JPWO2016143799A1 - 無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の3’末端に隣接して連結される3’非翻訳領域としての200塩基長以下の核酸からなる、翻訳促進剤。
(2)前記3’非翻訳領域は、100塩基長以下である、(1)に記載の翻訳促進剤。
(3)前記3’非翻訳領域は、80塩基長以下である、(2)に記載の翻訳促進剤。
(4)前記3’非翻訳領域は、60塩基長以下である、(3)に記載の翻訳促進剤。
(5)前記3’非翻訳領域は、40塩基長以下である、(4)に記載の翻訳促進剤。
(6)前記3’非翻訳領域は、2個以上のAが連続するポリA配列を有する、(1)〜(5)のいずれかに記載の翻訳促進剤。
(7)前記3’非翻訳領域は、5個以上40個以下のAが連続する前記ポリA配列を有する、(6)に記載の翻訳促進剤。
(8)前記3’非翻訳領域は、5個以上20個以下のA(アデニン)が連続する前記ポリA配列を有し、全長が10塩基長以上50塩基長以下、好ましくは、10塩基長以上40塩基長以下である、(6)又は(7)に記載の翻訳促進剤。、好ましくは、10塩基長
(9)前記3’非翻訳領域は、配列番号6又は26で表される塩基配列又は当該塩基配列において1個以上5個以下の塩基を置換、付加、挿入又は欠失した塩基配列若しくは配列番号6又は26で表される塩基配列と85%以上の同一性を有する塩基配列であって、3’非翻訳領域活性を有する塩基配列を有する、(1)〜(8)のいずれかに記載の翻訳促進剤。
(10)前記所望のタンパク質は、任意のタンパク質のC末端にプロテインタグを備える融合タンパク質である、(1)〜(9)のいずれかに記載の翻訳促進剤。
(11)前記所望のタンパク質は、任意のタンパク質のN末端にプロテインタグを備える融合タンパク質である、(1)〜(10)のいずれかに記載の翻訳促進剤。
(12)コムギ胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤である、(1)〜(11)のいずれかに記載の翻訳促進剤。
(13)無細胞タンパク質合成系に用いる発現ベクターであって、
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の挿入サイトの3’側に、200塩基長以下の3’非翻訳領域を保持する、ベクター。
(14)前記3’非翻訳領域は、その5’側にプロテインタグをコードする領域を保持する、(13)に記載のベクター。
(15)無細胞タンパク質合成系に用いる鋳型核酸であって、
プロモーター領域と、
前記プロモーター領域によって作動可能に連結される所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域と、
(1)〜(12)のいずれかに記載の翻訳促進剤からなる、前記コード領域の3’非翻訳領域と、
を備える、鋳型核酸。
(16)前記コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のC末端にプロテインタグを備える融合タンパク質をコードする領域である、(15)に記載の鋳型核酸。
(17)前記コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のN末端にプロテインタグを備える融合タンパク質をコードする領域である、(15)又は(16)に記載の鋳型核酸。
(18)前記鋳型核酸は、転写鋳型DNAである、(15)〜(17)のいずれかに記載の鋳型核酸。
(19)前記鋳型核酸は、翻訳鋳型mRNAである、(15)〜(17)のいずれかに記載の鋳型核酸。
(20)無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型DNAを合成するためのDNAポリメラーゼ増幅に用いるプライマーセットであって、
1又は2以上のフォワードプライマーと、
1又は2以上のリバースプライマーと、
を備え、
前記1又は2以上のリバースプライマーは、(1)〜(12)のいずれかに記載の翻訳促進剤又はその一部を備える、プライマーセット。
(21)前記1又は2以上のリバースプライマーは、さらに、前記翻訳促進剤の3’末端側に隣接してC末端プロテインタグコード領域を備える、(20)に記載のプライマーセット。
(22)前記1又は2以上のフォワードプライマーは、N末端プロテインタグコード領域を有する、(20)又は(21)に記載のプライマーセット。
(23)(20)〜(22)のいずれかに記載のプライマーセットと、
無細胞タンパク質合成用媒体と、
を備える、無細胞タンパク質合成キット。
(24)前記無細胞タンパク質合成用媒体は、小麦胚芽由来である、(23)に記載のキット。
(25)無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型DNAの生産方法であって、
(20)〜(22)のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、所望のタンパク質のコード領域を含むDNAに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型DNAを合成する工程、
を備える、方法。
(26)無細胞タンパク質合成系のための翻訳鋳型の生産方法であって、
細胞の不存在下であってかつ転写鋳型DNAをmRNAに転写するための要素の存在下で(15)〜(18)のいずれかに記載の鋳型核酸を用いて翻訳鋳型mRNAを合成する工程、
を備える、方法。
(27)タンパク質の生産方法であって、
細胞の不存在下であってかつ翻訳鋳型mRNAをタンパク質に翻訳するための要素の存在下で(19)に記載の鋳型核酸を用いてタンパク質を合成する工程、
を備える、生産方法。
(28)転写鋳型DNAのアレイであって、
複数のタンパク質に対応する(15)〜(18)のいずれかに記載の複数の鋳型核酸を転写鋳型DNAとして保持する、アレイ。
(29)RNA安定化剤であって、
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の3’末端に隣接して連結される3’非翻訳領域としての200塩基長以下の核酸からなる、RNA安定化剤。
本開示の翻訳促進剤(以下、本促進剤ともいう。)は、無細胞タンパク質合成系(以下、単に合成系ともいう。)に用いる剤である。図1に示すように、本促進剤は、合成系において、所定の塩基配列からなる核酸を、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の3’末端に隣接して連結される3’UTRとして用いる。
本促進剤は、mRNAの安定性を向上してその結果タンパク質への翻訳効率を向上しうる。すなわち、本促進剤はmRNA等のRNAの安定性向上しうるRNA安定化剤としても機能しうる。したがって、本促進剤の上記した各種態様の塩基配列をRNAに変換した態様の塩基配列を、RNA安定化剤としてのRNAが有する塩基配列とすることができる。mRNAがかかる配列をその3’側に有することで、mRNAを安定化し、タンパク質への翻訳を促進できるほか、逆転写酵素によるcDNAの合成も促進できる。また、他の各種の有用なRNAを安定化することができる。
本開示の発現ベクター(以下、単に、本ベクターという。)は、本促進剤をその一部に備えることができる。本促進剤は、本ベクターにおいては、二本鎖DNAとして備えられる。本ベクターは、好ましくは、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の挿入サイトの3’側に本促進剤を備えることができる。挿入サイトについては後述する。
本開示の鋳型核酸(以下、単に、本鋳型核酸ともいう。)は、合成系に用いる要素の1つである。鋳型核酸は、転写鋳型DNAであり、また、翻訳鋳型mRNAでもありうる。また、転写鋳型DNAは、PCR等で合成された直鎖状ほかプラスミドなどの環状体であってもよい。なお、本明細書において、鋳型核酸とは、無細胞タンパク質合成系において用いられ得るDNA二本鎖の形態をいう。鋳型核酸が促進剤を備えるというとき、センス鎖が、例えば、本促進剤としてポリA配列を有しているとき、アンチセンス鎖は対応してポリT配列を有していることになる。また、転写鋳型DNAや翻訳鋳型mRNAが本促進剤を備えるというときには、その3’末端側に本促進剤を備えていることになる。
本開示のプライマーセット(以下、単に、本プライマーセットともいう。)は、合成系に用いる要素の1つである。本プライマーセットは、本鋳型核酸である転写鋳型DNAを、DNAポリメラーゼを用いる核酸増幅反応で取得するために用いられる。
本開示に無細胞タンパク質合成キット(以下、単に本キットともいう。)は、本プライマーセットと、無細胞タンパク質合成用組成物と、を備えることができる。さらに、本キットは、本プライマーセットを用いてPCRによる核酸増幅反応を実施するためのDNAポリメラーゼ等の核酸増幅試薬、各種ヌクレオチド、緩衝液等の各種試薬を備えることができる。さらに、本キットは、本プライマーセットによって合成される複数の転写鋳型DNAを保持させるアレイ形態等各種形態の固相担体を備えることもできる。固相担体は、例示であって限定するものではないが、ガラスウェルプレート等が挙げられる。
本開示の無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型DNAの生産方法は、本プライマーセットを用いて、所望のタンパク質のコード領域を含むDNAに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型DNAを合成する工程、を備えることができる。転写鋳型DNAを合成するには、本プライマーセットを用いて、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域を含むDNAに対して、従来公知のPCRの増幅反応条件を適宜適用して核酸増幅反応を実施してPCR産物としての転写鋳型DNAを得るようにする。なお、本プライマーセットが、2以上のフォワードプライマー及び/又は2以上のリバースプライマーを含む場合には、必要に応じて、2以上の増幅反応条件(特に温度サイクル等)を利用して意図する転写鋳型DNAを増幅産物として取得するようにする。
本開示の細胞タンパク質合成系のための翻訳鋳型の生産方法は、細胞の不存在下であってかつ転写鋳型DNAをmRNAに転写するための要素の存在下で転写鋳型DNAを用いて翻訳鋳型mRNAを合成する工程、を備えることができる。本方法は、例えば、既述の無細胞タンパク質合成用組成物を用い、少なくとも、転写反応に必要な各種成分の存在下でインビトロで行うことができる。より具体的には、転写鋳型DNAを含むPCR反応液又は本ベクターに由来する転写鋳型DNAに対して、転写鋳型DNAが備えるプロモーター領域に適合するRNAポリメラーゼ及びRNA合成用の基質(4種類のリボヌクレオシド3リン酸)等を転写反応に必要な成分を含む組成の下で、例えば、約20℃〜60℃、好ましくは、約30℃〜42℃で適当な時間インキュベートすることにより翻訳鋳型mRNAを得ることができる。
本開示のタンパク質の生産方法は、細胞の不存在下であってかつ翻訳鋳型mRNAからタンパク質に翻訳するための要素の存在下で、翻訳鋳型mRNAを用いてタンパク質を合成する工程、を備えることができる。本方法は、また、細胞の不存在下であってかつ転写鋳型DNAをmRNAに転写するための要素の存在下で転写鋳型DNAを用いて翻訳鋳型mRNAを合成する工程も備えることができる。さらに、本方法は、所望のタンパク質のコード領域を含むDNAに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型DNAを合成する工程を備えることもできる。本方法によれば、本促進剤を含む翻訳鋳型mRNA、転写鋳型DNAを用いるために、タンパク質合成を効率的に行うことができる。
本開示の転写鋳型DNAのアレイは、複数の所望のタンパク質に対応する複数の本鋳型核酸を転写鋳型DNAとして保持することができる。こうしたアレイによれば、複数の所望のタンパク質をアレイ上で合成系に適用して一挙に合成することができる。こうしたアレイは、タンパク質−タンパク質相互作用解析、タンパク質−DNA相互作用解析、タンパク質翻訳後修飾解析、タンパク質構造解析及び抗原タンパク質の合成等、タンパク質に関する各種の解析等の用途に好ましく用いることができる。
本実施例の概要を図4に示す。本実施例では、図4に示すように、T7プロモーター、エンハンサー、プロテインタグ及びWRKY18のコード領域を組み込んだプラスミドベクターに対して、PCRを行い、WRKY18の終止コドンの3’末端側に40bp〜1200bpの3’UTRを備えるDNA断片を調製した。なお、3’UTRである1200bp、600bp、300bp、100bp、50bp及び40bpのDNAの塩基配列は、それぞれ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5及び配列番号1で表される。
プラスミドベクターに対する第1回目のPCR及び第2回目の2PCRのためのプライマーセットを以下に示す。なお、フォワードプライマーは、第1回及び第2回のPCRにおいてそれぞれ以下に示す別個のものを用いたが、リバースプライマーについては同一プライマーを用いた。
転写鋳型DNAを作製するためのPCRは、DNAポリメラーゼとしてKOD-Plus-Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、以下の条件で行った。
次に、作製した転写鋳型DNAを用いて、翻訳鋳型mRNAを作製した。転写反応は、MEGAscript T7 Transcription Kit(Invitrogen)の以下の反応液を用い、先に作製した第2回のPCR反応溶液(転写鋳型DNA含有)2.5μlを用いて、37℃で3時間行った。
次に、以下の組成の翻訳反応液を用いて、16℃のインキュベーターにいれて約10時間反応させた。なお、以下の組成のうち、翻訳鋳型mRNAを除いた組成液を調製し、その後、この組成液を室温に戻した後に、翻訳鋳型mRNAを添加して、泡を立てないようにポンピングして、反応させた。
本実施例では、pENTR/D-TOPO及びpDONR221の2つのベクターの3’UTRと、実施例1で用いた3’UTRとによる翻訳効率について評価した。
本実施例では、実施例2で評価した37塩基長の3’UTR(配列番号26)を翻訳促進剤として用いて6種類のタンパク質(MKK1、MKK2、MKK4、MKK6、MKK6、MKK9)の各N末端に対してFLAGタグを付与したタンパク質を、図8に示すプライマー設計に基づき転写鋳型DNAを調製して合成した。
本実施例では、実施例2で評価した37塩基長の3’UTR(配列番号26)を翻訳促進剤として用いて6種類のタンパク質(ERF1、WRKY18、TGA2、NPR1、MYC2、phyB)の各C末端に対してFLAGタグを付与したタンパク質を、図11に示すプライマー設計に基づき転写鋳型DNAを調製して合成した。なお、転写鋳型DNAを調製するための第2回目のPCRの反応液は以下の通りとした。
本実施例では、実施例2で評価した37塩基長の3’UTR(配列番号26)を翻訳促進剤として用いてタンパク質(WRKY18)を図14に示す態様にトランケーションして各断片のN末端にFLAGタグを付与した融合タンパク質1〜4を合成した。
本実施例では、3’UTRとして使用できる配列及び塩基長について評価した。以下に示すプライマーを用いて、シロイヌナズナの転写補助因子NPR1及び転写因子AREB2をコードする塩基配列の終止コドンに続けて異なる数のAが連続するポリA配列を3’UTRとして付加して、各タンパク質の合成量を評価した。
本実施例では、3’UTRとして使用できる塩基配列について、さらに評価した。以下に示すプライマーを用いて、シロイヌナズナの転写補助因子 NPR1をコードする塩基配列の終止コドンに続けて10個のAが連続するポリA配列及び配列番号1で表される塩基配列のポリAに続く第17位〜第26位までの合計20塩基からなる配列及び同第17位〜第63位までの合計47塩基からなる配列を3’UTRとして付加して、各タンパク質の合成量を評価した。
配列番号7〜25、27〜74:プライマー
Claims (29)
- 無細胞タンパク質合成系における翻訳促進剤であって、
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の3’末端に隣接して連結される3’非翻訳領域としての200塩基長以下の核酸からなる、翻訳促進剤。 - 前記3’非翻訳領域は、100塩基長以下である、請求項1に記載の翻訳促進剤。
- 前記3’非翻訳領域は、80塩基長以下である、請求項2に記載の翻訳促進剤。
- 前記3’非翻訳領域は、60塩基長以下である、請求項3に記載の翻訳促進剤。
- 前記3’非翻訳領域は、40塩基長以下である、請求項4に記載の翻訳促進剤。
- 前記3’非翻訳領域は、2個以上のAが連続するポリA配列を有する、請求項1〜5のいずれかに記載の翻訳促進剤。
- 前記3’非翻訳領域は、5個以上40個以下のAが連続する前記ポリA配列を有する、請求項6に記載の翻訳促進剤。
- 前記3’非翻訳領域は、5個以上20個以下のAが連続する前記ポリA配列を有し、全長が50個以下である、請求項6に記載の翻訳促進剤。
- 前記3’非翻訳領域は、配列番号6又は26で表される塩基配列又は当該塩基配列において1個以上5個以下の塩基を置換、付加、挿入又は欠失した塩基配列若しくは配列番号6又は26で表される塩基配列と85%以上の同一性を有する塩基配列であって、3’非翻訳領域活性を有する塩基配列を有する、請求項1〜8のいずれかに記載の翻訳促進剤。
- 前記所望のタンパク質は、任意のタンパク質のC末端にプロテインタグを備える融合タンパク質である、請求項1〜9のいずれかに記載の翻訳促進剤。
- 前記所望のタンパク質は、任意のタンパク質のN末端にプロテインタグを備える融合タンパク質である、請求項1〜9のいずれかに記載の翻訳促進剤。
- コムギ胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤である、請求項1〜11のいずれかに記載の翻訳促進剤。
- 無細胞タンパク質合成系に用いる発現ベクターであって、
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の挿入サイトの3’側に、200塩基長以下の3’非翻訳領域を保持する、ベクター。 - 前記3’非翻訳領域は、その5’側にプロテインタグをコードする領域を保持する、請求項13に記載のベクター。
- 無細胞タンパク質合成系に用いる鋳型核酸であって、
プロモーター領域と、
前記プロモーター領域によって作動可能に連結される所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域と、
請求項1〜12のいずれかに記載の翻訳促進剤からなる、前記コード領域の3’非翻訳領域と、
を備える、鋳型核酸。 - 前記コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のC末端にプロテインタグを備える融合タンパク質をコードする領域である、請求項15に記載の鋳型核酸。
- 前記コード領域は、前記所望のタンパク質として、任意のタンパク質のN末端にプロテインタグを備える融合タンパク質をコードする領域である、請求項15又は16に記載の鋳型核酸。
- 前記鋳型核酸は、転写鋳型DNAである、請求項15〜17のいずれかに記載の鋳型核酸。
- 前記鋳型核酸は、翻訳鋳型mRNAである、請求項15〜17のいずれかに記載の鋳型核酸。
- 無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型DNAを合成するためのDNAポリメラーゼ増幅に用いるプライマーセットであって、
1又は2以上のフォワードプライマーと、
1又は2以上のリバースプライマーと、
を備え、
前記1又は2以上のリバースプライマーは、請求項1〜12のいずれかに記載の翻訳促進剤又はその一部を備える、プライマーセット。 - 前記1又は2以上のリバースプライマーは、さらに、前記翻訳促進剤の3’末端側に隣接してC末端プロテインタグコード領域を備える、請求項20に記載のプライマーセット。
- 前記1又は2以上のフォワードプライマーは、N末端プロテインタグコード領域を有する、請求項20又は21に記載のプライマーセット。
- 請求項20〜22のいずれかに記載のプライマーセットと、
無細胞タンパク質合成用媒体と、
を備える、無細胞タンパク質合成キット。 - 前記無細胞タンパク質合成用媒体は、小麦胚芽由来である、請求項23に記載のキット。
- 無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型DNAの生産方法であって、
請求項20〜22のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、所望のタンパク質のコード領域を含むDNAに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型DNAを合成する工程、
を備える、方法。 - 無細胞タンパク質合成系のための翻訳鋳型の生産方法であって、
細胞の不存在下であってかつ転写鋳型DNAをmRNAに転写するための要素の存在下で請求項15〜18のいずれかに記載の鋳型核酸を用いて翻訳鋳型mRNAを合成する工程、
を備える、方法。 - タンパク質の生産方法であって、
細胞の不存在下であってかつ翻訳鋳型mRNAをタンパク質に翻訳するための要素の存在下で請求項19に記載の鋳型核酸を用いてタンパク質を合成する工程、
を備える、生産方法。 - 転写鋳型DNAのアレイであって、
複数のタンパク質に対応する請求項15〜18のいずれかに記載の複数の鋳型核酸を転写鋳型DNAとして保持する、アレイ。 - RNA安定化剤であって、
所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域の3’末端に隣接して連結される3’非翻訳領域としての200塩基長以下の核酸からなる、RNA安定化剤。
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