JP6440820B2 - 無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤及びその利用 - Google Patents

無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤及びその利用 Download PDF

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Description

本明細書は、無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤及びその利用に関する。本出願は、２０１５年３月９日に出願された日本国特許出願である特願２０１５−０４６４７０の関連出願であり、この日本出願に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容を援用するものである。
タンパク質を無細胞で合成する合成系は、タンパク質合成に関わる細胞内要素を含む媒体を準備して、鋳型ＤＮＡの転写から翻訳まで無細胞で行う、タンパク質合成系である。こうした無細胞タンパク質合成系は種々知られている。かかる合成系として、転写鋳型である鋳型ＤＮＡを媒体に適用して最終産物であるタンパク質を合成する系と、翻訳鋳型であるｍＲＮＡを媒体に適用してタンパク質を合成する系とがある。
これらいずれの系においても、最初の原料として転写鋳型ＤＮＡを合成する必要がある。転写鋳型ＤＮＡの合成は、通常、まず、合成しようとするタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングし、クローニングしたｃＤＮＡをプラスミドに組み込んで、プロモーター、コード領域、ターミネーター等を含む発現のためのDNA領域を構築する。その後、プラスミドからかかるDNA領域を切り出すか、あるいはプラスミドに対して直接ＰＣＲを実施して、鋳型ＤＮＡとする。
鋳型ＤＮＡの構造は、無細胞タンパク質合成系における発現効率について影響を及ぼすと考えられ、発現カセットを構築するベクターについて種々の試みがなされている。例えば、５’非翻訳領域に特定の翻訳促進配列を導入することが報告されている（特許文献１、２）。また、３’非翻訳領域を長くすることで翻訳鋳型であるｍＲＮＡが長寿命化したり、翻訳効率が向上することも記載されている（特許文献３、段落J００４９）。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、１０００塩基以上であることが好ましいことも報告されている（特許文献４、５）。
また、酵母抽出物を用いた無細胞タンパク質合成系についても３’−ＵＴＲの利用について言及されている（非特許文献１）。
特開２００９−７２２０７号公報 特開２０１３−１５８３４２号公報 特開２００７−９７４３８号公報 特開２００８−３５７０１号公報 特開２００５−２４７８５７号公報
Biotechonology Journal, 2014, 9,641-651
しかしながら、上記特許文献４、５等で推奨される長い３’ＵＴＲを翻訳鋳型であるｍＲＮＡに付与するためには、対応する長さの転写鋳型ＤＮＡを合成する必要があるし、こうした鋳型ＤＮＡからｍＲＮＡを合成する必要がある。いずれにしても、翻訳鋳型であるｍＲＮＡを合成するまでのプロセスにおいて効率的ではない。
また、無細胞合成系の鋳型核酸に長い３’ＵＴＲを備えることで、ライブラリ等からクローニングした所望のタンパク質のＣ末端やＮ末端にプロテインタグを付与した融合タンパク質を合成するのに不都合があった。すなわち、プライマーを用いた核酸増幅反応では、所望のタンパク質の３’末端直下にタグを備え、さらにその３’末端に長い３’ＵＴＲを備える増幅断片を合成するようなプライマーは設計できないからである。したがって、かかる融合タンパク質をコードするＤＮＡを化学合成して準備するか、ライゲーションによって融合タンパク質をコードするＤＮＡを準備するしかなかった。
非特許文献１には、酵母由来の無細胞タンパク質合成系では、３’ＵＴＲの長さについては影響がないとされている。
本明細書は、無細胞タンパク質合成系における翻訳鋳型ｍＲＮＡを効率的に取得し、ひいては優れた翻訳効率を実現できる翻訳促進剤を提供する。また、本明細書は、当該翻訳促進剤の利用を提供する。さらに、本明細書は、ｍＲＮＡを安定化できる点に着目した利用についても提供する。
本発明者らは、無細胞タンパク質合成系の転写鋳型の作製に関し種々検討した。その結果、意外にも、従来要していた長い３’ＵＴＲを用いることなく短い３’ＵＴＲで転写鋳型ＤＮＡを核酸増幅反応により取得でき、この転写鋳型ＤＮＡを無細胞タンパク質合成系に適用することでｍＲＮＡ及びタンパク質を効率的に取得できるという知見を得た。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
（１）無細胞タンパク質合成系における翻訳促進剤であって、
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の３’末端に隣接して連結される３’非翻訳領域としての２００塩基長以下の核酸からなる、翻訳促進剤。
（２）前記３’非翻訳領域は、１００塩基長以下である、（１）に記載の翻訳促進剤。
（３）前記３’非翻訳領域は、８０塩基長以下である、（２）に記載の翻訳促進剤。
（４）前記３’非翻訳領域は、６０塩基長以下である、（３）に記載の翻訳促進剤。
（５）前記３’非翻訳領域は、４０塩基長以下である、（４）に記載の翻訳促進剤。
（６）前記３’非翻訳領域は、２個以上のＡが連続するポリＡ配列を有する、（１）〜（５）のいずれかに記載の翻訳促進剤。
（７）前記３’非翻訳領域は、５個以上４０個以下のＡが連続する前記ポリＡ配列を有する、（６）に記載の翻訳促進剤。
（８）前記３’非翻訳領域は、５個以上２０個以下のＡ（アデニン）が連続する前記ポリＡ配列を有し、全長が１０塩基長以上５０塩基長以下、好ましくは、１０塩基長以上４０塩基長以下である、（６）又は（７）に記載の翻訳促進剤。、好ましくは、１０塩基長
（９）前記３’非翻訳領域は、配列番号６又は２６で表される塩基配列又は当該塩基配列において１個以上５個以下の塩基を置換、付加、挿入又は欠失した塩基配列若しくは配列番号６又は２６で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列であって、３’非翻訳領域活性を有する塩基配列を有する、（１）〜（８）のいずれかに記載の翻訳促進剤。
（１０）前記所望のタンパク質は、任意のタンパク質のＣ末端にプロテインタグを備える融合タンパク質である、（１）〜（９）のいずれかに記載の翻訳促進剤。
（１１）前記所望のタンパク質は、任意のタンパク質のＮ末端にプロテインタグを備える融合タンパク質である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の翻訳促進剤。
（１２）コムギ胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の翻訳促進剤。
（１３）無細胞タンパク質合成系に用いる発現ベクターであって、
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の挿入サイトの３’側に、２００塩基長以下の３’非翻訳領域を保持する、ベクター。
（１４）前記３’非翻訳領域は、その５’側にプロテインタグをコードする領域を保持する、（１３）に記載のベクター。
（１５）無細胞タンパク質合成系に用いる鋳型核酸であって、
プロモーター領域と、
前記プロモーター領域によって作動可能に連結される所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域と、
（１）〜（１２）のいずれかに記載の翻訳促進剤からなる、前記コード領域の３’非翻訳領域と、
を備える、鋳型核酸。
（１６）前記コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のＣ末端にプロテインタグを備える融合タンパク質をコードする領域である、（１５）に記載の鋳型核酸。
（１７）前記コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のＮ末端にプロテインタグを備える融合タンパク質をコードする領域である、（１５）又は（１６）に記載の鋳型核酸。
（１８）前記鋳型核酸は、転写鋳型ＤＮＡである、（１５）〜（１７）のいずれかに記載の鋳型核酸。
（１９）前記鋳型核酸は、翻訳鋳型ｍＲＮＡである、（１５）〜（１７）のいずれかに記載の鋳型核酸。
（２０）無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型DNAを合成するためのDNAポリメラーゼ増幅に用いるプライマーセットであって、
１又は２以上のフォワードプライマーと、
１又は２以上のリバースプライマーと、
を備え、
前記１又は２以上のリバースプライマーは、（１）〜（１２）のいずれかに記載の翻訳促進剤又はその一部を備える、プライマーセット。
（２１）前記１又は２以上のリバースプライマーは、さらに、前記翻訳促進剤の３’末端側に隣接してＣ末端プロテインタグコード領域を備える、（２０）に記載のプライマーセット。
（２２）前記１又は２以上のフォワードプライマーは、Ｎ末端プロテインタグコード領域を有する、（２０）又は（２１）に記載のプライマーセット。
（２３）（２０）〜（２２）のいずれかに記載のプライマーセットと、
無細胞タンパク質合成用媒体と、
を備える、無細胞タンパク質合成キット。
（２４）前記無細胞タンパク質合成用媒体は、小麦胚芽由来である、（２３）に記載のキット。
（２５）無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型ＤＮＡの生産方法であって、
（２０）〜（２２）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、所望のタンパク質のコード領域を含むＤＮＡに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型ＤＮＡを合成する工程、
を備える、方法。
（２６）無細胞タンパク質合成系のための翻訳鋳型の生産方法であって、
細胞の不存在下であってかつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で（１５）〜（１８）のいずれかに記載の鋳型核酸を用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、
を備える、方法。
（２７）タンパク質の生産方法であって、
細胞の不存在下であってかつ翻訳鋳型ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するための要素の存在下で（１９）に記載の鋳型核酸を用いてタンパク質を合成する工程、
を備える、生産方法。
（２８）転写鋳型ＤＮＡのアレイであって、
複数のタンパク質に対応する（１５）〜（１８）のいずれかに記載の複数の鋳型核酸を転写鋳型ＤＮＡとして保持する、アレイ。
（２９）ＲＮＡ安定化剤であって、
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の３’末端に隣接して連結される３’非翻訳領域としての２００塩基長以下の核酸からなる、ＲＮＡ安定化剤。
本開示における鋳型核酸の概要をその一例を提示して説明する図である。 本開示の転写鋳型ＤＮＡ（Ｎ末端プロテインタグを有するタンパク質の合成用である）プライマーセットの一例を示す図である。 本開示の転写鋳型ＤＮＡ（Ｃ末端プロテインタグを有するタンパク質の合成用である）を取得するためのプライマーセットの一例を示す図である。 各種長さの３’ＵＴＲを備える転写鋳型ＤＮＡを示す図である。 図４に示すプライマーセットによって得られる第１回目のＰＣＲ産物及び第２回目のＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。 図４に示す各種転写鋳型ＤＮＡを用いて得られる翻訳鋳型ｍＲＮＡ及びタンパク質のアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。 ３’ＵＴＲの検討の概要を示す図である。 所定のタンパク質にＮ末端プロテインタグを付与した融合タンパク質を得るための転写鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを示す図である。 図８に示すプライマーセットによって得られる転写鋳型ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。 翻訳鋳型ｍＲＮＡのアガロースゲル電気泳動結果及び融合タンパク質のゲル電気泳動結果を示す図である。 所定のタンパク質にＣ末端プロテインタグを付与した融合タンパク質を得るための転写鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを示す図である。 図１１に示す転写鋳型ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。 翻訳鋳型ｍＲＮＡ及び融合タンパク質のゲル電気泳動結果を示す図である。 トランケーションによる断片化物を得るための転写鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを示す図である。 図１４に示すプライマーセットによって得られる転写鋳型ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。 図１４に示す各種転写ＤＮＡによって得られる翻訳鋳型ｍＲＮＡと断片化物のアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。 Ａが５、１０、２０、３０及び４０個連続する３’ＵＴＲを備える鋳型ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成の結果を示す図である。 合成したタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す図である。
本明細書の開示は、無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤、鋳型核酸、プライマーセット、転写鋳型ＤＮＡの生産方法、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法、タンパク質の生産方法及び転写鋳型ＤＮＡアレイ等に関する。
本明細書に開示される上記翻訳促進剤は、無細胞タンパク質合成系における翻訳鋳型ｍＲＮＡのコード領域の３’ＵＴＲ（なお、転写鋳型ＤＮＡにおいても３’ＵＴＲという。）によれば、２００塩基長以下であっても翻訳鋳型ｍＲＮＡにおいて３’ＵＴＲとして機能し、効率的なタンパク質への翻訳に寄与することができる。
また、３’ＵＴＲが２００塩基以下で構成されるため、転写鋳型ＤＮＡの長さを短縮化することができ、核酸増幅反応によって効率的に転写鋳型DNAを取得できるようになる。
さらに、３’ＵＴＲが２００塩基長以下であるために、任意のタンパク質のＣ末端にプロテインタグを備える融合タンパク質を合成するための転写鋳型ＤＮＡを簡易に取得できるようになる。すなわち、こうした短い３’ＵＴＲであるために、３’ＵＴＲの一部又は全部をタグ領域やハイブリダイズ領域として備えるリバースプライマーを設計できるようになる。こうしたリバースプライマーを用いた核酸増幅反応を実施することで、簡易にＣ末端にプロテインタグを備える所望のタンパク質をコードする転写鋳型ＤＮＡが得られるようになる。
本開示の他の形態である、無細胞タンパク質合成系に用いる鋳型核酸及びプライマーセット、かかる転写鋳型ＤＮＡの生産方法、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法，無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の生産方法及び転写鋳型ＤＮＡアレイは、かかる塩基長の３'ＵＴＲを翻訳促進剤として用いることで、効率的にかつ簡易に所望のタンパク質を合成でき、当該タンパク質を種々の用途に供することができるようになっている。
なお、本明細書において「無細胞タンパク質合成系」とは、細胞の不存在下で、細胞に由来する少なくともｍＲＮＡからタンパク質への翻訳工程を実現する要素組成物によって構成される翻訳系（いわゆるツーステップ法）をいう。また、「無細胞タンパク質合成系」とは、かかる翻訳系及び細胞の不存在下で上記翻訳工程に先立つＤＮＡからｍＲＮＡへの転写工程を実現する要素組成物って構成される転写系との双方を備える系（いわゆるワンステップ法）をいう。
無細胞タンパク質合成系は、当業者において周知である。当業者は、大腸菌などの原核生物、コムギ、ウサギ、昆虫等の様々な真核生物に由来する無細胞タンパク質合成系を商業的に入手可能であるほか、当業者であれば適宜調製することができる。本無細胞タンパク質合成系としては、大腸菌由来、コムギ胚芽由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫培養細胞由来等の各種の合成系が挙げられる。また、無細胞合成系は、転写系及び翻訳系の要素を個々に組み合わせた人工的な合成系も構築可能であり、商業的に入手可能となっている。本開示の各種形態が適用される無細胞タンパク質合成系は、好ましくは、真核生物由来であり、より好ましくはコムギ胚芽由来である。
以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本発明の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤及びその利用を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
以下、本開示の各種形態を、適宜図面を参照しながら説明する。図１は、本開示の翻訳促進剤を含む、転写鋳型ＤＮＡ及び翻訳鋳型ｍＲＮＡの一例を示し、図２は、合成しようとする所望のタンパク質が、任意のタンパク質のＣ末端にプロテインタグを備える場合に、核酸増幅反応に用いるプライマーセットの一例を示す図である。
（翻訳促進剤）
本開示の翻訳促進剤（以下、本促進剤ともいう。）は、無細胞タンパク質合成系（以下、単に合成系ともいう。）に用いる剤である。図１に示すように、本促進剤は、合成系において、所定の塩基配列からなる核酸を、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の３’末端に隣接して連結される３’ＵＴＲとして用いる。
本促進剤は、合成しようとする所望のタンパク質は、任意のタンパク質が、任意のタンパク質のＣ末端にプロテインタグなどの任意のタンパク質とは異種のペプチドを備える融合タンパク質であることが好ましい。こうしたタンパク質は、従来、合成系に適用するにはクローニング等を伴い非常に煩雑な操作が必要であり、ハイスループットな合成が困難であったからである。また、同様に、本促進剤は、合成しようとする所望のタンパク質が、任意のタンパク質のＣ末端にプロテインタグなどの異種ペプチドを備える融合タンパク質であることが好ましい。
任意のタンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端に備えることができるプロテインタグの異種ペプチドは、特に限定するものではないが、こうしたプロテインタグとしては、例示であって限定するものではないが、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＢＣＣＰタグが挙げられる。また、視覚的に検出可能なものとしては、例えば、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、ＢＦＰ(Blue Fluorescent Protein)、ＣＦＰ(Cyan Fluorescent Protein)、ＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)、ＹＦＰ(Yellow Fluorescent Protein)、ＥＧＦＰ(Enhanced Green Fluorescent Protein)、ＥＣＦＰ(Enhanced Cyan Fluorescent Protein)、ＥＲＦＰ(Enhanced Red Fluorescent Protein)、ＥＹＦＰ(Enhanced Yellow Fluorescent Protein)、ＴＭＲ（TetraMethyl−Rhodamine）、ルシフェラーゼ等があるが特に限定されない。
なお、プロテインタグは、任意のタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に対して直接又は適当なリンカーを介して連結されるようになっている。
本促進剤は、２００塩基長以下である核酸からなることが好ましい。このような本促進剤の塩基長は、従来の３’ＵＴＲの塩基長に比較すると、約１／５〜１／１５であり、著しく短縮化されている。従来、合成系において翻訳鋳型の安定性向上及び翻訳効率の向上の観点から、より長い３’ＵＴＲが有効であるとされており、概して３’ＵＴＲの長さは、概して５００塩基長以上、典型的には１０００塩基長以上３０００塩基長以下とされてきている。これに対して、本促進剤は、２００塩基長以下という極めて短い塩基長を、その塩基配列にかかわらず３’ＵＴＲとして用いることで、意外にも効率的に合成系においてタンパク質を合成できること、及び、こうした短い３’ＵＴＲによって、従来にない形態でプロテインタグを備える融合タンパク質のための転写鋳型や翻訳鋳型を簡易に取得でき、結果として、こうした融合タンパク質を簡易に合成できる。
本促進剤は、合成系の転写鋳型ＤＮＡに適用される場合には、このＤＮＡの３’末端側においてＤＮＡ二本鎖として備えられる。また、本促進剤が、合成系の翻訳鋳型ｍＲＮＡに適用される場合には、このｍＲＮＡの３’末端側において一本鎖ＲＮＡとして備えられる。
図１に示すように、所定の塩基配列からなる核酸を３’ＵＴＲとして用いるとは、無細胞タンパク質合成系における転写鋳型ＤＮＡ又は翻訳鋳型ｍＲＮＡにおいてアミノ酸配列をコードする領域の終止コドンに直接若しくは適当な介在配列を介して間接的に結合した状態で用いることを意味している。終止コドンに対して間接的に結合される場合、介在配列は特に限定するものではないが、２００塩基長以下の３’ＵＴＲという本促進剤の長さを考慮すると、５０塩基長以下であることが好ましく、より好ましくは３０塩基長以下であり、さらに好ましくは２０塩基長以下であり、一層好ましくは１０塩基長以下であり、より一層好ましくは５塩基長以下である。さらに一層好ましくは２塩基長以下である。
本促進剤は、一定の翻訳効率を維持できる範囲において２００塩基長より短いことが好ましい。より好ましくは１５０塩基長以下であり、さらに好ましくは１００塩基長以下であり、一層好ましくは８０塩基長以下であり、より一層好ましくは６０塩基長以下である。さらに一層好ましくは４０塩基長以下である。最も好ましくは３０塩基長又は２０塩基長以下である。
また、本促進剤の塩基長は、合成しようとする所望のタンパク質をコードする領域を含む転写鋳型ＤＮＡをＰＣＲなどの核酸増幅反応によって取得することを考慮すると、プライマー設計上の観点から、より短いことが好ましい。当該観点を考慮した場合、本促進剤の塩基長が１００塩基長又は８０塩基長以下であると、本促進剤を転写鋳型ＤＮＡのコード領域の３’末端に付加するには、２又は３種類程度のリバースプライマーで足りる。さらに、本促進剤の塩基長が６０塩基長又は４０塩基長以下であると、同コード領域の３’末端に付加するには、１又は２種類程度のリバースプライマーで足りる。さらにまた、本促進剤の塩基長が３０塩基長以下又は２０塩基長以下であると、同様に、１種類程度のリバースプライマーで足りる。
また、本促進剤の塩基長は、１５塩基長以下であってもよく、さらに、１０塩基長以下であってもよい。
本促進剤の塩基長の下限は特に限定するものではないが、５塩基長以上であることが好ましい。５塩基長未満であると意図するコード領域が翻訳されない可能性があるからである。より好ましくは１０塩基長以上である。
本促進剤の好ましい態様は、配列番号１で表される塩基配列（１２００塩基）の５’末端の１番目の塩基から所定の塩基長に対応する塩基までの塩基配列が例示できる。本促進剤は、好ましくは配列番号１で表される塩基配列の５’末端からの５塩基長４００塩基長以下、より好ましくは同２００塩基長以下の塩基配列を３’ＵＴＲとして用いることが好ましい。さらに好ましくは、同１００塩基長以下であり、なお好ましくは、同８０塩基長以下であり、一層好ましくは、同６０塩基長以下であり、より一層好ましくは同４０塩基長以下である。こうした各態様の３’ＵＴＲは、配列番号１で表される塩基配列の５’側から所定の塩基長長さの塩基配列で表されるヌクレオチドのみからなることがより好ましい。
本促進剤は、また、配列番号１で表される塩基配列の５’末端からの４０塩基長の塩基配列（配列番号６）において１個以上数個以下の塩基を置換、付加、挿入又は欠失した塩基配列であって、３’ＵＴＲ活性を有する核酸を用いることができる。例えば、配列番号１で表される塩基配列において、５’側において連続するＡは、８個以上であることが好ましいが、２０個以下であってもよい。好ましくは１０個以上１６個以下である。
また、配列番号６で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列であって、３’ＵＴＲ活性を有する核酸を用いることもできる。配列番号６で表される塩基配列に対する同一性は、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９６％以上であり、一層好ましくは９７％以上であり、より一層好ましくは９８％以上であり、さらに一層好ましくは９９％以上である。
配列番号６で表される塩基配列は、ステム−ループ構造を取り得る塩基配列を有する。したがって、この塩基配列から派生する塩基配列もこうした特徴を維持することが好ましい。
配列番号６で表される塩基配列又はこの塩基配列から上記のように派生する塩基配列を備える核酸を３’ＵＴＲとして用いる場合には、当該塩基配列の領域は、３’ＵＴＲの５’末端として又は可能な限りその５’末端に近接して備えるようにすることが好ましい。また、配列番号６で表される塩基配列又はその派生配列を備えている限り、その３末端側における塩基配列は特に限定しないで種々の態様を採ることができる。
本促進剤は、少なくとも２個以上のＡ（アデニン）が連続するポリＡ配列を有することができる。かかるポリＡ配列において連続するＡの数は、特に限定するものではないが、好ましくはＡが３個以上連続し、さらに好ましくはＡが５個以上連続する。好ましくは、Ａが１０個以上連続し、より好ましくは１５個以上連続し、さらに好ましくは２０個以上連続する。上限は、例えば、Ａが４０個以下連続することが好ましく、より好ましくは３０個以下連続する。さらに例えば、ポリＡ配列は、５個以上３０個以下のＡが連続していてもよい、また、５個以上２０個以下のＡが連続していてもよく、さらに、１０個以上３０個以下のＡが連続していてもよく、さらにまた１０個以上２０個以下のＡが連続していてもよい。
本促進剤は、複数のポリＡ配列を有していてもよい。このとき、複数のポリＡ配列は、Ａ以外のＧ、Ｔ及びＣの１又は数個を介在させた状態で備えることができる。介在される塩基（ヌクレオチド）は、好ましくは５個以下であり、より好ましくは３個以下であり、さらに好ましくは２個以下であり、なお好ましくは１個である。こうした介在塩基又は配列を有して隣接される複数のポリＡ配列は、全体として、ポリＡモチーフということができる。
本促進剤は、ポリＡ配列を、そのポリヌクレオチドにおいて、例えば、ある態様においては、本促進剤の５’末端又は５’末端側に備えることができる。また、ある態様においては、５’末端及び３’末端の中間部に備えることができる。さらにまた、ある態様では、３’末端又は３’末端側に備えることができる。例えば、転写鋳型ＤＮＡのコード領域に３’ＵＴＲとして本促進剤を付加するときには、ポリＡ配列は、終止コドンの直後、終止コドンのすぐ３’末端に備えられうるが、このとき、本促進剤のポリヌクレオチドにおいてポリＡ配列は５’末端側に備えられることになる。
本促進剤が、ポリＡ配列を有するとき、ポリＡ配列又はポリＡモチーフのみから構成されていてもよいし、ポリＡ配列又はポリＡモチーフのほかに、任意の塩基からなる他の配列を有していてもよい。この場合、本促進剤は、ポリＡ配列を含んで、全体として、１０塩基長以上６０塩基長以下とすることができる。また、好ましくは、本促進剤は、１０塩基長５０塩基長以下とすることができる。さらに、本促進剤は、１０塩基長４０塩基以下とすることができる。例えば、配列番号１で表される塩基配列のうち、第１７位以降の塩基配列を有することができる。例えば、かかる塩基配列の第１７位から数個から１００個以下、例えば、８０個以下、また例えば、７０個以下、さらに例えば、６０個以下、また例えば、５０個以下連続する塩基配列を備えていてもよい。ポリＡ配列に加えてこうした追加の配列を有することで、ＲＮＡ安定化及び翻訳促進機能が一層向上する傾向がある。
かかる他の配列は、また例えば、全体（ＡＧＴＣ）におけるＧＣ含有率が５０％以上であることが好ましく、より好ましくは同含有率が５５％以上であり、さらに好ましくは同含有率が５８％以上である。
本促進剤がポリＡ配列を含む場合、好適なＡの連続数は、３’ＵＴＲとして種々の数（例えば、５個以上５０個以下程度、好ましくは、４０個以下程度）でＡが連続するポリＡ配列を備えるような鋳型核酸を作製できるように種々のリバースプライマーを含むプライマーセットを設計する。こうしたプライマーセットにより、種々の長さのポリＡ配列を含む鋳型核酸を作製して、本促進剤を適用しようとする無細胞タンパク質合成系に適用し、得られるタンパク質量に基づいて好適なポリＡの長さを決定することができる。
３’ＵＴＲ活性とは、所定の塩基配列からなる核酸を３’ＵＴＲとして合成系に適用したとき、意図したタンパク質を合成できることをいう。３’ＵＴＲ活性の有無やその程度を評価する方法は特に限定するものではないが、例えば、配列番号１、配列番号６、配列番号２６で表される塩基配列からなる核酸を３’ＵＴＲとして用いる以外は同様の条件で所定の核酸を３’ＵＴＲを用いたとき、配列番号１、 配列番号６、配列番号２６で表される塩基配列からなる核酸による翻訳量に対して５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、一層好ましくは１００％、さらに好ましくは１００％超の翻訳量を呈する活性である。なお、合成系としては、コムギ胚芽由来の合成系を用いることが好ましく、より好ましくは実施例において開示されるコムギ胚芽由来の合成系を用いる。
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質又はポリヌクレオチド配列の間のアライメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアライメントによって決定されるような、タンパク質又はポリヌクレオチド配列の間の配列普遍性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質又はポリヌクレオチド配列の間のアライメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保持性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアライメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215 : p403-410（1990）, Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acid Res. 25 : p3398-3402（1997））を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
本促進剤は、それ自体公知の化学的又は遺伝子工学的な核酸合成法に基づき取得できるが、本促進剤は、後述するように、鋳型核酸やプライマーの要素として用いられ、鋳型核酸やプライマーとして取得されるのが一般的である。
（ＲＮＡ安定化剤）
本促進剤は、ｍＲＮＡの安定性を向上してその結果タンパク質への翻訳効率を向上しうる。すなわち、本促進剤はｍＲＮＡ等のＲＮＡの安定性向上しうるＲＮＡ安定化剤としても機能しうる。したがって、本促進剤の上記した各種態様の塩基配列をＲＮＡに変換した態様の塩基配列を、ＲＮＡ安定化剤としてのＲＮＡが有する塩基配列とすることができる。ｍＲＮＡがかかる配列をその３’側に有することで、ｍＲＮＡを安定化し、タンパク質への翻訳を促進できるほか、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成も促進できる。また、他の各種の有用なＲＮＡを安定化することができる。
（発現ベクター）
本開示の発現ベクター（以下、単に、本ベクターという。）は、本促進剤をその一部に備えることができる。本促進剤は、本ベクターにおいては、二本鎖ＤＮＡとして備えられる。本ベクターは、好ましくは、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の挿入サイトの３’側に本促進剤を備えることができる。挿入サイトについては後述する。
本ベクターは、本促進剤を１又は２以上を含むことができる。本ベクターがプロモーター領域を含む場合、本促進剤をプロモーター領域の３’下流側において、順方向（５→３’）に組み込まれてもよいし、逆方向に組み込まれてもよい。また、１又は２以上の本促進剤は、互いに同一であっても異なっていてもよい。また、２以上の本促進剤を備える場合、その方向は、互いに同一でも異なっていてもよい。
本ベクターは、本促進剤の５’側にプロテインタグをコードする領域を備えることができる。こうすることで、任意のタンパク質のＣ末端にプロテインタグ備える所望のタンパク質を得ることができる。この場合、プロテインタグをコードする領域は、後述する挿入サイトの３’末端側に備えることができる。また、本ベクターは、挿入サイトの５’末端側にもプロテインタグをコードする領域を備えていてもよい。なお、プロテインタグについては後述する。
本ベクターは、この他、本促進剤の５’側にプロモーター領域を備えることができる。プロモーター領域としては、例示であって限定するものではないが、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
本ベクターは、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の挿入サイトを備えることができる。挿入サイトは、概して、従来公知のマルチクローニングサイト等として用いられる配列、相同組換用の配列等が挙げられる。挿入サイトは、本促進剤の５’側に組み込まれる。
本ベクターは、本促進剤の３’側においては、ポリＡ配列やターミネーター領域を備えていなくてもよい。本促進剤自体で翻訳促進が可能であるからである。
本ベクターは、このほか、宿主内で安定に保持されるために従来公知の薬剤耐性マーカー、宿主内で自立複製を行うための従来公知のｐＢＲ３２２ Ｏｒｉ、ｐＵＣ Ｏｒｉ、ＳＶ４０ Ｏｒｉ等の複製起点等を備えることができる。
本ベクターは、従来公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。
本ベクターにおいて所望のタンパク質をコードする領域を挿入することで、鋳型核酸として転写鋳型ＤＮＡを構築することができる。
（鋳型核酸）
本開示の鋳型核酸（以下、単に、本鋳型核酸ともいう。）は、合成系に用いる要素の１つである。鋳型核酸は、転写鋳型ＤＮＡであり、また、翻訳鋳型ｍＲＮＡでもありうる。また、転写鋳型DNAは、ＰＣＲ等で合成された直鎖状ほかプラスミドなどの環状体であってもよい。なお、本明細書において、鋳型核酸とは、無細胞タンパク質合成系において用いられ得るＤＮＡ二本鎖の形態をいう。鋳型核酸が促進剤を備えるというとき、センス鎖が、例えば、本促進剤としてポリＡ配列を有しているとき、アンチセンス鎖は対応してポリＴ配列を有していることになる。また、転写鋳型DNAや翻訳鋳型ｍＲＮＡが本促進剤を備えるというときには、その３’末端側に本促進剤を備えていることになる。
本鋳型核酸は、プロモーター領域と、プロモーター領域によって作動可能に連結される所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域と、上記翻訳促進剤からなる３’ＵＴＲとを備えることができる。本鋳型核酸によれば、３’ＵＴＲが２００塩基長以下等であるために、効率的に本鋳型核酸を取得できるとともに、結果として合成系により所望のタンパク質を効率的に合成できる。また、本鋳型核酸は、ターミネーター領域、ポリＡシグナル等、コード領域の３’側に一般的に用いられる要素を必要としない点において有利である。
本鋳型核酸におけるプロモーター領域は、適用しようとする合成系に種類等に応じて適宜公知のプロモーター領域を適用できる。
本鋳型核酸は、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を備えることができる。既述のとおり、コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端にプロテインタグ等の異種ペプチドを備えることが好ましい。
本鋳型核酸は、公知の化学的又は遺伝子工学的殊能により取得できるが、後述するように、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を利用して遺伝子やｃＤＮＡを鋳型として取得することが好ましい。また、翻訳鋳型ｍＲＮＡは、ツーステップ法等に適用される公知の翻訳鋳型ｍＲＮＡの合成方法により取得することができる。
（プライマーセット）
本開示のプライマーセット（以下、単に、本プライマーセットともいう。）は、合成系に用いる要素の１つである。本プライマーセットは、本鋳型核酸である転写鋳型ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅反応で取得するために用いられる。
本プライマーセットは、図２及び図３に示すように、１又は２以上のフォワードプライマーと、１又は２以上のリバースプライマーとを備えることができる。本プライマーセットは、１又は２以上のリバースプライマーが、本促進剤又はその一部を備えることができる。換言すれば、転写鋳型ＤＮＡに対して本促進剤を付与可能に備えられる。かかる構成により、コード領域の３’末端に本促進剤を備える転写鋳型ＤＮＡを合成できる。
なお、図２及び図３に示すプライマーセットは、それぞれ任意のタンパク質のＮ末端にプロテインタグを備える所望のタンパク質のための転写鋳型核酸及び同Ｃ末端にプロテインタグを備える所望のタンパク質のための転写鋳型核酸を意図したものである。
本促進剤を備えるリバースプライマーは、本促進剤の塩基長やコード領域の３’末端の構成によって、その採りうる構成や必要数が異なってくるため、各種態様を採りうる。例えば、図２に示すように、リバースプライマーの一態様は、その５’末端側に本促進剤又はその一部を備えることができる。この態様のリバースプライマーは、コード領域にハイブリダイズするためのハイブリダイゼーション用領域も備える。
また、さらに、図２に示すように、リバースプライマーの他の一態様は、その全体が、本促進剤又はその一部からなる態様も採ることができる。この態様のリバースプライマーの態様は、ユニバーサルプライマーとして利用できる。
また、例えば、図３に示すように、リバースプライマーの一態様は、その５’末端側に本促進剤又はその一部を備えることができる。この態様のリバースプライマーは、コード領域にハイブリダイズするためのハイブリダイゼーション用領域も備える。また、この態様のリバースプライマーは、本促進剤の３’末端側にプロテインタグのコード領域も備えることができる。この態様のリバースプライマーは、特定プロテインタグを付与するためのユニバーサルプライマーとして利用できる。
また、さらに、図３に示すように、リバースプライマーの他の一態様は、その全体が、本促進剤又はその一部からなる態様も採ることができる。この態様のリバースプライマーの態様は、ユニバーサルプライマーとして利用できる。この態様のリバースプライマーの態様は、ユニバーサルプライマーとして利用できる。
なお、各種態様のリバースプライマーにおいて、プロテインタグ等の任意のタンパク質に連結するためのペプチドリンカーをコードする領域を適宜備えることができる。
本プライマーセットは、１又は２以上のフォワードプライマーを備えることができる。フォワードプライマーも、図２及び図３に示すように、コード領域に対してハイブリダイズするハイブリダイゼーション領域、リンカーペプチドコード領域、プロテインタグコード領域を適宜備えることが備えることができる。
なお、本プライマーセットにおいては、リバースプライマーが本促進剤を含むことができる。この場合、リバースプライマーは、鋳型核酸のアンチセンス鎖に相当する塩基配列を有することになる。したがって、例えば、上記したポリＡ配列を３’ＵＴＲに備えるようなセンス鎖を有するＤＮＡ二本鎖の鋳型核酸を備える場合には、リバースプライマーはその一部に本促進剤として、センス鎖の３’ＵＴＲに相補的な配列を含むことになる。例えば、本促進剤がポリＡ配列を有するとき、本促進剤を含むリバースプライマーは、ポリＴ配列を含むことになる。
本プライマーセットは、一般的には、化学的な核酸合成方法によって取得することができる。以上説明した本プライマーセットは、後述する本開示の合成系のためのキットの要素とすることができる。
（キット）
本開示に無細胞タンパク質合成キット（以下、単に本キットともいう。）は、本プライマーセットと、無細胞タンパク質合成用組成物と、を備えることができる。さらに、本キットは、本プライマーセットを用いてＰＣＲによる核酸増幅反応を実施するためのＤＮＡポリメラーゼ等の核酸増幅試薬、各種ヌクレオチド、緩衝液等の各種試薬を備えることができる。さらに、本キットは、本プライマーセットによって合成される複数の転写鋳型ＤＮＡを保持させるアレイ形態等各種形態の固相担体を備えることもできる。固相担体は、例示であって限定するものではないが、ガラスウェルプレート等が挙げられる。
無細胞タンパク質合成用組成物（以下、単に、本組成物という。）としては、ツーステップ法又はワンステップ法に基づく各種細胞に由来する又は人工的に構成されたタンパク質合成に必要な要素の組成物である。こうした組成物は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて調製し、また商業的に入手できるものである。
例示であって限定するものではないが、こうした組成物としては、例えば、従来公知の大腸菌、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物、及びホウレンソウなど植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球などから抽出された抽出物、抽出液を含むことができる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液の場合、Ｚｕｂａｙ Ｇ「Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ」Ｖｏｌ.７, ｐ２６７−２８７(１９７３)などに記載の方法等に準じて調製することもできる。市販のタンパク質合成用細胞抽出液としては、大腸菌由来では、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｏｒ ｌｉｎｅａｒ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ（プロメガ社製）などが挙げられ、ウサギ網状赤血球由来ではｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）など、コムギ胚芽由来ではｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔ（プロメガ社製）、PROTEIOS（東洋紡績社製）などが挙げられる。
また、本組成物としては、足動物由来の抽出物、哺乳動物培養細胞由来の抽出物等を含んでいてもよい。カイコ組織由来の抽出液は特開２００３−２３５５９８明細書記載の方法、培養細胞由来の抽出液は特開２００４−２１５６５１明細書記載の方法によって作製することが好ましい。
本キットに備える組成物は、例えば、コムギ胚芽由来の組成物とすることができる。
本キットは、こうした抽出液又は抽出物以外に、翻訳系や転写／翻訳系にそれぞれ必要な従来公知の各種成分を１又は２以上含有する組成物を備えることができる。例示であって限定するものではないが、タンパク質合成に必要な核酸分解酵素阻害剤、各種イオン、基質、リン酸転移酵素、エネルギー源等の各種タンパク質合成反応用添加物ほか、ＲＮＡポリメラーゼ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸などのヌクレオチド及びタンパク質をコードする転写鋳型又は翻訳鋳型、加えて所望によりイノシトール、トレハロース、マンニトール等から選択される少なくとも１種の成分を含有する安定化剤を含むことができる。タンパク質合成反応用添加物としては、例えば、基質となるアミノ酸、エネルギー源、カリウム塩、マグネシウム塩などの各種イオン源、緩衝液、ＡＴＰ再生系（リン酸転移酵素）、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、ＤＴＴなどの還元剤、ポリエチレングリコール、３'，５'−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等が挙げられる。また、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼを含んでいてもよい。なお、これら各成分の添加濃度は、当業者であれば公知の配合比を決定できる。
こうした翻訳系又は転写／翻訳系に必要な各種成分については、抽出物又は抽出液と別個に準備されていてもよいし、予め一部又は全体が、抽出物又は抽出液に含まれていてもよい。
さらに、本キットは、本プライマーに替えて、又は本プライマーとともに本ベクターを備えていてもよい。
（転写鋳型ＤＮＡの生産方法）
本開示の無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型ＤＮＡの生産方法は、本プライマーセットを用いて、所望のタンパク質のコード領域を含むＤＮＡに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型ＤＮＡを合成する工程、を備えることができる。転写鋳型ＤＮＡを合成するには、本プライマーセットを用いて、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含むＤＮＡに対して、従来公知のＰＣＲの増幅反応条件を適宜適用して核酸増幅反応を実施してＰＣＲ産物としての転写鋳型ＤＮＡを得るようにする。なお、本プライマーセットが、２以上のフォワードプライマー及び／又は２以上のリバースプライマーを含む場合には、必要に応じて、２以上の増幅反応条件（特に温度サイクル等）を利用して意図する転写鋳型ＤＮＡを増幅産物として取得するようにする。
なお、転写鋳型ＤＮＡは、本ベクターを用いて取得することもできる。すなわち、本タンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を少なくとも含むＤＮＡを本ベクターに挿入することによって鋳型核酸を取得できる。こうして作製したベクターは、それ自体を転写鋳型ＤＮＡとして用いることができるし、本ベクターから転写鋳型ＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を切り出して用いることもできる。
転写鋳型ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ反応液（すなわち、転写鋳型ＤＮＡを精製することなく）として、合成系に適用してもよいし、適宜精製等して合成系に適用してもよい。
（翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法）
本開示の細胞タンパク質合成系のための翻訳鋳型の生産方法は、細胞の不存在下であってかつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、を備えることができる。本方法は、例えば、既述の無細胞タンパク質合成用組成物を用い、少なくとも、転写反応に必要な各種成分の存在下でインビトロで行うことができる。より具体的には、転写鋳型DNAを含むＰＣＲ反応液又は本ベクターに由来する転写鋳型ＤＮＡに対して、転写鋳型ＤＮＡが備えるプロモーター領域に適合するＲＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡ合成用の基質（４種類のリボヌクレオシド３リン酸）等を転写反応に必要な成分を含む組成の下で、例えば、約２０℃〜６０℃、好ましくは、約３０℃〜４２℃で適当な時間インキュベートすることにより翻訳鋳型ｍＲＮＡを得ることができる。
本方法は、合成系としての転写／翻訳系の一部として実施することができるし、翻訳鋳型ｍＲＮＡの翻訳系への適用に先立つ工程として実施することもできる。こうして得られた翻訳鋳型ｍＲＮＡは、その反応液を、翻訳系に適用することができる。
（タンパク質の生産方法）
本開示のタンパク質の生産方法は、細胞の不存在下であってかつ翻訳鋳型ｍＲＮＡからタンパク質に翻訳するための要素の存在下で、翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてタンパク質を合成する工程、を備えることができる。本方法は、また、細胞の不存在下であってかつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程も備えることができる。さらに、本方法は、所望のタンパク質のコード領域を含むＤＮＡに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型ＤＮＡを合成する工程を備えることもできる。本方法によれば、本促進剤を含む翻訳鋳型ｍＲＮＡ、転写鋳型ＤＮＡを用いるために、タンパク質合成を効率的に行うことができる。
本方法におけるタンパク質の生産は、翻訳系を用いて実現されるものであってもよいし、転写／翻訳系を用いて実現されるものであってもよい。
本方法は、例えば、既述の無細胞タンパク質合成用組成物を用い、少なくとも、翻訳反応に必要な各種成分の存在下でインビトロで行うことができる。より具体的には、翻訳鋳型ｍＲＮＡに対して、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、各酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３’−５’ーｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等、必要又は好適な程度に存在下、翻訳反応に適した適当な温度で適当な時間インキュベートすることにより実施することができる。
（転写鋳型アレイ及びその利用）
本開示の転写鋳型ＤＮＡのアレイは、複数の所望のタンパク質に対応する複数の本鋳型核酸を転写鋳型ＤＮＡとして保持することができる。こうしたアレイによれば、複数の所望のタンパク質をアレイ上で合成系に適用して一挙に合成することができる。こうしたアレイは、タンパク質−タンパク質相互作用解析、タンパク質−ＤＮＡ相互作用解析、タンパク質翻訳後修飾解析、タンパク質構造解析及び抗原タンパク質の合成等、タンパク質に関する各種の解析等の用途に好ましく用いることができる。
こうしたアレイとしては、例えば、例示であって限定するものではないが、各ウエル内に転写鋳型DNAを保持可能な９６ウエルプレートや、転写鋳型DNAが適当な固相担体に固定化されたプレート、ディスク及びストリップ等が挙げられる。なお、固相担体としては、ガラス材料、セラミックス材料プラスチック材料等からなる非多孔質体及び多孔質体が挙げられる。
以下、本開示に係る実施例を挙げて具体的に説明する。ただし、以下の実施例は本開示を説明するものであって、本開示を限定するものではない。
（３’ＵＴＲの長さ１２００〜４０ｂｐについてのタンパク質合成評価）
本実施例の概要を図４に示す。本実施例では、図４に示すように、Ｔ７プロモーター、エンハンサー、プロテインタグ及びＷＲＫＹ１８のコード領域を組み込んだプラスミドベクターに対して、ＰＣＲを行い、ＷＲＫＹ１８の終止コドンの３’末端側に４０ｂｐ〜１２００ｂｐの３’ＵＴＲを備えるＤＮＡ断片を調製した。なお、３’ＵＴＲである１２００ｂｐ、６００ｂｐ、３００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ及び４０ｂｐのＤＮＡの塩基配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号１で表される。
各種長さの３’ＵＴＲを備えるＤＮＡ断片を利用して無細胞タンパク質合成反応によりタンパク質を合成した。以下、プロトコールを示す。
（１）長さの異なる３’ＵＴＲを取得するためのプライマー配列
プラスミドベクターに対する第１回目のＰＣＲ及び第２回目の２ＰＣＲのためのプライマーセットを以下に示す。なお、フォワードプライマーは、第１回及び第２回のＰＣＲにおいてそれぞれ以下に示す別個のものを用いたが、リバースプライマーについては同一プライマーを用いた。
（２）ＰＣＲ及びタンパク質合成
転写鋳型ＤＮＡを作製するためのＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてKOD-Plus-Neo（東洋紡株式会社製）を用いて、以下の条件で行った。
また、第２回目のＰＣＲは、表３及び表４に示す以下の反応液組成及び反応条件で実施した。なお、第１回目のＰＣＲ産物は１μｌ用いた。
第１回目及び第２回目のＰＣＲ産物について、常法に従いアガロースゲル電気泳動を行った結果を図５に示す。図５に示すように、第１回目及び第２回目のＰＣＲ産物として意図した転写鋳型ＤＮＡが得られていることがわかった。
（転写反応）
次に、作製した転写鋳型ＤＮＡを用いて、翻訳鋳型ｍＲＮＡを作製した。転写反応は、MEGAscript T7 Transcription Kit（Invitrogen）の以下の反応液を用い、先に作製した第２回のＰＣＲ反応溶液（転写鋳型ＤＮＡ含有）２．５μｌを用いて、３７℃で３時間行った。
転写反応終了後、アガロースゲル電気泳動を用いて1 μlの転写産物を確認した。結果を図６左側に示す。確認後、転写反応液25μｌに対して10 μlの4 M 酢酸アンモニウムを加えてよく混合し、さらに、100 μlの100% エタノールを加え転倒混和し、卓上遠心機で数秒間遠心分離した後、氷上で20分間静置し、その後、遠心分離（15,000 rpm、20分、4°C）した。上清を除去後、卓上遠心機を用い数秒間遠心する。再度上清を除去し、沈殿が乾燥するまで静置した。その後、転写反応液25 μlに対して70 μlのRNase free水（DEPC水）を加え、チップで沈殿をよく懸濁し、これを翻訳鋳型mRNA溶液とした。
（翻訳反応）
次に、以下の組成の翻訳反応液を用いて、１６℃のインキュベーターにいれて約１０時間反応させた。なお、以下の組成のうち、翻訳鋳型ｍＲＮＡを除いた組成液を調製し、その後、この組成液を室温に戻した後に、翻訳鋳型ｍＲＮＡを添加して、泡を立てないようにポンピングして、反応させた。
反応後、反応液をエッペンドルフチューブに回収し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）を行い、上清を−８０℃で保存した。得られたタンパク質についてのウェスタンブロット結果を図６右側に示す。
図６に示すように、異なる長さの３’ＵＴＲに応じて転写鋳型ＤＮＡが合成され、それぞれの転写鋳型ＤＮＡから意図したタンパク質を得ることができた。これらの結果から、３’ＵＴＲの長さにかかわらず、また、３’ＵＴＲとして４０塩基長の長さの転写鋳型ＤＮＡでもタンパク質を合成できることがわかった。
（３種類の３’ＵＴＲについての評価）
本実施例では、pENTR/D-TOPO及びpDONR221の2つのベクターの３’ＵＴＲと、実施例１で用いた３’ＵＴＲとによる翻訳効率について評価した。
図７に示すように、ＷＲＫＹ６７のコード領域をクローニングしたpENTR/D-TOPOと、ＵＰＢ１のコード領域をクローニングしたpDONR221に対して、以下のプライマーセットを用いて実施例１と同様にして第１回及び第２回のＰＣＲを行い、転写鋳型ＤＮＡを調製した。すなわち、図７に示すように、ＷＲＫＹ６７/pENTR/D-TOPOから、ベクター由来の３’ＵＴＲ（図７中、Ａとして示す配列（ただし、終始コドン後の配列））を付加した転写鋳型ＤＮＡと、実施例１で用いた３’ＵＴＲ（図７中、Ｂとして示す配列（ただし、終始コドン後の配列）（AAAAAAAAAAGAGCTCTTGGATCCGGCCATAAGGGCC）（配列番号２６））を付加した転写鋳型ＤＮＡを調製した。また、ＵＰＢ１/pDONR221から、ベクター由来の３’ＵＴＲ（図７中、Ｃとして示す配列（ただし、終始コドン後の配列））を付加した転写鋳型ＤＮＡと、実施例１で用いた３’ＵＴＲ（図７中、Ｂとして示す配列の一部）を付加した転写鋳型ＤＮＡを調製した。
得られた転写鋳型ＤＮＡは、さらに、実施例１と同様にして、翻訳鋳型ｍＲＮＡを調製してタンパク質を合成した。合成したタンパク質のウェスタンブロットの結果を併せて図７に示す。
図７に示すように、いずれの３’ＵＴＲでもタンパク質を合成することができたが、図７中、Ｂとして示される塩基配列で特定されるＡが１０個連続するポリＡ配列を含む３’ＵＴＲが高発現に有利であることがわかった。
（約４０塩基長の３’ＵＴＲによるＮ末タグ付加）
本実施例では、実施例２で評価した３７塩基長の３’ＵＴＲ（配列番号２６）を翻訳促進剤として用いて６種類のタンパク質（ＭＫＫ１、ＭＫＫ２、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ６、ＭＫＫ９）の各Ｎ末端に対してＦＬＡＧタグを付与したタンパク質を、図８に示すプライマー設計に基づき転写鋳型ＤＮＡを調製して合成した。
これら各タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングしたベクターpDONR221に対して、以下のプライマーセットを用いて、実施例１と同様にして第１回ＰＣＲ及び第２回ＰＣＲを行って、転写鋳型ＤＮＡを調製した。第１回及び第２回の各ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動結果を図９に示す。さらに、実施例１と同様にして翻訳鋳型ｍＲＮＡを調製し、最終的に無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を取得した。転写鋳型ｍＲＮＡのアガロースゲル電気泳動結果及び合成したタンパク質のウェスタンブロットの結果を図１０に示す。
図９に示すように、第１回及び第２回のＰＣＲ産物は、いずれも意図した長さを有しており、各タンパク質をコードする転写鋳型ＤＮＡが取得できていることがわかった。また、図１０に示すように、転写鋳型ＤＮＡに対応する翻訳鋳型ｍＲＮＡ及び意図したタンパク質を取得できていることがわかった。
以上のことから、約４０塩基長の３’ＵＴＲであっても、いずれのタンパク質についてもＮ末端にＦＬＡＧタグを備える態様で融合タンパク質を取得できることがわかった。
（約４０塩基長の３’ＵＴＲによるＣ末タグ付加）
本実施例では、実施例２で評価した３７塩基長の３’ＵＴＲ（配列番号２６）を翻訳促進剤として用いて６種類のタンパク質（ＥＲＦ１、ＷＲＫＹ１８、ＴＧＡ２、ＮＰＲ１、ＭＹＣ２、ｐｈｙＢ）の各Ｃ末端に対してＦＬＡＧタグを付与したタンパク質を、図１１に示すプライマー設計に基づき転写鋳型ＤＮＡを調製して合成した。なお、転写鋳型DNAを調製するための第2回目のＰＣＲの反応液は以下の通りとした。
これら各タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングしたベクターpDONR221に対して、以下のプライマーセットを用いて、実施例１と同様にして第１回ＰＣＲ及び第２回ＰＣＲを行って、転写鋳型ＤＮＡを調製した。第１回及び第２回の各ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動結果を図１２に示す。さらに、実施例１と同様にして翻訳鋳型ｍＲＮＡを調製し、最終的に無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を取得した。翻訳鋳型ｍＲＮＡのアガロースゲル電気泳動結果及び合成したタンパク質のウェスタンブロットの結果を図１３に示す。
図１２に示すように、第１回及び第２回のＰＣＲ産物は、いずれも意図した長さを有しており、各タンパク質をコードする転写鋳型ＤＮＡが取得できていることがわかった。また、図１３に示すように、転写鋳型ＤＮＡに対応する翻訳鋳型ｍＲＮＡ及び意図したタンパク質を取得できていることがわかった。
以上のことから、約４０塩基長の３’ＵＴＲであっても、いずれのタンパク質についてもＣ末端にＦＬＡＧタグを備える態様で融合タンパク質を取得できることがわかった。
（トランケーションの実施例）
本実施例では、実施例２で評価した３７塩基長の３’ＵＴＲ（配列番号２６）を翻訳促進剤として用いてタンパク質（ＷＲＫＹ１８）を図１４に示す態様にトランケーションして各断片のＮ末端にＦＬＡＧタグを付与した融合タンパク質１〜４を合成した。
これらタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングしたベクターpDONR221に対して、以下のプライマーセットを用いて、実施例１と同様にして第１回ＰＣＲ及び第２回ＰＣＲを行って、転写鋳型ＤＮＡを調製した。第１回及び第２回の各ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動結果を図１５に示す。さらに、実施例１と同様にして翻訳鋳型ｍＲＮＡを調製し、最終的に無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を取得した。翻訳鋳型ｍＲＮＡのアガロースゲル電気泳動結果及び合成したタンパク質のウェスタンブロットの結果を図１６に示す。
図１５に示すように、第１回及び第２回のＰＣＲ産物は、いずれも意図した長さを有しており、各タンパク質をコードする転写鋳型ＤＮＡが取得できていることがわかった。また、図１６に示すように、転写鋳型ＤＮＡに対応する翻訳鋳型ｍＲＮＡ及び意図した融合タンパク質を取得できていることがわかった。
以上のことから、約４０塩基長の３’ＵＴＲであっても、いずれのタンパク質についてもＮ末端にＦＬＡＧタグを備える態様で各種のトランケーション断片として融合タンパク質を取得できることがわかった。
（促進剤の塩基長についての評価）
本実施例では、３’ＵＴＲとして使用できる配列及び塩基長について評価した。以下に示すプライマーを用いて、シロイヌナズナの転写補助因子ＮＰＲ１及び転写因子ＡＲＥＢ２をコードする塩基配列の終止コドンに続けて異なる数のＡが連続するポリＡ配列を３’ＵＴＲとして付加して、各タンパク質の合成量を評価した。
すなわち、5個、１０個、２０個、３０個及び４０個のＡが連続するポリＡ配列を、各タンパク質をコードする塩基配列の終止コドンに直接連続して付加した鋳型核酸を得られるようリバースプライマーを含むプライマーセットを合成した。なお、各タンパク質のＮ末端にＦＬＡＧタンパク質を付加できるようにフォワードプライマーを設計した。これらのプライマーセットを用いて、実施例１と同様にして、これらの転写因子等のコード領域を含むようにクローニングしたベクターｐＤＯＮＲ２２１に対して、第１回及び第２回ＰＣＲを行い、転写鋳型ＤＮＡ及びｍＲＮＡを調製し、最終的に無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を取得した。合成したタンパク質のウェスタンブロットの結果を図１７に示す。
図１７に示すように、ＮＰＲ１タンパク質については、５個のＡが連続するポリＡ配列のみを３’ＵＴＲとしただけでは、十分なタンパク質合成量を確保できなかったが、１０個以上３０個以下のＡが連続するポリＡを３’ＵＴＲとすることで十分なタンパク質合成量を確保することができた。特に限定するものではないが、１０個のポリＡで最大の合成量となった。
また、ＡＲＥＢ２タンパク質については、５個以上４０個以下のＡが連続するポリＡ配列のみを３’ＵＴＲとすることで、おおよそ十分なタンパク質合成量を確保することができた。なかでも、１０個〜２０個のＡが連続するポリＡ配列によって、良好なタンパク質合成量を確保することができた。
以上のことから、３’ＵＴＲとして、少なくとも５個のＡが連続するポリＡ配列によっても、ｍＲＮＡを安定化して、無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を合成できることがわかった。また、ポリＡにおけるＡ連続量は、必要に応じて５個程度から４０個以下程度の範囲で適宜選択できることもわかった。
（促進剤の塩基配列についての評価）
本実施例では、３’ＵＴＲとして使用できる塩基配列について、さらに評価した。以下に示すプライマーを用いて、シロイヌナズナの転写補助因子 ＮＰＲ１をコードする塩基配列の終止コドンに続けて１０個のＡが連続するポリＡ配列及び配列番号１で表される塩基配列のポリＡに続く第１７位〜第２６位までの合計２０塩基からなる配列及び同第１７位〜第６３位までの合計４７塩基からなる配列を３’ＵＴＲとして付加して、各タンパク質の合成量を評価した。
すなわち、１０個Ａが連続するポリＡ配列を、各タンパク質をコードする塩基配列の終止コドンに直接連続し、さらに、上記した配列番号１で表される塩基配列のうちの第１７位からの所定の個数の塩基からなる塩基配列を付加した鋳型核酸を得られるようリバースプライマーを含むプライマーセットを合成した。なお、各タンパク質のＮ末端にＦＬＡＧタンパク質を付加できるようにフォワードプライマーを設計した。これらのプライマーセットを用いて、実施例１と同様にして、これらの転写因子のコード領域を含むようにクローニングしたベクターｐＤＯＮＲ２２１に対して、第１回及び第２回ＰＣＲを行い、転写鋳型ＤＮＡ及びｍＲＮＡを調製し、最終的に無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を取得した。合成したタンパク質のウェスタンブロットの結果を図１８に示す。
図１８に示すように、Ａが１０個連続するポリＡ配列に対して、一定長さのポリヌクレオチドを追加することで、タンパク質合成能が向上することがわかった。以上のことから、促進剤又は安定化剤として、ポリＡを含み、かつ一定の長さ、例えば、１０塩基以上４０塩基以下のポリヌクレオチドが好ましいことがわかった。
配列番号１〜６、２６：人工的３’ＵＴＲ
配列番号７〜２５、２７〜７４：プライマー

Claims (9)

  1. 無細胞タンパク質合成系における翻訳促進剤であって、
    所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の３’末端に隣接して連結される３’非翻訳領域としての核酸からなり、
    前記３’非翻訳領域が、１０個以上２０個以下のＡが連続するポリＡ配列を有し、且つ、前記ポリＡ配列の３’末端側に塩基を含まない、
    翻訳促進剤。
  2. 無細胞タンパク質合成系に用いる鋳型核酸であって、
    プロモーター領域と、
    前記プロモーター領域によって作動可能に連結される所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域と、
    請求項１に記載の翻訳促進剤からなる、前記コード領域の３’非翻訳領域と、
    を備える、鋳型核酸。
  3. 前記コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のＣ末端にプロテインタグを備える融合タンパク質をコードする領域である、請求項２に記載の鋳型核酸。
  4. 前記コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のＮ末端にプロテインタグを備える融合タンパク質をコードする領域である、請求項２又は３に記載の鋳型核酸。
  5. 前記鋳型核酸は、転写鋳型ＤＮＡである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の鋳型核酸。
  6. 前記鋳型核酸は、翻訳鋳型ｍＲＮＡである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の鋳型核酸。
  7. 無細胞タンパク質合成系のための翻訳鋳型の生産方法であって、
    細胞の不存在下であってかつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で請求項２〜５のいずれか一項に記載の鋳型核酸を用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、
    を備える、方法。
  8. タンパク質の生産方法であって、
    細胞の不存在下であってかつ翻訳鋳型ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するための要素の存在下で請求項６に記載の鋳型核酸を用いてタンパク質を合成する工程、
    を備える、生産方法。
  9. 転写鋳型ＤＮＡのアレイであって、
    複数のタンパク質に対応する請求項２〜５のいずれか一項に記載の複数の鋳型核酸を転写鋳型ＤＮＡとして保持する、アレイ。
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JP6738111B1 (ja) * 2019-10-10 2020-08-12 ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ株式会社 翻訳促進剤、鋳型核酸、翻訳鋳型の生産方法、および、タンパク質の生産方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0871722A1 (en) * 1993-05-24 1998-10-21 University Of Massachusetts Medical Center Post-transcriptional gene regulation by trace minerals
EP1221481A4 (en) * 1999-10-15 2004-12-08 Yaeta Dr Endo MATRIX MOLECULE WITH WIDE APPLICATION AND HIGHLY EFFICIENT, FUNCTIONAL MEANS OF THE CELL-FREE SYNTHESIS OF PROTEINS BY USING THE SAME
JP4723713B2 (ja) * 2000-09-25 2011-07-13 トヨタ自動車株式会社 ｍＲＮＡの潜在的翻訳制御因子のスクリーニング方法
JP4747292B2 (ja) * 2002-06-12 2011-08-17 学校法人慶應義塾 翻訳テンプレートおよびそのライブラリー、それらから合成される蛋白質および蛋白質のライブラリー、ならびにそれらを構成する要素、ならびにそれらの製造法および利用方法
WO2004000233A2 (en) * 2002-06-25 2003-12-31 Arkion Life Sciences Llc Algal gdp-mannose-3',5'-epimerases and methods of use thereof
US9528137B2 (en) * 2013-03-15 2016-12-27 Northwestern University Methods for cell-free protein synthesis

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