CN112955556A - 翻译促进剂、模板核酸、翻译模板的生产方法以及蛋白质的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供一种提高目标蛋白质的合成效率的翻译促进剂。通过如下翻译促进剂，能够解决该课题：一种无细胞蛋白质合成系统中的翻译促进剂，该翻译促进剂由作为3'非翻译区域的核酸构成，所述3'非翻译区域与对目标蛋白质的氨基酸序列进行编码的编码区域的3'末端相邻地连结，所述3'非翻译区域由第一区域和第二区域构成，所述第一区域与所述编码区域的3'末端相邻，并且由10～40个核酸序列构成；所述第二区域与所述第一区域连结，并且由2～40个A连续的聚A序列构成，所述第一区域具有发夹结构。

Description

翻译促进剂、模板核酸、翻译模板的生产方法以及蛋白质的生 产方法
技术领域
本申请的公开涉及翻译促进剂、模板核酸、翻译模板的生产方法以及蛋白质的生产方法。
背景技术
以无细胞的方式合成蛋白质的合成系统是如下蛋白质合成系统：准备包含与蛋白质合成有关的细胞内要素的介质，以无细胞的方式进行从模板DNA的转录到翻译。这种无细胞蛋白质合成系统有多种。作为这样的合成系统，存在将作为转录模板的模板DNA应用于介质来合成作为最终产物的蛋白质的系统、以及将作为翻译模板的mRNA应用于介质来合成蛋白质的系统。
在这些系统的任一中，都需要合成转录模板DNA作为最初的原料。转录模板DNA的合成通常首先克隆对要合成的蛋白质进行编码的cDNA，将所克隆的cDNA组合到质粒中，构建包含启动子、编码区域、终止子等的用于表达的DNA区域。然后，从质粒切出该DNA区域，或者对质粒直接实施PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)，作为模板DNA。
模板DNA的结构被认为对无细胞蛋白质合成系统中的表达效率有影响，对构建表达盒的载体进行了各种尝试。例如，报告有在5'非翻译区域(5'UTR)中导入特定的翻译促进序列(专利文献1、2)。另外，还记载有通过延长3'非翻译区域(3'UTR)，使作为翻译模板的mRNA寿命长，或提高翻译效率(专利文献3)。还报告有mRNA的3'UTR优选为1000碱基以上(专利文献4、5)。
另外，关于使用酵母提取物的无细胞蛋白质合成系统，也提及了3'UTR的利用(非专利文献1)。
另一方面，还已知在200碱基以下的3'UTR中通过核酸扩增反应可以获取转录模板DNA，通过将该转录模板DNA应用于无细胞蛋白质合成系统，可以有效地获取mRNA和蛋白质(参照专利文献6)。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-72207号公报；
专利文献2：日本特开2013-158342号公报；
专利文献3：日本特开2007-97438号公报；
专利文献4：日本特开2008-35701号公报；
专利文献5：日本特开2005-247857号公报；
专利文献6：国际公开第2016/143799号。
非专利文献
非专利文献1：Biotechonology Journal，2014，9，641-651。
发明内容
在无细胞蛋白质合成中，需要从模板DNA合成作为翻译模板的mRNA。因此，从mRNA的合成效率的观点出发，优选的是，与目标蛋白质的合成无关的3'UTR短的一方。但是，优选的是，目标蛋白质的合成效率高的一方。
本申请中的公开是为了解决上述以往的问题而做出的，并且，经过认真研究新发现：(1)作为与对目标蛋白质的氨基酸序列进行编码的编码区域的3'末端相邻地连结的3'非翻译区域的核酸，(2)包括与所述编码区域的3'末端相邻且由10～40个核酸序列构成的第一区域、以及与所述第一区域连结且由2～40个A连续的聚A序列构成的第二区域，(3)所述第一区域具有发夹结构，(4)由此尽管较短的3'非翻译区域，也能够提高蛋白质合成效率。
即，本申请的公开的目的在于提供一种翻译促进剂、模板核酸、翻译模板的生产方法以及蛋白质的生产方法，其即使在较短的3'非翻译区域，也提高目标蛋白质的合成效率。
本申请的公开涉及以下所示的翻译促进剂、模板核酸、翻译模板的生产方法以及蛋白质的生产方法。
(1)一种翻译促进剂，所述翻译促进剂是无细胞蛋白质合成系统中的翻译促进剂，其中，
所述翻译促进剂由作为3'非翻译区域的核酸构成，所述3'非翻译区域与对目标蛋白质的氨基酸序列进行编码的编码区域的3'末端相邻地连结，
所述3'非翻译区域由第一区域和第二区域构成，
所述第一区域与所述编码区域的3'末端相邻，并且由10～40个核酸序列构成；
所述第二区域与所述第一区域连结，并且由2～40个A连续的聚A序列构成，
所述第一区域具有发夹结构。
(2)一种模板核酸，用于无细胞蛋白质合成系统，所述模板核酸包括：
启动子区域；
编码区域，对通过所述启动子区域能够操作地连结的目标蛋白质的氨基酸序列进行编码；以及
所述编码区域的3'非翻译区域，由权利要求1所述的翻译促进剂构成。
(3)根据上述(2)所述的模板核酸，其中，所述编码区域是将任意的蛋白质C末端包含蛋白质标签的融合蛋白质作为所述目标蛋白质而进行编码的区域。
(4)根据上述(2)或(3)所述的模板核酸，其中，所述编码区域是将任意的蛋白质N末端包含蛋白质标签的融合蛋白质作为所述目标蛋白质而进行编码的区域。
(5)根据上述(2)至(4)中的任一项所述的模板核酸，其中，所述模板核酸是转录模板DNA。
(6)根据上述(2)至(4)中的任一项所述的模板核酸，其中，所述模板核酸是翻译模板mRNA。
(7)一种翻译模板的生产方法，用于无细胞蛋白质合成系统，所述生产方法包括以下工序：
在不存在细胞、且存在用于将转录模板DNA转录成mRNA的要素的情况下，使用上述(2)～(5)中的任一项所述的模板核酸来合成翻译模板mRNA。
(8)一种蛋白质的生产方法，包括以下工序：
在不存在细胞、且存在用于将翻译模板mRNA翻译成蛋白质的要素的情况下，使用上述(6)所述的模板核酸来合成蛋白质。
附图说明
图1是说明翻译促进剂和模板核酸的概要的概要图；
图2是说明实施例和比较例中使用的转录用模板DNA的概要的概要图；
图3是说明通过PCR制备转录模板DNA的步骤的概要图；
图4是表示使用mRNA的二级结构预测软件CentroidFold分析实施例1～2和比较例1～3的3'UTR序列的结构的图；
图5是表示实施例1～2和比较例1～3的蛋白质的表达量的三维图像；
图6是表示使用mRNA的二级结构预测软件CentroidFold分析实施例3～5的3'UTR序列的结构的图；
图7是表示实施例3～5和比较例4的蛋白质的表达量的三维图像；
图8是表示使用mRNA的二级结构预测软件CentroidFold分析实施例6～9和比较例5的3'UTR序列的结构的图；
图9是表示实施例6～8和比较例5的蛋白质的表达量的三维图像；
图10是表示实施例9和比较例5的蛋白质的表达量的三维图像。
具体实施方式
以下，对本申请所公开的翻译促进剂、模板核酸、翻译模板的生产方法以及蛋白质的生产方法进行详细说明。此外，以下说明是为了便于理解的，本申请所公开的技术事项的范围并不限于以下说明。除了以下例示以外，当然也可以在不损害本申请所公开的主旨的范围内进行适当变更。
(翻译促进剂)
参照图1，对翻译促进剂的实施方式进行说明。图1是说明翻译促进剂的概要的概要图。翻译促进剂1在无细胞蛋白质合成系统中使用的模板核酸中，与对目标蛋白质的氨基酸序列进行编码的编码区域2的3'末端相邻地连结。并且，翻译促进剂1由作为3'非翻译区域的核酸组成，该核酸本身不会作为蛋白质合成。实施方式所涉及的翻译促进剂1由与编码区域2的3'末端相邻的第一区域1a、以及与第一区域1a连结的第二区域1b构成。
第一区域1a具有发夹结构。此外，在本说明书中，“发夹结构”是指，在构成第一区域1a的核酸内，与其他核酸配对地形成的稳定的环(loop)结构。第一区域1a只要是能够形成发夹结构的序列，则对核酸序列没有特别限制。另外，关于构成第一区域1a的核酸的长度(核酸个数)，如果核酸序列过短，则难以形成发夹结构，或者终止密码子被包含在发夹结构中或接近，因此，例如为10以上、13以上、15以上、20以上即可。另一方面，关于上限，只要在能够进行蛋白质合成的范围内，就没有特别限制。但是，一般而言，包含启动子3、编码区域2和3'非翻译区域1的模板核酸DNA通过PCR等核酸扩增反应获取。因此，从引物(primer)设计的观点、成本的观点出发，优选的是短的。因此，从效率的观点出发，构成第一区域1a的核酸的长度可以为50以下、45以下、40以下、30以下。此外，形成于第一区域1a的“环结构”的数量可以是一个，也可以是两个以上。
第二区域1b由A(腺嘌呤)连续的聚A序列构成。A的长度(核酸个数)如果过少，则蛋白质的合成效率不提高，因此例如为2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上。另一方面，关于上限，与第一区域1a同样地，只要在能够进行无细胞蛋白质合成的范围内，就没有特别限制，但从引物设计的观点、成本的观点出发，构成第二区域1b的A(腺嘌呤)的长度(个数)可以为50以下、45以下、40以下、35以下、30以下。
通过实施方式所涉及的翻译促进剂，虽然作为目标的蛋白质的合成效率提高的机理尚不明确，但如后述的实施例和比较例所示，通过在编码区域2的3'末端依次配置第一区域1a和第二区域1b，蛋白质的合成效率提高。
在翻译促进剂应用于转录模板DNA的情况下，在该DNA的3'末端侧作为DNA双链而具备。另外，在翻译促进剂应用于翻译模板mRNA的情况下，在该mRNA的3'末端侧作为单链RNA而具备。
(模板核酸)
参照图1，对模板核酸的实施方式进行说明。图1是说明模板核酸的概要的概要图。模板核酸10包含启动子区域3、对目标蛋白质的氨基酸序列进行编码的编码区域2、以及翻译促进剂1。由于翻译促进剂1已被说明，因此以下对启动子区域3和编码区域2进行说明。
启动子区域3只要作为进行基因转录时的转录开始部分发挥作用，则序列没有特别限制，可以采用该技术领域中公知的启动子序列。作为构成启动子区域3的序列，可以举出公知的T7启动子序列、SP6启动子序列、T3启动子序列等，但仅是例示而不是限定。
编码区域2只要是对目标蛋白质的氨基酸进行编码的核酸序列、且通过启动子区域3能够操作地连结即可，就没有特别限制。
此外，在图1所示的例子中，紧接在启动子区域3之后连结有编码区域2，但也可以在编码区域2的启动子区域3侧连结有对蛋白质标签(C末端蛋白质标签)进行编码的序列，该蛋白质标签(C末端蛋白质标签)附加到通过编码区域2合成的目标蛋白质。通过包含蛋白质标签序列，可以将目标蛋白质合成为带标签的融合蛋白质。同样地，也可以在编码区域2的翻译促进剂1侧连结有对蛋白质标签(N末端蛋白质标签)进行编码的序列，该蛋白质标签(N末端蛋白质标签)附加到通过编码区域2合成的目标蛋白质。C末端蛋白质标签序列和N末端蛋白质标签序列可以仅连结其中一个，也可以连结两者。
C末端蛋白质标签和N末端蛋白质标签包括例如His(多聚组氨酸)标签、GST(谷胱甘肽S转移酶)标签、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签、myc标签、标记(FLAG)标签和BCCP(生物素羧基载体蛋白)标签。另外，作为视觉上可检测的物质，例如，可以举出GFP(GreenFluorescent Protein，绿色荧光蛋白)、BFP(Blue Fluorescent Protein，蓝色荧光蛋白)、CFP(Cyan Fluorescent Protein，青色荧光蛋白)、RFP(Red Fluorescent Protein，红色荧光蛋白)、YFP(Yellow Fluorescent Protein，黄色荧光蛋白)、EGFP(Enhanced GreenFluorescent Protein，增强型绿色荧光蛋白)、ECFP(Enhanced Cyan FluorescentProtein，增强型青色荧光蛋白)、ERFP(Enhanced Red Fluorescent Protein，增强型红色荧光蛋白)、EYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein，增强型黄色荧光蛋白)、TMR(TetraMethyl-Rhodamine，四甲基罗丹明)、萤光素酶等。此外，上述C末端蛋白质标签和N末端蛋白质标签仅是例示，也可以是其他的蛋白质标签。
此外，C末端蛋白质标签序列和N末端蛋白质标签序列可以与任意蛋白质序列的N末端和/或C末端直接连结，也可以经由适当的接头(Linker)序列连结。
模板核酸是后述的无细胞蛋白质合成系统中使用的要素之一。模板核酸是转录模板DNA，并且，也可以是翻译模板mRNA。另外，转录模板DNA可以是由PCR等合成的直链状之外，还可以是质粒等环状体。在模板核酸是可用于无细胞蛋白质合成系统中的DNA双链的形态时，当有义链作为翻译促进剂而具有聚A序列时，反义链对应地具有聚T序列。另外，在转录模板DNA、翻译模板mRNA具备翻译促进剂的情况下，在其3'末端侧具有翻译促进剂。
模板核酸可以通过公知的化学方法或基因工程方法获取，但优选的是如后所述那样，利用PCR等核酸扩增反应将基因、cDNA作为模板获取。另外，翻译模板mRNA可以通过应用于两步法等中的公知的翻译模板mRNA的合成方法来获取。
(转录模板DNA的生产方法)
用于无细胞蛋白质合成系统的转录模板DNA的生产方法可以包括：对包含目标蛋白质的编码区域的DNA实施核酸扩增反应来合成转录模板DNA的工序。转录模板DNA例如可以使用适当设计的引物组，对包含编码区域的DNA进行PCR的核酸扩增反应来得到，该编码区域对目标蛋白质的氨基酸序列进行编码。
另外，转录模板DNA也可以使用载体获取。通过将至少包含对蛋白质的氨基酸序列进行编码的编码区域的DNA插入到载体来获得模板核酸。这样制备的载体可以将其自身用作转录模板DNA，也可以从载体切出相当于转录模板DNA的DNA片段来使用。
转录模板DNA例如可以作为PCR反应液(即，无需纯化转录模板DNA)应用于无细胞蛋白质合成系统，也可以进行适当纯化等来应用于无细胞蛋白质合成系统。
(翻译模板mRNA的生产方法)
用于细胞蛋白质合成系统的翻译模板的生产方法可以包括以下工序：在不存在细胞、且存在用于将转录模板DNA转录为mRNA的要素的情况下，使用转录模板DNA而合成翻译模板mRNA。更具体而言，对于来自含有转录模板DNA的PCR反应液或载体的转录模板DNA，将适合于转录模板DNA所具备的启动子区域的RNA聚合酶及RNA合成用底物(4种核糖核苷3磷酸)等，在含有转录反应所需成分的组成下，例如在约20℃～60℃、优选在约30℃～42℃下，温育适当的时间，由此可以得到翻译模板mRNA。此外，上述例子表示从转录模板DNA合成翻译模板mRNA的步骤。可选地，虽然也与mRNA的长度有关，然而可以通过核酸合成直接合成mRNA。
翻译模板mRNA的生产方法可以作为无细胞蛋白质合成系统的转录/翻译系统的一部分来实施，也可以作为在将翻译模板mRNA应用于翻译系统之前的工序来实施。这样得到的翻译模板mRNA可以将其反应液应用于翻译系统。
(蛋白质的生产方法)
蛋白质的生产方法可以包括如下工序：在不存在细胞、且存在用于从翻译模板mRNA翻译为蛋白质的要素的情况下，使用翻译模板mRNA而合成蛋白质。蛋白质的生产方法还可以包括如下工序：在不存在细胞、且存在用于将转录模板DNA转录为mRNA的要素的情况下，使用转录模板DNA而合成翻译模板mRNA。进而，蛋白质的生产方法也可以包括：对包含目标蛋白质的编码区域的DNA实施核酸扩增反应来合成所述转录模板DNA。本申请所公开的蛋白质的生产方法中，由于使用含有翻译促进剂的翻译模板mRNA、转录模板DNA，因此可以有效地进行蛋白质合成。
以下列举实施例，具体说明本申请所公开的实施方式，但该实施例仅用于说明实施方式。并不表示对本申请所公开的发明的范围进行限定或限制。
[实施例]
[无细胞蛋白质合成的步骤]
对实施例中的无细胞蛋白质合成步骤进行说明。
(1)转录用模板DNA的结构
参照图2，对实施例和比较例中使用的转录用模板DNA的概要进行说明。如图2所示，转录模板DNA由如下构成：
·5'非翻译区域(5'UTR)：T7启动子3、增强子；
·编码区域2：CSF3(Granulocyte colony-stimulating factor protein，粒细胞集落刺激因子蛋白)、接头_C(Linker_C)、标记标签(FLAG tag)；
·3'非翻译区域(3'UTR)。
在后述的实施例和比较例中，仅将3'UTR部分替代成各种序列进行实验。3'UTR部分之外的序列如下。
[表1]
Figure BDA0002934369310000091
Figure BDA0002934369310000101
(2)基于PCR的转录模板DNA的制备
参照图3，对通过PCR制备转录模板DNA的步骤进行说明。转录模板DNA如图3所示那样设计引物(Primer)，通过2阶段PCR制备转录模板DNA。PCR的反应溶液组成和程序如下所示。此外，表5所示的程序是利用序列号30、31所示的引物时的专用程序。
[表2]
第一PCR反应液
反应液 容量
10×PCR缓冲液 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO<sub>4</sub> 3μl
10μM第一_CSF3_F 1μl
10μM第一_CSF3_R 1μl
质粒DNA 1μl
PCR DNA聚合酶 1μl
超纯水 33μl
合计 50μl
[表3]
第二PCR反应液
Figure BDA0002934369310000102
Figure BDA0002934369310000111
[表4]
第一/第二PCR程序
Figure BDA0002934369310000113
[表5]
第二PCR 2-1、2-2专用程序
Figure BDA0002934369310000112
此外，所使用的试剂和设备如下。
·PCR酶：东洋纺株式会社KOD-Plus-Neo
·引物(Primer)，人工基因：欧陆基因组学(Eurofin Genomics)株式会社受托合成服务
·热循环仪(Thermal Cycler)：艾本德(eppendorf)公司制造Mastecycler X50s
(3)转录反应
接着，使用所制备的转录模板DNA，制备翻译模板mRNA。转录反应使用新蛋白质公司制造的PSS4050的以下反应液，使用先前制备的第二次PCR反应溶液(含有转录模板DNA)2～5μl，在37℃下进行3小时。
[表6]
Figure BDA0002934369310000121
在25μl的转录反应液中加入10μl的4M乙酸铵，充分混合，再加入100μl的100％乙醇，翻转混合，用台式离心机离心分离数秒后，在-20℃下静置10分钟。然后，进行离心分离(12,000rpm，15分钟，4℃)。去除上清液后，使用台式离心机离心数秒。再次去除上清液，静置直至沉淀干燥。然后，向25μl的转录反应液中加入40μl的无RNA酶水(DEPC水)，用芯片充分悬浮沉淀。按照PSS4050协议，进行核酸浓度测定以使110μl翻译溶液中的mRNA量为35μg，填充到80μl，将其作为翻译模板mRNA溶液。
(4)翻译反应
接着，使用以下组成的翻译反应液，放入到16℃的保温箱中反应10小时。此外，制备从以下的组成中去除了翻译模板mRNA的组成液，然后，将该组成液返回到室温后，添加翻译模板mRNA，以不产生泡沫的方式进行泵送，使其反应。关于小麦胚芽提取物(Wheat germextract)和氨基酸混合物(amino acid mix)，使用新蛋白质公司制造的PSS4050。
[表7]
反应液 容量
小麦胚芽提取物 10μl
氨基酸混合物 20μl
mRNA溶液 80μl
合计 110μl
反应后，将反应液回收到艾本德管(Eppendorf tube)中，进行离心分离(15,000rpm，15分钟，4℃)，将上清液作为翻译完成后的蛋白质溶液。所得的蛋白质表达量的分析步骤如下所示。
<所使用的试剂类>
·凝胶：4-15％三甘氨酸凝胶(Tris-Glycine gel，伯乐公司(Bio-Rad)制造)
·膜：0.2μm PVDF膜(伯乐公司(Bio-Rad)制造)
·一次抗体：标记(FLAG)抗体(小鼠(mouse)；和光纯药工业株式会社制造)
·二次抗体：山羊抗小鼠(goat anti mouse)HRP抗体(Southern Biotech公司制造)
·蛋白质印迹发光试剂：SuperSignal West Pico(赛默飞世尔科技制造)
<分析步骤>
(1)混合1μL的翻译完成后的蛋白质溶液上清液、2.5μL的4×样品缓冲液(samplebuffer)、1μL的2M DTT、5.5μL的超纯水而调整至10μL。
(2)用块状加热器在70℃下加热10分钟。
(3)对加热后的样品进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)。
(4)将SDS-PAGE完成后的凝胶和膜通过托宾缓冲液(Toubin Buffer)来平衡15分钟。
(5)用半干转录装置将凝胶的蛋白质电转录到膜。
(6)用超纯水洗涤膜2分钟。
(7)用PBS+2％脱脂乳+0.05％Tween20进行30分钟的膜封闭。
(8)在适量的(7)的脱脂乳溶液中加入抗体，以使其成为一次抗体(1：2000)、二次抗体(1：1000)。
(9)将该抗体溶液与膜包装并在室温下反应1小时。
(10)反应结束后，从包装中取出膜，用(7)的缓冲液进行5分钟×3次的洗涤。
(11)用超纯水洗涤膜2分钟。
(12)在膜上均匀地涂布发光试剂，放置3分钟。
(13)使用化学发光成像系统Fusion Solo 7S(VILBER公司制造)，以曝光时间1秒，将膜的发光量作为三维图像。
[实施例1～2、比较例1～3]
(发夹结构+聚A序列的评价)
(1)转录用模板DNA的结构
作为实施例1～2和比较例1～3的3'UTR，使用具有以下序列的转录用模板DNA。具体序列如表8所示。
·名称1-1(比较例1)：聚A序列(长度10)+核酸序列(长度47，有发夹结构)
·名称1-2(比较例2)：第一区域(长度20，无发夹结构)+聚A序列(长度10)
·名称1-3(比较例3)：第一区域(长度20，无发夹结构)+聚A序列(长度10)
·名称1-4(实施例1)：第一区域(长度20，有发夹结构)+聚A序列(长度10)
·名称1-5(实施例2)：第一区域(长度20，有发夹结构)+聚A序列(长度10)
[表8]
名称 3′UTR的序列(5′到3′终止+UTR 20_倍数+聚A 10) 序列号
1-1(比较例1) TAA AAAAAAAAAA GAGCTCTTGG ATCCGGCCAT AAGGGCCTGA TCCTTCGAGG GGGGGCC 6
1-2(比较例2) TAG AATAA GGCCATTTTTACCGG AAAAAAAAA 7
1-3(比较例3) TAG AATAA GGCCCTTTTTCCCGG AAAAAAAAAA 8
1-4(实施例1) TAG AATAA GTGCTCGGGCtGGCC AAAAAAAAAA 9
1-5(实施例2) TAG AATAA GTGCTCGGGCtGGtC AAAAAAAAAA 10
另外，图4表示使用mRNA的二级结构预测软件CentroidFold(http：//rtools.cbrc.jp/centroidfold/)分析实施例1～2和比较例1～3的3′UTR序列的结构。
(2)蛋白质合成量的比较
按照上述[无细胞蛋白质合成的步骤]，使用实施例1～2和比较例1～3的转录用模板DNA而合成蛋白质。所使用的引物如下所示。此外，关于“第二反向引物(2nd Reverseprimer)CR2”，根据实施例1～2和比较例1～3使用不同的引物，而其他引物使用相同的引物。
[表9]
第一基因特异性PCR引物10μM
名称 序列 序列号
CSF3_CF CACAAAACAT TTCCCTACAT ACAACTTTCA ACTTCCTATT ATGGCTGGAC CTGCCACC 11
CSF3_CR AGTACCTCCC TGCTGGAGAC CGGGCTGGGC AAGGTGGCG 12
第二反向引物CR1 100nM
Figure BDA0002934369310000151
Figure BDA0002934369310000161
第二反向引物CR2 10μM
名称 序列 序列号
CR2 1-1 GGCCCCCCCTCGAAGG 15
CR2 1-2 TTTTTTTTTT CCGGTAAAAATGGCC TTATT CTACTTGTCA TCG 16
CR2 1-3 TTTTTTTTTT CCGGGAAAAAGGGCC TTATT CTACTTGTCA TCG 17
CR2 1-4 TTTTTTTTT GGCCAGCCCG AGCACTTATT CTACTTGTCA TCG 18
CR2 1-5 TTTTTTTTTT GACCAGCCCG AGCACTATT CTACTTGTCA TCG 19
第二正向引物CF1 10μM
名称 序列 序列号
CF1 CCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCC 20
图5是表示实施例1～2及比较例1～3的蛋白质的表达量的三维图像。从图5可知，在3′UTR的第一区域不具有发夹结构的比较例2和3的情况下，蛋白质的表达量与比较例1大致相同。另一方面，在3′UTR的第一区域具有发夹结构、且在第一区域后设置聚A序列时，蛋白质表达量有显著的提高。
另外，比较例1相当于专利文献6的实施例7(图18)中蛋白质表达量提高最多的“A10+47bp”，且如图4所示具有发夹结构。然而，本申请所公开的翻译促进剂的第一区和第二区的顺序相反，其结果，蛋白质的表达量降低。根据以上的结果，确认到：通过第一区域具有发夹结构、且在具有发夹结构的第一区域的3′末端侧形成由聚A序列构成的第二区域，起到蛋白质的合成量显著提高的效果。
[实施例3～5、比较例4]
(第一区域的长度的研究)
接着，研究第一区域的长度与蛋白质表达量的关系。
(1)转录用模板DNA的结构
作为实施例3～5和比较例4的3′UTR，使用具有以下序列的转录用模板DNA。具体序列如表10所示。
·名称2-1(比较例4)：第一区域(长度0)+聚A序列(长度10)
·名称2-2(实施例3)：第一区域(长度10)+聚A序列(长度10)
·名称2-3(实施例4)：第一区域(长度30)+聚A序列(长度10)
·名称2-4(实施例5)：第一区域(长度40)+聚A序列(长度10)
[表10]
名称 3′UTR的序列(5′到3′终止+第一区域0～40+聚A 10) 序列号
2-1(比较例4) TAG AAAAAAAAAA 21
2-2(实施例3) TAG AATAA GTGCT AAAAAAAAAA 22
2-3(实施例4) TAG AATAA AGTAA ATATA GTGCTCGGGCGGGCC AAAAAAAAAA 23
2-4(实施例5) TAG AATAA AGTAA ATATA CACGAGCCCG GTGCTCGGGCGGGCC AAAAAAAAA 24
另外，图6表示使用mRNA的2次结构预测软件CentroidFold(http：//rtools.cbrc.jp/centroidfold/)分析实施例3～5的3′UTR序列的结构。如图6所示，实施例3～5虽然第一区域的长度不同，但都具有发夹结构。
(2)蛋白质合成量的比较
按照上述[无细胞蛋白质合成的步骤]，使用实施例3～5和比较例4的转录用模板DNA而合成蛋白质。所使用的引物如下所示。序列号为相同编号的序列意味着相同的序列。
[表11]
第一基因特异性PCR引物10μM
Figure BDA0002934369310000171
Figure BDA0002934369310000181
第二反向引物CR1 100nM
Figure BDA0002934369310000182
第二反向引物CR2 10μM
Figure BDA0002934369310000183
第二正向引物CF1 10μM
名称 序列 序列号
CF1 CCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCC 20
图7是表示实施例3～5和比较例4的蛋白质的表达量的三维图像。从图7可知，与3′UTR的第一区域的长度为0(无发夹结构)的比较例4(2-1)相比，在第一区域的核酸的长度为10(2-2，实施例3)、30(2-3，实施例4)、40(2-5，实施例5)的任一种情况下，蛋白质的表达量也提高。从以上的结果可知，第一区域的长度只要在能够形成发夹结构的范围内适当调整即可。
[实施例6～9、比较例5]
(聚A序列的长度的研究)
接着，研究聚A序列的长度与蛋白质表达量的关系。
(1)转录用模板DNA的结构
作为实施例6～9和比较例5的3′UTR，使用具有以下序列的转录用模板DNA。具体序列如表12所示。
·名称3-1(比较例5)：第一区域(长度20)+聚A序列(长度0)
·名称3-2(实施例6)：第一区域(长度20)+聚A序列(长度10)
·名称3-3(实施例7)：第一区域(长度20)+聚A序列(长度20)
·名称3-4(实施例8)：第一区域(长度20)+聚A序列(长度40)
·名称3-5(实施例9)：第一区域(长度20)+聚A序列(长度2)
[表12]
名称 3′UTR的序列(5′到3′终止+第一区域20_倍数+聚A 0～40) 序列号
3-1(比较例5) TAG AATAA GTGCTCGGGCGGGCC 33
3-2(实施例6) TAG AATAA GTGCTCGGGCGGGCC AAAAAAAAAA 34
3-3(实施例7) TAG AATAA GTGCTCGGGCGGGCC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 35
3-4(实施例8) TAG AATAA GTGCTCGGGCGGCC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 36
3-5(实施例9) TAG AATAA GTGCTCGGGCGGGCC AA 37
另外，图8表示使用mRNA的二级结构预测软件CentroidFold(http://rtools.cbrc.jp/centroidfold/)分析实施例6～9和比较例5的3′UTR序列的结构。如图8所示，实施例6～9和比较例5中使用的第一区域具有发夹结构。
(2)蛋白质合成量的比较
按照上述[无细胞蛋白质合成的步骤]，使用实施例6～9和比较例5的转录用模板DNA而合成蛋白质。所使用的引物如下所示。此外，序列号为相同编号的序列意味着相同的序列。
[表13]
第一基因特异性PCR引物10μM
名称 序列 序列号
CSF3_CF CACAAAACAT TTCCCTACAT ACAACTTTCA ACTTCCTATT ATGGCTGGAC CTGCCACC 11
CSF3_CR AGTACCTCCC TGCTGGAGAC CGGGCTGGGC AAGGTGGCG 12
第二反向引物CR1 100nM
名称 序列 序列号
CR1_U20 GGCCCTCCCG AGCACTTATTCTACTTGTCA TCGTCATCCT TGTAGTCAGT ACCTCCCTGC TGG <sub>14</sub>
第二反向引物CR2 10μM
Figure BDA0002934369310000201
Figure BDA0002934369310000211
第二正向引物CF1 10μM
名称 序列 序列号
CF1 CCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCC 20
图9是表示实施例6～8和比较例5的蛋白质的表达量的三维图像。从图9可知，对于连结到第一区域的聚A序列，当聚A的长度为10(3-2，实施例6)时，蛋白质的表达量增加，随着聚A的长度增加，蛋白质的表达量缓慢减少，然而，当聚A的长度在10～40之间时，蛋白质的表达量大于比较例5(3-1，聚A的长度为0)。
接着，图10是表示实施例9(3-5，2个聚A)和比较例5中蛋白质的表达量的三维图像。从图10可知，即使在第一区域之后连结2个A的情况下，与聚A为0个的比较例5相比，蛋白质的表达量增加。因此，聚A的长度可以适当调整为2以上。
从以上结果可知，在组合具有发夹结构的第一区域与聚A序列来制备翻译促进剂的情况下，聚A为2个以上即可，聚A序列的上限可以考虑模板核酸的设计效率等来适当选择。
工业应用性
本申请所公开的翻译促进剂可以增加使用无细胞蛋白质合成系统合成的蛋白质的合成量。因此，在制药行业、研究机构等需要无细胞蛋白质合成的产业中有用。
序列表
<110> 新蛋白质株式会社
<120> 翻译促进剂
<130> M19072PCT
<160> 42
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7启动子
<400> 1
cccgcgaaat taatacgact cactata 27
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 增强子
<400> 2
gggctcacct atctctctac acaaaacatt tccctacata caactttcaa cttcctatt 59
<210> 3
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSF3
<400> 3
atggctggac ctgccaccca gagccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg 60
cacagtgcac tctggacagt gcaggaagcc acccccctgg gccctgccag ctccctgccc 120
cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg 180
ctccaggaga agctggtgag tgagtgtgcc acctacaagc tgtgccaccc cgaggagctg 240
gtgctgctcg gacactctct gggcatcccc tgggctcccc tgagcagctg ccccagccag 300
gccctgcagc tggcaggctg cttgagccaa ctccatagcg gccttttcct ctaccagggg 360
ctcctgcagg ccctggaagg gatctccccc gagttgggtc ccaccttgga cacactgcag 420
ctggacgtcg ccgactttgc caccaccatc tggcagcaga tggaagaact gggaatggcc 480
cctgccctgc agcccaccca gggtgccatg ccggccttcg cctctgcttt ccagcgccgg 540
gcaggagggg tcctggttgc ctcccatctg cagagcttcc tggaggtgtc gtaccgcgtt 600
ctacgccacc ttgcccagcc c 621
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头_C
<400> 4
ggactccagc agggaggtac t 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 标记标签
<400> 5
gactacaagg atgacgatga caag 24
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 6
taaaaaaaaa aaagagctct tggatccggc cataagggcc tgatccttcg agggggggcc 60
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 7
tagaataagg ccatttttac cggaaaaaaa aaa 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 8
tagaataagg ccctttttcc cggaaaaaaa aaa 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 9
tagaataagt gctcgggctg gccaaaaaaa aaa 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 10
tagaataagt gctcgggctg gtcaaaaaaa aaa 33
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cacaaaacat ttccctacat acaactttca acttcctatt atggctggac ctgccacc 58
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
agtacctccc tgctggagac cgggctgggc aaggtggcg 39
<210> 13
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ccctcgaagg atcaggccct tatggccgga tccaagagct cttttttttt tttacttgtc 60
atcgtcatcc ttgtagtcag tacctccctg ctgg 94
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
ggccctcccg agcacttatt ctacttgtca tcgtcatcct tgtagtcagt acctccctgc 60
tgg 63
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ggccccccct cgaagg 16
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tttttttttt ccggtaaaaa tggccttatt ctacttgtca tcg 43
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tttttttttt ccgggaaaaa gggccttatt ctacttgtca tcg 43
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tttttttttt ggccagcccg agcacttatt ctacttgtca tcg 43
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
tttttttttt gaccagcccg agcacttatt ctacttgtca tcg 43
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
cccgcgaaat taatacgact cactataggg ctcacctatc tctctacaca aaacatttcc 60
<210> 21
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 21
tagaaaaaaa aaa 13
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 22
tagaataagt gctaaaaaaa aaa 23
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 23
tagaataaag taaatatagt gctcgggcgg gccaaaaaaa aaa 43
<210> 24
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 24
tagaataaag taaatataca cgagcccggt gctcgggcgg gccaaaaaaa aaa 53
<210> 25
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
tcatccttgt agtcagtacc tccctgctgg agaccgggct gggcaaggtg gcg 53
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
ctacttgtca tcgtcatcct tgtagtcagt acctccctgc tgg 43
<210> 27
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
agcacttatt ctacttgtca tcgtcatcct tgtagtcagt acctccctgc tgg 53
<210> 28
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
ggccctcccg agcactatat ttactttatt ctacttgtca tcgtcatcct tgtagtc 57
<210> 29
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ggccctcccg agcaccgggc tcgtgtatat ttactttatt ctacttgtca tcgtcatcct 60
tgtagtc 67
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tttttttttt ctacttgtca tcgtc 25
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
tttttttttt agcacttatt cta 23
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
tttttttttt ggcccgcccg agcac 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 33
tagaataagt gctcgggcgg gcc 23
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 34
tagaataagt gctcgggcgg gccaaaaaaa aaa 33
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 35
tagaataagt gctcgggcgg gccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 43
<210> 36
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 36
tagaataagt gctcgggcgg gccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaa 63
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工3'UTR
<400> 37
tagaataagt gctcgggcgg gccaa 25
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ggcccgcccg agcac 15
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
tttttttttt ggcccgcccg agcac 25
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
tttttttttt tttttttttt ggcccgcccg agcac 35
<210> 41
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ggcccgcccg agcac 55
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
ttggcccgcc cgagcac 17

Claims (9)

1.一种翻译促进剂，所述翻译促进剂是无细胞蛋白质合成系统中的翻译促进剂，其中，
所述翻译促进剂由作为3'非翻译区域的核酸构成，所述3'非翻译区域与对目标蛋白质的氨基酸序列进行编码的编码区域的3'末端相邻地连结，
所述3'非翻译区域由第一区域和第二区域构成，
所述第一区域与所述编码区域的3'末端相邻，并且由10～40个核酸序列构成；
所述第二区域与所述第一区域连结，并且由2～40个A连续的聚A序列构成，
所述第一区域具有发夹结构。
2.一种模板核酸，用于无细胞蛋白质合成系统，所述模板核酸包括：
启动子区域；
编码区域，对通过所述启动子区域能够操作地连结的目标蛋白质的氨基酸序列进行编码；以及
所述编码区域的3'非翻译区域，由权利要求1所述的翻译促进剂构成。
3.根据权利要求2所述的模板核酸，其中，
所述编码区域是将任意的蛋白质C末端包含蛋白质标签的融合蛋白质作为所述目标蛋白质而进行编码的区域。
4.根据权利要求2所述的模板核酸，其中，
所述编码区域是将任意的蛋白质N末端包含蛋白质标签的融合蛋白质作为所述目标蛋白质而进行编码的区域。
5.根据权利要求3所述的模板核酸，其中，
所述编码区域是将任意的蛋白质N末端包含蛋白质标签的融合蛋白作为所述目标蛋白质而进行编码的区域。
6.根据权利要求2至5中的任一项所述的模板核酸，其中，
所述模板核酸是转录模板DNA。
7.根据权利要求2至5中的任一项所述的模板核酸，其中，
所述模板核酸是翻译模板mRNA。
8.一种翻译模板的生产方法，用于无细胞蛋白质合成系统，所述生产方法包括以下工序：
在不存在细胞、且存在用于将转录模板DNA转录成mRNA的要素的情况下，使用权利要求2至6中的任一项所述的模板核酸来合成翻译模板mRNA。
9.一种蛋白质的生产方法，包括以下工序：
在不存在细胞、且存在用于将翻译模板mRNA翻译成蛋白质的要素的情况下，使用权利要求7所述的模板核酸来合成蛋白质。
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