WO2011125833A1 - 生体分子相互作用解析ツールの構成とそれを用いた解析方法 - Google Patents

生体分子相互作用解析ツールの構成とそれを用いた解析方法 Download PDF

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region
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宮本　悦子
辻　融
藤森　茂雄
正道 石坂
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学校法人 慶應義塾
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Definitions

  • the present invention relates to a configuration of a biomolecule interaction analysis tool and an analysis method using the same.
  • Non-Patent Document 1 Next-generation sequencers have been introduced to transcriptome and proteome analysis, and attempts have been made to obtain large amounts of information on molecular interactions related to proteins, DNA, and RNA.
  • An object of the present invention is to provide a biomolecule interaction analysis method that does not require affinity selection using a fixed bait.
  • the present inventors have found that when the protein part of the mRNA-protein correspondence molecule interacts, cross-linking between each mRNA part that will be in close proximity is possible by an oligo DNA linker having a specific structure.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is a DNA linker for linking the mRNA portion of the mapping molecule, the 5 ′ end thereof, an mRNA complementary region complementary to the 5 ′ end sequence of the mRNA portion, and the 3 ′
  • a DNA linker is provided that includes self-complementary regions complementary at the ends between the DNA linkers, the 5 ′ ends of which are phosphorylated.
  • the sequence at the 5 ′ end of the mRNA portion of the mapping molecule may contain a promoter sequence, an ⁇ -like sequence, and a T7 peptide tag gene in this order from the 5 ′ end side.
  • the present invention also provides a method for synthesizing DNA linked with genes encoding interacting proteins, comprising the following steps.
  • the step of causing the mapping molecule to interact with the protein portion thereof is a step of ligating the mRNA portion of the interacting mapping molecule by annealing through the DNA linker of the present invention, and the pairing is 5 ′ of the mRNA portion.
  • the step occurring between the terminal sequence and the mRNA complementary region and between the self-complementary regions The step of converting the mRNA part into a DNA-RNA hybrid by reverse transcription and the 5 ′ end of the DNA linker and reverse transcription
  • the step of ligating the 3 ′ ends of the DNA strands synthesized in step The step of decomposing RNA constituting the DNA-RNA hybrid
  • the present invention further includes a method for analyzing an interaction comprising determining a base sequence of the DNA obtained by the synthesis method of the present invention and specifying a set of genes encoding interacting proteins or a set of interacting proteins. I will provide a.
  • the present invention provides a method for analyzing biomolecular interactions that does not require affinity selection using a fixed bait.
  • a method for analyzing biomolecular interactions that does not require affinity selection using a fixed bait.
  • the interaction between proteins can be comprehensively analyzed.
  • preparation of bait protein is not required, and all mRNA-protein association molecules present in the library can be bait.
  • protein interactions are estimated to be around 300,000 (Rhodes ⁇ et al., Nat Biotech. 2005), but the analysis capability of next-generation sequencers is 500,000-100 million reads / run. On the expected value, all protein-protein interactions are detected at once.
  • A mRNA library; b, mRNA-protein library ; Affinity selection using target protein (bait) presented on c-1, resin; d-1, reverse transcription-PCR. Acquisition of gene encoding protein bound to babait. In the method of the present invention, selection using bait is not performed.
  • C-2 RNA linked to interacting proteins are close to each other and thus cross-linked via linker DNA.
  • D-2 after several steps of reaction When PCR is performed, a DNA fragment in which genes encoding two interacting proteins are linked via a linker can be obtained. Several types of interactions can be detected simultaneously.
  • the explanatory view of the synthesis method of DNA which has a gene connection sequence of the present invention is shown.
  • the schematic diagram of the structure of F gene mRNA used in Example 1 and the base sequence (SEQ ID NO: 1) of priSP6O′T7FOS117f are shown.
  • the base sequence corresponds to a part of the 5 'side of the FOS gene from the SP6 promoter.
  • the schematic diagram and base sequence (sequence number 2) of linker Sqlinker09 used in Example 1 are shown.
  • the paired portions are palindromic and have self-complementarity. The other portions correspond to the 5 ′ side of the mRNA shown in FIG.
  • the agarose electrophoresis (photograph) of a PCR product is shown.
  • the agarose electrophoresis (photograph) of a PCR product is shown.
  • region amplified by primer priSqlinker07-02 and priFOS211FLAGA6, and the base sequence (sequence number 3 and 5) of priSqlinker07-02 and priFOS211FLAGA6 are shown.
  • the result (sequence number 4) of having determined the base sequence by DNA sequencing of the DNA fragment obtained in Example 1 is shown.
  • the agarose electrophoresis (photograph) of a PCR product is shown.
  • the base sequences (a: SEQ ID NO: 6, b: SEQ ID NO: 7, c: SEQ ID NO: 8, d: SEQ ID NO: 9, e: SEQ ID NO: 10) used in Example 2 are shown.
  • An explanatory view of a method of Example 2 is shown.
  • the structure of the IVV molecule constructed in Example 2 is shown.
  • An explanatory view of a reverse transcription reaction using IVV molecules bound to beads as a template is shown.
  • the agarose electrophoresis (photograph) of a PCR product is shown.
  • DNA linker of the present invention is a DNA linker for linking the mRNA portion of the mapping molecule, and its 5 ′ end is complementary to the 5 ′ end sequence of the mRNA portion.
  • the complementary region and its 3 ′ end include a self-complementary region complementary between DNA linkers, and its 5 ′ end is phosphorylated.
  • the sequence at the 5 ′ end of the mRNA portion of the mapping molecule includes a promoter sequence, an ⁇ -like sequence, and a T7 peptide tag gene in this order from the 5 ′ end side.
  • the promoter site is not particularly limited as long as it is a promoter sequence capable of in vitro transcription reaction
  • the SP6 promoter site is not particularly limited as long as it is a promoter sequence capable of in vitro transcription reaction.
  • the T7 promoter can also be used.
  • the portion of the ⁇ -like sequence is not particularly limited as long as it is a sequence that enhances translation efficiency. There is no particular limitation as long as the T7-tag portion is also a peptide tag.
  • the mRNA complementary region of the DNA linker of the present invention may be selected from a sequence complementary to the sequence at the 5 ′ end of the mRNA portion of the corresponding molecule to be used.
  • the length of the mRNA complementation region is usually 8 to 30 bp, preferably 10 to 20 bp.
  • the Tm in this region is usually 20 to 70 ° C., preferably 25 to 50 ° C.
  • the self-complementary region of the DNA linker of the present invention is not particularly limited as long as the 3 ′ end of the linker is paired with a complementary sequence, and is usually 10 to 35 bp, preferably 12 to 30 bp.
  • the Tm in this region is usually 22 to 72 ° C., preferably 25 to 55 ° C.
  • DNA that serves as a spacer may be inserted between the self-complementary region and the mRNA complementary region.
  • the length of the spacer is usually 3 to 15 bp, preferably 4 to 10 bp.
  • the DNA synthesis method of the present invention is a method for synthesizing DNA in which genes encoding interacting proteins are linked, and includes the following steps. (1) The process of interacting the mapping molecule with its protein part (2) A step of linking the interacting mRNA portion of the mapping molecule via the DNA linker of the present invention by annealing, and the pairing is performed between the sequence at the 5 ′ end of the mRNA portion and the mRNA complementary region.
  • the conditions are not particularly limited as long as the interaction of the protein portion of the mapping molecule is maintained by annealing in the next step.
  • the interaction can be performed under the conditions described in Patent Document 2.
  • Corresponding molecules synthesized in a cell-free translation system may be mixed, or coding molecules may be translated (co-translated) in the same system as described later.
  • Annealing The mRNA portion of the interacting mapping molecule is linked by annealing via the DNA linker according to claim 1 or 2.
  • the pairing may occur between the sequence of the 5 ′ end of the mRNA part and the mRNA complementarity region, between the self-complementary regions, both pairs may be simultaneous, Either one may be the first.
  • the Tm of both regions should be close (usually within 5 ° C).
  • the region with the higher Tm may be paired first and then the other.
  • the self-complementary region of the DNA linker is paired, and then the complementary DNA linker is added to the interaction system to complement the 5 'end sequence of the mRNA portion of the mapping molecule with the mRNA complementarity.
  • a region may be paired.
  • Tms ⁇ Tmr if Tm of the self-complementary region is Tms and Tm of the mRNA region is Tmr. Moreover, it is necessary to perform the reaction at the temperature (for example, 37 ° C.) during the reverse transcription reaction and the extension reaction among various enzyme reactions in the subsequent steps. Therefore, it is necessary to set Tmr> enzyme reaction temperature.
  • the DNA linker added at the time of annealing is usually 10 fM to 10 pM, preferably 50 fM to 5 pM.
  • the mRNA portion is converted into a DNA-RNA hybrid by reverse transcription and reverse transcription. Reverse transcription can be performed under normal conditions.
  • Ligation reaction The 5 ′ end of the DNA linker is linked to the 3 ′ end of the DNA strand synthesized by reverse transcription. Ligation can be performed under normal ligation reaction conditions.
  • RNA degradation RNA of DNA-RNA hybrid is degraded. This can be done using RNaseH.
  • the DNA linker can be used as a primer for extension under normal conditions using a DNA polymerase.
  • the extended DNA can be purified and amplified by ordinary cloning or ordinary PCR.
  • FIG. 2 shows a scheme of the synthesis method of the present invention. Similar to the conventional IVV method, the C-terminus of the protein is linked to mRNA via puromycin.
  • the 5 'and 3' ends of mRNA have a constant region. For example, a promoter sequence or an Omega sequence that increases translation efficiency is used for the 5'constant region.
  • the 3 'end uses an affinity tag such as FLAG peptide (a).
  • a library of such mRNA-protein mapping molecules is constructed from the mRNA library. Corresponding molecules that form protein-protein interactions have an increased probability that the 5 'end of the mRNA portion is close (b).
  • an oligo DNA having a self-complementary sequence and having complementarity at the 5 'end of mRNA is added to function as a linker that crosslinks the 5' end of mRNA (c).
  • a phosphate group is added to the 5 'end of the linker oligo DNA.
  • reverse transcription reaction is performed using a primer having complementarity to the 3 'end of mRNA (d).
  • the extended cDNA and linker DNA are ligated using DNA ligase (e). This completes the mRNA / cDNA hybrid.
  • RNaseH is used to degrade the RNA portion (f).
  • an extension reaction of the 3 'end of the cDNA is performed using DNA polymerase (g).
  • g DNA polymerase
  • a DNA fragment in which the genes encoding interacting proteins A and B are linked via a linker DNA is obtained. If this DNA fragment is analyzed by a sequencer, the protein-protein interaction can be read as DNA base sequence information.
  • ⁇ 3> Analysis method of the present invention By determining the base sequence of the DNA obtained by the synthesis method of the present invention, a set of genes encoding interacting proteins or a set of interacting proteins can be identified, This makes it possible to analyze the interaction.
  • the base sequence may be determined after cloning DNA. In the case of Sanger sequencing, once cloning is performed, DNA fragments of the same length are purified, so that individual sequences can be sequenced. It is also possible to insert a restriction enzyme site into the spacer, cleave it in advance, perform PCR, and then clone and sequence. You may sequence with a next-generation sequencer.
  • association molecule means a molecule that associates a phenotype with a genotype.
  • the association molecule is formed by binding a genotype molecule containing a nucleic acid having a base sequence reflecting the genotype and a phenotype molecule containing a protein involved in phenotype expression.
  • a genotype molecule is formed by binding a coding molecule having a base sequence reflecting a genotype in such a form that the base sequence can be translated and a spacer part.
  • Such an association molecule is described in, for example, Patent Document 2, and will be described with reference to Patent Document 2.
  • the interaction can be determined by sequencing the linked DNA, the modification or labeling for detecting the interaction in Patent Document 2 is not necessary in the present invention.
  • mapping molecule a part derived from a phenotype molecule, a part derived from a spacer molecule, and a part derived from a coding molecule are referred to as a decoding part, a spacer part, and a coding part, respectively.
  • a part derived from a spacer molecule and a part derived from a coding molecule in a genotype molecule are referred to as a spacer part and a coding part, respectively.
  • FIG. 8 shows a rough configuration of an example of an association molecule, a spacer molecule, and a coding molecule.
  • This mapping molecule consists of a spacer containing puromycin (referred to as the spacer part) and a base sequence reflecting the phenotypic code (referred to as the code part).
  • This mapping molecule has a structure in which a spacer portion containing puromycin is bound to a coding molecule by some method to form a genotype molecule and is linked to a phenotype molecule on a ribosome in a cell-free translation system.
  • the spacer molecule is a PEG region mainly composed of polyethylene glycol, a CCA region consisting of at least puromycin or puromycin and one or more residues of DNA or / and RNA, or a donor including at least one or more residues of DNA or / or RNA.
  • the region further comprises a function-imparting unit (X) in which at least one residue of DNA or / or RNA is functionally modified.
  • the coding molecule is a 3 ′ end region containing a DNA or / or RNA polyA sequence consisting of a part of the decoding part, and a 5′UTR containing a transcription promoter and translation enhancer consisting of DNA or / or RNA, Furthermore, it is composed of an ORF region mainly consisting of a sequence of phenotypic molecules.
  • this invention is not limited to this.
  • a spacer molecule is formed by a donor region capable of binding to the 3 ′ end of a nucleic acid, a PEG region mainly composed of polyethylene glycol bound to the donor region, and a peptide transfer reaction bound to the PEG region. And a peptide acceptor region containing a group capable of binding to a peptide.
  • the donor region that can bind to the 3 ′ end of a nucleic acid usually consists of one or more nucleotides.
  • the number of nucleotides is usually 1 to 15, preferably 1 to 2.
  • the nucleotide may be ribonucleotide or deoxyribonucleotide.
  • the sequence at the 5 ′ end of the donor region affects ligation efficiency.
  • the residue dCdC (dideoxycytidylic acid) is preferred.
  • the base type is preferably C> U or T> G> A.
  • the PEG region is mainly composed of polyethylene glycol.
  • the main component means that the total number of nucleotides contained in the PEG region is 20 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 400 or more. Preferably, it means that the total number of nucleotides is 10 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 1,000 or more.
  • the average molecular weight of polyethylene glycol in the PEG region is usually 400 to 30,000, preferably 1,000 to 10,000, more preferably 2,000 to 8,000.
  • a post-process of associated translation may be required ( Liu, R., Barrick, E., Szostak, JW, Roberts, RW (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293), using PEG with a molecular weight of 1,000 or more, more preferably 2,000 or more Since high-efficiency association can be performed only by translation, post-translation processing is not necessary.
  • the stability of genotype molecules tends to increase, especially when the molecular weight is 1,000 or more, and when the molecular weight is 400 or less, the DNA spacer may not be so characteristic and unstable. .
  • the peptide acceptor region is not particularly limited as long as it can bind to the C-terminal of the peptide.
  • puromycin 3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-amino acid)
  • PANS-Gly whose amino acid part is glycine, PANS-Val of valine, PANS-Ala of alanine, and other PANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • 3'-Aminoacyladenosineoaminonucleoside AANS-amino acid, 3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, formed by dehydration condensation of the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of the amino acid as a chemical bond.
  • AANS-Gly having an amino acid part of glycine, AANS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, and other AANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • Nucleosides or nucleosides and amino acid ester-bonded ones can also be used.
  • nucleoside or a substance having a chemical structure skeleton similar to nucleoside and an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to amino acid can be used as long as they can be chemically bonded.
  • the peptide acceptor region is preferably composed of puromycin or a derivative thereof, or puromycin or a derivative thereof and one or two deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
  • the derivative means a derivative capable of binding to the C-terminus of the peptide in the protein translation system.
  • the puromycin derivatives are not limited to those having a complete puromycin structure, but also include those lacking a part of the puromycin structure. Specific examples of the puromycin derivative include PANS-amino acid and AANS-amino acid.
  • the peptide acceptor region may be composed of puromycin alone, but preferably has a base sequence consisting of DNA or / and RNA of 1 residue or more on the 5 ′ side.
  • the sequence is dC-puromycin, rC-puromycin, etc., more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-puromycin, etc., and the 3 ′ end of aminoacyl-tRNA is Simulated CCA sequences (Philipps, GR (1969) Nature 223, 374-377) are suitable.
  • the base type is preferably C> U or T> G> A.
  • the coding molecule comprises a 5 ′ untranslated region containing a transcription promoter and a translation enhancer, a protein-encoding ORF region bound to the 3 ′ side of the 5 ′ untranslated region, and an ORF region 3 A nucleic acid comprising a 3 'terminal region containing a poly A sequence bound to the' side and, if necessary, a translation enhancing sequence (for example, a sequence recognized by the restriction enzyme XhoI) on the 5 'side.
  • the coding molecule may be DNA or RNA. In the case of RNA, the 5 'end may or may not have a Cap structure.
  • the coding molecule may be incorporated into any vector or plasmid.
  • the 3 ′ end region preferably includes an SNNS sequence (for example, XhoI sequence) and a poly A sequence downstream thereof.
  • an SNNS sequence for example, XhoI sequence
  • the polyA sequence in the 3 ′ end region is important, and the polyA sequence can be a mixture of dA and / or rA having at least 2 residues or more.
  • the poly A continuous chain is preferably 3 or more residues, more preferably 6 or more, and even more preferably 8 residues or more.
  • ⁇ Elements that affect the translation efficiency of the coding molecule include a 5 'UTR consisting of a transcription promoter and translation enhancer, and a 3' end region combination containing a poly A sequence.
  • the effect of the poly A sequence in the 3 ′ end region is usually exerted with 10 residues or less.
  • T7 / T3 or SP6 can be used as the 5 'UTR transcription promoter, and there is no particular limitation.
  • SP6 is preferable, and SP6 is particularly preferable when an omega sequence or a sequence containing a part of the omega sequence ( ⁇ -like sequence) is used as an enhancer sequence for translation.
  • the translation enhancer is preferably a part of the omega sequence, which is part of the TMV omega sequence (Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638). Those containing the part (O29) are preferred.
  • the combination of the XhoI sequence and the polyA sequence is important in the 3 ′ end region. Also important is the combination of the poly A sequence with an affinity tag downstream of the ORF region, ie, upstream of the XhoI sequence.
  • the affinity tag sequence is not particularly limited as long as it is a sequence for using any means capable of detecting a protein such as an antigen-antibody reaction. Preferably, it is a Flag-tag sequence which is a tag for affinity separation analysis by antigen-antibody reaction.
  • the translation efficiency of an affinity tag such as Flag-tag with an XhoI sequence and a poly A sequence added thereto is increased.
  • the configuration effective for the translation efficiency is also effective for the association efficiency.
  • the ORF region may be any sequence consisting of DNA and / or RNA.
  • a gene sequence, exon sequence, intron sequence, random sequence, or any natural sequence or artificial sequence is possible, and there is no sequence limitation.
  • each length is about 60 bp in 5′UTR
  • the length is about 40 bp at the 3 ′ end region and can be incorporated as an adapter region into a PCR primer.
  • a coding molecule having a 5 ′ UTR and a 3 ′ terminal region can be easily prepared by PCR from any vector, plasmid, or cDNA library.
  • translation may be done beyond the ORF region. That is, there may not be a stop codon at the end of the ORF region.
  • FIG. 10 shows a detailed configuration of an example of a code molecule.
  • the coding molecule is composed of a 3 ′ end region, a 5′UTR containing a transcription promoter and translation enhancer composed of DNA or / or RNA, and an ORF region consisting of the sequence information of the decoding portion, ie, encoding a phenotypic protein.
  • the 3 ′ terminal region includes an affinity tag sequence consisting of DNA or / or RNA, an XhoI sequence, and a poly A sequence, and uses a Flag-tag sequence.
  • As 5′UTR a sequence containing SP6 of the transcription promoter and O29 which is a part of the omega sequence of the translation enhancer is used.
  • a genotype molecule includes a 5 ′ untranslated region containing a transcription promoter and a translation enhancer, and an ORF region encoding a protein bound to the 3 ′ side of the 5 ′ untranslated region.
  • the 3 ′ end of the coding molecule which is a nucleic acid containing the 3 ′ end region containing the polyA sequence, bound to the 3 ′ side of the ORF region, and the donor region of the spacer molecule.
  • the coding molecule constituting the genotype molecule is as described for the coding molecule except that the XhoI sequence is not essential in the above coding molecule. However, it is preferred to have an XhoI sequence.
  • the genotype molecule can be produced by binding the 3 ′ end of the coding molecule and the donor region of the spacer molecule by a usual ligase reaction.
  • the reaction conditions usually include conditions at 4 to 25 ° C. for 4 to 48 hours.
  • polyethylene glycol having the same molecular weight as the polyethylene glycol in the PEG region of the spacer molecule containing the PEG region is added to the reaction system, It can also be shortened to 0.5-4 hours at 15 ° C.
  • spacer molecule and coding molecule has an important effect on ligation efficiency.
  • a DNA or / or RNA polyA sequence of at least 2 residues, preferably 3 residues, more preferably 6-8 residues.
  • a partial sequence of an omega sequence (O29; U.S. Pat. No. 6,057,097) is preferable, and a donor region of a spacer part is at least one dC (deoxycytidylic acid) or two residues. dCdC (dideoxycytidylic acid) is preferred.
  • RNA ligase the problems of DNA ligase can be avoided and the efficiency can be maintained at 60 to 80%.
  • genotype molecule is RNA
  • the ligation efficiency is improved to 80 to 90% or more regardless of the molecular weight of the polyethylene glycol of the spacer part.
  • the separation step can also be omitted.
  • mapping molecule and production method thereof
  • the mapping molecule is obtained by linking the above genotype molecule with a phenotype molecule that is a protein encoded by an ORF region in the genotype molecule by a peptide transfer reaction. It will be.
  • the mapping molecule includes translating the genotype molecule with a cell-free translation system and linking with a phenotype molecule that is a protein encoded by the ORF region in the genotype molecule by a peptide transfer reaction.
  • the cell-free translation system is preferably that of wheat germ or rabbit reticulocyte.
  • the conditions for translation may be those normally employed. For example, the condition is 15 to 240 minutes at 25 to 37 ° C.
  • mapping molecules has been studied in the E.coli, rabbit reticulocyte, and wheat germ systems, and the mapping molecule has been confirmed only in the rabbit reticulocyte system.
  • an association molecule having a spacer portion containing a PEG region an association molecule can be formed even in a wheat germ system.
  • Protein-substance interactions can be analyzed in vitro using various combinations of proteins (corresponding molecules) synthesized by translation on ribosomes and their libraries. For example, primary screening of IVV It can be used for secondary screening to analyze a detailed gene network later (Patent Document 2, FIG. 21).
  • the cell-free translation system may be any of E. coli, rabbit reticulocyte, wheat germ system and the like.
  • IVV method in vitro virus method
  • the formation of the mapping molecule is considerably unstable in E. coli (E. coli), but the system of rabbit reticulocytes (Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Yanagawa H. (1997) ) FEBS Lett. 414, 405; Roberts RW, Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297), and more in the wheat germ system (WO 02/46395) It has been confirmed to be stable.
  • an SP6 promoter, an ⁇ -like sequence, a T7 tag peptide, and an oligo DNA encoding part of the FOS gene were used as forward primers.
  • As reverse primers hexaadenylic acid, a FLAG tag, and an oligo DNA encoding part of the FOS gene (priFOS211FLAGA6r (SEQ ID NO: 5)) were used. These oligo DNAs were purchased from Fasmac. PCR was performed using KOD Plus (TOYOBO) according to the attached manual.
  • the thermal cycler program consists of 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 30 seconds.
  • the template DNA is the cDNA of the human FOS gene.
  • F gene mRNA was synthesized in vitro using SP6 RNA polymerase (Promega) (FIG. 3). The reaction conditions are 3 hours at 37 ° C.
  • a DNA linker (Sqlinker09) having a self-complementary region, a promoter sequence of the F gene mRNA constructed above, an ⁇ -like sequence, and a region complementary to the T7 peptide tag gene was designed and synthesized (FIG. 4). A phosphate group was added to the 5 ′ end of Sqlinker09. Oligo DNA was purchased from Fasmac Co., Ltd.
  • Reverse transcription A mixed solution of reverse transcriptase, reverse transcription reaction buffer, and substrate dNTP mix (10 ⁇ l) was mixed with the solution prepared in 1), and a reverse transcription reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reverse transcriptase is M-MLV reverse transcriptase RNaseH minus, point mutant manufactured by Promega.
  • RNA degradation 1 ⁇ l of RNaseH was mixed with the solution prepared in 3) to degrade the RNA portion.
  • RNaseH was from Invitrogen.
  • PCR reaction priFOS211FLAGA6r (20 pmol / ⁇ l) was added in an amount shown in Table 1 to the reaction solution of 5).
  • the thermal cycler program consists of 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 3 minutes.
  • This PCR product was cut out from the gel and purified, and used as a PCR template.
  • the composition of the reaction solution includes KOD Plus ver. 2 buffer solution, dNTP, MgSO 4 , priFOS211FLAGA6r, KOD Plus (TOYOBO), template DNA, and DEPC water.
  • the thermal cycler program consists of 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute.
  • the electrophoresis result of the obtained PCR product is shown in FIG. 6a.
  • priFOS211FLAGA6r as a primer, a 700-800 bp long DNA fragment could be amplified. From this, it is considered that a DNA fragment having the structure shown in FIG. 2h was obtained.
  • the above DNA fragment has a palindromic sequence as a whole molecule, and the base sequence by DNA sequencing is determined using the above PCR product as a template and priSq0702 and priFOS211FLAGA6r6 consisting of a part of Sqlinker09 as primers.
  • PCR was performed (FIG. 7). This PCR is expected to yield a DNA fragment corresponding to about half the length of the DNA.
  • the electrophoresis result of this PCR product is shown in FIG. 6b. DNA was obtained in the size of 300-400 bp, and the expected DNA fragment was obtained.
  • the mRNA concentration when the square reaction was successful was 2 ⁇ M
  • the mRNA concentration when it was not successful was 0.2 ⁇ M.
  • the IVV molecule concentration is 2 ⁇ M or more
  • a cDNA dimer can be obtained due to complementarity between the mRNA portion of the IVV molecule and the linker even if there is no protein-protein interaction.
  • Example 2 (1) Confirmation of Linkage between Linker and cDNA
  • Sqlinker08 A single-stranded oligo DNA having a self-complementary sequence (named as Sqlinker08; manufactured by Fasmac) was used as a DNA linker (FIG. 10a, SEQ ID NO: 6).
  • a phosphate group was added to the 5 ′ end of Sqlinker08.
  • Sqlinker08 self-hybridization was performed. 5 ⁇ l of 100 ⁇ M Sqlinker08, 10 ⁇ l of 10 ⁇ T4 RNA Ligase buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 18 ⁇ l of DEPC water were mixed, heated at 95 ° C. for 3 minutes, and then gradually cooled to 68 ° C.
  • FIG. 11a 6 ⁇ l of 1.6 pmol / ⁇ l mRNA obtained by transcription from the F gene (leucine zipper region of the FOS gene, see Example 1), obtained by transcription from the J gene (leucine zipper region of the JUN gene, see Example 1) 7 ⁇ l of 1.5 pmol / ⁇ l mRNA was added and then cooled to 15 ° C. A phosphate group was added to the 5 ′ end of mRNA. Sqlinker08 has a sequence complementary to the SP6 promoter and ⁇ sequence of the F gene. Next, 12.5 ⁇ l of T4 RNA ligase (manufactured by Takara Bio Inc.) was added, and a ligation reaction was performed at 15 ° C.
  • T4 RNA ligase manufactured by Takara Bio Inc.
  • This reaction solution is 6 ⁇ l of 10 nmol / ⁇ l PEG2000, 3 ⁇ l of 0.1 M DTT, 1 ⁇ l of 40 mM ATP, 20 ⁇ l of DMSO, 20 ⁇ l of BSA solution attached to the enzyme, 2 ⁇ l of RNase inhibitor, 4.24 of DEPC water It contained ⁇ l.
  • the product was recovered by ethanol precipitation. The ligation reaction was confirmed by electrophoresis.
  • the reaction solution contains 5 ⁇ pmol RNA, 20 ⁇ M primer (priFOS1r, FIG. 1b, SEQ ID NO: 7), attached 5 ⁇ buffer, 12.5 ⁇ l 2 ⁇ m dNTP, and 15.5 ⁇ l DEPC water. After heating at 95 ° C. for 30 seconds, slowly cooling to 50 ° C., and allowing to stand for 3 minutes, 5 ⁇ l of M-MLV RTase (Promega) was added. After being allowed to stand at 50 ° C. for 1 hour, it was purified with a gel filtration spin column (Bio-Rad, Micro Bio-Spin® 6 Chromatograpy® Columns).
  • the cDNA portion synthesized by the reverse transcription reaction and the linker portion were ligated using Ligation high ver.2 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). At that time, 50 ⁇ l each of the purified reverse transcription reaction product and Ligation high ver.2 were mixed, and ligation reaction was carried out overnight at 16 ° C. (FIG. 11d). Subsequently, 10 ⁇ l of RNase H (manufactured by Invitrogen) was added to decompose the RNA part of RNA / cDNA (FIG. 11e).
  • a linker was added to the above reaction product to carry out an extension reaction (FIG. 11f).
  • the reaction solution was 5 ⁇ l of 10 x KOD Plus 2 ver. 2 buffer, 5 ⁇ l of 2 mM dNTP, 3 ⁇ l of 25 mM MgSO 4 , 1 ⁇ l of 20 ⁇ M linker as a primer, 1 ⁇ l of the ligation product, KOD Plus (manufactured by Toyobo) ) 1 ⁇ l and DEPC water 34 ⁇ l.
  • the reaction conditions are 94 ° C for 1 minute 30 seconds and 68 ° C for 3 minutes.
  • PCR was performed (FIG. 11g).
  • the reaction conditions were 94 ° C for 1 minute followed by 35 cycles of 94 ° C, 30 seconds, 58 ° C, 30 seconds and 68 ° C for 1 minute.
  • a band corresponding to a size of about 200 base pairs was obtained. This region was excised from the gel and cloned, and the nucleotide sequence was determined. The sequence is shown in FIG. From this result, it can be seen that the linker portion and the SP6 promoter portion of the F gene are correctly linked (however, the bases shown by diagonal lines were deleted for some reason). From the above analysis, it was confirmed that the linker and cDNA were linked.
  • the purified ligation product was added to a cell-free translation system (Promega, Wheat germ plus) and translated to synthesize IVV molecules ( Figure 12)
  • the composition of the cell-free translation reaction solution was 40 ⁇ l of wheat germ extract. 1.3 ⁇ l of RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega) and 5 pmol of ligation product
  • the translation reaction was performed at 25 ° C. for 1 hour.
  • the reverse transcription reaction solution contained a buffer attached to the reverse transcription kit, dNTP mix, M-MLV reverse transcriptase RNaseH minus, point mutant, and priFLAGA6r (FIG. 10e). This reaction solution was added to the purified beads and reacted at 37 ° C. for 1 hour (FIG. 13).
  • the reverse transcription reaction solution contains DTT
  • the anti-M2 antibody bound to the beads is denatured during the reverse transcription reaction, and the IVV molecules are dissociated from the beads. Therefore, this mixture is purified by spin column gel filtration (manufactured by BIO-RAD, Micro Bio-Spin 6 Chromatograpy Columns) to recover IVV molecules whose mRNA part is hybridized with cDNA (Matsumura et al. , FASEB J., 24, 2201-2210, 2010). Also in this example, hybridized IVV molecules were recovered by this method. PCR was performed using 1 ⁇ l of the collected solution as a template, and it was confirmed that the reverse transcription reaction progressed and hybrid IVV molecules were formed and recovered (FIG. 14). In the case where the reverse transcription reaction was not performed, no such band was obtained.
  • Example 2 the linkage between the linker and the cDNA was confirmed by analysis of the base sequence.
  • the present invention provides a method for analyzing biomolecular interactions that does not require affinity selection using a fixed bait.

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Abstract

固定したベイトを用いたアフィニティ選択が不要な生体分子相互作用の解析方法を提供する。対応付け分子のmRNA部分を連結するためのDNAリンカーであって、その5'末端に、前記mRNA部分の5'末端の配列に相補的なmRNA相補性領域、及び、その3'末端に、DNAリンカー相互間で相補的な自己相補性領域を含み、その5'末端がリン酸化されているDNAリンカーを介するアニーリングにより、相互作用した対応付け分子のmRNA部分を連結させる。

Description

生体分子相互作用解析ツールの構成とそれを用いた解析方法
　本発明は、生体分子相互作用解析ツールの構成とそれを用いた解析方法に関する。
　次世代型シーケンサーをトランスクリプトームやプロテオーム解析に導入し、蛋白質・DNA・RNAに関する分子間相互作用情報を、大量に取得する試みがなされている。(非特許文献１)。
　mRNAとそれがコードする蛋白質が共有結合で連結したmRNA-protein対応付け分子を用い（図1a, b）、蛋白質のアミノ酸配列情報を、DNAの塩基配列情報として取り出す方法がin vitro virus (IVV)法として知られている（特許文献１、特許文献２）。このIVV法とサンガー型DNAシーケンサーを用いて、プロテオーム解析が行なわれてきた(非特許文献２; 非特許文献３; 非特許文献４)。しかし、従来法では、標的蛋白質（ベイト(bait)と呼ぶ）を樹脂に固定し、アフィニティ選択を行ない（図１c-1）、その後、RT-PCRにより、ベイトに結合した蛋白質に連結したmRNAから、DNAを増幅する必要があった（図１d-1）。したがって、大規模な解析を行なう場合、数多くのベイトを調製し、個別にアフィニティ選択を行なう必要があった。
　例えば、50種類のベイト蛋白質の相互作用を解析するならば、個別に50種類の蛋白質を調製、樹脂に固定し、アフィニティ選択を行なう必要があった。このような作業は煩雑でコストがかかる。また、50種程度のベイト蛋白質を用いても、得られる相互作用数は網羅的であるとは言えない。
WO 98/16636 WO 2003/048363
Review: Morozova & Marra, Genome Res, 19, 521-532, 2009 Genome Res., 15, 710-717, 2005 J Biol Chem, 284, 478-485, 2009 PLoS ONE, 5, e9289, 2010
　本発明は、固定したベイトを用いたアフィニティ選択が不要な生体分子相互作用の解析方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、mRNA-protein対応付け分子の蛋白質部分が相互作用した場合に、近接することとなるそれぞれのmRNA部分の間の架橋が、特定の構造を有するオリゴDNAリンカーにより可能になることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、対応付け分子のmRNA部分を連結するためのDNAリンカーであって、その5'末端に、前記mRNA部分の5'末端の配列に相補的なmRNA相補性領域、及び、その3'末端に、DNAリンカー相互間で相補的な自己相補性領域を含み、その5'末端がリン酸化されているDNAリンカーを提供する。対応付け分子のmRNA部分の5'末端の配列は、5'末端側からプロモーター配列、Ω様配列、T7ペプチドタグ遺伝子をこの順序で含むものであってもよい。
　本発明は、また、下記の工程を含む、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子が連結したDNAの合成方法を提供する。
　対応付け分子をその蛋白質部分で相互作用させる工程
　相互作用した対応付け分子のmRNA部分を、本発明のDNAリンカーを介してアニーリングにより連結させる工程であって、対合は、前記mRNA部分の5'末端の配列と前記mRNA相補性領域との間、及び、前記自己相補性領域間に生じる前記工程
　逆転写により前記mRNA部分をDNA-RNAハイブリッドにする工程
　前記DNAリンカーの5'末端と、逆転写で合成されたDNA鎖の3'末端を連結する工程
　DNA-RNAハイブリッドを構成するRNAを分解する工程
　前記DNAリンカー3'末端を伸長してcDNAを合成する工程
　本発明はさらに、本発明の合成方法で得られたDNAの塩基配列を決定し、相互作用した蛋白質をコードする遺伝子の組または相互作用した蛋白質の組を特定することを含む相互作用の解析方法を提供する。
　本発明により、固定したベイトを用いたアフィニティ選択が不要な生体分子相互作用の解析方法が提供される。蛋白質のアミノ酸配列をDNAの塩基配列に変換し、且つ、その解析を次世代シーケンサーで行なうことにより、蛋白質間相互作用を網羅的に解析することができる。また、ベイト蛋白質の調製を必要とせず、ライブラリー中に存在する全てのmRNA-protein対応付け分子がベイトになり得る。ヒトの場合、蛋白質間相互作用は30万種程度と見積もられているが (Rhodes et al., Nat Biotech. 2005)、次世代シーケンサーの解析能力は50万～１億リード/runであるため、期待値の上では、全ての蛋白質間相互作用が一度に検出されることになる。
従来型IVV法（a,b,c-1,d-1）と本発明方法（a,b,c-2,d-2）の比較. a, mRNAライブラリー; b, mRNA-proteinライブラリー; c-1,樹脂に提示した標的蛋白質（ベイト）を用いたアフィニティ選択; d-1, 逆転写-PCR. ベイト(bait)に結合した蛋白質をコードする遺伝子の取得を示す。本発明方法では、ベイトを用いた選択は行なわない. c-2,相互作用する蛋白質に連結したRNAは近接するので、リンカーDNAを介して架橋される. d-2, 数ステップの反応の後に、PCRを行なうと、リンカーを介して、相互作用する2種の蛋白質をコードする遺伝子が連結したDNA断片を得ることができる。何種類もの相互作用を同時に検出できる。 本発明の遺伝子連結配列を有するDNAの合成方法の説明図を示す。 実施例１で用いたF遺伝子mRNAの構造の模式図とpriSP6O’T7FOS117fの塩基配列（配列番号１）を示す。塩基配列はSP6プロモーターからFOS遺伝子の5’側の一部に相当する。 実施例１で用いたリンカーSqlinker09の模式図と塩基配列（配列番号２）を示す。対合した部分はパリンドロームで自己相補性を有する。その他の部分は、それぞれ図３に示したmRNAの5’側、すなわち、SP6プロモーター、Ω様配列、T7ペプチドタグに対応しているが、図３に示した配列とは相補的な配列になっている。 PCR産物のアガロース電気泳動（写真）を示す。 PCR産物のアガロース電気泳動（写真）を示す。 プライマーpriSqlinker07-02とpriFOS211FLAGA6で増幅される領域を示した模式図とpriSqlinker07-02及びpriFOS211FLAGA6の塩基配列（配列番号３及び５）を示す。 実施例１で得られたDNA断片のDNAシーケンシングにより、塩基配列を決定した結果（配列番号４）を示す。 PCR産物のアガロース電気泳動（写真）を示す。 実施例２で用いたプライマー等の塩基配列（a:配列番号６、b:配列番号７、c:配列番号８、d:配列番号９、e:配列番号１０）を示す。 実施例２の方法の説明図を示す。 実施例２で構築されたIVV分子の構造を示す。 ビーズに結合したIVV分子をテンプレートとする逆転写反応の説明図を示す。 PCR産物のアガロース電気泳動（写真）を示す。
＜１＞本発明DNAリンカー
　本発明DNAリンカーは、対応付け分子のmRNA部分を連結するためのDNAリンカーであって、その5'末端に、前記mRNA部分の5'末端の配列に相補的なmRNA相補性領域、及び、その3'末端に、DNAリンカー相互間で相補的な自己相補性領域を含み、その5'末端がリン酸化されていること特徴とする。
　対応付け分子としては、後述するように通常の対応付け分子が使用できる。例えば、対応付け分子のmRNA部分の5'末端の配列が、5'末端側からプロモーター配列、Ω様配列、T7ペプチドタグ遺伝子をこの順序で含むものが挙げられる。プロモーターの箇所は試験管内転写反応が可能なプロモーター配列であれば特に制限は無くSP6プロモーターの箇所は試験管内転写反応が可能なプロモーター配列であれば特に制限は無い。例えばT7プロモーターも利用できる。Ω様配列の部分は、翻訳効率を高める配列であれば特に制限は無い。T7-tagの箇所もペプチドタグであれば特に制限は無い。
　本発明DNAリンカーのmRNA相補性領域は、用いる対応付け分子のmRNA部分の5'末端の配列に相補的な配列を選択すればよい。mRNA相補性領域の長さは、通常には、8～30bpであり、好ましくは、10～20 bpである。また、この領域のTmは、通常には、20～70℃であり、好ましくは25～50℃である。
　本発明DNAリンカーの自己相補性領域は、リンカーの3'末端が相補配列により対合する限り、特に限定されず、通常には、10～35bpであり、好ましくは、12～30bpである。また、この領域のTmは、通常には、22～72℃であり、好ましくは25～55℃である。
　自己相補領域とmRNA相補領域との間にスペーサーとなるDNAを挿入してもよい。スペーサーの長さは、通常には、3～15 bpであり、好ましくは、4～10 bpである。
＜２＞本発明DNA合成方法
　本発明DNA合成方法は、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子が連結したDNAの合成方法であり、下記の工程を含む。
(1)対応付け分子をその蛋白質部分で相互作用させる工程
(2)相互作用した対応付け分子のmRNA部分を、本発明DNAリンカーを介してアニーリングにより連結させる工程であって、対合は、前記mRNA部分の5'末端の配列と前記mRNA相補性領域との間、前記自己相補性領域間に生じる前記工程
(3)逆転写により前記mRNA部分をDNA-RNAハイブリッドにする工程
(4)前記ＤＮＡリンカーの5'末端と、逆転写で合成されたDNA鎖の3'末端を連結する工程
(5)DNA-RNAハイブリッドを構成するRNAを分解する工程
(6)前記ＤＮＡリンカー3'末端を伸長してcDNAを合成する工程
　以下、各工程について説明する。
１）相互作用
　対応付け分子の蛋白質部分の相互作用が次工程のアニーリングで維持される限り、特に条件は限定されない。例えば、特許文献２に記載の条件で相互作用させることができる。無細胞翻訳系で合成した対応付け分子を混合してもよいし、後述するようにコード分子を同一の系で翻訳（共翻訳）してもよい。
２）アニーリング
　相互作用した対応付け分子のmRNA部分を、請求項１又は２に記載のDNAリンカーを介してアニーリングにより連結させる。この際には、対合は、前記mRNA部分の5'末端の配列と前記mRNA相補性領域との間、前記自己相補性領域間に生じればよく、両対合は、同時でもよいし、いずれか一方が先でもよい。同時に対合させる場合は、両領域のTmを近くする（通常には5℃以内）。また、Tmの高い方の領域を先に対合させて、ついでもう一方を対合させてもよい。例えば、別の系で、DNAリンカーの自己相補性領域を対合させてから、相互作用の系に対合DNAリンカーを加えて、対応付け分子のmRNA部分の5'末端の配列とmRNA相補性領域とを対合させてもよい。
　DNAリンカーはその自己相補領域を利用して予めハイブリッドを作成しやすいため、自己相補性領域のTmをTms、mRNA領域とのTmをTmrとすれば、Tms ≧ Tmrとすることが好ましい。また、以後の工程における各種酵素反応の中で逆転写反応と伸長反応時の温度（例えば37℃）で反応を行う必要がある。そのため、Tmr > 酵素反応温度とする必要がある。
　アニーリングの際に加えるDNAリンカーは、通常には、10fM～10pM、好ましくは、50fM～ 5pMの濃度である。
３）逆転写
逆転写により前記mRNA部分をDNA-RNAハイブリッドにする。逆転写は、通常の条件で行うことができる。
４）ライゲーション反応
　前記ＤＮＡリンカーの5'末端と、逆転写で合成されたDNA鎖の3'末端を連結する。通常のライゲーション反応条件で連結することができる。
５）RNA分解
　DNA-RNAハイブリッドのRNAを分解する。RNaseHを用いて行うことができる。
６）伸長反応
　DNAリンカーをプライマーとして、DNAポリメラーゼを用いて通常の条件で伸長させることができる。
　伸長したDNAは、通常のクローニングや通常のPCRにより精製、増幅することができる。
　図２に本発明の合成方法のスキームを示す。従来のIVV法と同様に、蛋白質のC末端はピューロマイシンを介してmRNAと連結している。mRNAの5’末端と3’末端は、constant regionをもつ。例えば、5’constant regionにはプロモーター配列や翻訳効率を高めるOmega配列などを用いる。一方、3’末端はFLAGペプチドなどのアフィニティタグを用いる (a)。このようなmRNA-protein対応付け分子のライブラリーを、mRNAライブラリーから構築する。蛋白質-蛋白質相互作用を形成する対応付け分子は、そのmRNA部の5’末端が近接する確率が高まる (b)。ここで、接近した２つのIVVを連結するためには、同じ方向の核酸を連結する必要があり（スクエア反応）、従来の単純な逆方向の連結方法では実現出来ない。そこで、自己相補配列をもち、かつmRNAの5’末端に相補性を有するオリゴDNAを加え、mRNAの5’末端を架橋するリンカーとして機能させる (c)。ここで、(e)におけるライゲーション反応を可能とするために、リンカーオリゴDNAの5’末端には、リン酸基を付加しておく。次に、mRNAの3’末端に相補性を有するプライマーを用いて逆転写反応を行う (d)。続いてDNAリガーゼを用いて、伸長したcDNAとリンカーDNAを連結する (e)。これで、mRNA/cDNAのハイブリッドが完成する。次に、RNaseHを用いてRNA部を分解する (f)。続いてDNAポリメラーゼを用い、cDNAの3’末端の伸長反応を行う (g)。伸長反応が完結すると(h)のように、相互作用する蛋白質Aと蛋白質Bをコードする遺伝子が、リンカーDNAを介して連結されたDNAの断片が得られる。このDNA断片をシーケンサーにより解析すれば、蛋白質間相互作用をDNAの塩基配列情報として読み取ることができる。
＜３＞本発明解析方法
　本発明の合成方法で得られたDNAの塩基配列を決定することにより、相互作用した蛋白質をコードする遺伝子の組または相互作用した蛋白質の組を特定することができ、これによって相互作用を解析できる。
　塩基配列の決定は、DNAをクローニングしてから行ってもよい。サンガー法のシーケンシングの場合であれば、一度クローニングを行なうことで、同一長のDNA断片でも純化するので、個々の配列のシーケンシングが可能になる。また、スペーサーに制限酵素部位を挿入しておき、予め切断してからPCRを行ない、その後、クローニングしシーケンシングを行なうこともできる。次世代シーケンサーで、シーケンスしてもよい。
　本発明の解析方法では、ベイトを用いたアフィニティ選択を行なう必要がない。図１c-2に示すように、蛋白質が相互作用すると、連結したRNAは近接し、オリゴDNAリンカーによる架橋が可能となる。この時、本発明では、通常の核酸連結とは異なる同じ方向の核酸を連結する必要が出て来る（図１c-2；スクエア反応）が、特定の数工程の組み合わせによりこれが可能となる。これにより、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子が、リンカーを介して連結されたDNA断片を得ることができる（図１d-2）。その後、cDNAライブラリーからmRNA-protein対応付け分子ライブラリーを構築し、さらに解析を進めることができる。ベイト調製が不要で、樹脂ビーズへの固定も洗いの工程も必要なくなるため、相互作用解析が飛躍的に効率化される。また、ライブラリー中に存在する全ての相互作用を一挙に同定できる。そのため、大量の相互作用データを取得でき、次世代シーケンサーの能力を充分に活用して解析を行うことができる。
＜４＞対応付け分子
　本明細書において、対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現型の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を、その塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。このような対応付け分子は、例えば、特許文献２に記載されているので特許文献２を参照して説明する。なお、本発明においては連結DNAの配列決定により相互作用を判定できるので、特許文献２における相互作用の検出のための修飾又はラベル化は本発明では不要である。
　対応付け分子における、表現型分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、及び、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部及びコード部と呼ぶ。また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、及び、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部及びコード部と呼ぶ。
　特許文献２図８に、対応付け分子、スペーサー分子及びコード分子の一例の大まかな構成が示されている。この対応付け分子は、ピューロマイシンを含むスペーサー(スペーサー部と呼ぶ)と表現型のコードを反映する塩基配列(コード部と呼ぶ)からなる。この対応付け分子は、コード分子に何らかの方法によってピューロマイシンを含むスペーサー部を結合して遺伝子型分子とし、無細胞翻訳系において、リボソーム上で表現型分子と連結した構成をもつ。スペーサー分子は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域、少なくともピューロマイシンあるいはピューロマイシンと1残基以上のDNAあるいは/またはRNAからなるCCA領域、少なくとも1残基以上のDNAあるいは/またはRNAを含むドナー領域、さらに、少なくとも1残基のDNAあるいは/またはRNAの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニット(X)からなる。コード分子は、デコード部の一部の配列からなるDNAあるいは/またはRNAのポリA配列を含む3'末端領域、および、DNAあるいは/またはRNAからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ5'UTR、さらに、主として表現型分子の配列からなるORF領域から構成される。以下、この例を参照して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜４－１＞スペーサー分子
　スペーサー分子は、核酸の3'末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域と、PEG領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。
　核酸の3'末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１～１５、好ましくは１～２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。
　ドナー領域の5'末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)あるいは２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。
　PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が20 bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が10 bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が1,000以上であることを意味する。
　PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、400～30,000、好ましくは1,000～10,000、より好ましくは2,000～8,000である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約400より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Liu, R., Barrick, E., Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293）、分子量1,000以上、より好ましくは2,000以上のPEGを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量1,000以上で良好であり、分子量400以下ではDNAスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
　ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
　ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とは蛋白質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、PANS-アミノ酸、AANS-アミノ酸などが挙げられる。
　ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、5'側に1残基以上のDNAあるいは/またはRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、dC-ピューロマイシン, rC-ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC-ピューロマイシン, rCrC-ピューロマイシン, rCdC-ピューロマイシン, dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル-tRNAの3'末端を模倣したCCA配列（Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374-377）が適当である。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。
＜４－２＞コード分子
　コード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'側に結合した、ポリA配列及び、必要によりその5'側に翻訳増強配列（例えば制限酵素XhoIが認識する配列）を含む3'末端領域を含む核酸である。
　コード分子は、DNAでもRNAでもよく、RNAの場合、5'末端にCap構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。
　3'末端領域は、好ましくはSNNS配列（例えばXhoI配列）とその下流にポリA配列を含む。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては3'末端領域のポリA配列が重要であり、ポリA配列は、少なくとも２残基以上のdAあるいは/またはrAの混合あるいは単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリA連続鎖である。
　コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる5'UTR、および、ポリA配列を含む3'末端領域の組み合わせがある。3'末端領域のポリA配列の効果は通常には10残基以下で発揮される。5'UTRの転写プロモーターはT7/T3あるいはSP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくはSP6であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列（Ω様配列）を利用する場合はSP6を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、TMVのオメガ配列（Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638）の一部(O29)を含んだものが好ましい。
　また、翻訳効率に関し、3'末端領域においては、XhoI配列とポリA配列の組み合わせが重要となる。また、ORF領域の下流部分、すなわちXhoI配列の上流に親和性タグがついたものとポリA配列の組み合わせも重要となる。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、蛋白質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlag-tag配列である。ポリA配列効果としては、Flag-tag等の親和性タグにXhoI配列がついたものとそこへさらにポリA配列がついたものの翻訳効率が上昇する。
　上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
　ORF領域については、DNAあるいは/またはRNAからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、あるいは、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。また、コード分子の5'UTRをSP6+O29とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+An(n=8)とすることで、各長さは、5'UTRで約60bp、3'末端領域で約40bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、5'UTRと3'末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はORF領域を超えてされてもよい。すなわち、ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
　特許文献２図１０に、コード分子の一例の詳細な構成が示されている。コード分子は、3'末端領域と、DNAあるいは/またはRNAからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'UTRと、デコード部の配列情報からなる、すなわち表現型蛋白質をコードするORF領域とからなる。ここでは、3'末端領域として、DNAあるいは/またはRNAからなる親和性タグ配列、XhoI配列、ポリA配列を含み、Flag-tag配列を用いている。5'UTRとして、転写プロモーターのSP6、翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部であるO29を含む配列を用いている。
＜４－３＞遺伝子型分子およびその製造方法
　遺伝子型分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含む核酸であるコード分子の3'末端と、スペーサー分子のドナー領域とが結合してなる。
　遺伝子型分子を構成するコード分子は、上記のコード分子においてXhoI配列が必須ではない他は、コード分子について説明したとおりである。しかしながら、XhoI配列を有することが好ましい。
　遺伝子型分子は、上記コード分子の3'末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４～２５℃で４～４８時間の条件が挙げられ、PEG領域を含むスペーサー分子のPEG領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、15℃で0.5～４時間に短縮することも可能である。
　スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード部の3'末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６～８残基以上のDNAあるいは/またはRNAのポリA配列があること、さらに、5'UTRの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列(O29; 特許文献２図１０)が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)あるいは２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。このことによって、RNAリガーゼを用いることでDNAリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を60～80%に保つことができる。
　遺伝子型分子がRNAである場合には、(a)転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含むコード分子の3'末端と、(b)（１）～（４）のいずれか１項に記載のスペーサー分子のドナー領域であってRNAからなるものとを、スペーサー分子内のPEG領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、RNAリガーゼにより結合させることが好ましい。
　ライゲーション反応時に、PEG領域を含むスペーサー部のPEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が80～90%以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。
＜４－４＞対応付け分子及びその製造方法
　対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされた蛋白質である表現型分子と連結してなるものである。
　対応付け分子は、遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされた蛋白質である表現型分子と連結することを含む。
　無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽又はウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、２５～３７℃で１５～240分の条件が挙げられる。
　無細胞翻訳系については、これまで大腸菌(E. coli)、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系で対応付け分子の形成が検討され、ウサギ網状赤血球の系でのみ対応付け分子が確認されていたが（Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts, R.W, Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297）、この態様によれば、PEG領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子として、小麦胚芽の系でも対応付け分子の形成を行うことができる。また、これまでウサギ網状赤血球の系では遺伝子型分子の安定性を欠くために実用性に乏しく、短い鎖長の遺伝子型分子にのみ適用されてきたが（Roberts, R.W, Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297; Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H. (1997) FEBS Lett. 414, 405）、PEG領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子は、小麦胚芽の系ではより安定であり長い鎖長を取り扱える実用的な系である。
　リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質(対応付け分子)およびそのライブラリーのいろいろな組み合わせを用いて、in vitroで蛋白質と物質の相互作用解析が可能であり、たとえば、IVVの一次スクリーニング後の詳細な遺伝子ネットワークを解析する二次スクリーニングに利用できる (特許文献２図２１)。
　無細胞共翻訳で「相互作用」が実現される場合、その無細胞翻訳系については、大腸菌(E. coli)、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。in vitro virus法（IVV法）では、対応付け分子の形成は、大腸菌(E. coli)はかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系(Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Yanagawa H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297)では安定に確認されており、さらに小麦胚芽の系(WO 02/46395)ではより安定に確認されている。
　以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
＜実施例１＞
［F遺伝子mRNAの構築］
　PCRによって、ヒトFOS蛋白質のロイシンジッパー構造を含む領域をコードするDNA断片の5’側に、SP6プロモーター、Ω様配列、T7タグペプチドをコードする塩基配列を連結した。また、3’側にFLAGタグペプチドをコードする塩基配列とヘキサアデニル酸を連結し、F遺伝子DNA断片を構築した。このとき、フォワードプライマーとして、SP6プロモーター、Ω様配列、T7タグペプチド、およびFOS遺伝子の一部をコードするオリゴDNA（priSP6O’T7FOS117f (配列番号１)）を用いた。リバースプライマーとしてヘキサアデニル酸、FLAGタグ、およびFOS遺伝子の１部をコードするオリゴDNA（priFOS211FLAGA6r(配列番号５)）を用いた。これらのオリゴDNAは（株）ファスマックより購入した。PCRはKOD Plus（TOYOBO）を用い、添付のマニュアルに従い行なった。サーマルサイクラーのプログラムは、94℃30秒、58℃30秒、68℃30秒を30サイクルである。鋳型DNAはヒトFOS遺伝子のcDNAである。このPCR産物を鋳型として、SP6 RNAポリメラーゼ（Promega）を用い、in vitroでF遺伝子mRNAを合成した（図３）。反応条件は37℃で３時間である。
［DNAリンカーの構築］
　自己相補性領域と、上記で構築したF遺伝子mRNAのプロモーター配列、Ω様配列、T7ペプチドタグ遺伝子に相補的な領域をもつDNAリンカー（Sqlinker09）を設計し合成した（図４）。Sqlinker09の5’末端には、リン酸基を付加した。オリゴDNAは、（株）ファスマックより購入した。
［スクエア反応］
１）アニーリング
　上記で構築したF遺伝子mRNAを20 pmol、上記で構築したSqlinkerを40 pmol、F遺伝子mRNAの3’側に結合する逆転写用プライマー（priFOS211FLAGA6r）を40 pmol、混合し10 μlとした。90℃で30秒加熱後、室温まで徐冷した。
２）逆転写
　逆転写酵素、逆転写用反応緩衝液、基質dNTPミックスの混合溶液10 μlを、１）で調製した溶液と混合し、37℃で１時間、逆転写反応を行った。逆転写酵素は、Promega製のM-MLV逆転写酵素RNaseH minus, point mutantである。
３）ライゲーション反応
　DNAライゲースを含む溶液20 μlを、２）で調製した溶液と混合し、25℃で１時間、ライゲーション反応を行った。DNAライゲースは、TOYOBOのLigation high ver.2を用いた。
４）RNA分解
　３）で調製した溶液に、RNaseHを1 μl混合し、RNA部分を分解した。RNaseHは、Invitrogen社のものを用いた。
５）伸長反応
　４）で調製した溶液に、DNAポリメラーゼ、dNTPミックス、DNAポリメラーゼ反応用緩衝液の混合溶液を加え、56℃で15分伸長反応を行なった。この際、４）で調製した試料を表１に記した分量加えた。
６）PCR反応
　５）の反応液に、priFOS211FLAGA6r（20 pmol/μl）を、表１に記した分量加えた。サーマルサイクラーのプログラムは、94℃30秒、56℃30秒、72℃３分、を40サイクルである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
７）PCR反応産物を電気泳動した。その結果を図５に示す。DNAマーカーの濃いバンドは500 bpに相当する。1-8のサンプルに於いて、300-400 bpに濃いDNAバンドが観られた。これは、F遺伝子DNA（397 bp）に相当する。本来、図２hに示すDNA断片の合成に成功していれば、その約２倍の長さのDNA断片が得られるはずである。モノマーのF遺伝子DNAに相当するDNA断片が得られた理由は、試料に含まれる未反応のSqlinker09がプライマーとして働き、Sqlinker09とpriFOS211FLAGA6rで挟まれた領域が増幅されたためと考えられる。そこで、Sqlinker09の持ち込み量を減らす目的で、試料の量を減らし（lane 7, 8, 9）、さらにpriFOS211FLAGA6rの添加量を増やし（lane 1, 4, 7）、PCRにより、priFOS211FLAGA6rで挟まれたDNA断片が、増幅される確率を高めるよう試みた。その結果、lane 7には、うっすらではあるが700-800 bp長のDNA断片が得られた（矢印）。
８）このPCR産物をゲルから切り出した後に精製し、PCRの鋳型として用いた。反応液の組成は、KOD Plus ver.2緩衝液、dNTP、MgSO4、priFOS211FLAGA6r、KOD Plus（TOYOBO）、鋳型DNA、DEPC水を含む。サーマルサイクラーのプログラムは、94℃30秒、56℃30秒、68℃１分を30サイクルである。得られたPCR産物の電気泳動結果を図６aに示す。プライマーとしてpriFOS211FLAGA6rのみを用いることによって、700-800 bp長のDNA断片を増幅することができた。このことから図2hに示す構造のDNA断片が得られたと考えられる。
９）しかし、上記DNA断片は分子全体としてパリンドローム配列になっており、DNAシーケンシングによる塩基配列の決定は、上記のPCR産物を鋳型とし、Sqlinker09の１部からなるpriSq0702とpriFOS211FLAGA6r をプライマーとして用いてPCRを行なった（図７）。このPCRにより、上記DNAの約半分の長さに相当するDNA断片が得られると予想される。このPCR産物の電気泳動結果を図6bに示す。300-400 bpのサイズにDNAが得られ、予想通りのDNA断片が得られた。
１０）上記で得られたDNA断片をクローニングし（Invitrogen, PCR-TOPO）、DNAシーケンシングにより、塩基配列を決定した。その結果を図８に示す。斜体字で示した部分はベクター由来の配列である。太字で示した文字はSqlinker09あるいはpriSqlinler07-02由来の配列である。ACTGGT領域のTとGの境界で、Sqlinker09の5’末端とF遺伝子のcDNAの３‘末端が、正しく連結されたことが確認された。以上、８）、９）、１０）の結果を合わせて考察すると、図２hあるいは図７のDNA断片が得られたと推測できる。
　上記のスクエア反応において、F遺伝子mRNAの量を20 pmolから2 pmolに変更する他は同様に反応を行った。この場合、700-800 bpにバンドは得られなかった（図９）。
　本実施例に於いてスクエア反応に成功した場合のmRNA濃度は2 μMであり、逆に成功しなかった場合のmRNA濃度は0.2 μMであった。このことは、IVV分子濃度が2 μM以上であれば、蛋白質間相互作用がなくてもIVV分子のmRNA部分とリンカーとの相補性により、cDNAダイマーが得られてしまうことを示している。逆に、IVV濃度を0.2 μM以下に設定し、スクエア反応を行えば、核酸部分での相補性によるcDNAダイマーの合成は確認されず、蛋白質間相互作用が検出される可能性がある。つまり、Kdで表したときに、Kd = 2 x 10-7以下の結合の強さをもつ蛋白質間相互作用であれば、本実験条件により、その相互作用を検出できることになる。
＜実施例２＞
（１） リンカーとcDNAの連結の確認
　自己相補配列を有する一本鎖オリゴDNA（Sqlinker08と命名；ファスマック社製）をDNAリンカーとして用いた（図１０a、配列番号６）。Sqlinker08の5’末端にはリン酸基が付加されていた。まずSqlinker08のセルフハイブリダイゼーションを行った。100μＭのSqlinker08を5μl、10ｘT4 RNA Ligase緩衝液（宝バイオ社製）を10μl、DEPC水を18μl、混合し95℃で3分加熱し、その後68℃まで徐冷した（図１１a）。Ｆ遺伝子（FOS遺伝子のロイシンジッパー領域、実施例１参照）から転写により得られた1.6 pmol/μlのmRNAを6μl、Ｊ遺伝子（JUN遺伝子のロイシンジッパー領域、実施例１参照）から転写により得られた1.5 pmol/μlのmRNAを7μl添加し、その後、15℃まで冷却した。mRNAの5’末端にはリン酸基が付加されていた。Sqlinker08は、F遺伝子のSP6プロモーターおよびΩ配列に相補的な配列を有している。次にT4 RNA ligase（宝バイオ社製）を12.5 μl添加し、15℃で終夜連結反応を行った（図１１b）。この反応溶液は10 nmol/μlのPEG2000を6μl、0.1 MのDTTを3μl、40 mMのATPを1μl、DMSOを20μl、酵素に添付のBSA溶液を20μl、RNase阻害剤を2μl、DEPC水を4.24 μl含むものであった。連結反応後、生成物はエタノール沈殿により回収した。また連結反応は電気泳動により確認した。
　続いて逆転写反応を行った（図１１c）。反応溶液は5 pmolのRNA、20μMのプライマー（priFOS1r、図1b、配列番号７）、添付の5x緩衝液、2 mMｄNTPを12.5 μlおよびDEPC水を15.5μl含む。95℃で30秒加熱後、50℃に徐冷し、3分放置した後、M-MLV RTase（プロメガ社製）を5μl添加した。50℃で1時間放置した後、ゲルろ過スピンカラム（Bio-Rad社製、Micro Bio-Spin 6 Chromatograpy Columns）により精製した。
　逆転写反応により合成されたcDNA部とリンカー部をLigation high ver.2（東洋紡社製）を用いて連結した。その際、精製済みの逆転写反応生成物とLigation high ver.2を50μlずつ混合し、16℃で終夜連結反応を行った（図１１d）。続いてRNase H（インビトロジェン社製）を10μl添加し、RNA/cDNAのRNA部を分解した（図１１e）。
　上記の反応産物にリンカーを加え伸長反応を行った（図１１f）。反応溶液は10 x KOD Plus 2 ver. 2緩衝液を5μl、2 mM dNTPを5μl、25 mM MgSO4を3μl、20μMのリンカーをプライマーとして1μl、連結反応生成物を1μl、KOD Plus（東洋紡社製）を1μl、DEPC水を34μl含む。反応条件は94℃で1分30秒、68℃を3分である。
　続いてPCRを行った（図１１g）。この反応溶液には反応溶液は10 x KOD Plus 2 ver. 2緩衝液を5μl、2 mM dNTPを5μl、25 mM MgSO4を3μl、20μMのフォワードプライマー（priSqlinker0801f、図１０c、配列番号８）と20μMのリバースプライマー（priFOS1r）を1μlずつ、伸長反応生成物を1μl、KOD Plus（東洋紡社製）を1μl、DEPC水を33μl含むものであった。反応条件は94℃で1分のあと94℃、30秒、58℃、30秒、68℃を1分を35サイクルであった。得られた資料をアガロース電気泳動により分析したところ、約200塩基対のサイズに相当するバンドが得られた。この領域をゲルから切り出しクローニングし、塩基配列を決定した。その配列を図１０dに示す。この結果から、リンカー部とF遺伝子のSP6プロモーター部が正しく連結されていることが分かる（ただし、斜線で示した塩基は何らかの理由により欠失していた）。以上の解析から、リンカーとcDNAが連結されていたことが確認された。
（２） IVV分子の無細胞翻訳系からの精製法についての検討
[FOSおよびJUN相互作用領域に対応するIVV分子の構築]
　IVV分子としてFOSとJUNの相互作用領域を用いた。これらの構造遺伝子の構造、構築方法、およびRNAへの転写反応は、実施例１に記載した通りである。得られたRNA分子とスペーサーピューロマイシン（p(dCp)2T(FI)pPEG(2000)p(dCp)2 Puro（記号はWO 02/48347に定義された通りである）は、T4 RNAリガーゼ（宝酒造製）を用い、WO 02/48347の実施例1に記載の方法に従い連結した。連結反応は25℃で1時間行なった。ライゲーション産物をRNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。精製されたライゲーション産物を無細胞翻訳系（プロメガ社,  Wheat germ plus）に加えて翻訳を行ない、IVV分子を合成した（図１２）。無細胞翻訳反応液の組成は、40μlの小麦胚芽抽出液、1.3μlの RNasin Plus RNase Inhibitor（プロメガ社）、および5 pmolのライゲーション産物を含む。翻訳反応は25℃で1時間行なった。
 [IVV分子の精製]
　翻訳反応産物50μlにTBSTE緩衝液（50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 0.2 % Tween20, 10 mM EDTA）450μlを混合後、15,000 rpmで10分遠心し、上澄み液を回収した。回収した上澄み液に40μlスラリーのanti-M2 agarose beads（シグマ社製）を添加し、IVV分子のアフィニティ精製を行った。アフィニティ精製は、上澄み液とアフィニティビーズの結合反応（1時間（4℃））の後に400μlのTBESTE緩衝液を用いて洗浄することで行った。図１２に示したように、IVV分子のタンパク質部分には、FOSあるいはJUN由来のアミノ酸配列のC末端側に、FLAG-ペプチド・タグが付加されていた（実施例１参照）。
 [IVV分子の逆転写反応]
　精製したIVV分子を逆転写した。逆転写反応溶液は、逆転写キット添付の緩衝液、dNTPミックス、M-MLV逆転写酵素RNaseH minus, point mutant、およびpriFLAGA6r（図１０e）を含むものであった。この反応溶液を精製済みのビーズに添加し、37℃で1時間反応させた（図１３）。
　逆転写反応溶液にはDTTが含まれるために、ビーズに結合しているanti-M2抗体は逆転写反応中に変性し、IVV分子はビーズから解離する。したがって、この混合液をスピンカラムによるゲルろ過（BIO-RAD社製、Micro Bio-Spin 6 Chromatograpy Columns）により精製することで、mRNA部分がcDNAとハイブリッド化したIVV分子を回収できる（Matsumura et al., FASEB J., 24, 2201-2210, 2010参照）。本実施例でもこの方法によりハイブリッド化IVV分子を回収した。尚、回収した溶液の1μlを鋳型としてPCRを行い、逆転写反応が進行し、ハイブリッド化IVV分子が形成、回収されることを確認した（図１４）。尚、逆転写反応を行わない場合は、このようなバンドは一切得られなかった。
　実施例２に於いては、リンカーとcDNAの連結を塩基配列の解析から確認された。また、IVVスクエア法の実施には、逆転写反応を阻害する夾雑物を含む無細胞翻訳系からIVV分子を精製する必要がある。上述のようにIVV分子のペプチド部分に付加したFLAG-tagを用いた精製法により精製できることが確認された。
　本発明により、固定したベイトを用いたアフィニティ選択が不要な生体分子相互作用の解析方法が提供される。

Claims (4)

  1. 対応付け分子のmRNA部分を連結するためのDNAリンカーであって、その5'末端に、前記mRNA部分の5'末端の配列に相補的なmRNA相補性領域、及び、その3'末端に、DNAリンカー相互間で相補的な自己相補性領域を含み、その5'末端がリン酸化されているDNAリンカー。
  2. 対応付け分子のmRNA部分の5'末端の配列が、5'末端側からプロモーター配列、Ω様配列、T7ペプチドタグ遺伝子をこの順序で含む、請求項１に記載のDNAリンカー。
  3. 下記の工程を含む、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子が連結したDNAの合成方法。
    　対応付け分子をその蛋白質部分で相互作用させる工程
    　相互作用した対応付け分子のmRNA部分を、請求項１又は２に記載のDNAリンカーを介してアニーリングにより連結させる工程であって、対合は、前記mRNA部分の5'末端の配列と前記mRNA相補性領域との間、及び、前記自己相補性領域間に生じる前記工程
    　逆転写により前記mRNA部分をDNA-RNAハイブリッドにする工程
    　前記DNAリンカーの5'末端と、逆転写で合成されたDNA鎖の3'末端を連結する工程
    　DNA-RNAハイブリッドを構成するRNAを分解する工程
    　前記DNAリンカー3'末端を伸長してcDNAを合成する工程
  4. 請求項３に記載の合成方法で得られたDNAの塩基配列を決定し、相互作用した蛋白質をコードする遺伝子の組または相互作用した蛋白質の組を特定することを含む相互作用の解析方法。
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