JP2018113952A - タンパク質セット、タンパク質、遺伝子セット、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、及びボトリオコッセンの合成方法 - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】プレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする特定の塩基配列を有するDNAと、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするの特定の塩基配列を有するDNAとが、リンカーペプチドをコードするDNAによって連結された構造とされている遺伝子セット、遺伝子セットによってコードされるタンパク質セット、遺伝子セットを有する発現ベクター、遺伝子セットが導入された形質転換酵母、形質転換酵母を培養しボトリオコッセンを回収するボトリオコッセンの合成方法。
【選択図】図1
Description
〔1〕(a1)又は(b1)のいずれか一方に示すタンパク質と、(c1)に示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質セット。
(b1)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
(a2)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b2)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
(d2)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(e2)配列番号4に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。
(g1)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA。
(j1)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(g2)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA。
(h2)配列番号1に記載の塩基配列と配列同一性が81%以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(j2)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(l2)配列番号3に記載の塩基配列を有するDNA。
(m2)配列番号3に記載の塩基配列と配列同一性が79%以上の塩基配列を有し、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(o2)配列番号4に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
〔9〕遺伝子セットが導入された形質転換体。当該遺伝子セットは、前記(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAと、前記(k1)に示すDNAとが、リンカーペプチドをコードするDNAによって連結された構造とされている。
ここで、本明細書でいう「プレスクアレン二リン酸合成酵素」とは、ファルネシル二リン酸を基質として、プレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質である。また、本明細書でいう「ボトリオコッセン合成酵素」とは、プレスクアレン二リン酸を基質として、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質である。また、本明細書でいう「プレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子」とは、ファルネシル二リン酸を基質として、プレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、本明細書でいう「ボトリオコッセン合成酵素遺伝子」とは、プレスクアレン二リン酸を基質として、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
本開示のタンパク質セットは、下記(a1)又は下記(b1)のいずれか一方に示すタンパク質と、下記(c1)に示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有する。なお、(a1)及び(b1)に示すタンパク質は、本件発明者が見出した新規なプレスクアレン二リン酸合成酵素であり、発見した場所にちなんで、MH1SSL−1タンパク質と表記されることもある。
(b1)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
また、上記(c1)に示すタンパク質は、下記(d1)〜(f1)のいずれか1つに示すタンパク質であってもよい。つまり、本開示のタンパク質セットは、上記(a1)又は上記(b1)のいずれか一方に示すタンパク質と、下記(d1)〜(f1)のいずれか1つに示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するものであってもよい。
(e1)配列番号4に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。
なお、(d1)及び(e1)に示すタンパク質は、本件発明者が見出した新規なボトリオコッセン合成酵素であり、発見した場所にちなんで、MH1SSL−3タンパク質と表記されることもある。また、(f1)に示すタンパク質は、Botryocuccus braunii showa株(以下showa株ともいう)由来のボトリオコッセン合成酵素であり、SHSSL−3タンパク質と表記することもある。
本開示の遺伝子セットは、下記(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子と、下記(k1)に示すDNAからなる遺伝子と、を含む。なお、(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子は、本件発明者が見出した新規なプレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子であり、発見した場所にちなんで、MH1SSL−1遺伝子と表記されることもある。
(h1)配列番号1に記載の塩基配列と配列同一性が81%以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(j1)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
遺伝子セットは、上記MH1SSL−1遺伝子及び上記(k1)に示すDNAからなる遺伝子の組み合わせである。遺伝子セットは、例えば、上記MH1SSL−1遺伝子の塩基配列及び上記(k1)に示すDNAからなる遺伝子の塩基配列がそれぞれ異なるポリヌクレオチド鎖を形成して組み合わされていてもよい。また、遺伝子セットは、例えば、上記MH1SSL−1遺伝子の塩基配列及び上記(k1)に示すDNAからなる遺伝子の塩基配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成して組み合わされていてもよい。
また、上記(k1)に示すDNAからなる遺伝子は、下記(l1)〜(q1)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子であってもよい。つまり、本開示の遺伝子セットは、上記(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子と、下記(l1)〜(q1)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子と、を含んでいてもよい。
(m1)配列番号3に記載の塩基配列と配列同一性が79%以上の塩基配列を有し、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(o1)配列番号4に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(q1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
また、当業者が通常用いる方法を用いて、例えば、下記の実施例1に記載される方法により、MH1SSL−1遺伝子及びMH1SSL−3遺伝子を合成することができる。さらに、例えば、当業者が通常用いる方法を用いて、本明細書に記載の配列情報に基づいてプライマー等を調製し、MH1SSL−1遺伝子が存在する起源のcDNAを鋳型とするPCRによってもMH1SSL−1遺伝子を得ることができる。例えば、当業者が通常用いる方法を用いて、本明細書に記載の配列情報に基づいてプライマー等を調製し、MH1SSL−3遺伝子が存在する起源のcDNAを鋳型とするPCRによってもMH1SSL−3遺伝子を得ることができる。
本開示は、遺伝子セットを有する発現ベクターを提供する。本開示の発現ベクターに含まれる遺伝子セットは、上記(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAと、上記(k1)に示すDNAとが、リンカーペプチドをコードするDNAによって連結された構造である。また、本開示の発現ベクターに含まれる遺伝子セットは、上記(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAと、上記(l1)〜(q1)のいずれか1つに示すDNAとが、リンカーペプチドをコードするDNAによって連結された構造とされていてもよい。この場合の遺伝子セットとしては、例えば、配列番号5や配列番号25に記載の塩基配列からなるもの等が挙げられる。
[形質転換体]
本開示は、上記MH1SSL−1遺伝子及び上記(k1)に示すDNAからなる遺伝子が導入された形質転換体を提供する。
[ボトリオコッセンの合成方法]
本開示は、上記の形質転換体を培養する工程、及び培養された形質転換体からボトリオコッセンを回収する工程を含む、ボトリオコッセンの合成方法を提供する。
[実施例1:MH1SSL−1遺伝子及びMH1SSL−3遺伝子の抽出]
[野生株の培養と選抜]
天然の池の愛知県みよし市保田ヶ池より採取したボトリオコッカス・ブラウニー株をAF−6培地にて1か月培養した。容器内で水面上に浮いた細胞をピペットにて個別に採取し単離した。単離した藻体は1%CO2を通気し、蛍光灯照射下でAF−6培地にて培養し増殖させた。増えた藻体にヘキサンを添加し、オイル成分を抽出した。GC−MSにてオイルを定性分析し、ボトリオコッセンを産生する株をピックアップした。
期間:3週間
培地:AF−6培地
エアー:1%CO2通気
温度:25℃室温
光量:150μmol photons/m2/sec
[RNAの抽出]
回収した80mLの培養液を遠沈管2本に等分し、9000rpmで15分間遠心分離した後、上澄みを廃棄した。滅菌水15mLを各遠沈管に加え撹拌し、再度遠心分離した後、上澄みを廃棄した。細胞を含む沈殿物を凍結用チューブへ移し液体窒素で凍結させた後、−80℃で保管した。
シーケンスライブラリーの作製は、イルミナ社のマニュアルDirectional mRNA-Seq Sample Preparation Rev.Aを参考に、イルミナ社製のTruSeq Small RNA Sample Prep Kit及びTruSeq RNA Sample Preparation Kit v2を用いて行った。なお、以下に説明する実施形態においては、別に記載しない限り、以下の材料を用いた。アルカリホスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼはタカラバイオ社製のものを用い、T4 RNA ligase 2,truncatedはNEB社製のものを用いた。
作製したシーケンスライブラリーを用いて、シーケンスの鋳型となるクラスターを形成し、鋳型DNAの塩基配列を取得した。シーケンスデータの解析は付属のソフトウェアを使用しベースコールを行い、fastq形式ファイルとして出力した。これらの作業は表1に示すイルミナ社のマニュアルを参考に、表2に示すイルミナ社製の機器、試薬、及びソフトウェアを用いて行った。シーケンスデータの解析により、リード数102,018,468個、解析鎖長10,201,846,800bpの塩基配列情報を得た。
次に、株式会社CLCバイオジャパン社製のソフトウェアである「CLC Genomics Workbench 6.5.1」を用いて、フィルタリング及びDe novoアセンブリを行った。まず、fastq形式のファイルを読み込み、ペア配列に変換した後、低クオリティー部分の配列、N表示される塩基の配列、75塩基以下の配列を除去し、フィルタリングを行った。その後、ペアが壊れた配列、重複断片を除去し、De novoアセンブリにより、308bpの35,809種類のコンティグを作製した。De novoアセンブリの条件は以下である。
Ambiguous trim = Yes
Ambiguous limit = 0
Quality trim = Yes
Quality limit = 0.00035
Create report = Yes
Save discarded sequences = No
Remove 5’ terminal nucleotides = No
Maximum number of nucleotides in reads = 1,000
Minimum number of nucleotides in reads = 97
Discard short reads = Yes
Remove 3’ terminal nucleotides = No
Discard long reads = Yes
Save broken pairs = No
ここで、プレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子としてshowa株由来のSSL−1遺伝子(SHSSL−1遺伝子と称する)、ボトリオコッセン合成酵素遺伝子としてshowa株由来のSHSSL−3遺伝子が知られている。SHSSL−1遺伝子の配列は、NCBIデータベースにGenBank:HQ585058.1として登録され、SHSSL−3遺伝子の配列は、NCBIデータベースにGenBank:HQ585060.1として登録されている。
[発現ベクターの構築]
実施例1で得られたアミノ酸配列情報を基に、酵母での発現に最適化した塩基配列の合成を行い、MH1株由来のMH1SSL−1遺伝子及びMH1SSL−3遺伝子を合成した。以下、具体的に説明する。
発現ベクターpSP73-URA3-MH1SSL-1,3、pSP73-URA3-MH1SSL-1+SHSSL-3、及びpSP73-URA3-SHSSL-1, 3をそれぞれ大腸菌のコンピテントセルに導入することによって、大腸菌のコンピテントセルを形質転換した。コンピテントセルは、ニッポンジーン社製のECOM(商標)Competent E.coli DH5αを用いた。具体的な手順は、以下の通りである。
調製した酵母導入用発現ベクターを用いて、MH1SSL−1,3、MH1SSL−1+SHSSL−3、及びSHSSL−1,3をそれぞれ導入した形質転換酵母を得た。以下、具体的に説明する。
予め調製しておいたコンピテントセル50μLに、断片化した各コンストラクトを50μg加え、PEGバッファーで希釈した。これを45分間加温することで、各コンストラクトを遺伝子座HXTへ導入し、形質転換した。形質転換した後の各形質転換酵母を洗浄後、滅菌水に懸濁して、下記成分のウラシル選抜培地(SD−Ura)に塗布した。
ウラシル選抜培地成分:2% agar、2% glucose、0.67% Yeast Nitrogen Base without amino acids(YNB)(Difco Laboratories社製、デトロイト、ミシガン州)、0.082% Complete Supplement Mixture(CSM)-URA(ForMedium社製、ノーフォーク、イギリス)、adenine(40mg/L)
30℃で1昼夜静止培養して形質転換酵母のコロニーを得た。得られたコロニーをそれぞれの選択培地で培養し、生育能を安定に保持している株を選択して、コロニーPCRを行い、目的遺伝子の導入を確認した。使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。なお、MH1SSL−1,3のPCR確認バンドの長さは2600bpであり、MH1SSL−1+SHSSL−3のPCR確認バンドの長さは2095bpであり、SHSSL−1,3のPCR確認バンドの長さは2020bpである。
フォワードプライマー:ATGTCCATGCACCAAGACCACGGTGTAG(配列番号13)
リバースプライマー:TCTTGGGGATGGTCTGGAAGGGA(配列番号14)
MH1SSL−1+SHSSL−3のプライマー
フォワードプライマー:ATGTCCATGCACCAAGACCACGGTGTAG(配列番号13)
リバースプライマー:TGAAGACACCTTCGTCCCAA(配列番号16)
SHSSL−1,3のプライマー
フォワードプライマー:TTAGCCGCCACTACATACGG(配列番号15)
リバースプライマー:TGAAGACACCTTCGTCCCAA(配列番号16)
[実施例3:オイル生産能力の比較]
MH1SSL−1,3、MH1SSL−1+SHSSL−3、及びSHSSL−1,3をそれぞれ導入した形質転換酵母をそれぞれD317株、D318株、及びD320株と命名した。以下の方法により、D317株、D318株、及びD320株の酵母それぞれを培養し、酵母培養液から抽出したオイルをGC−MSにて定性分析を行った。試験数3にて実施した。以下、具体的に説明する。
下記組成の固体培地のプレート上にて各株を生育させ、コロニーをひとかき取り、下記組成の液体培地の入った試験管に移した。試験管を振とう培養器にセットし、48時間培養を行った。固体培地及び液体培地の作成方法、振とう培養器による培養条件は以下の通りである。
(1)Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/L
(2)CSM-Trp 0.74g/L
(3)Adenine 20mg/L
(4)D-glucose 20 g/L
《作成方法》
(1)、(2)及び(3)を混合し、pH6に調整し、試料Aとした。(4)を調製し、試料Bとした。固体培地の作製時には、(4)にAgarが20g/Lとなるように添加して調製し、試料Bとした。試料A及び試料Bをオートクレーブにて滅菌した後、混合し、液体培地を作製した。固体培地の作製時には、当該混合液をプレートに撒いて固め、固体培地を作製した。
培養時間 48時間
容量 3mL
容器 シリコ栓付きガラス試験管
振とう条件 150rpm
温度 30℃
[本培養]
分光光度計を用いて、前培養で増殖した菌体のOD600を測定し、1000mLに希釈されたときにOD600が0.1となるように前培養液からの採取量を決定した。予め下記組成の培地の入ったフラスコに前培養で得た菌体を計算した採取量を加え、振とう培養器にセットし培養を開始した。培養条件は以下の通りである。
YPDA Broth(Clontech社製) 1パウチ/0.5L蒸留水
アデニン 40mg/L
《作成方法》
YPDA Brothを1パウチ開封し、0.5L蒸留水に溶かした。溶解したYPDA Brothに終濃度40mg/Lになるようにアデニンを加え、オートクレーブで加熱殺菌した。
培養時間 48時間
容量 100mL
容器 シリコ栓付きフラスコ
振とう条件 150rpm
温度 30℃
[菌体の回収]
本培養した培養液を50mL遠沈管に分注し、トミー精工社製の遠心分離機を用いて4600Gで5分間遠心分離し、菌体と培地を分離し、培地を除いた。菌体を15mLの滅菌水に懸濁し、再度同条件で遠心分離し、菌体のみの状態にした後、−80℃の冷凍庫で凍結させた。凍結乾燥機を用い、チューブ内の菌体を12時間乾燥させた。
乾燥した菌体をスパーテルで取り出し、菌体の重量を測定した。
[菌体からのオイル抽出]
乾燥菌体を一定量かきとり、50mL遠沈管に移し、ヘキサン及びグラスビーズを加えた後、密栓した。その後、安井器機株式会社製のマルチビーズショッカーに遠沈管をセットし破砕した。破砕条件は以下の通りである。
乾燥菌体 1g
ヘキサン 10mL/g菌体
グラスビーズ:YGB05 0.5mm(安井器機株式会社製) 菌体と等量(vol.)
2500rpm、60sec/60sec(ON/OFF)、30サイクル
粉砕後に遠沈管を取り出し、4600Gで5分間遠心分離し、菌体と溶媒を分離し、溶媒画分をガラスピペットによりガラス瓶に取り分けた。遠沈管に新たにヘキサン10mLを加え、ボルテックスで混合した後、再度同条件で遠心分離した。溶媒画分を先ほど分注したガラス瓶に移した。同様にヘキサンを遠沈管に加え、遠心分離し分注する作業を更に1回繰り返した。ガラス瓶に分注された溶媒画分を新たな遠沈管に移し、4600Gで10分間遠心分離し、分注時に混入した不溶画分を除き、溶媒画分のみをエバポレータにて濃縮した。乾固したサンプルの重量を測定し、オイル回収量とした。乾固したオイルを終濃度1mg/10mLとなるようにヘキサンで希釈し、GCーMS分析用のサンプルとした。
サンプルをヘキサンに溶解させて、非特許文献1と同様の方法でGCーMS分析を行った。
形質転換酵母におけるオイル生産能力を比較した結果を図7に示す。有意差検定にはまずD317株、D318株、及びD320株の三群間の有意差を測定するためにKruskal Wallis検定を用い、P<0.05(帰無仮説が5%未満)のものを有意差ありと判断した。次にD317株とD320株、又はD318株とD320株の二群間の有意差検定を行うためMann-WhitneyのU検定を用い、P<0.05(帰無仮説が5%未満)のものを有意差ありと判断した。有意差検定の結果、Kruskal Wallis検定ではP=0.03899で有意差ありと判断した。Mann-WhitneyのU検定ではどちらの二群間でもP=0.04935で有意差ありと判断し、図中に記載した。
[発明の効果]
MH1SSL−1及びMH1SSL−3のタンパク質を利用することにより、ボトリオコッセンの生産量を増加し、さらにボトリオコッセンの純度を高めることができた。
Claims (15)
- 下記(a1)又は下記(b1)のいずれか一方に示すタンパク質と、下記(c1)に示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質セット。
(a1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b1)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。
(c1)ドメイン1〜5のアミノ酸配列を有し、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質であり、
前記ドメイン1のアミノ酸配列は、配列番号19に記載の配列又は配列番号19に記載の配列と99%以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン2のアミノ酸配列は、配列番号20に記載の配列又は配列番号20に記載の配列と94%以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン3のアミノ酸配列は、配列番号21に記載の配列又は配列番号21に記載の配列と94%以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン4のアミノ酸配列は、配列番号22に記載の配列又は配列番号22に記載の配列と93%以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン5のアミノ酸配列は、配列番号23に記載の配列又は配列番号23に記載の配列と92%以上の配列同一性をもつ。 - 請求項1に記載のタンパク質セットであって、
前記(a1)又は前記(b1)のいずれか一方に示すタンパク質と、下記(d1)〜(f1)のいずれか1つに示すタンパク質とを含み、ファルネシル二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質セット。
(d1)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(e1)配列番号4に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。
(f1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質セットであって、
前記(a1)又は前記(b1)のいずれか一方に示すタンパク質と、前記(c1)に示すタンパク質とが、リンカーペプチドによって連結された構造とされているタンパク質セット。 - 下記(a2)又は下記(b2)のいずれか一方に示すタンパク質。
(a2)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b2)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質。 - 下記(d2)又は下記(e2)のいずれか一方に示すタンパク質。
(d2)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(e2)配列番号4に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質。 - 下記(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子と、下記(k1)に示すDNAからなる遺伝子と、を含む遺伝子セット。
(g1)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA。
(h1)配列番号1に記載の塩基配列と配列同一性が81%以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(i1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(j1)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(k1)ドメイン1〜5のアミノ酸配列を有し、ボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNAであり、
前記ドメイン1のアミノ酸配列は、配列番号19に記載の配列又は配列番号19に記載の配列と99%以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン2のアミノ酸配列は、配列番号20に記載の配列又は配列番号20に記載の配列と94%以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン3のアミノ酸配列は、配列番号21に記載の配列又は配列番号21に記載の配列と94%以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン4のアミノ酸配列は、配列番号22に記載の配列又は配列番号22に記載の配列と93%以上の配列同一性をもち、
前記ドメイン5のアミノ酸配列は、配列番号23に記載の配列又は配列番号23に記載の配列と92%以上の配列同一性をもつ。 - 請求項6に記載の遺伝子セットであって、
前記(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子と、下記(l1)〜(q1)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子と、を含む遺伝子セット。
(l1)配列番号3に記載の塩基配列を有するDNA。
(m1)配列番号3に記載の塩基配列と配列同一性が79%以上の塩基配列を有し、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(n1)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(o1)配列番号4に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(p1)配列番号9に記載の塩基配列を有するDNA。
(q1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。 - 請求項6に記載の遺伝子セットであって、
前記(g1)〜(j1)のいずれか1つに示すDNAと、前記(k1)に示すDNAとが、リンカーペプチドをコードするDNAによって連結された構造とされている遺伝子セット。 - 下記(g2)〜(j2)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子。
(g2)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA。
(h2)配列番号1に記載の塩基配列と配列同一性が81%以上の塩基配列を有し、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(i2)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(j2)配列番号2に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 下記(l2)〜(o2)のいずれか1つに示すDNAからなる遺伝子。
(l2)配列番号3に記載の塩基配列を有するDNA。
(m2)配列番号3に記載の塩基配列と配列同一性が79%以上の塩基配列を有し、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(n2)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(o2)配列番号4に記載のアミノ酸配列と配列同一性が87%以上のアミノ酸配列からなり、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項8に記載の遺伝子セットを有する発現ベクター。
- 請求項9及び請求項10に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
- 請求項8に記載の遺伝子セットが導入された形質転換体。
- 請求項12又は請求項13に記載の形質転換体を培養する工程、及び
培養された前記形質転換体からボトリオコッセンを回収する工程を含む、ボトリオコッセンの合成方法。 - 請求項14に記載のボトリオコッセンの合成方法であって、
請求項12に記載の形質転換体を培養する工程、及び
培養された前記形質転換体からボトリオコッセンを回収する工程を含み、
回収されたボトリオコッセンの純度が82%以上である、ボトリオコッセンの合成方法。
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