide zueinander komplementär sind, wodurch Dimer-Sonden der ersten Gruppe (α) gebildet werden, wobei die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen nicht zueinander komplementär sind. Genauso weist ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe und Dimer-Sonden davon (β), ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der dritten Gruppe und Dimer-Sonden davon (γ), und ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der vierten Gruppe und Dimer-Sonden davon (δ) den Aufbau wie vorstehend beschrieben auf (7(b) bis (d)).
In der Dimer-Sonde der ersten Gruppe (α), der Dimer-Sonde der zweiten Gruppe (β), der Dimer-Sonde der dritten Gruppe (γ) und der Dimer-Sonde der vierten Gruppe (δ), wie in 7 und in 8(a) dargestellt, weisen die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (δ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (δ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (δ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α), bzw. die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (δ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) Basensequenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird (8(b)).
6. Zweites Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit n Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Mehrere Gruppen werden aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach gebildet, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind.
In den Dimer-bildenden Sonden weisen (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe Basense quenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird.
Ein Beispiel von n = 3 in dem vorstehenden zweiten Beispiel ist in 9 dargestellt, ein Beispiel von n = 4 in dem vorstehenden zweiten Beispiel ist in 10 und 11 dargestellt, und ein Beispiel von n = 5 in dem vorstehenden zweiten Beispiel ist in 12 und 13 dargestellt.
7. Zweites Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit drei Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Wie in 9(a) dargestellt, umfasst die erste Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide zueinander komplementär sind, wodurch Dimer-Sonden der ersten Gruppe (α) gebildet werden, wobei die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen nicht zueinander komplementär sind. Genauso weist ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe und Dimer-Sonden davon (β), und ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der dritten Gruppe und Dimer-Sonden davon (γ) den Aufbau wie vorstehend beschrieben auf.
In der Dimer-Sonde der ersten Gruppe (α), der Dimer-Sonde der zweiten Gruppe (β) und der Dimer-Sonde der dritten Gruppe (γ), wie in 9(a) dargestellt, weisen die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α), bzw. die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α) Basensequenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird (9(b)).
8. Zweites Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit vier Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Wie in 10(a) dargestellt, umfasst die erste Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelre gion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide zueinander komplementär sind, wodurch Dimer-Sonden der ersten Gruppe (α) gebildet werden, wobei die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen nicht zueinander komplementär sind. Genauso weist ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe und Dimer-Sonden davon (β), ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der dritten Gruppe und Dimer-Sonden davon (γ), und ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der vierten Gruppe und Dimer-Sonden davon (δ) den Aufbau wie vorstehend beschrieben auf (10(b) bis (d)).
In der Dimer-Sonde der ersten Gruppe (α), der Dimer-Sonde der zweiten Gruppe (β), der Dimer-Sonde der dritten Gruppe (γ) und der Dimer-Sonde der vierten Gruppe (δ), wie in 10 und in 11(a) dargestellt, weisen die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (δ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (δ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (δ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α), bzw. die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (δ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α) Basensequenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird (11(b)).
9. Zweites Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit fünf Sätzen von Dimer-bildenden Sonden
Wie in 12(a) dargestellt, umfasst die erste Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide zueinander komplementär sind, wodurch Dimer-Sonden der ersten Gruppe (α) gebildet werden, wobei die 3'-Seitenregionen und die 5'-Seitenregionen nicht zueinander komplementär sind. Genauso weist ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe und Dimer-Sonden davon (β), ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der dritten Gruppe und Dimer-Sonden davon (γ), ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der vierten Gruppe und Dimer-Sonden davon (δ), und ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der fünften Gruppe und Dimer-Sonden davon (θ) den Aufbau wie vorstehend beschrieben auf (12(b) bis (d)).
In der Dimer-Sonde der ersten Gruppe (α), der Dimer-Sonde der zweiten Gruppe (β), der Dimer-Sonde der dritten Gruppe (γ), der Dimer-Sonde der vierten Gruppe (δ) und der Dimer-Sonde der fünften Gruppe (θ), wie in 12 und in 13(a) dargestellt, weisen die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (α) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (β), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (β) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (γ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (δ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (γ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (δ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (δ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (θ), die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (δ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (θ), die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (θ) und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α), bzw. die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der Dimer-Sonde (θ) und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der Dimer-Sonde (α) Basensequenzen auf, die zueinander komplementär sind. Somit lagern sich beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden miteinander die Oligonucleotide selbst zusammen, so dass eine doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird (13(b)).
Weiterhin wird in dem vorstehenden zweiten Beispiel als Beispiel des Bildens einer selbst-zusammengelagerten Substanz mit n Sätzen von Dimer-bildenden Sonden, enthalten in n Gruppen, eine selbst-zusammengelagerte Substanz durch Hybridisieren von n Sätzen von Dimer-Sonden mit der Kombination gebildet, wie in 13(c) dargestellt.
Als ein bevorzugtes Verfahren zum Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden wurde vorstehend das Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz beschrieben, wobei zuerst die Dimer-bildenden Sonden hybridisiert werden, so dass die Dimer-Sonden gebildet werden, und dann die für jede Gruppe gebildeten Dimer-Sonden hybridisiert werden, wie vorstehend beschrieben. Jedoch ist das Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf das vorstehend beschriebene Verfahren beschränkt und enthält z.B. auch das Verfah ren, in welchem die selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird, indem die Dimer-bildenden Sonden jeder Gruppe alle gleichzeitig umgesetzt werden, so dass die Sonden zu hybridisieren.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, in welchem mindestens ein G (Guanin) oder C (Cytosin) an einem oder mehreren Enden der drei Regionen der Dimer-bildenden Sonden angeordnet ist, wobei beim Hybridisieren der Dimer-bildenden Sonden mindestens eine G-C-Bindung an den Enden der Regionen gebildet wird, wodurch die spezielle Wechselwirkung durch π-Elektronen von Basen erzeugt wird, die zum Aufschichten der Basen beitragen kann, so dass eine stabile doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird.
In dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz haben die Erfinder herausgearbeitet, dass, wenn die Bindung an mehreren verschiedenen Stellen jeder Region schwach ist, dann die Hybridisierung der durch die mehreren verschiedenen Stellen in Sandwich-Form zusammengehaltenen Region nicht stabil ist; deshalb hat das Aufschichten von Basen, das durch die spezielle Wechselwirkung von π-Elektronen von Basen zustande kommt, in der Gesamtheit der Region eine stärkere Wirkung, wodurch es an der jeweiligen Region zu einer stärkeren Hybridisierungsreaktion kommt.
Die Zahl von C oder G, die an den Enden der Regionen angeordnet sind, kann mindestens eine Base betragen, wobei eine Vielzahl von Basen verwendet werden kann. Unter Berücksichtigung der Basensequenz der jeweiligen Region kann die Zahl solcher Basen geeignet ausgewählt werden. Wenn zwei oder mehr C und G angeordnet werden sollen, können C und G willkürlich kombiniert und in einer beliebigen Reihenfolge angeordnet werden.
In der vorliegenden Erfindung haben die aufgeschichteten Basen in der selbst-zusammengelagerten Substanz, die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurde, eine regelmäßige Struktur höherer Ordnung, wodurch ein hypochromatischer Effekt, der auch „Hypochromismus" genannt wird, zustande kommt, wodurch die Intensität einer Absorptionsbande bei 260 nm in der ultravioletten Region abgeschwächt wird, so dass der Zustand der selbst-zusammengelagerten Substanz bestätigt werden kann.
Weiterhin kann in der vorliegenden Erfindung der Zustand der selbst-zusammengelagerten Substanz bestätigt werden, indem eine fluoreszierende Substanz zugefügt wird, welche die Fähigkeit besitzt, an Basenpaare einer Nucleinsäure der selbst-zusammengelagerten Substanz zu binden, und indem eine Änderung in der Intensität der Fluoreszenz bestimmt wird. Z.B. kann die selbst-zusammengelagerte Substanz nachgewiesen werden, indem ein Farbstoff zugegeben wird, der in die zwei Stränge von Oligonucleotiden eingebaut wird, so dass er eine Fluoreszenz aussendet, und indem die Emission der Fluoreszenz mit dem I-CORE^TM (Smart Cycler^TM), hergestellt von Cepheid Inc., überwacht wird, usw..
Die gebildete selbst-zusammengelagerte Substanz kann auch durch eine allgemeine Agarose-Gel-Elektrophorese einfach nachgewiesen werden.
Beispiele
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung durch Bezug auf Beispiele noch ausführlicher beschrieben, wobei man jedoch nicht darauf hinweisen muss, dass die vorliegende Erfindung in keiner Weise durch die Beispiele eingeschränkt werden soll.
Oligonucleotid-Sonden, die in den Beispielen verwendet werden:

1) Sonde Nr. 1 5'-GTGCTGACTT AACCGGATAC GAACAGGATC CTAGACCTAG CATAGT ACAG TCCGATGGTG-3'
2) Sonde Nr. 2 5'-CCTCAAGACG CATGTCTTTC CTAGGTCTAG GATCCTGTTC CTAGAA CGGA CTGTACTTCG-3'
3) Sonde Nr. 3 5'-GAAAGACATG CGTCTTGAGG CTATCCGTTC GACTTGCATG CGAAGT ACAG TCCGTTCTAG-3'
4) Sonde Nr. 4 5'-GTATCCGGTT AAGTCAGCAC CATGCAAGTC GAACGGATAG CACCAT CGGA CTGTACTATG-3'
5) Sonde X1 5'-GTGCTGACTT AACCGGATAC GAACAGGATC CTAGACCTAG CATAGT ACAG TCCGATGGTG-3'
6) Sonde X2 5'-CCTCAAGACG CATGTCTTTC CTAGGTCTAG GATCCTGTTC CTAGAA CGGA CTGTACTTCG-3'
7) Sonde Y1 5'-GAAAGACATG CGTCTTGAGG CTATCCGTTC GACTTGCATG CTAGAC GCTT CTTGCGTAAG-3'
8) Sonde Y2 5'-GTGTCGAATT GACACTCAGC CATGCAAGTC GAACGGATAG CACCAT CGGA CTGTACTATG-3'
9) Sonde Z1 5'-GCTGAGTGTC AATTCGACAC GCACCCTATC AGGCAGTATC CGAAGT ACAG TCCGTTCTAG-3'
10) Sonde Z2 5'-GTATCCGGTT AAGTCAGCAC GATACTGCCT GATAGGGTGC CTTACG CAAG AAGCGTCTAG-3'

Versuchsbeispiele 1 bis 6
1. Aufgabe
Die Bildung von Dimer-Sonden mit zwei Sätzen von Paaren von Dimer-bildenden Sonden der ersten und zweiten Gruppe wurde bewiesen.
2. Material

(1) Die Sonden Nr. 1 und Nr. 2 wurden als ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der ersten Gruppe hergestellt, und die Sonden Nr. 3 und Nr. 4 wurden als ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe hergestellt. Die Oligonucleotid-Sonden wurden eingesetzt, die jeweils in einer Konzentration von 100 pMol hergestellt wurden.
(2) 20 × SSC (3 M NaCl, 0,3 M C₆H₅O₇Na₃·2H₂O, pH 7) wurde als Pufferlösung verwendet.

3. Verfahren
Versuchsbeispiele 1 bis 4: Herstellen von Dimer-bildenden Sonden 1 μl Oligonucleotid-Sonde, 12 μl 20 × SSC und 7 μl H₂O wurden jeweils in 0,2-ml-Mikroröhrchen gegeben, so dass 20 μl Reaktionslösung erhalten wurden. Als Oligonucleotid-Sonden wurde im Versuchsbeispiel 1 die Sonde Nr. 1, im Versuchsbeispiel 2 die Sonde Nr. 2, im Versuchsbeispiel 3 die Sonde Nr. 3 bzw. im Versuchsbeispiel 4 die Sonde Nr. 4 verwendet.
Die Reaktionslösungen wurden jeweils 30 Sekunden auf 94°C erhitzt.
Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen war, wurden die Reaktionslösungen schnell auf Eis abgekühlt und sodann einer Elektrophorese auf einem 0,5 % Agarose-Gel 30 Minuten bei 100 V unterworfen. Nachdem die Agarose-Gel-Elektrophorese vollständig abgelaufen war, wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt.
Versuchsbeispiele 5 und 6: Herstellen von Dimer-Sonden
Im Versuchsbeispiel 5 wurden 0,5 μl der Sonde Nr. 1, 0,5 μl der Sonde Nr. 2, 12 μl 20 × SSC und 7 μl H₂O in ein 0,2-ml-Mikroröhrchen gegeben, so dass 20 μl Reaktionslösung erhalten wurden.
Im Versuchsbeispiel 6 wurden 0,5 μl der Sonde Nr. 3, 0,5 μl der Sonde Nr. 4, 12 μl 20 × SSC und 7 μl H₂O in ein 0,2-ml-Mikroröhrchen gegeben, so dass 20 μl Reaktionslösung erhalten wurden.
Die Reaktionslösungen wurden jeweils 30 Sekunden auf 94°C erhitzt, danach wurden sie 30 Minuten bei 64°C umgesetzt.
Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen war, wurden die Reaktionslösungen schnell auf Eis abgekühlt und sodann einer Elektrophorese auf einem 0,5 % Agarose-Gel 30 Minuten bei 100 V unterworfen. Nachdem die Agarose-Gel-Elektrophorese vollständig abgelaufen war, wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt.
4. Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 17 dargestellt. Wie in dem Foto der Agarose-Gel-Elektrophorese von 17 zu sehen ist, wurde in den Versuchsbeispielen 1 bis 4 bestätigt, dass jede Dimer-bildende Sonde im Zustand eines Monomers vorlag (Bahn 1, 2, 4 und 5). Im Versuchsbeispiel 5, wie im Foto der Agarose-Gel-Elektrophorese von 17 zu sehen ist, waren ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der ersten Gruppe gemäß der vorliegenden Erfindung, anders als die Oligonucleotid-Sonden, die bei dem PALSAR-Verfahren verwendet wurden, solche Oligonucleotid-Sonden, die keine selbst-zusammengelagerte Substanz bildeten, sondern die nur ein Dimer bildeten (Bahn 3). Genauso bildete in Versuchsbeispiel 6, anders als bei der Oligonucleotid-Sonde, die beim PALSAR-Verfahren verwendet wurde, ein Paar von Dimer-bildenden Sonden der zweiten Gruppe gemäß der vorliegenden Erfindung keine selbst-zusammengelagerte Substanz, sondern es bildete nur ein Dimer (Bahn 6).
Erfindungsbeispiel 1
1. Aufgabe
Zwei Sätze von Dimer-Sonden wurden vorher gebildet, und die Bildung einer selbst-zusammengelagerten Substanz wurde bestätigt.
2. Material

(1) Das Dimer der ersten Gruppe, das in Versuchsbeispiel 5 gebildet wurde, wurde als Dimer-Sonde der ersten Gruppe (α) eingesetzt, und das Dimer der zweiten Gruppe, das in Versuchsbeispiel 6 gebildet wurde, wurde als Dimer-Sonde der zweiten Gruppe (β) eingesetzt.
(2) 20 × SSC (3 M NaCl, 0,3 M C₆H₅O₇Na₃·2H₂O, pH 7) wurde als Pufferlösung verwendet.

3. Verfahren
0,5 μl einer Dimer-Sonde (α) der ersten Gruppe, 0,5 μl einer Dimer-Sonde (β) der zweiten Gruppe, 12 μl 20 × SSC und 7 μl H₂O wurden jeweils in 0,2-ml-Mikroröhrchen gegeben, so dass 20 μl Reaktionslösung erhalten wurden.
Die Reaktionslösungen wurden 30 Minuten auf 52°C, 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C bzw. 70°C erhitzt.
Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen war, wurden die Reaktionslösungen schnell auf Eis abgekühlt und sodann einer Elektrophorese auf einem 0,5 % Agarose-Gel 30 Minuten bei 100 V unterworfen. Nachdem die Agarose-Gel-Elektrophorese vollständig abgelaufen war, wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt.
4. Ergebnisse
Wie in dem Foto von 14 zu sehen ist, wurde durch Vergleich mit dem PALSAR-Verfahren die Bildung der selbst-zusammengelagerten Substanz bei einem großen Spektrum von Temperaturen, jedoch bei der gleichen Reaktionszeit, bestätigt. Man kann erwarten, dass dadurch die Reaktionszeit verkürzt wird.
Erfindungsbeispiel 2
1. Aufgabe
Vier Typen von Dimer-bildenden Sonden wurden alle gleichzeitig umgesetzt, und die Bildung einer selbst-zusammengelagerten Substanz wurde bestätigt.
2. Material

(1) Die Sonden Nr. 1 und Nr. 2 wurden als Dimer-bildende Sonden der ersten Gruppe verwendet, und die Sonden Nr. 3 und Nr. 4 wurden als Dimer-bildende Sonden der zweiten Gruppe verwendet. Diejenigen, die in den Versuchsbeispielen 1 bis 4 hergestellt wurden, wurden für die jeweiligen Oligonucleotid-Sonden verwendet.
(2) 20 × SSC (3 M NaCl, 0,3 M C₆H₅O₇Na₃·2H₂O, pH 7) wurde als Pufferlösung verwendet.

3. Verfahren
0,5 μl von jeder der Sonden Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4 wurden gleichzeitig jeweils in 0,2-ml-Mikroröhrchen gegeben, und 12 μl 20 · SSC und 6 μl H₂O wurden weiterhin zugegeben, so dass Reaktionslösungen von jeweils 20 μl erhalten wurden.
Die Reaktionslösungen wurden 30 Minuten auf 52°C, 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C bzw. 70°C erhitzt.
Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen war, wurden die Reaktionslösungen schnell auf Eis abgekühlt und sodann einer Elektrophorese auf einem 0,5 % Agarose-Gel 30 Minuten bei 100 V unterworfen. Nachdem die Agarose-Gel-Elektrophorese vollständig abgelaufen war, wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt.
4. Ergebnisse
Wie in dem Foto von 15 zu sehen ist, wurde die Bildung der selbst-zusammengelagerten Substanz durch Vergleich mit dem Versuchsbeispiel 1 festgestellt, wobei eine unspezifische Reaktion bei der unteren Reaktionstemperatur im Bereich von 52 bis 62°C festgestellt wurde.
Erfindungsbeispiel 3
1. Aufgabe
Die Bildung einer selbst-zusammengelagerten Substanz wurde untersucht, indem drei Sätze von Paaren von Dimer-bildenden Sonden der ersten, zweiten und dritten Gruppe verwendet wurden. In Erfindungsbeispiel 1 und Erfindungsbeispiel 2 wurde die Bildung der selbst-zusammengelagerten Substanz bei der gleichen Reaktionstemperatur bestätigt, auch wenn die Sonden vorher als Dimer zubereitet wurden und wenn die Sonden gleichzeitig zugegeben wurden, und deshalb wurden in diesem Erfindungsbeispiel die Typen von Dimeren für die Sonde auf drei Sätze vermehrt, und die Sonden wurden gleichzeitig zugegeben, um die Bildung einer selbst-zusammengelagerten Substanz bei der gleichen Reaktionstemperatur zu untersuchen.
2. Material

(1) Die Sonden X1 und X2 wurden als Dimer-bildende Sonden der ersten Gruppe verwendet, und außerdem wurden die Sonden Y1 und Y2 als Dimer-bildende Sonden der zweiten Gruppe, und die Sonden Z1 und Z2 als Dimer-bildende Sonden der dritten Gruppe verwendet. Die Oligonucleotid-Sonden wurden eingesetzt, die jeweils in einer Konzentration von 100 pMol hergestellt wurden.
(2) 20 ·× SSC (3 M NaCl, 0,3 M C₆H₅O₇Na₃·2H₂O, pH 7) wurde als Pufferlösung verwendet.

3. Verfahren
0,5 μl von jeder der Sonden X1, X2, Y1, Y2, Z1 und Z2 wurden alle gleichzeitig jeweils in 0,2-ml-Mikroröhrchen gegeben, und 18 μl 20 × SSC und 9 μl H₂O wurden weiterhin zugegeben, so dass jeweils Reaktionslösungen von 30 μl erhalten wurden.
Die Reaktionslösungen wurden jeweils 30 Sekunden auf 94°C erhitzt.
Nach dem Erhitzen wurden die Reaktionslösungen 30 Minuten bei 52°C, 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C, 70°C, 72°C bzw. 74°C gehalten.
Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen war, wurden die Reaktionslösungen schnell auf Eis abgekühlt und sodann einer Elektrophorese auf einem 0,5 % Agarose-Gel 30 Minuten bei 100 V unterworfen. Nachdem die Agarose-Gel-Elektrophorese vollständig abgelaufen war, wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt.
4. Ergebnisse
In dem Foto von 16 ist zu sehen, dass sogar bei Verwendung von sechs Typen von Dimer-bildenden Sonden, die drei Sätze von Dimer-Sonden bilden, die Bildung der selbst-zusammengelagerten Substanz wie im Erfindungsbeispiel 1 und im Erfindungsbeispiel 2 festgestellt wurde, in denen zwei Sätze von Dimer-bildenden Sonden eingesetzt wurden.
Möglichkeiten der Nutzung in der Industrie
Wie vorstehend beschrieben ist es gemäß dem Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz der vorliegenden Erfindung möglich, die Reaktionszeit zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz im Vergleich zu dem früheren Verfahren zu verkürzen. Außerdem ist es gemäß dem Verfahren zum Nachweisen der selbst-zusammengelagerten Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, die selbst-zusammengelagerte Substanz, die durch das Verfahren zum Bilden der selbst-zusammengelagerten Substanz wie vorstehend beschrieben gebildet wurde, einfach nachzuweisen.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Herstellen einer selbst-zusammengelagerten („self-assembly") Substanz, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer ersten Gruppe und einer zweiten Gruppe, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und alle 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind; zuerst Bilden von Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden der ersten bzw. zweiten Gruppe; danach Hybridisieren der gebildeten Dimer-Sonden von jeder Gruppe; und Bilden einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz durch Selbst-Zusammenlagern der Oligonucleotide.
Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer ersten Gruppe und einer zweiten Gruppe, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligo nucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und alle 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind; zuerst Bilden von Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden der ersten bzw. zweiten Gruppe; danach Hybridisieren der gebildeten Dimer-Sonden von jeder Gruppe; und Bilden einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz durch Selbst-Zusammenlagern der Oligonucleotide.
Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz, umfassend die Schritte: Bereitstellen mehrerer Gruppen aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und alle 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind; zuerst Bilden von Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden der ersten bzw. bis zur n. Gruppe; danach Hybridisieren der gebildeten Dimer-Sonden von jeder Gruppe; und Bilden einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz durch Selbst-Zusammenlagern der Oligonucleotide.
Verfahren zum Bilden einer selbst-zusammengelagerten Substanz, umfassend die Schritte: Bereitstellen mehrerer Gruppen aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und alle 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind; zuerst Bilden von Dimer-Sonden mit einer Vielzahl von Paaren der Dimer-bildenden Sonden der ersten bzw. bis zur n. Gruppe; danach Hybridisieren der gebildeten Dimer-Sonden von jeder Gruppe; und Bilden einer doppelsträngigen selbst-zusammengelagerten Substanz durch Selbst-Zusammenlagern der Oligonucleotide.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens ein G (Guanin) oder C (Cytosin) an beiden Enden von jeder der drei Regionen der Dimer-bildenden Sonden angeordnet ist, und wobei beim Hybridisieren der Dimer- bildenden Sonden mindestens eine G-C-Bindung an allen Enden der Regionen gebildet wird, wodurch eine stabile doppelsträngige selbst-zusammengelagerte Substanz gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Dimer-bildenden Sonden aus DNA, RNA, PNA und/oder LNA bestehen.
Gruppe von Dimer-Sonden, gebildet durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden, gebildet aus einer ersten Gruppe bis zu einer zweiten Gruppe, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind.
Gruppe von Dimer-Sonden, gebildet durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden, gebildet aus einer ersten Gruppe bis zu einer zweiten Gruppe, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der zweiten Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der zweiten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind.
Gruppe von Dimer-Sonden, gebildet durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden, gebildet aus mehreren Gruppen aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind.
Gruppe von Dimer-Sonden, gebildet durch Hybridisieren eines Paars von Dimer-bildenden Sonden, gebildet aus mehreren Gruppen aus einer ersten Gruppe bis zu einer n. (n ist 2 oder eine größere gerade Zahl) Gruppe der Reihe nach, wobei jede Gruppe ein Paar von Dimer-bildenden Sonden umfasst, enthaltend ein Paar von Oligonucleotiden Nr. 1 und Nr. 2, wobei jedes Oligonucleotid drei Regionen aufweist, nämlich eine 3'-Seitenregion, eine Mittelregion und eine 5'-Seitenregion, wobei die Mittelregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind, und die 3'-Seitenregionen und 5'-Seitenregionen der Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 Basensequenzen aufweisen, die nicht zueinander komplementär sind, und wobei (a) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (b) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der (n-1). Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der n. Gruppe, (c) die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 3'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe, bzw. (d) die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 1 der letzten Gruppe und die 5'-Seitenregion des Oligonucleotids Nr. 2 der ersten Gruppe Basensequenzen aufweisen, die zueinander komplementär sind.