ES2273892T3 - Procedimiento de construccion de sondas de autoensamblaje y procedimiento de deteccion de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de formación de una sustancia de auto-ensamblaje que comprende las etapas de: proporcionar un primer grupo y un segundo grupo, en los que cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3'', una región media y una región lateral 5'', en las que las regiones medias de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases complementarias entre sí, y todas las regiones laterales 3'' y las regiones laterales 5'' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases no complementarias entre sí, y en las que (a) la región lateral 3'' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo y la región lateral 3'' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo, (b) la región lateral 5'' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo y la región lateral 5'' del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo, (c) la región lateral 3'' del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo y la región lateral 3'' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y (d) la región lateral 5'' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo y la región lateral 5'' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo tienen secuencias de bases complementarias entre sí, respectivamente; formar en primer lugar sondas dímeras con una pluralidad de pares de las sondas que forman dímeros del primer y segundo grupo, respectivamente; hibridar luego las sondas dímeras formadas de cada grupo; y formar una sustancia de auto-ensamblaje de doble hebra mediante auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
Description
Procedimiento de construcción de sondas de
autoensamblaje y procedimiento de detección de las mismas.
La presente invención se refiere a una
pluralidad de sondas que forman dímeros que contienen un par de
oligonucleótidos, a un procedimiento de formación de una sustancia
de auto-ensamblaje de las sondas que forman dímeros,
a una sustancia de auto-ensamblaje formada, y a un
procedimiento para la detección de la sustancia de
auto-ensamblaje formada.
En el procedimiento de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje de sondas, en el que se
forma una sustancia de auto-ensamblaje de doble
hebra, proporcionando una pluralidad de pares de sondas que
comprenden cada una n partes (n \geq 3) complementarias
entre sí (se pueden designar en lo sucesivo como una "sonda en
panal de abejas o "HoneyComb": HCP'') e hibridando las
sondas de modo que se crucen alternativamente (véanse los
documentos USP número 6.261.846, JP A 00-201687, y
la solicitud de patente japonesa nº 2000-98797, y
este procedimiento se puede designar en lo sucesivo como un
"procedimiento de PALSAR (reacción de
auto-ensamblaje por unión con alternancia de
sonda), se detecta un gen diana con la formación de una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra, usando sólo un par
de sondas de oligonucleótidos e hibridación de las sondas de modo
que se reticulen alternativamente, pero como sólo se usan dos
sondas de oligonucleótidos, hay varias restricciones en regiones de
las sondas de oligonucleótidos que se usan para detección de un gen
diana y regiones para marcaje con un tinte fluorescente, un enzima
o un anticuerpo.
Además, cuando dos sondas de oligonucleótidos
reaccionan entre ellas alternativamente, cada región compite con
las demás, y se requiere un tiempo de reacción un poco largo para la
formación de una sustancia de auto-ensamblaje.
En un par de sondas de oligonucleótidos usado en
el procedimiento de PALSAR, sólo se usan e hibridan un par de
sondas de oligonucleótidos entre ellas de modo que se reticulan
alternativamente, con lo que se forma una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento nuevo para la formación de una
sustancia de auto-ensamblaje de sondas, en el que
no sólo se prepare previamente un par de sondas de oligonucleótidos,
sino cada sonda de oligonucleótido se prepare previamente como una
pluralidad de sondas dímeras, y se aumenten los tipos con lo que se
facilita que se acorte adicionalmente un tiempo de reacción
requerido para la formación de una sustancia de
auto-ensamblaje y faciliten regiones de sondas de
oligonucleótidos que se pueden usar para detección de un gen diana
y regiones para marcaje con un tinte fluorescente, un enzima o un
anticuerpo que se quiera resaltar y un procedimiento para la
detección de la sustancia de auto-ensamblaje formada
con el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje.
En las técnicas recientes para diagnóstico
genético se usan distintas técnicas representadas por un
inmunoensayo enzimático denominado EIA y un marcado fluorescente
para detectar un gen diana, pero en cualquier procedimiento, se
requieren el uso de una enzima cara, un anticuerpo o etiqueta
fluorescente y operaciones complicadas.
Para solucionar los problemas descritos
anteriormente, un procedimiento de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención comprende, en un primer aspecto, las etapas de
proporcionar un primer grupo y un segundo grupo, en los que cada
grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que contienen un
par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido
tres regiones de una región lateral 3', una región media y una
región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y todas las regiones laterales 3' y las
regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases no complementarias entre sí, y en las que (a)
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo y la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo, (b)
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo y la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo, (c)
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo y
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo
y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo
tienen secuencias de bases complementarias entre sí,
respectivamente; formándose en primer lugar sondas dímeras con una
pluralidad de pares de las sondas que forman dímeros del primer y
segundo grupo, respectivamente; hibridando luego las sondas dímeras
formadas de cada grupo; y formándose una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra mediante
auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
Un procedimiento de formación de una sustancia
de auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención comprende, en un segundo aspecto, las etapas de
proporcionar un primer grupo y un segundo grupo, en los que cada
grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que contienen un
par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido
tres regiones de una región lateral 3', una región media y una
región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y todas las regiones laterales 3' y las
regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases no complementarias entre sí, y en las que (a) la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo y la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo, (b) la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo y la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo, (c)
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo y la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y (d)
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo y la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, respectivamente;
formándose en primer lugar sondas dímeras con una pluralidad de
pares de las sondas que forman dímeros del primer y segundo grupo,
respectivamente; hibridando luego las sondas dímeras formadas de
cada grupo; y formándose una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra mediante
auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
Un procedimiento de formación de una sustancia
de auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención comprende, en un tercer aspecto, las etapas de
proporcionar grupos plurales desde un primer grupo hasta un grupo
n-ésimo (n es un número par igual a 2 o superior)
sucesivamente, en el que cada grupo incluye un par de sondas que
forman dímeros que contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2,
teniendo cada oligonucleótido tres regiones de una región lateral
3', una región media y una región lateral 5', en las que las
regiones medias de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, y todas las regiones
laterales 3' y las regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº
1 y nº 2 tienen secuencias de bases no complementarias entre sí, y
en las que (a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del
grupo (n-1)-ésimo y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo, (b) la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 2 del grupo (n-1)-ésimo y
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del grupo
n-ésimo, (c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1
del último grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del
primer grupo, y (d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2
del último grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del primer grupo tienen secuencias de bases complementarias entre
sí, respectivamente; formándose en primer lugar sondas dímeras con
una pluralidad de pares de las sondas que forman dímeros del primer
hasta el grupo n-ésimo, respectivamente; hibridando luego las
sondas dímeras formadas de cada grupo; y formándose una sustancia
de auto-ensamblaje de doble hebra mediante
auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
Un procedimiento de formación de una sustancia
de auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención comprende, en un cuarto aspecto, las etapas de
proporcionar grupos plurales desde un primer grupo hasta un grupo
n-ésimo (n es un número par igual a 2 o superior)
sucesivamente, en el que cada grupo incluye un par de sondas que
forman dímeros que contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2,
teniendo cada oligonucleótido tres regiones de una región lateral
3', una región media y una región lateral 5', en las que las
regiones medias de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, y todas las regiones
laterales 3' y las regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº
1 y nº 2 tienen secuencias de bases no complementarias entre sí, y
en las que (a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del
grupo (n-1)-ésimo y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo, (b) la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 1 del grupo (n-1)-ésimo y
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del grupo
n-ésimo, (c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1
del último grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del
primer grupo, y (d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del último grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo tienen secuencias de bases complementarias entre
sí, respectivamente; formándose en primer lugar sondas dímeras con
una pluralidad de pares de las sondas que forman dímeros del primero
hasta el n-ésimo grupo, respectivamente; hibridando luego las
sondas dímeras formadas de cada grupo; y formándose una sustancia
de auto-ensamblaje de doble hebra mediante
auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
Disponiendo al menos una G (guanina) o C
(citosina) en ambos extremos de cada una de las tres regiones de
las sondas que forman dímeros y formación de al menos un enlace
G-C en todos los extremos de las regiones en la
hibridación de las sondas que forman dímeros, se hace posible formar
una sustancia de auto-ensamblaje de doble hebra
estable.
Un ácido nucleico que constituye las sondas que
forman dímeros se compone normalmente de ADN o ARN, pero puede ser
un análogo de ácido nucleico. El análogo de ácido nucleico incluye,
por ejemplo, ácido nucleico peptídico (PNA, documento WO 92/20702)
y ácido nucleico bloqueado (LNA, Koshkin AA y col.
Tetrahedron 1998. 54, 3607-3630, Koshkin AA
y col. J. Am. Chem. Soc. 1998. 120,
13252-13253, Wahlestedt C y col. PANS 2000. 97,
5633-5638). Además, un par de las sondas que forman
dímeros se componen normalmente del mismo tipo de ácidos nucleicos,
pero se pueden usar, por ejemplo, un par de sondas de ADN y ARN. Es
decir, el tipo de ácido nucleicos en las sondas se pueden
seleccionar de ADN, ARN o análogos de ácido nucleico (por ejemplo,
PNA, LNA, etc.). Además, no se requiere que la composición del
ácido nucleico en una sonda esté constituida por sólo un tipo de
ácidos nucleicos (por ejemplo, sólo ADN) y según se necesite, por
ejemplo, se puede usar una sonda (una sonda quimérica) compuesta
por ADN y ARN, que esté dentro del alcance de la presente
invención.
En la hibridación de una pluralidad de pares de
sondas que forman dímeros, es preferible formar en primer lugar
sondas dímeras con una pluralidad de pares de sondas que forman
dímeros y luego hibridar las sondas dímeras formadas para cada
grupo.
Se forma una sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente invención
mediante el procedimiento de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje. Un apilamiento de bases en la
sustancia de auto-ensamblaje formada mediante el
procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención tiene una estructura regular de orden superior que conduce
aproximadamente a un efecto hipocrómico denominado
"hipocromismo" que reduce la intensidad de una banda de
absorción en la región ultravioleta a 260 nm, con lo que se
confirma el estado de la sustancia de
auto-ensamblaje. Además se inserta un material
fluorescente económico entre las bases apiladas de la sustancia de
auto-ensamblaje para provocar un cambio en la
intensidad de fluorescencia, con lo que se confirma el estado de la
sustancia de auto-ensamblaje. Por tanto, el
procedimiento de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente invención
es una técnica que es excelente en cuanto a rendimiento en coste y
hace posible detectar fácilmente genes a un coste bajo sin
precedentes.
Se puede detectar una sustancia de
auto-ensamblaje formada mediante el procedimiento de
formación de una sustancia de auto-ensamblaje
usando un cambio en absorción fotoquímica de rayos ultravioleta de
la sustancia de auto-ensamblaje.
Se puede detectar una sustancia de
auto-ensamblaje formada mediante el procedimiento de
formación de una sustancia de auto-ensamblaje
añadiendo una sustancia fluorescente que tenga la propiedad de unir
un ácido nucleico a pares de bases de la sustancia de
auto-ensamblaje y comprobando un cambio fotoquímico
de la sustancia fluorescente.
Un grupo de sondas dímeras de acuerdo con la
presente invención se forma, en un primer aspecto, mediante
hibridación de un par de sondas que forman dímeros, formado desde
un primer grupo hasta un segundo grupo, en los que cada grupo
incluye un par de sondas que forman dímeros que contienen un par de
oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido tres
regiones de una región lateral 3', una región media y una región
lateral 5', en las que las regiones medias de los oligonucleótidos
nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases complementarias entre sí, y
todas las regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases no
complementarias entre sí, y en las que (a) la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 1 del primer grupo y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 del segundo grupo, (b) la región lateral 5'
del oligonucleótido nº 2 del primer grupo y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 1 del segundo grupo, (c) la región lateral 3'
del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo y la región lateral 3'
del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y (d) la región lateral
5' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo y la región lateral
5' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo tienen secuencias de
bases complementarias entre sí, respectivamente.
Un grupo de sondas dímeras de acuerdo con la
presente invención se forma, en un segundo aspecto, mediante
hibridación de un par de sondas que forman dímeros, formado desde un
primer grupo a un segundo grupo, en los que cada grupo incluye un
par de sondas que forman dímeros que contienen un par de
oligonucleótidos nº 1 y nº 2, en los que las regiones medias de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y las regiones laterales 3' y las
regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases no complementarias entre sí, y en los que (a) la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo y la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo, (b) la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo y la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del segundo grupo, (c)
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo y la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y (d)
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del segundo grupo y la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, respectivamente.
Un grupo de sondas dímeras de acuerdo con la
presente invención se forma, en un tercer aspecto, mediante
hibridación de un par de sondas que forman dímeros, formados grupos
plurales desde un primer grupo a un grupo n-ésimo (n
es un número par igual a 2 o superior) sucesivamente, en los que
cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que
contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y las regiones laterales 3' y las
regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases no complementarias entre sí, y en las que (a)
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del grupo
(n-1)-ésimo y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo, (b) la región lateral
5' del oligonucleótido nº 2 del grupo
(n-1)-ésimo y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 1 del grupo n-ésimo, (c) la región lateral
3' del oligonucleótido nº 1 del último grupo y la región lateral 3'
del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y (d) la región lateral
5' del oligonucleótido nº 2 del último grupo y la región lateral 5'
del oligonucleótido nº 1 del primer grupo tienen secuencias de
bases complementarias entre sí, respectivamente.
Un grupo de sondas dímeras de acuerdo con la
presente invención se forma, en un cuarto aspecto, mediante
hibridación de un par de sondas que forman dímeros, formados grupos
plurales desde un primer grupo a un grupo n-ésimo (n
es un número par igual a 2 o superior) sucesivamente, en los que
cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que
contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y las regiones laterales 3' y las
regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases no complementarias entre sí, y en los que (a)
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del grupo
(n-1)-ésimo y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo, (b) la región lateral
5' del oligonucleótido nº 1 del grupo
(n-1)-ésimo y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo, (c) la región lateral
3' del oligonucleótido nº 1 del último grupo y la región lateral 3'
del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y (d) la región lateral
5' del oligonucleótido nº 1 del último grupo y la región lateral 5'
del oligonucleótido nº 2 del primer grupo tienen secuencias de
bases complementarias entre sí, respectivamente.
Es preferible disponer al menos una G (guanina)
o C (citosina) en uno o más extremos de las tres regiones de las
sondas que forman dímeros.
Las sondas que forman dímeros se componen de
ADN, ARN, PNA y/o LNA.
Una sonda dímera de acuerdo con la presente
invención se forma mediante hibridación de un par de las sondas que
forman dímeros.
La figura 1 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de dos conjuntos de sondas dímeras
en el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención, y en esta figura se muestran la formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros de un primer grupo
en (a) y formación de una sonda dímera con un par de sondas que
forman dímeros de un segundo grupo en (b), respectivamente.
La figura 2 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje con los dos conjuntos de sondas
dímeras mostradas en la figura 1, y en esta figura se muestran los
dos conjuntos de sondas dímeras en (a), y una sustancia de
auto-ensamblaje formada en (b), respectivamente.
La figura 3 es una vista esquemática que
muestra otro ejemplo de formación de dos conjuntos de sondas
dímeras en el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención, y en esta figura se muestran la formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros de un primer grupo
en (a), y formación de una sonda dímera con un par de sondas que
forman dímeros de un segundo grupo en (b), respectivamente.
La figura 4 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje con los dos conjuntos de sondas
dímeras mostrados en la figura 3, y en esta figura se muestran los
dos conjuntos de sondas dímeras en (a), y una sustancia de
auto-ensamblaje formada en (b), respectivamente.
La figura 5 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de tres conjuntos de sondas dímeras
en el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención, y en esta figura se muestran la formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros de un primer grupo
en (a), formación de una sonda dímera con un par de sondas que
forman dímeros de un segundo grupo en (b), y formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros de un tercer grupo en
(c), respectivamente.
La figura 6 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje con los tres conjuntos de sondas
dímeras mostrados en la figura 5, y en esta figura se muestran los
tres conjuntos de sondas dímeras en (a), y una sustancia de
auto-ensamblaje formada en (b), respectivamente.
La figura 7 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de cuatro conjuntos de sondas
dímeras en el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención, y en esta figura se muestran la formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros de un primer grupo
en (a), formación de una sonda dímera con un par de sondas que
forman dímeros de un segundo grupo en (b), formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros de un tercer grupo en
(c), y formación de una sonda dímera con un par de sondas que
forman dímeros de un cuarto grupo en (d), respectivamente.
La figura 8 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje con los cuatro conjuntos de sondas
dímeras mostradas en la figura 7, y en esta figura se muestran los
cuatro conjuntos de sondas dímeras en (a), y una sustancia de
auto-ensamblaje formada en (b), respectivamente.
La figura 9 es una vista esquemática que
muestra otro ejemplo de formación de tres conjuntos de sondas
dímeras en el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención, y en esta figura se muestran la formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros, formada desde un
primer grupo hasta un tercer grupo en (a), y una sustancia de
auto-ensamblaje formada con los tres conjuntos de
sondas dímeras en (b), respectivamente.
La figura 10 es una vista esquemática que
muestra otro ejemplo de formación de cuatro conjuntos de sondas
dímeras en el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con el procedimiento de
la presente invención, y en esta figura se muestran la formación de
una sonda dímera con un par de sondas que forman dímeros de un
primer grupo en (a), formación de una sonda dímera con un par de
sondas que forman dímeros de un segundo grupo en (b), formación de
una sonda dímera con un par de sondas que forman dímeros de un
tercer grupo en (c), y formación de una sonda dímera con un par de
sondas que forman dímeros de un cuarto grupo en (d),
respectivamente.
La figura 11 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje con los cuatro conjuntos de sondas
dímeras mostrados en la figura 10, y en esta figura se muestran los
cuatro conjuntos de sondas dímeras en (a), y una sustancia de
auto-ensamblaje formada en (b), respectivamente.
La figura 12 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de cinco conjuntos de sondas dímeras
en el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención, y en esta figura se muestran la formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros de un primer grupo
en (a), formación de una sonda dímera con un par de sondas que
forman dímeros de un segundo grupo en (b), formación de una sonda
dímera con un par de sondas que forman dímeros de un tercer grupo en
(c), formación de una sonda dímera con un par de sondas que forman
dímeros de un cuarto grupo en (d), y formación de una sonda dímera
con un par de sondas que forman dímeros de un quinto grupo en (e),
respectivamente.
La figura 13 es una vista esquemática que
muestra un ejemplo de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje con los cinco conjuntos de sondas
dímeras mostrados en la figura 12, y en esta figura se muestran los
cinco conjuntos de sondas dímeras en (a), una sustancia de
auto-ensamblaje formada en (b), y un ejemplo de
combinaciones de hibridación de n conjuntos de sondas dímeras en el
caso de n grupos en (c) respectivamente.
La figura 14 es una fotografía que muestra el
resultado del ejemplo inventivo 1.
La figura 15 es una fotografía que muestra el
resultado del ejemplo inventivo 2.
La figura 16 es una fotografía que muestra el
resultado del ejemplo inventivo 3.
La figura 17 es una fotografía que muestra los
resultados de los ejemplos experimentales 1 a 4 (carriles 1, 2, 4
y 5) y ejemplos experimentales 5 y 6 (carriles 3 y 6).
Se describen a continuación realizaciones de la
presente invención con referencia a los dibujos adjuntos, y no es
necesario indicar que estas realizaciones se dan a título
ilustrativo y que son posibles diversas modificaciones dentro del
alcance del concepto técnico de la presente invención.
En la presente invención se usan conjuntos
plurales de pares de sondas que forman dímeros, y se hacen
reaccionar las sondas entre ellas en condiciones isotérmicas en
ausencia de enzimas, con lo que se forma una sustancia de
auto-ensamblaje. El número de sondas que forman
dímeros que se usan no se encuentra particularmente limitado, pero
preferiblemente está en el intervalo de 10^{2} a 10^{15} sondas.
La composición y concentración de la solución tampón usada en la
reacción no están particularmente limitadas, y se puede usar
preferiblemente una solución tampón usada habitualmente en una
técnica de amplificación de ácido nucleico. El pH también puede
estar de forma adecuada en el intervalo habitual, preferiblemente en
el intervalo de pH 7,0 a pH 9,0. La temperatura de reacción es de
40 a 90ºC, preferiblemente de 55 a 65ºC. Estas condiciones no se
encuentran particularmente limitadas.
Ilustrando la constitución de la presente
invención usando un ejemplo más específico, la longitud (el número
de bases) de cada una de las regiones en una sonda que forma dímeros
puede ser la misma o diferente.
Y la longitud de cada una de las regiones en una
sonda que forma dímeros como el número de bases es de al menos 5
bases, preferiblemente de al menos 8, más preferiblemente de 10 a
100 bases, y aún más preferiblemente de 15 a 30 bases.
Se describen a continuación ejemplos de
formación de una sustancia de auto-ensamblaje con
las sondas que forman dímeros de acuerdo con la presente
invención.
1. El primer ejemplo de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje con dos conjuntos de
sondas que forman dímeros.
Como se muestra en (a) en la figura 1, el primer
grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que contienen un
par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido
tres regiones de una región lateral 3', una región media y una
región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos presentan complementariedad entre ellas, con lo
que se forman sondas dímeras del primer grupo (\alpha) con las
regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' que no presentan
complementariedad entre ellas. De forma similar, un par de sondas
que forman dímeros del segundo grupo y sondas dímeras del mismo
(\beta) tienen la constitución como se describió anteriormente
((b) en figura 1).
En la sonda dímera del primer grupo (\alpha) y
la sonda dímera del segundo grupo (\beta), como se muestra en la
figura 1 y en (a) en la figura 2, la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\alpha) y la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de las sondas dímeras (\beta),
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\alpha) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de las
sondas dímeras (\beta), la región lateral 3' del oligonucleótido
nº 2 de las sondas dímeras (\alpha) y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\beta), y la región
lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de las sondas dímeras
(\alpha) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\beta) tienen secuencias de bases complementarias
entre sí, respectivamente. Por tanto, mediante hibridación de las
sondas dímeras (\alpha) y (\beta) entre ellas, se
auto-ensamblan los oligonucleótidos para formar una
sustancia de auto-ensamblaje de doble hebra ((b) en
la figura 2).
2. El segundo ejemplo de formación de
una sustancia de auto-ensamblaje con dos conjuntos
de sondas que forman dímeros.
\newpage
Como el segundo ejemplo de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje con dos conjuntos de
sondas que forman dímeros, es posible intercambiar la región
lateral 3' o la región lateral 5' en el oligonucleótido nº 1 de la
sondas que forman dímeros del segundo grupo con la región lateral 3'
o la región lateral 5' en el oligonucleótido nº 2 del mismo, como
se muestra en (b) en la figura 3.
En la sonda dímera del primer grupo (\alpha) y
la sonda dímera del segundo grupo (\beta'), como se muestra en
(a) en la figura 4, la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 y
la sonda dímera (\alpha) y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 3 de las sondas dímeras (\beta'), la región
lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\alpha) y
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 3 de las sonda dímera
(\beta'), la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\alpha) y la región lateral 3' del oligonucleótido
nº 4 de la sonda dímera (\beta'), y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\alpha) y la región
lateral 5' del oligonucleótido nº 4 de la sonda dímera (\beta')
tienen secuencias de bases complementarias entre sí,
respectivamente. Por tanto, mediante hibridación de las sondas
dímeras (\alpha) y (\beta') entre ellas, se
auto-ensamblan los oligonucleótidos para formar una
sustancia de auto-ensamblaje de doble hebra ((b) en
la figura 4).
3. El primer ejemplo de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje con n conjuntos de
sondas que forman dímeros.
Se forman grupos plurales desde un primer grupo
hasta un grupo n-ésimo (n es un número par de 2 o superior)
sucesivamente, en los que cada grupo incluye un par de sondas que
forman dímeros que contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº
2, teniendo cada oligonucleótido tres regiones de una región lateral
3', una región media y una región lateral 5', en las que las
regiones medias de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, y las regiones
laterales 3' y las regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº
1 y nº 2 tienen secuencias de bases no complementarias entre sí.
En las sondas que forman dímeros, (a) la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del grupo
(n-1)-ésimo y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo, (b) la región lateral
5' del oligonucleótido nº 2 del grupo
(n-1)-ésimo y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 1 del grupo n-ésimo, (c) la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del último grupo y la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y (d) la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del último grupo y la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del primer grupo tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, respectivamente. Por
tanto, mediante hibridación de las sondas que forman dímeros entre
ellas, los oligonucleótidos se auto-ensamblan para
formar una sustancia de auto-ensamblaje de doble
hélice.
Se muestra un ejemplo de n = 3 en el
primer ejemplo anterior en la figura 5 y figura 6, y se muestra un
ejemplo de n = 4 en el primer ejemplo anterior en la figura
7 y figura 8.
4. El primer ejemplo de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje con tres conjuntos de
sondas que forman dímeros.
Como se muestra en (a) en la figura 5, el primer
grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que contienen un
par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido
tres regiones de una región lateral 3', una región media y un
región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos presentan complementariedad entre ellas, con lo
que se forman sondas dímeras del primer grupo (\alpha) con las
regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' no presentando
complementariedad entre ellas. De forma similar, un par de sondas
que forman dímeros del segundo grupo y sondas dímeras del mismo
(\beta), y un par de sondas que forman dímeros del tercer grupo y
sondas dímeras del mismo (\gamma) tienen la constitución que se
describió anteriormente ((b) y (c) en la figura 5).
En la sonda dímera del primer grupo (\alpha),
la sonda dímera del segundo grupo (\beta) y la sonda dímera del
tercer grupo (\gamma), como se muestran en figura 5 y en (a) en la
figura 6, la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda
dímera (\alpha) y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de
la sonda dímera (\beta), la región lateral 5' del oligonucleótido
nº 2 de la sonda dímera (\alpha) y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\beta), la región lateral
3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\beta) y la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\gamma), la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\beta) y la región lateral 5' del oligonucleótido
nº 1 de la sonda dímera (\gamma), la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\gamma) y la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\alpha), y
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\gamma) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la
sonda dímera (\alpha) tienen secuencias de bases complementarias
entre sí, respectivamente. Por tanto, mediante hibridación de las
sondas que forman dímeros entre ellas, se
auto-ensamblan los oligonucleótidos para formar una
sustancia de auto-ensamblaje de doble hebra ((b) en
la figura 6).
5. El primer ejemplo de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje con 4 conjuntos de
sondas que forman dímeros.
Como se muestra en (a) en la figura 7, el primer
grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que contienen un
par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido
tres regiones de una región lateral 3', una región media y un
región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos presentan complementariedad entre ellas, con lo
que se forman sondas dímeras del primer grupo (\alpha) con las
regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' no presentando
complementariedad entre ellas. De forma similar, un par de sondas
que forman dímeros del segundo grupo y sondas dímeras del mismo
(\beta), un par de sondas que forman dímeros del tercer grupo y
sondas dímeras del mismo (\gamma), y un par de sondas que forman
dímeros del cuarto grupo y sondas dímeras del mismo (\delta)
tienen la constitución que se describió anteriormente ((b) a (d) en
la figura 7).
En la sonda dímera del primer grupo (\alpha),
la sonda dímera del segundo grupo (\beta), la sonda dímera del
tercer grupo (\gamma) y la sonda dímera del cuarto grupo
(\delta), como se muestran en figura 7 y en (a) en la figura 8,
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera
(\alpha) y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\beta), la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 de la sonda dímera (\alpha) y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\beta), la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\beta) y
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\gamma), la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\beta) y la región lateral 5' del oligonucleótido
nº 1 de la sonda dímera (\gamma), la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\gamma) y la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\delta),
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\gamma) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la
sonda dímera (\delta), la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 de la sonda dímera (\delta) y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\alpha), y la región
lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\delta) y
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera
(\alpha) tienen secuencias de bases complementarias entre sí,
respectivamente. Por tanto, mediante hibridación de las sondas que
forman dímeros entre ellas, se auto-ensamblan los
oligonucleótidos para formar una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra ((b) en la figura
8).
6. El segundo ejemplo de formación de
una sustancia de auto-ensamblaje con n
conjuntos de sondas que forman dímeros.
Se forman grupos plurales desde un primer grupo
hasta un grupo n-ésimo (n es un número par de 2 o
superior) sucesivamente, en los que cada grupo incluye un par de
sondas que forman dímeros que contienen un par de oligonucleótidos
nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido tres regiones de una
región lateral 3', una región media y una región lateral 5', en las
que las regiones medias de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, y las regiones
laterales 3' y las regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº
1 y nº 2 tienen secuencias de bases no complementarias entre sí.
En las sondas que forman dímeros, (a) la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del grupo
(n-1)-ésimo y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo, (b) la región lateral
5' del oligonucleótido nº 1 del grupo
(n-1)-ésimo y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo, (c) la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 1 del último grupo y la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo, y (d) la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 del último grupo y la
región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 del primer grupo tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, respectivamente. Por
tanto mediante la hibridación de las sondas que forman dímeros
entre ellas, los oligonucleótidos se auto-ensamblan
para formar una sustancia de auto-ensamblaje de
doble hebra.
Se muestra un ejemplo de n = 3 en el
segundo ejemplo anterior en la figura 9, se muestra un ejemplo de
n = 4 en el segundo ejemplo anterior en la figura 10 y
figura 11, y se muestra un ejemplo de n = 5 en el segundo
ejemplo anterior en la figura 12 y figura 13.
7. El segundo ejemplo de formación de
una sustancia de auto-ensamblaje con tres conjuntos
de sondas que forman dímeros.
Como se muestra en (a) en la figura 9, el primer
grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que contienen un
par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido
tres regiones de una región lateral 3', una región media y una
región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos presentan complementariedad entre ellas, con lo
que se forman sondas dímeras del primer grupo (\alpha) con las
regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' que no presentan
complementariedad entre ellas. De forma similar, un par de sondas
que forman dímeros del segundo grupo y sondas dímeras del mismo
(\beta), y un par de sondas que forman dímeros del tercer grupo y
sondas dímeras del mismo (\gamma) tienen la constitución que se
describió anteriormente.
En la sonda dímera del primer grupo (\alpha),
la sonda dímera del segundo grupo (\beta) y la sonda dímera del
tercer grupo (\gamma), como se muestran en (a) en la figura 9, la
región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera
(\alpha) y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\beta), la región lateral 5' del oligonucleótido nº
1 de la sonda dímera (\alpha) y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\beta), la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\beta) y
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\gamma), la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la
sonda dímera (\beta) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 de la sonda dímera (\gamma), la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\gamma) y la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\alpha) y
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera
(\gamma) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\alpha) tienen secuencias de bases complementarias
entre sí, respectivamente. Por tanto mediante hibridación de las
sondas que forman dímeros entre ellas, los oligonucleótidos se
auto-ensamblan para formar una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra ((b) en la figura
9).
8. El segundo ejemplo de formación de
una sustancia de auto-ensamblaje con cuatro
conjuntos de sondas que forman dímeros.
\newpage
Como se muestra en (a) en la figura 10, el
primer grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que
contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos presentan complementariedad entre ellas, con lo
que se forman sondas dímeras del primer grupo (\alpha) con las
regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' que no presentan
complementariedad entre ellas. De forma similar, un par de sondas
que forman dímeros del segundo grupo y sondas dímeras del mismo
(\beta), y un par de sondas que forman dímeros del tercer grupo y
sondas dímeras del mismo (\gamma), y un par de sondas que forman
dímeros del cuarto grupo y sondas dímeras del mismo (\delta)
tienen la constitución que se describió anteriormente ((b) a (d) en
la figura 10).
En la sonda dímera del primer grupo (\alpha),
la sonda dímera del segundo grupo (\beta), la sonda dímera del
tercer grupo (\gamma) y la sonda dímera del cuarto grupo
(\delta), como se muestran en la figura 10 y en (a) en la figura
11, la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera
(\alpha) y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\beta), la región lateral 5' del oligonucleótido nº
1 de la sonda dímera (\alpha) y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\beta), la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\beta) y
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\gamma), la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la
sonda dímera (\beta) y la región lateral 5' del oligonucleótido
nº 2 de la sonda dímera (\gamma), la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\gamma) y la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\delta),
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera
(\gamma) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\delta), la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 de la sonda dímera (\delta) y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\alpha), y la región
lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\delta) y
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\alpha) tienen secuencias de bases complementarias entre sí,
respectivamente. Por tanto, mediante hibridación de las sondas que
forman dímeros entre ellas, los oligonucleótidos se
auto-ensamblan para formar una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra ((b) en la figura
11).
9. El segundo ejemplo de formación de
una sustancia de auto-ensamblaje con cinco conjuntos
de sondas que forman dímeros.
Como se muestra en (a) en la figura 12, el
primer grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que
contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos presentan complementariedad entre ellas, con lo
que se forman sondas dímeras del primer grupo (\alpha) sin que las
regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' tengan
complementariedad entre ellas. De forma similar, un par de sondas
que forman dímeros del segundo grupo y sondas dímeras del mismo
(\beta), un par de sondas que forman dímeros del tercer grupo y
sondas dímeras del mismo (\gamma), un par de sondas que forman
dímeros del cuarto grupo y sondas dímeras del mismo (\delta), y
un par de sondas que forman dímeros del quinto grupo y sondas
dímeras del mismo (\theta) tienen la constitución que se describió
anteriormente ((b) a (d) en la figura 12).
En la sonda dímera del primer grupo (\alpha),
la sonda dímera del segundo grupo (\beta), la sonda dímera del
tercer grupo (\gamma), la sonda dímera del cuarto grupo (\delta)
y la sonda dímera del quinto grupo (\theta), como se muestran en
la figura 12 y en (a) en la figura 13, la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\alpha) y la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\beta),
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera
(\alpha) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\beta), la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 de la sonda dímera (\beta) y la región lateral 3' del
oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\gamma), la región
lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\beta) y
la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\gamma), la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la
sonda dímera (\gamma) y la región lateral 3' del oligonucleótido
nº 2 de la sonda dímera (\delta), la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\gamma) y la región
lateral 5' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\delta),
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera
(\delta) y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la
sonda dímera (\theta), la región lateral 5' del oligonucleótido
nº 1 de la sonda dímera (\delta) y la región lateral 5' del
oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera (\theta), la región
lateral 3' del oligonucleótido nº 1 de la sonda dímera (\theta) y
la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2 de la sonda dímera
(\alpha) y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1 de la
sonda dímera (\theta) y la región lateral 5' del oligonucleótido
nº 2 de la sonda dímera (\alpha) tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, respectivamente. Por tanto, mediante
hibridación de las sondas que forman dímeros entre ellas, los
oligonucleótidos se auto-ensamblan para formar una
sustancia de auto-ensamblaje de doble hebra ((b) en
la figura 13).
Además, en el segundo ejemplo anterior, como un
ejemplo de formación de una sustancia de
auto-ensamblaje con n conjuntos de sondas
que forman dímeros incluidas en n grupos, se forma una
sustancia de auto-ensamblaje mediante hibridación
de n conjuntos de sondas dímeras con la combinación que se
muestra en (c) en la figura 13.
Como un procedimiento preferible para la
hibridación de las sondas que forman dímeros, se describió
anteriormente el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje mediante hibridación previamente de
las sondas que forman dímeros para formar las sondas dímeras, y
luego hibridación de las sondas dímeras formadas para cada grupo.
Sin embargo el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de acuerdo con la presente
invención no se limita al procedimiento descrito anteriormente, y
contiene, por ejemplo, el procedimiento en el que la sustancia de
auto-ensamblaje se forma haciendo reaccionar todas
las sondas que forman dímeros de cada grupo simultáneamente para
hibridar las sondas.
\newpage
Además, la presente invención proporciona el
procedimiento en el que al menos una G (guanina) o C (citosina) se
dispone en uno o más extremos de las tres regiones de las sondas que
forman dímeros, y en la hibridación de las sondas que forman
dímeros se forma al menos un enlace G-C en los
extremos de las regiones, generándose así la interacción especial
mediante electrones \pi de bases que se pueden atribuir al
apilamiento de bases para formar una sustancia de
auto-ensamblaje estable de doble hebra.
En el procedimiento de formación de la sustancia
de auto-ensamblaje, los inventores han resuelto que
cuando la fuerza del enlace en sitios ramificados de cada región es
débil, la hibridación de la región intercalada por los sitios
ramificados está inestabilizada; por tanto, el efecto del
apilamiento de bases que resulta de la interacción especial
mediante electrones \pi de bases en toda la región se ve aumentado
de forma que se fortalece la reacción de hibridación en cada
región.
El número de C o G dispuestas en los extremos de
las regiones puede ser al menos una base, pudiéndose aplicar una
pluralidad de bases. Considerando la secuencia de bases de cada
región se puede seleccionar de forma adecuada el número de tales
bases. Si se deben disponer dos o más C y G, C y G se pueden
combinar de forma arbitraria y disponer en cualquier orden.
En la presente invención, el apilamiento de
bases en la sustancia de auto-ensamblaje formada de
acuerdo con la presente invención tiene una estructura de orden
superior regular que conduce aproximadamente a un efecto
hipocrómico denominado "hipocromismo" que reduce la intensidad
de una banda de absorción a 260 nm en la región ultravioleta, con
lo que se puede confirmar el estado de la sustancia de
auto-ensamblaje.
Además, en la presente invención, se puede
confirmar el estado de la sustancia de
auto-ensamblaje mediante adición de una sustancia
fluorescente que tenga la propiedad de unirse a un ácido nucleico, a
pares de bases de la sustancia de auto-ensamblaje y
comprobando un cambio en la intensidad de fluorescencia. Por
ejemplo, se puede detectar la sustancia de
auto-ensamblaje mediante adición de una materia
colorante que se inserta entre dos hebras de oligonucleótidos para
emitir fluorescencia, y control de la emisión de fluorescencia con
el I-CORE^{TM} (Smart Cycler^{TM}) fabricado por
Cepheid Inc., y similares.
La sustancia de auto-ensamblaje
formada se puede detectar también fácilmente mediante la
electroforesis en gel de agarosa general.
A continuación la presente invención se describe
con más detalle en referencia a ejemplos, pero no es necesario
indicar que la presente invención no se limita a los ejemplos.
Sondas de oligonucleótidos usadas en los
ejemplos.
1) Sonda nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
2) Sonda nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
3) Sonda nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
4) Sonda nº 4:
\newpage
5) Sonda X1
\vskip1.000000\baselineskip
6) Sonda X2
\vskip1.000000\baselineskip
7) Sonda Y1
\vskip1.000000\baselineskip
8) Sonda Y2
\vskip1.000000\baselineskip
9) Sonda Z1
\vskip1.000000\baselineskip
10) Sonda Z2
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos experimentales 1 a
6
Se probó la formación de sondas dímeras con dos
conjuntos de pares de sondas que forman dímeros del primer y
segundo grupos.
(1) Las sondas nº 1 y nº 2 se prepararon
como un par de sondas que forman dímeros del primer grupo, y las
sondas nº 3 y nº 4 se prepararon como un par de sondas que forman
dímeros del segundo grupo. Se usaron las sondas de oligonucleótidos
preparadas cada una hasta la concentración de 100 pmol.
(2) Se usó 20 x SSC (NaCl 3 M,
C_{6}H_{5}O_{7}Na_{3} · 2 H_{2}O 0,3 M, pH 7) como una
solución tampón.
\newpage
Ejemplos experimentales 1 a
4
Se añadieron 1 \mul de sonda de
oligonucleótido, 12 \mul de 20 x SSC y 7 \mul de H_{2}O a
microtubos de 0,2 ml cada uno para obtener 20 \mul de solución de
reacción. Como las sondas de oligonucleótidos, se usó la sonda nº 1
en el ejemplo experimental 1, la sonda nº 2 en el ejemplo
experimental 2, la sonda nº 3 en el ejemplo experimental 3 y la
sonda nº 4 en el ejemplo experimental 4, respectivamente.
Cada una de las soluciones de reacción se
calentó durante 30 segundos a 94ºC.
Después de completarse la reacción se enfriaron
rápidamente las soluciones de reacción en hielo, y se sometieron a
electroforesis usando gel de agarosa al 0,5% durante 30 minutos a
100 v. Después de completarse la electroforesis en gel de agarosa,
se coloreó el gel con bromuro de etidio.
Ejemplos experimentales 5 y
6
En el ejemplo experimental 5, se añadieron 0,5
\mul de sonda nº 1, 0,5 \mul de sonda nº 2, 12 \mul de 20 x
SSC y 7 \mul de H_{2}O a un microtubo de 0,2 ml para obtener 20
\mul de solución de reacción.
En el ejemplo experimental 6, se añadieron 0,5
\mul de sonda nº 3, 0,5 \mul de sonda nº 4, 12 \mul de 20 x
SSC y 7 \mul de H_{2}O a un microtubo de 0,2 ml para obtener 20
\mul de solución de reacción.
Se calentó cada una de las soluciones de
reacción durante 30 segundos a 94ºC, y luego se hizo reaccionar
durante 30 minutos a 64ºC.
Después de completarse la reacción se enfriaron
rápidamente las soluciones de reacción en hielo, y se sometieron a
electroforesis durante 30 minutos a 100 v usando gel de agarosa al
0,5%. Después de completarse la electroforesis en gel de agarosa,
se coloreó el gel con bromuro de etidio.
El resultado se muestra en la figura 17. Como se
muestra en una fotografía de electroforesis en gel de agarosa de la
figura 17, en los ejemplos experimentales 1 a 4, se confirmó que
cada sonda que forma dímeros estaba en el estado de monómero
(carril 1, 2, 4 y 5). En el ejemplo experimental 5, como se muestra
en la fotografía de electroforesis en gel de agarosa de la figura
17, diferente de las sondas de oligonucleótidos usadas por el
procedimiento de PALSAR, un par de sondas que forman dímeros del
primer grupo de acuerdo con la presente invención eran sondas de
oligonucleótidos que no formaron una sustancia de
auto-ensamblaje y formaron sólo un dímero (carril
3). De forma similar, en el ejemplo experimental 6, diferente de la
sonda de oligonucleótido usada por el procedimiento de PALSAR, un
par de sondas que forman dímeros del segundo grupo de acuerdo con
la presente invención no formaba una sustancia de
auto-ensamblaje, y formaba sólo un dímero (carril
6).
Ejemplo inventivo
1
Se formaron dos conjuntos de sondas dímeras
previamente, y se probó la formación de una sustancia de
auto-ensamblaje.
(1) Se usó el dímero del primer grupo
formado en el ejemplo experimental 5 como una sonda dímera del
primer grupo (\alpha) y se usó el dímero del segundo grupo formado
en el ejemplo experimental 6 como una sonda dímera del segundo
grupo (\beta).
(2) Se usó 20 x SSC (NaCl 3 M,
C_{6}H_{5}O_{7}Na_{3} · 2H_{2}O 0,3 M, pH 7) como una
solución tampón.
Se añadieron 0,5 \mul de la sonda dímera
(\alpha) del primer grupo, 0,5 \mul de la sonda dímera (\beta)
del segundo grupo, 12 \mul de 20 x SSC, y 7 \mul de H_{2}O a
microtubos de 0,2 ml cada uno para obtener 20 \mul de soluciones
de reacción.
Las soluciones de reacción estuvieron durante 30
minutos a 52ºC, 54ºC, 56ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 64ºC, 66ºC, 68ºC y
70ºC, respectivamente.
Después de completarse la reacción, se enfriaron
rápidamente las soluciones de reacción en hielo, y se sometieron a
electroforesis durante 30 minutos a 100 v usando gel de agarosa al
0,5%. Después de completarse la electroforesis en gel de agarosa,
se coloreó el gel con bromuro de etidio.
Como se muestra en una fotografía de la figura
14 mediante comparación con el procedimiento de PALSAR, se confirmó
la formación de la sustancia de auto-ensamblaje en
un amplio intervalo de temperatura a pesar del mismo tiempo de
reacción. Se espera que esto acorte el tiempo de reacción.
Ejemplo inventivo
2
Se hicieron reaccionar cuatro tipos de sondas
que forman dímeros todas simultáneamente, y se probó la formación
de una sustancia de auto-ensamblaje.
(1) Se usaron las sondas nº 1 y nº 2 como
sondas que forman dímeros del primer grupo, y se usaron las sondas
nº 3 y nº 4 como sondas que forman dímeros del segundo grupo. Se
usaron las preparadas en ejemplos experimentales 1 a 4 para cada
una de las sondas de oligonucleótidos.
(2) Se usó 20 x SSC (NaCl 3 M,
C_{6}H_{5}O_{7}Na_{3} · 2 H_{2}O, 0,3 M, pH 7) como una
solución tampón.
Se añadieron de forma simultánea 0,5 \mul de
cada una de las sondas nº 1, nº 2, nº 3 y nº 4 a microtubos de 0,2
ml cada uno, y se añadieron además 12 \mul de 20 x SSC y 6 \mul
de H_{2}O a esto para obtener 20 \mul de soluciones de
reacción.
Las soluciones de reacción estuvieron durante 30
minutos a 52ºC, 54ºC, 56ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 64ºC, 66ºC, 68ºC y
70ºC, respectivamente.
Después de completarse la reacción, se enfriaron
rápidamente las soluciones de reacción en hielo, y se sometieron a
electroforesis durante 30 minutos a 100 v usando gel de agarosa al
0,5%. Después de completarse la electroforesis en gel de agarosa,
se coloreó el gel con bromuro de etidio.
Como se muestra en una fotografía de la figura
15, se observó formación de la sustancia de
auto-ensamblaje, mediante comparación con el
ejemplo inventivo 1, se observó reacción no específica a la
temperatura de reacción en el intervalo de 52ºC a 62ºC.
Ejemplo inventivo
3
Se examinó la formación de una sustancia de
auto-ensamblaje usando tres conjuntos de pares de
sondas que forman dímeros del primer, segundo y tercer grupos. En
el ejemplo inventivo 1 y ejemplo inventivo 2, incluso cuando se
prepararon previamente las sondas para el dímero, y cuando se
añadieron simultáneamente las sondas, se confirmó la formación de
la sustancia de auto-ensamblaje a la misma
temperatura de reacción, y por tanto en este ejemplo inventivo, los
tipos de dímeros para sonda aumentan a tres conjuntos, y las sondas
se añadieron simultáneamente para comprobar la formación de una
sustancia de auto-ensamblaje a la misma temperatura
de reacción.
(1) Se usaron las sondas X1 y X2 como
sondas que forman dímeros del primer grupo, y también las sondas Y1
e Y2 como sondas que forman dímeros del segundo grupo, y las sondas
Z1 y Z2 como sondas que forman dímeros del tercer grupo. Se usaron
las sondas de oligonucleótidos preparadas cada una a la
concentración de 100 pmol.
(2) Se usó 20 x SSC (NaCl 3 M,
C_{6}H_{5}O_{7}Na_{3} · 2 H_{2}O, 0,3 M, pH 7) como una
solución tampón.
Se añadieron 0,5 \mul de cada una de las
sondas X1, X2, Y1, Y2, Z1 y Z2 a microtubos de 0,2 ml cada uno de
una vez, y se añadieron adicionalmente 18 \mul de 20 x SSC y 9
\mul de H_{2}O a esto para obtener 30 \mul de soluciones de
reacción.
Cada una de las soluciones de reacción se
calentó durante 30 segundos a 94ºC.
Después de calentar, las soluciones de reacción
estuvieron durante 30 minutos a 52ºC, 54ºC, 56ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC,
64ºC, 66ºC, 68ºC, 70ºC, 72ºC y 74ºC, respectivamente.
Después de completarse la reacción se enfriaron
rápidamente las soluciones de reacción en hielo, y se sometieron a
electroforesis durante 30 minutos a 100 v usando gel de agarosa al
0,5%. Después de completarse la electroforesis en gel de agarosa,
se coloreó el gel con bromuro de etidio.
Como se muestra en una fotografía de la figura
16, aún cuando se usaron 6 tipos de sondas que forman dímeros, que
forman tres conjuntos de sondas dímeras, se observó formación de la
sustancia de auto-ensamblaje como en ejemplo
inventivo 1 y ejemplo inventivo 2 en los que se usaron dos conjuntos
de sondas dímeras.
Como se describió anteriormente, de acuerdo con
el procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje de la presente invención, es
posible acortar un tiempo de reacción para la formación de la
sustancia de auto-ensamblaje en comparación con el
procedimiento previo. También de acuerdo con el procedimiento para
la detección de la sustancia de auto-ensamblaje de
acuerdo con la presente invención, es posible detectar fácilmente la
sustancia de auto-ensamblaje formada por el
procedimiento de formación de la sustancia de
auto-ensamblaje descrita anteriormente.
<110> Sanko Junyaku Co., Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS PARA LA FORMACIÓN Y
DETECCIÓN DE LA SUSTANCIA DE AUTO-ENSAMBLAJE DE
SONDAS
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
76037-PCT-EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/JP01/08806
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-10-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000-311151
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-10-11
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgctgactt aaccggatac gaacaggatc ctagacctag catagtacag tccgatggtg
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcaagacg catgtctttc ctaggtctag gatcctgttc ctagaacgga ctgtacttcg
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaagacatg cgtcttgagg ctatccgttc gacttgcatg cgaagtacag tccgttctag
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatccggtt aagtcagcac catgcaagtc gaacggatag caccatcgga ctgtactatg
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgctgactt aaccggatac gaacaggatc ctagacctag catagtacag tccgatggtg
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcaagacg catgtctttc ctaggtctag gatcctgttc ctagaacgga ctgtacttcg
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaagacatg cgtcttgagg ctatccgttc gacttgcatg ctagacgctt cttgcgtaag
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtcgaatt gacactcagc catgcaagtc gaacggatag caccatcgga ctgtactatg
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgagtgtc aattcgacac gcaccctatc aggcagtatc cgaagtacag tccgttctag
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatccggtt aagtcagcac gatactgcct gatagggtgc cttacgcaag aagcgtctag
\hfill60
Claims (10)
1. Un procedimiento de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje que comprende las
etapas de:
proporcionar un primer grupo y un segundo grupo,
en los que cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros
que contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y todas las regiones laterales 3' y las
regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases no complementarias entre sí, y en las que
(a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del primer grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del segundo grupo,
(b) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del primer grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del segundo grupo,
(c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del segundo grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del segundo grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del primer grupo
tienen secuencias de bases
complementarias entre sí,
respectivamente;
formar en primer lugar sondas dímeras con una
pluralidad de pares de las sondas que forman dímeros del primer y
segundo grupo, respectivamente;
hibridar luego las sondas dímeras formadas de
cada grupo; y
formar una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra mediante
auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
2. Un procedimiento de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje que comprende las
etapas de:
proporcionar un primer grupo y un segundo grupo,
en los que cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros
que contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y todas las regiones laterales 3' y las
regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases no complementarias entre sí, y en las que
(a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del primer grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1
del segundo grupo,
(b) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del primer grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del segundo grupo,
(c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
2 del segundo grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del segundo grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del primer grupo
tienen secuencias de bases
complementarias entre sí,
respectivamente;
formar en primer lugar sondas dímeras con una
pluralidad de pares de las sondas que forman dímeros del primer y
segundo grupo, respectivamente;
hibridar luego las sondas dímeras formadas de
cada grupo; y
formar una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra mediante
auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
3. Un procedimiento de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje que comprende las
etapas de:
proporcionar grupos plurales desde un primer
grupo hasta un grupo n-ésimo (n es un número par igual
a 2 o superior) sucesivamente, en el que cada grupo incluye un par
de sondas que forman dímeros que contienen un par de
oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido tres
regiones de una región lateral 3', una región media y una región
lateral 5', en las que las regiones medias de los oligonucleótidos
nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases complementarias entre sí, y
todas las regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases no
complementarias entre sí, y en las que
(a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del grupo (n-1)-ésimo y la región lateral
3' del oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo,
(b) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del grupo (n-1)-ésimo y la región lateral
5' del oligonucleótido nº 1 del grupo n-ésimo,
(c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del último grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del último grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del primer grupo
tienen secuencias de bases
complementarias entre sí,
respectivamente;
formar en primer lugar sondas dímeras con una
pluralidad de pares de las sondas que forman dímeros del primer
hasta el grupo n-ésimo, respectivamente;
hibridar luego las sondas dímeras formadas de
cada grupo; y
formar una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra mediante
auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
4. Un procedimiento de formación de una
sustancia de auto-ensamblaje que comprende las
etapas de:
proporcionar grupos plurales desde un primer
grupo hasta un grupo n-ésimo (n es un número par igual
a 2 o superior) sucesivamente, en el que cada grupo incluye un par
de sondas que forman dímeros que contienen un par de
oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada oligonucleótido tres
regiones de una región lateral 3', una región media y una región
lateral 5', en las que las regiones medias de los oligonucleótidos
nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases complementarias entre sí, y
todas las regiones laterales 3' y las regiones laterales 5' de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases no
complementarias entre sí, y en las que
(a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del grupo (n-1)-ésimo y la región lateral
3' del oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo,
(b) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
1 del grupo (n-1)-ésimo y la región lateral
5' del oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo,
(c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del último grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
1 del último grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo
tienen secuencias de bases
complementarias entre sí,
respectivamente;
formar en primer lugar sondas dímeras con una
pluralidad de pares de las sondas que forman dímeros del primer
hasta el grupo n-ésimo, respectivamente;
hibridar luego las sondas dímeras formadas de
cada grupo; y
formar una sustancia de
auto-ensamblaje de doble hebra mediante
auto-ensamblaje de los oligonucleótidos.
5. Un procedimiento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos una G
(guanina) o C (citosina) se dispone en ambos extremos de cada una de
las tres regiones de las sondas que forman dímeros, y en la
hibridación de las sondas que forman dímeros al menos se forma un
enlace G-C en todos los extremos de las regiones,
con lo que se forma una sustancia de auto-ensamblaje
de doble hebra estable.
6. Un procedimiento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las sondas que
forman dímeros se componen de ADN, ARN, PNA y/o LNA.
7. Un grupo de sondas dímeras formadas
mediante hibridación de un par de sondas que forman dímeros
formadas desde un primer grupo hasta un segundo grupo, en los que
cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que
contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de los
oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y las regiones laterales 3' y las
regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases no complementarias entre sí, y en las que
(a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del primer grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del segundo grupo,
(b) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del primer grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del segundo grupo,
(c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del segundo grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del segundo grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del primer grupo
tienen secuencias de bases
complementarias entre sí,
respectivamente.
8. Un grupo de sondas dímeras formadas
mediante hibridación de un par de sondas que forman dímeros
formadas desde un primer grupo hasta un segundo grupo, en los que
cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que
contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, en los que las
regiones medias de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen
secuencias de bases complementarias entre sí, y las regiones
laterales 3' y las regiones laterales 5' de los oligonucleótidos nº
1 y nº 2 tienen secuencias de bases no complementarias entre sí, y
en las que
(a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del primer grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 1
del segundo grupo,
(b) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del primer grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del segundo grupo,
(c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
2 del segundo grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del segundo grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del primer grupo
tienen secuencias de bases
complementarias entre sí,
respectivamente.
9. Un grupo de sondas dímeras formado
por hibridación de un par de sondas que forman dímeros, formados
grupos plurales desde un primer grupo hasta un grupo n-ésimo
(n es un número par igual a 2 o superior) sucesivamente, en
el que cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que
contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de
los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y las regiones laterales 3' y las regiones
laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias
de bases no complementarias entre sí, y en las que
(a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del grupo (n-1)-ésimo y la región lateral
3' del oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo,
(b) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del grupo (n-1)-ésimo y la región lateral
5' del oligonucleótido nº 1 del grupo n-ésimo,
(c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del último grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
2 del último grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 1
del primer grupo
tienen secuencias de bases
complementarias entre sí,
respectivamente.
10. Un grupo de sondas dímeras formado por
hibridación de un par de sondas que forman dímeros, formados grupos
plurales desde un primer grupo hasta un grupo n-ésimo
(n es un número par igual a 2 o superior) sucesivamente, en
el que cada grupo incluye un par de sondas que forman dímeros que
contienen un par de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, teniendo cada
oligonucleótido tres regiones de una región lateral 3', una región
media y una región lateral 5', en las que las regiones medias de
los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias de bases
complementarias entre sí, y las regiones laterales 3' y las regiones
laterales 5' de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 tienen secuencias
de bases no complementarias entre sí, y en las que
(a) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del grupo (n-1)-ésimo y la región lateral
3' del oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo,
\newpage
(b) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
1 del grupo (n-1)-ésimo y la región lateral
5' del oligonucleótido nº 2 del grupo n-ésimo,
(c) la región lateral 3' del oligonucleótido nº
1 del último grupo y la región lateral 3' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo, y
(d) la región lateral 5' del oligonucleótido nº
1 del último grupo y la región lateral 5' del oligonucleótido nº 2
del primer grupo
tienen secuencias de bases
complementarias entre sí,
respectivamente.
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