JP2002095483A - ｍＲＮＡの潜在的翻訳制御因子のスクリーニング方法 - Google Patents
ｍＲＮＡの潜在的翻訳制御因子のスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 in vitro進化の原理を応用し、所与の翻訳系
のなかでmRNAの翻訳効率を促進または抑制する潜在的翻
訳制御因子をスクリーニングする方法を提供する。 【解決手段】 非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補で
あるランダムオリゴヌクレオチド配列が導入されたmRNA
を合成し、未処理のものと比べて翻訳効率に変化の生じ
たmRNAを選択することを含む、mRNAの潜在的翻訳制御因
子をスクリーニングする方法、この方法でスクリーニン
グされた翻訳制御因子、ならびに、このスクリーニング
方法を使用することによって未処理のものと比べて翻訳
効率に変化の生じたmRNAを単離する方法。
のなかでmRNAの翻訳効率を促進または抑制する潜在的翻
訳制御因子をスクリーニングする方法を提供する。 【解決手段】 非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補で
あるランダムオリゴヌクレオチド配列が導入されたmRNA
を合成し、未処理のものと比べて翻訳効率に変化の生じ
たmRNAを選択することを含む、mRNAの潜在的翻訳制御因
子をスクリーニングする方法、この方法でスクリーニン
グされた翻訳制御因子、ならびに、このスクリーニング
方法を使用することによって未処理のものと比べて翻訳
効率に変化の生じたmRNAを単離する方法。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、mRNAの潜在的翻訳
制御因子をスクリーニングする方法に関する。具体的に
は、本発明は、非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補が導
入されたmRNAを合成し、未処理のもと比べて翻訳効率に
変化の生じたmRNAを選択することを含む上記方法に関す
る。
制御因子をスクリーニングする方法に関する。具体的に
は、本発明は、非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補が導
入されたmRNAを合成し、未処理のもと比べて翻訳効率に
変化の生じたmRNAを選択することを含む上記方法に関す
る。
【０００２】本発明はまた、上記方法でスクリーニング
された翻訳制御因子に関する。本発明はさらに、そのよ
うなスクリーニング方法を使用することによって未処理
のものと比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAを単離する
方法に関する。
された翻訳制御因子に関する。本発明はさらに、そのよ
うなスクリーニング方法を使用することによって未処理
のものと比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAを単離する
方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】mRNAの5'UTRや3'UTRにはmRNAの翻訳効率
を制御する因子が存在し、遺伝子の発現調節に重要な役
割を演じていることが知られている(Gallie，D.R.およ
びKobayashi, M. (1994), Gene, 142:159-165; Yamamot
o, Y.Y.ら(1995), J. Biol. Chem., 270:12466-12470;
Bailey-Serres, J. (1999), Trends Plant Sci., 4:142
-148)。このUTR配列は様々な分子機構で翻訳開始頻度に
影響を与えていると考えられている。しかしこれまで、
UTRと翻訳開始頻度との関係が実際に解析された例はほ
んの少数であり、多くの遺伝子については未解明であ
る。したがってこれらの領域にはまだ明らかになってい
ない多くの翻訳制御配列とそれらを介した制御機構が存
在していると推定される。さらにそれらの翻訳制御因子
全般に共通する性質やモチーフ、構造などが見出された
例はない。もしUTR中で機能する翻訳制御配列を体系的
に選抜する方法があれば、制御配列として機能するのに
必須な基本的性質を明らかにしたり、また目的遺伝子の
発現を翻訳段階で確実に制御する技術を確立することな
どが可能になると考えられる。
を制御する因子が存在し、遺伝子の発現調節に重要な役
割を演じていることが知られている(Gallie，D.R.およ
びKobayashi, M. (1994), Gene, 142:159-165; Yamamot
o, Y.Y.ら(1995), J. Biol. Chem., 270:12466-12470;
Bailey-Serres, J. (1999), Trends Plant Sci., 4:142
-148)。このUTR配列は様々な分子機構で翻訳開始頻度に
影響を与えていると考えられている。しかしこれまで、
UTRと翻訳開始頻度との関係が実際に解析された例はほ
んの少数であり、多くの遺伝子については未解明であ
る。したがってこれらの領域にはまだ明らかになってい
ない多くの翻訳制御配列とそれらを介した制御機構が存
在していると推定される。さらにそれらの翻訳制御因子
全般に共通する性質やモチーフ、構造などが見出された
例はない。もしUTR中で機能する翻訳制御配列を体系的
に選抜する方法があれば、制御配列として機能するのに
必須な基本的性質を明らかにしたり、また目的遺伝子の
発現を翻訳段階で確実に制御する技術を確立することな
どが可能になると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このような状況の下
で、本発明の目的は、in vitro進化の原理を応用し、所
与の翻訳系のなかでmRNAの翻訳効率を促進または抑制す
る潜在的翻訳制御因子をスクリーニングする方法を提供
することである。
で、本発明の目的は、in vitro進化の原理を応用し、所
与の翻訳系のなかでmRNAの翻訳効率を促進または抑制す
る潜在的翻訳制御因子をスクリーニングする方法を提供
することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために、個々の遺伝子のUTRを一つずつ解析
していく代わりにモデル遺伝子のin vitro分子進化系を
使って、所与の翻訳系の中で機能するUTR制御配列群を
組織的に単離し解析する手法を見出した。すなわちこの
手法は、遺伝子発現の潜在的制御部位であるUTR中にラ
ンダムな塩基配列集団を導入し、挿入された配列の効果
によって所与の翻訳系の中で優先的に翻訳されるように
なった（または、されないようになった）mRNAの選抜を
繰り返すというものである。
を達成するために、個々の遺伝子のUTRを一つずつ解析
していく代わりにモデル遺伝子のin vitro分子進化系を
使って、所与の翻訳系の中で機能するUTR制御配列群を
組織的に単離し解析する手法を見出した。すなわちこの
手法は、遺伝子発現の潜在的制御部位であるUTR中にラ
ンダムな塩基配列集団を導入し、挿入された配列の効果
によって所与の翻訳系の中で優先的に翻訳されるように
なった（または、されないようになった）mRNAの選抜を
繰り返すというものである。
【０００６】すなわち、本発明は以下のように要約され
る。本発明は、第1の態様において、非翻訳領域(UTR)に
翻訳制御因子候補であるランダムオリゴヌクレオチド配
列が導入されたmRNAを合成し、未処理のものと比べて翻
訳効率に変化の生じたmRNAを選択することを含む、mRNA
の潜在的翻訳制御因子をスクリーニングする方法を提供
する。
る。本発明は、第1の態様において、非翻訳領域(UTR)に
翻訳制御因子候補であるランダムオリゴヌクレオチド配
列が導入されたmRNAを合成し、未処理のものと比べて翻
訳効率に変化の生じたmRNAを選択することを含む、mRNA
の潜在的翻訳制御因子をスクリーニングする方法を提供
する。
【０００７】その一の実施態様において、前記mRNAの選
択は、(a)UTRに多様な翻訳制御配列候補を含むmRNA集団
をin vitroまたはin vivo翻訳系に導入してポリソーム
を生成し、(b)翻訳効率に変化の生じたｍRNAを含むポリ
ソームを分離することによって行われる。
択は、(a)UTRに多様な翻訳制御配列候補を含むmRNA集団
をin vitroまたはin vivo翻訳系に導入してポリソーム
を生成し、(b)翻訳効率に変化の生じたｍRNAを含むポリ
ソームを分離することによって行われる。
【０００８】その別の実施態様において、前記mRNAの選
択は、(c)前記分離されたポリソームからRNAを抽出し、
(d)該RNAを鋳型にしてDNA断片を合成し、このDNA断片を
鋳型にしてmRNAを合成することをさらに含む。
択は、(c)前記分離されたポリソームからRNAを抽出し、
(d)該RNAを鋳型にしてDNA断片を合成し、このDNA断片を
鋳型にしてmRNAを合成することをさらに含む。
【０００９】そのさらに別の実施態様において、前記mR
NAの選択は、(e)前記合成されたmRNAについて前記工程
(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返し、翻訳効率に変化の
生じた実質的に純粋なmRNAを単離し、（ｆ）該単離され
たmRNAについて、その中に導入された潜在的翻訳制御因
子の配列を決定することをさらに含む。
NAの選択は、(e)前記合成されたmRNAについて前記工程
(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返し、翻訳効率に変化の
生じた実質的に純粋なmRNAを単離し、（ｆ）該単離され
たmRNAについて、その中に導入された潜在的翻訳制御因
子の配列を決定することをさらに含む。
【００１０】別の実施態様において、上記の方法におい
て合成されたmRNAは、キャップ構造またはポリ（A）
鎖、あるいはそれらの両方を含むものである。すなわち
mRNAは、(1)キャップ構造およびポリ（A）鎖を有するも
の、(2)キャップ構造を有するがポリ（A）鎖をもたない
もの、または(3)キャップ構造をもたないがポリ（A）鎖
を有するものからなる。ここでポリ（A）はポリアデニ
ル酸を意味する。またキャップ構造は、真核細胞やウイ
ルスのmRNAの５'末端に存在するもので、蛋白質生合成
の開始反応等に関与するものをいう。
て合成されたmRNAは、キャップ構造またはポリ（A）
鎖、あるいはそれらの両方を含むものである。すなわち
mRNAは、(1)キャップ構造およびポリ（A）鎖を有するも
の、(2)キャップ構造を有するがポリ（A）鎖をもたない
もの、または(3)キャップ構造をもたないがポリ（A）鎖
を有するものからなる。ここでポリ（A）はポリアデニ
ル酸を意味する。またキャップ構造は、真核細胞やウイ
ルスのmRNAの５'末端に存在するもので、蛋白質生合成
の開始反応等に関与するものをいう。
【００１１】さらに別の実施態様において、前記in vit
ro翻訳系は無細胞タンパク質合成系であり、前記in viv
o翻訳系は真核細胞である。さらに別の実施態様におい
て、前記工程(b)でのポリソームの分離は該ポリソーム
のサイズに基づいて行われる。さらに別の実施態様にお
いて、前記の翻訳効率に変化の生じたｍRNAは未処理の
ものと比べて翻訳効率が高いものまたは低いものであ
り、好ましくは翻訳効率が高いものである。
ro翻訳系は無細胞タンパク質合成系であり、前記in viv
o翻訳系は真核細胞である。さらに別の実施態様におい
て、前記工程(b)でのポリソームの分離は該ポリソーム
のサイズに基づいて行われる。さらに別の実施態様にお
いて、前記の翻訳効率に変化の生じたｍRNAは未処理の
ものと比べて翻訳効率が高いものまたは低いものであ
り、好ましくは翻訳効率が高いものである。
【００１２】本発明のスクリーニング方法の具体例は、
以下のとおりである。 (1) mRNAの潜在的翻訳制御因子をスクリーニングする
方法であって、(a)非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補
であるランダムオリゴヌクレオチド配列が導入されたmR
NAを合成する工程、(b)UTRに多様な翻訳制御配列候補を
含む工程(a)からのmRNA集団をin vitroまたはin vivo翻
訳系に導入してポリソームを生成する工程、(c)工程(b)
で生成した翻訳効率に変化の生じたｍRNAを含むポリソ
ームを分離する工程、(d)工程(c)で分離されたポリソー
ムからRNAを抽出する工程、(e)工程(d)で抽出されたRNA
を鋳型にしてDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳
型にしてmRNAを合成する工程、(f)工程(e)で合成された
mRNAについて工程(b)〜(e)を少なくとも1回繰り返し、
翻訳効率に変化の生じた実質的に純粋なmRNAを単離する
工程、および(g)工程(f)で単離されたmRNAについて、そ
の中に導入された潜在的翻訳制御因子の配列を決定する
工程を含む方法。
以下のとおりである。 (1) mRNAの潜在的翻訳制御因子をスクリーニングする
方法であって、(a)非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補
であるランダムオリゴヌクレオチド配列が導入されたmR
NAを合成する工程、(b)UTRに多様な翻訳制御配列候補を
含む工程(a)からのmRNA集団をin vitroまたはin vivo翻
訳系に導入してポリソームを生成する工程、(c)工程(b)
で生成した翻訳効率に変化の生じたｍRNAを含むポリソ
ームを分離する工程、(d)工程(c)で分離されたポリソー
ムからRNAを抽出する工程、(e)工程(d)で抽出されたRNA
を鋳型にしてDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳
型にしてmRNAを合成する工程、(f)工程(e)で合成された
mRNAについて工程(b)〜(e)を少なくとも1回繰り返し、
翻訳効率に変化の生じた実質的に純粋なmRNAを単離する
工程、および(g)工程(f)で単離されたmRNAについて、そ
の中に導入された潜在的翻訳制御因子の配列を決定する
工程を含む方法。
【００１３】(2) mRNAの潜在的翻訳制御因子をスクリ
ーニングする方法であって、(a)5'非翻訳領域(5'UTR)に
翻訳制御因子候補であるランダムオリゴヌクレオチド配
列が導入された、かつキャップ構造およびポリ（A）鎖
配列を含む、ｍRNAを合成する工程、(b)5'UTRに多様な
翻訳制御配列候補を含む工程(a)からのmRNA集団をin vi
troまたはin vivo翻訳系に導入してポリソームを生成す
る工程、(c)工程(b)で生成した天然型と比べて翻訳効率
の高いｍRNAを含むポリソームをサイズに基いて分離す
る工程、(d)工程(c)で分離されたポリソームからRNAを
抽出する工程、(e)工程(d)で抽出されたRNAを鋳型にし
てDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmR
NAを合成する工程、(f)工程(e)で得られたmRNAについて
工程(b)〜(e)を少なくとも1回繰り返し、未処理のもの
と比べて翻訳効率の高いまたは低い実質的に純粋なmRNA
を単離する工程、および(g)工程(f)で単離されたmRNAに
ついて、その中に導入された潜在的翻訳制御因子の配列
を決定する工程を含む方法。
ーニングする方法であって、(a)5'非翻訳領域(5'UTR)に
翻訳制御因子候補であるランダムオリゴヌクレオチド配
列が導入された、かつキャップ構造およびポリ（A）鎖
配列を含む、ｍRNAを合成する工程、(b)5'UTRに多様な
翻訳制御配列候補を含む工程(a)からのmRNA集団をin vi
troまたはin vivo翻訳系に導入してポリソームを生成す
る工程、(c)工程(b)で生成した天然型と比べて翻訳効率
の高いｍRNAを含むポリソームをサイズに基いて分離す
る工程、(d)工程(c)で分離されたポリソームからRNAを
抽出する工程、(e)工程(d)で抽出されたRNAを鋳型にし
てDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmR
NAを合成する工程、(f)工程(e)で得られたmRNAについて
工程(b)〜(e)を少なくとも1回繰り返し、未処理のもの
と比べて翻訳効率の高いまたは低い実質的に純粋なmRNA
を単離する工程、および(g)工程(f)で単離されたmRNAに
ついて、その中に導入された潜在的翻訳制御因子の配列
を決定する工程を含む方法。
【００１４】(3) mRNAの潜在的翻訳制御因子をスクリ
ーニングする方法であって、(a)３'非翻訳領域(3'UTR)
に翻訳制御因子候補であるランダムオリゴヌクレオチド
配列が導入された、かつキャップ構造を含まずポリ
（A）鎖配列を含む、ｍRNAを合成する工程、(b)3'UTRに
多様な翻訳制御配列候補を含む工程(a)からのmRNA集団
をin vitroまたはin vivo翻訳系に導入してポリソーム
を生成する工程、(c)工程(b)で生成した天然型と比べて
翻訳効率の高いｍRNAを含むポリソームをサイズに基い
て分離する工程、(d)工程(c)で分離されたポリソームか
らRNAを抽出する工程、(e)工程(d)で抽出されたRNAを鋳
型にしてDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳型に
してmRNAを合成する工程、(f)工程(e)で得られたmRNAに
ついて工程(b)〜(e)を少なくとも1回繰り返し、未処理
のものと比べて翻訳効率の高いまたは低い実質的に純粋
なmRNAを単離する工程、および(g)工程(f)で単離された
mRNAについて、その中に導入された潜在的翻訳制御因子
の配列を決定する工程を含む方法。
ーニングする方法であって、(a)３'非翻訳領域(3'UTR)
に翻訳制御因子候補であるランダムオリゴヌクレオチド
配列が導入された、かつキャップ構造を含まずポリ
（A）鎖配列を含む、ｍRNAを合成する工程、(b)3'UTRに
多様な翻訳制御配列候補を含む工程(a)からのmRNA集団
をin vitroまたはin vivo翻訳系に導入してポリソーム
を生成する工程、(c)工程(b)で生成した天然型と比べて
翻訳効率の高いｍRNAを含むポリソームをサイズに基い
て分離する工程、(d)工程(c)で分離されたポリソームか
らRNAを抽出する工程、(e)工程(d)で抽出されたRNAを鋳
型にしてDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳型に
してmRNAを合成する工程、(f)工程(e)で得られたmRNAに
ついて工程(b)〜(e)を少なくとも1回繰り返し、未処理
のものと比べて翻訳効率の高いまたは低い実質的に純粋
なmRNAを単離する工程、および(g)工程(f)で単離された
mRNAについて、その中に導入された潜在的翻訳制御因子
の配列を決定する工程を含む方法。
【００１５】本発明は、別の態様において、翻訳効率の
高い天然型mRNAの翻訳制御因子をスクリーニングする方
法を提供する。この方法は以下の工程(a)〜(f)からな
る。 (a) 非翻訳領域に多様な翻訳制御配列を含むmRNA集団
をin vitroまたはin vivo翻訳系にかけてポリソームを
生成する工程、(b) 工程(a)で生成した翻訳効率の高い
ｍRNAを含むポリソームをサイズに基いて分離する工
程、(c) 工程(b)で分離されたポリソームからmRNAを抽
出する工程、(d) 工程(ｃ)で抽出されたRNAを鋳型にし
てDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmR
NAを合成する工程、(e) 工程(ｄ)で得られたmRNAにつ
いて工程(a)〜(ｄ)を少なくとも1回 繰り返し、翻訳
効率の高い実質的に純粋なmRNAを単離する工程、および
(f) 工程(e)で単離されたmRNAの翻訳制御因子の配列を
決定する工程。本発明はさらに、上記のスクリーニング
方法によって見出された、配列番号９〜28に示される配
列からなる群から選択される配列からなる翻訳制御因子
を提供する。
高い天然型mRNAの翻訳制御因子をスクリーニングする方
法を提供する。この方法は以下の工程(a)〜(f)からな
る。 (a) 非翻訳領域に多様な翻訳制御配列を含むmRNA集団
をin vitroまたはin vivo翻訳系にかけてポリソームを
生成する工程、(b) 工程(a)で生成した翻訳効率の高い
ｍRNAを含むポリソームをサイズに基いて分離する工
程、(c) 工程(b)で分離されたポリソームからmRNAを抽
出する工程、(d) 工程(ｃ)で抽出されたRNAを鋳型にし
てDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmR
NAを合成する工程、(e) 工程(ｄ)で得られたmRNAにつ
いて工程(a)〜(ｄ)を少なくとも1回 繰り返し、翻訳
効率の高い実質的に純粋なmRNAを単離する工程、および
(f) 工程(e)で単離されたmRNAの翻訳制御因子の配列を
決定する工程。本発明はさらに、上記のスクリーニング
方法によって見出された、配列番号９〜28に示される配
列からなる群から選択される配列からなる翻訳制御因子
を提供する。
【００１６】本発明はさらに、別の態様において、上記
のいずれかのスクリーニング方法を使用することによっ
て未処理のものと比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAを
単離する方法を提供する。特定的には、該方法は、(a)
非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補であるランダムオ
リゴヌクレオチド配列が導入されたmRNAを合成する工
程、(b)UTRに多様な翻訳制御配列候補を含む工程(a)か
らのmRNA集団をin vitroまたはin vivo翻訳系に導入し
てポリソームを生成する工程、(c)工程(b)で生成した翻
訳効率に変化の生じたｍRNAを含むポリソームを分離す
る工程、(d)工程(c)で分離されたポリソームからRNAを
抽出する工程、(e)工程(d)で抽出されたRNAを鋳型にし
てDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmR
NAを合成する工程、(f) 工程(e)で合成されたmRNAにつ
いて工程(b)〜(e)を少なくとも1回繰り返し、翻訳効率
に変化の生じた実質的に純粋なmRNAを単離する工程を含
む。上記工程(a)のmRNAは、キャップ構造またはポリ
（A）鎖、あるいはそれらの両方を含むことができる。
のいずれかのスクリーニング方法を使用することによっ
て未処理のものと比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAを
単離する方法を提供する。特定的には、該方法は、(a)
非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補であるランダムオ
リゴヌクレオチド配列が導入されたmRNAを合成する工
程、(b)UTRに多様な翻訳制御配列候補を含む工程(a)か
らのmRNA集団をin vitroまたはin vivo翻訳系に導入し
てポリソームを生成する工程、(c)工程(b)で生成した翻
訳効率に変化の生じたｍRNAを含むポリソームを分離す
る工程、(d)工程(c)で分離されたポリソームからRNAを
抽出する工程、(e)工程(d)で抽出されたRNAを鋳型にし
てDNA断片を合成し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmR
NAを合成する工程、(f) 工程(e)で合成されたmRNAにつ
いて工程(b)〜(e)を少なくとも1回繰り返し、翻訳効率
に変化の生じた実質的に純粋なmRNAを単離する工程を含
む。上記工程(a)のmRNAは、キャップ構造またはポリ
（A）鎖、あるいはそれらの両方を含むことができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明の方法をさらに具体的に説
明する。本方法は、非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候
補であるランダムオリゴヌクレオチド配列が導入された
mRNAを合成し、未処理のものと比べて翻訳効率に変化の
生じたmRNAを選択することを含む。mRNAは例えば以下の
ようにして合成することができる。
明する。本方法は、非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候
補であるランダムオリゴヌクレオチド配列が導入された
mRNAを合成し、未処理のものと比べて翻訳効率に変化の
生じたmRNAを選択することを含む。mRNAは例えば以下の
ようにして合成することができる。
【００１８】任意のタンパク質をコードするDNAを鋳型
にし、ランダムオリゴヌクレオチド配列を有する5'UTR
または3'UTRプライマー（ただし、順方向プライマーの
5'末端側にプロモーター配列(例えばT7など)を付加し、
一方逆方向プライマーの5'末端側に必要に応じてポリ
(T)配列を付加する。）を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）を行い、図1に示すような2種類の二本鎖DNA（ラ
ンダム5'UTRおよびランダム3'UTR）を作製する。続い
て、この二つのPCR産物を鋳型にin vitro転写を行い、
上記二本鎖DNAの各々に対応するキャップをもったmRNA
とキャップをもたないmRNAを合成する。この手法により
ランダム配列が5'UTRまたは3'UTRに導入されたmRNA集団
を調製することができる(図１のa'およびb')。
にし、ランダムオリゴヌクレオチド配列を有する5'UTR
または3'UTRプライマー（ただし、順方向プライマーの
5'末端側にプロモーター配列(例えばT7など)を付加し、
一方逆方向プライマーの5'末端側に必要に応じてポリ
(T)配列を付加する。）を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）を行い、図1に示すような2種類の二本鎖DNA（ラ
ンダム5'UTRおよびランダム3'UTR）を作製する。続い
て、この二つのPCR産物を鋳型にin vitro転写を行い、
上記二本鎖DNAの各々に対応するキャップをもったmRNA
とキャップをもたないmRNAを合成する。この手法により
ランダム配列が5'UTRまたは3'UTRに導入されたmRNA集団
を調製することができる(図１のa'およびb')。
【００１９】ランダムオリゴヌクレオチドは、塩基数10
以上、好ましくは10〜100、より好ましくは15〜20を有す
る。ランダムオリゴヌクレオチド配列上の各位置にはア
デニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、シトシン(C)の４
つの塩基のいずれかが配置されており、したがってオリ
ゴヌクレオチドの塩基数が例えばｎ個の場合、４n個か
らなるオリゴヌクレオチド配列の各々を含むDNAが得ら
れることになる。
以上、好ましくは10〜100、より好ましくは15〜20を有す
る。ランダムオリゴヌクレオチド配列上の各位置にはア
デニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、シトシン(C)の４
つの塩基のいずれかが配置されており、したがってオリ
ゴヌクレオチドの塩基数が例えばｎ個の場合、４n個か
らなるオリゴヌクレオチド配列の各々を含むDNAが得ら
れることになる。
【００２０】PCRは文献等に記載される慣用の条件を使
用することができる(蛋白質・核酸・酵素第41巻第5号19
96年(4月増刊号); F.M. Ausubelら, Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.な
ど)。RCRは例えば、ウォーターバスまたは自動サーマル
サイクラー中にて、耐熱性DNAポリメラーゼ（例えばAmp
li Taq（パーキンエルマー社）、Takara Taq(宝酒造)な
ど）、鋳型DNA、上記プライマーの存在下、DNAの変性
（９４℃、約１５〜３０秒）、プライマーのアニーリン
グ（５５℃、約３０秒〜1分）、および4種類の基質（dN
TP）の共存下での伸長反応（７２℃、約３０秒〜１０
分）を１サイクルとして約２５〜約４０サイクル実施し
たのち、７２℃、約５〜１０分の加熱処理を１サイクル
実施することによって行われる。
用することができる(蛋白質・核酸・酵素第41巻第5号19
96年(4月増刊号); F.M. Ausubelら, Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.な
ど)。RCRは例えば、ウォーターバスまたは自動サーマル
サイクラー中にて、耐熱性DNAポリメラーゼ（例えばAmp
li Taq（パーキンエルマー社）、Takara Taq(宝酒造)な
ど）、鋳型DNA、上記プライマーの存在下、DNAの変性
（９４℃、約１５〜３０秒）、プライマーのアニーリン
グ（５５℃、約３０秒〜1分）、および4種類の基質（dN
TP）の共存下での伸長反応（７２℃、約３０秒〜１０
分）を１サイクルとして約２５〜約４０サイクル実施し
たのち、７２℃、約５〜１０分の加熱処理を１サイクル
実施することによって行われる。
【００２１】鋳型DNAは、自動合成機を用いて化学的に
作製されてもよいし、あるいは適当な供給源からcDNAク
ローニングによるかまたは適当なcDNAもしくはゲノムラ
イブラリーからの単離によって得ることができる。ｃDN
Aクローニングの手法は例えばSambrookら, Molecular C
loning,第2版(1989年)（Cold Spring Harbor Laborator
y Press）に記載されており参照できる。
作製されてもよいし、あるいは適当な供給源からcDNAク
ローニングによるかまたは適当なcDNAもしくはゲノムラ
イブラリーからの単離によって得ることができる。ｃDN
Aクローニングの手法は例えばSambrookら, Molecular C
loning,第2版(1989年)（Cold Spring Harbor Laborator
y Press）に記載されており参照できる。
【００２２】UTRに多様な翻訳制御配列候補を含むmRNA
集団を作製した後、該mRNA集団の中から、未処理のもの
と比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAを選択し、これに
よって潜在的翻訳制御配列を確定することができる。こ
の選択の第一段階において、mRNA集団をin vitroまたは
in vivo翻訳系に導入してポリソームを生成する。invit
ro翻訳系は所謂、無細胞タンパク質合成系をいい、通
常、リボソームや翻訳因子、tRNAなどタンパク合成に必
要な諸因子を含有する細胞抽出液(例えば小麦胚芽抽出
液、大腸菌抽出液など)が使用される（Madin, K.ら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:559 (2000), Kigawa,
T.ら, FEBS Lett., 442:15 (1999)など）。in vitro翻
訳系では、mRNA集団をこの系に直接添加してポリソーム
を形成する。一方in vivo翻訳系では、真核細胞(例えば
カエルの卵母細胞など)を直接使用する。この場合mRNA
集団はパーティクルガンや顕微注入などの手法で真核細
胞内に導入され、適切な培地中で培養される。培養条件
としては慣用のものを使用できる。
集団を作製した後、該mRNA集団の中から、未処理のもの
と比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAを選択し、これに
よって潜在的翻訳制御配列を確定することができる。こ
の選択の第一段階において、mRNA集団をin vitroまたは
in vivo翻訳系に導入してポリソームを生成する。invit
ro翻訳系は所謂、無細胞タンパク質合成系をいい、通
常、リボソームや翻訳因子、tRNAなどタンパク合成に必
要な諸因子を含有する細胞抽出液(例えば小麦胚芽抽出
液、大腸菌抽出液など)が使用される（Madin, K.ら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:559 (2000), Kigawa,
T.ら, FEBS Lett., 442:15 (1999)など）。in vitro翻
訳系では、mRNA集団をこの系に直接添加してポリソーム
を形成する。一方in vivo翻訳系では、真核細胞(例えば
カエルの卵母細胞など)を直接使用する。この場合mRNA
集団はパーティクルガンや顕微注入などの手法で真核細
胞内に導入され、適切な培地中で培養される。培養条件
としては慣用のものを使用できる。
【００２３】ポリソームは1本のmRNAに複数のリボソー
ムが同時に結合してタンパク合成が行われている状態の
ものであり、リボソームの数(通常数個〜数十個)に応じ
てその重量が異なる。これは、UTRにランダム配列をも
つmRNAの中には翻訳効率の高くなったmRNAや低くなった
mRNAが生じ、様々な翻訳効率をもつmRNAの集団が形成さ
れる可能性があるからである。翻訳効率の高いmRNAが翻
訳されたときには、mRNAにリボソームがたくさん結合し
ている所謂大きなポリソームが生じ、逆に翻訳効率の低
いmRNAが翻訳されたときには、mRNAにリボソームがあま
り結合していない所謂小さなポリソームが生じるので、
ポリソームのサイズの違いを基にこのmRNA集団を分離す
れば、翻訳効率に変化の生じたmRNAを分画することがで
きる。invivo翻訳系として真核細胞を使用するときに
は、ポリソームの一部が小胞体に結合して存在している
ため、分離操作に先立ってポリソームを例えば界面活性
剤処理により小胞体から解離させる必要がある。
ムが同時に結合してタンパク合成が行われている状態の
ものであり、リボソームの数(通常数個〜数十個)に応じ
てその重量が異なる。これは、UTRにランダム配列をも
つmRNAの中には翻訳効率の高くなったmRNAや低くなった
mRNAが生じ、様々な翻訳効率をもつmRNAの集団が形成さ
れる可能性があるからである。翻訳効率の高いmRNAが翻
訳されたときには、mRNAにリボソームがたくさん結合し
ている所謂大きなポリソームが生じ、逆に翻訳効率の低
いmRNAが翻訳されたときには、mRNAにリボソームがあま
り結合していない所謂小さなポリソームが生じるので、
ポリソームのサイズの違いを基にこのmRNA集団を分離す
れば、翻訳効率に変化の生じたmRNAを分画することがで
きる。invivo翻訳系として真核細胞を使用するときに
は、ポリソームの一部が小胞体に結合して存在している
ため、分離操作に先立ってポリソームを例えば界面活性
剤処理により小胞体から解離させる必要がある。
【００２４】分離法の例には、密度勾配遠心法(例えば
ショ糖、塩化セシウム法など)、電気泳動（例えばキャ
ピラリィー電気泳動など）、ゲル濾過またはゲル浸透ク
ロマトグラフィーなどが含まれる。一般に、翻訳効率の
高いmRNA分子は、一分子あたりより多くのリボソームと
結合しているので沈降速度のより大きなポリソーム画分
に分布し、一方、翻訳効率の低いmRNA分子は沈降速度の
より小さいポリソーム画分に分布する。しかし一回の分
画ではその分離能にも限界があるため、目的のmRNAの分
離をさらに少なくとも1回、好ましくは２〜10回、さら
に好ましくは５〜8回行うのが望ましい。この場合、先
ず、分離したポリソームからRNAを抽出する。次いで、R
NAを鋳型にして逆転写(例えばRT-PCR)によりDNA断片を
合成し、このとき必要に応じてプロモーター配列、ポリ
（T）配列を付加し、さらにこのDNAを鋳型にしてmRNAを
合成する。次にｍRNAをin vitroまたはin vivo翻訳系に
導入し、目的のポリソームを分離し、ポリソームからRNA
を分離し、RNAからDNAついでDNAからmRNAを順次合成
し、目的のmRNAが単離されるまでこのサイクルを繰り返
す。 35S-Cysの取込みを利用した翻訳活性の測定（後述
の実施例３参照）によってスクリーニングされた未処理
のものに比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAについて、
その中に導入された潜在的翻訳制御配列を配列決定法に
より決定する。
ショ糖、塩化セシウム法など)、電気泳動（例えばキャ
ピラリィー電気泳動など）、ゲル濾過またはゲル浸透ク
ロマトグラフィーなどが含まれる。一般に、翻訳効率の
高いmRNA分子は、一分子あたりより多くのリボソームと
結合しているので沈降速度のより大きなポリソーム画分
に分布し、一方、翻訳効率の低いmRNA分子は沈降速度の
より小さいポリソーム画分に分布する。しかし一回の分
画ではその分離能にも限界があるため、目的のmRNAの分
離をさらに少なくとも1回、好ましくは２〜10回、さら
に好ましくは５〜8回行うのが望ましい。この場合、先
ず、分離したポリソームからRNAを抽出する。次いで、R
NAを鋳型にして逆転写(例えばRT-PCR)によりDNA断片を
合成し、このとき必要に応じてプロモーター配列、ポリ
（T）配列を付加し、さらにこのDNAを鋳型にしてmRNAを
合成する。次にｍRNAをin vitroまたはin vivo翻訳系に
導入し、目的のポリソームを分離し、ポリソームからRNA
を分離し、RNAからDNAついでDNAからmRNAを順次合成
し、目的のmRNAが単離されるまでこのサイクルを繰り返
す。 35S-Cysの取込みを利用した翻訳活性の測定（後述
の実施例３参照）によってスクリーニングされた未処理
のものに比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAについて、
その中に導入された潜在的翻訳制御配列を配列決定法に
より決定する。
【００２５】下記においては、添付の図面を参照しなが
ら本発明をさらに具体的に説明する。出発遺伝子として
β-グルクロニダーゼ(GUSという)遺伝子を改変したモデ
ル遺伝子を例として用いて本発明方法の各工程を説明す
る。
ら本発明をさらに具体的に説明する。出発遺伝子として
β-グルクロニダーゼ(GUSという)遺伝子を改変したモデ
ル遺伝子を例として用いて本発明方法の各工程を説明す
る。
【００２６】Conrad, R.C.ら（In Smith, C.W.J. (ed.)
RNA: Protein Interactions. A Practical Approach.
Oxford University Press, New York, pp.285-325）に
よる方法を用いて、5'UTRまたは3'UTRに15塩基のランダ
ム配列をもつプライマーを設計し、順方向プライマーの
5'末端側にはT7プロモーター（Lanar, D.E. およびKai
n, K.C. (1995), Expression-PCR. In Dieffenbach, C.
W. and Dveksler, G.S.(eds.), PCR Primer. A Laborat
ory Manual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Co
ld Spring Harbor, NY, pp.371-377）の配列を付加し
た。逆方向プライマーには、GUSコード領域の前半の312
塩基がORFになるように終止コドンを導入し、また、転
写されたmRNAがポリ（A）をもつように、5'末端側には5
0塩基のポリ（T）を付加した。次に、これらのプライマ
ーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、図1に
示す2種類の二本鎖DNA、すなわちランダム5'UTRとラン
ダム3'UTRを作製した。続いて、この二つのPCR産物を鋳
型にin vitro転写を行い、上記二本鎖DNAのそれぞれに
キャップをもったmRNAとキャップをもたないmRNAを合成
した。この手法によりランダム配列が5'UTR、3'UTRのそ
れぞれに導入されたmRNA集団を調製した(図１のa'およ
びb')。
RNA: Protein Interactions. A Practical Approach.
Oxford University Press, New York, pp.285-325）に
よる方法を用いて、5'UTRまたは3'UTRに15塩基のランダ
ム配列をもつプライマーを設計し、順方向プライマーの
5'末端側にはT7プロモーター（Lanar, D.E. およびKai
n, K.C. (1995), Expression-PCR. In Dieffenbach, C.
W. and Dveksler, G.S.(eds.), PCR Primer. A Laborat
ory Manual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Co
ld Spring Harbor, NY, pp.371-377）の配列を付加し
た。逆方向プライマーには、GUSコード領域の前半の312
塩基がORFになるように終止コドンを導入し、また、転
写されたmRNAがポリ（A）をもつように、5'末端側には5
0塩基のポリ（T）を付加した。次に、これらのプライマ
ーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、図1に
示す2種類の二本鎖DNA、すなわちランダム5'UTRとラン
ダム3'UTRを作製した。続いて、この二つのPCR産物を鋳
型にin vitro転写を行い、上記二本鎖DNAのそれぞれに
キャップをもったmRNAとキャップをもたないmRNAを合成
した。この手法によりランダム配列が5'UTR、3'UTRのそ
れぞれに導入されたmRNA集団を調製した(図１のa'およ
びb')。
【００２７】小麦胚芽in vitro翻訳系を用いて翻訳反応
を行い、実際にショ糖密度勾配遠心によって沈降係数の
違いを基にポリソームを分離した（Davis, E.およびAb
e, S.(1995), In Galbraith, D.W. et al. (eds.) Meth
ods in Plant Cell Biology,Academic Press, San Dieg
o, pp.209-222）。しかし、一度の分離では翻訳効率の高
くなったmRNAと低くなったmRNAを十分に分離することは
できなかった。これは同じmRNA分子種でもリボソームの
結合する数にはある程度のゆらぎがあり、そのためポリ
ソームRNAの分離回収、RT-PCRとin vitro転写によるmRN
Aの合成、翻訳反応、ショ糖密度勾配遠心法による再分
離、の一連の過程を何度か繰り返した(図2)。その結
果、以下に述べるように、ランダム塩基配列の導入によ
って翻訳開始頻度が上昇/低下したmRNAを段階的に濃縮
できることを見出した。
を行い、実際にショ糖密度勾配遠心によって沈降係数の
違いを基にポリソームを分離した（Davis, E.およびAb
e, S.(1995), In Galbraith, D.W. et al. (eds.) Meth
ods in Plant Cell Biology,Academic Press, San Dieg
o, pp.209-222）。しかし、一度の分離では翻訳効率の高
くなったmRNAと低くなったmRNAを十分に分離することは
できなかった。これは同じmRNA分子種でもリボソームの
結合する数にはある程度のゆらぎがあり、そのためポリ
ソームRNAの分離回収、RT-PCRとin vitro転写によるmRN
Aの合成、翻訳反応、ショ糖密度勾配遠心法による再分
離、の一連の過程を何度か繰り返した(図2)。その結
果、以下に述べるように、ランダム塩基配列の導入によ
って翻訳開始頻度が上昇/低下したmRNAを段階的に濃縮
できることを見出した。
【００２８】図3Aに、キャップとポリ（A）をもちラン
ダム配列を5'UTRに導入した構築物を用いて、また図3B
に、キャップとポリ（A）をもちランダム配列を3'UTRに
導入した構築物を用いて、それぞれ上記の濃縮サイクル
を行った結果を示した。3'UTRについては活性の上昇が
見られなかったのに対し、5'UTRにおいて初期集団に対
して約3倍の翻訳活性の上昇したmRNA集団を分離するこ
とができた。また両方の構築物の低活性画分において、
約4分の1に活性が低下したmRNA集団を分離することがで
きた。5'UTRで分離できた高活性集団と低活性集団の間
には約10倍もの活性の差が見られた。これらの結果は、
キャップとポリ（A）をもつmRNAでは、翻訳を促進する
ための配列としては主に5'UTRが機能していることを示
唆している。
ダム配列を5'UTRに導入した構築物を用いて、また図3B
に、キャップとポリ（A）をもちランダム配列を3'UTRに
導入した構築物を用いて、それぞれ上記の濃縮サイクル
を行った結果を示した。3'UTRについては活性の上昇が
見られなかったのに対し、5'UTRにおいて初期集団に対
して約3倍の翻訳活性の上昇したmRNA集団を分離するこ
とができた。また両方の構築物の低活性画分において、
約4分の1に活性が低下したmRNA集団を分離することがで
きた。5'UTRで分離できた高活性集団と低活性集団の間
には約10倍もの活性の差が見られた。これらの結果は、
キャップとポリ（A）をもつmRNAでは、翻訳を促進する
ための配列としては主に5'UTRが機能していることを示
唆している。
【００２９】真核生物の翻訳開始反応では、キャップ構
造が重要な役割をもっていることが知られている（Ging
ras，A.C.ら(1999), Annu. Rev. Biochem., 68:913-96
3）。また多くのRNAウイルスでは、宿主細胞中のキャッ
プ依存性翻訳開始装置を特異的なタンパク質分解酵素に
よって破壊し、キャップ非依存的な翻訳開始機構をとる
自分のmRNAを優先的に翻訳させる例が知られている（Eh
renfeld, E. (1996):In Hershey, J.W.B et al. (ed
s.), Translational Control. Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp.549-57
3）。そこで、キャップ構造が翻訳制御因子の出現に与
える影響を本発明の方法で検証するため、キャップをも
たないポリ（A）mRNAの5'UTRまたは3'UTRにランダム配
列を導入し、上述と同様の実験を行った(図３のCおよび
D)。その結果、3'UTRに導入したものでは約3倍の翻訳活
性の上昇が見られた。低活性集団は約2分の1に活性が低
下しており、高活性集団との差は約6倍であった。
造が重要な役割をもっていることが知られている（Ging
ras，A.C.ら(1999), Annu. Rev. Biochem., 68:913-96
3）。また多くのRNAウイルスでは、宿主細胞中のキャッ
プ依存性翻訳開始装置を特異的なタンパク質分解酵素に
よって破壊し、キャップ非依存的な翻訳開始機構をとる
自分のmRNAを優先的に翻訳させる例が知られている（Eh
renfeld, E. (1996):In Hershey, J.W.B et al. (ed
s.), Translational Control. Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp.549-57
3）。そこで、キャップ構造が翻訳制御因子の出現に与
える影響を本発明の方法で検証するため、キャップをも
たないポリ（A）mRNAの5'UTRまたは3'UTRにランダム配
列を導入し、上述と同様の実験を行った(図３のCおよび
D)。その結果、3'UTRに導入したものでは約3倍の翻訳活
性の上昇が見られた。低活性集団は約2分の1に活性が低
下しており、高活性集団との差は約6倍であった。
【００３０】上記の結果は、5'UTR上の翻訳制御配列が
十分その能力を発揮するためにはキャップとポリ（A）
が必要であること、一方3'UTR上の配列にはキャップの
欠損を補う効果をもった翻訳促進配列を出現させうるこ
とを示している。とりわけキャップ非依存的翻訳促進配
列が3'UTRに出現したという事実は、５'キャップのある
べき位置（５'末端）と３'UTRが遠く離れていることを
考えると全く驚くべきことである。
十分その能力を発揮するためにはキャップとポリ（A）
が必要であること、一方3'UTR上の配列にはキャップの
欠損を補う効果をもった翻訳促進配列を出現させうるこ
とを示している。とりわけキャップ非依存的翻訳促進配
列が3'UTRに出現したという事実は、５'キャップのある
べき位置（５'末端）と３'UTRが遠く離れていることを
考えると全く驚くべきことである。
【００３１】次に、翻訳活性の高まったmRNA集団が得ら
れた２つの例、すなわちキャップをもつmRNAの5'UTRに
ランダム配列を導入した例と、キャップをもたないmRNA
の3'UTRにランダム配列を導入した例について、得られ
た高翻訳mRNA集団から個々のcDNAのクローニングを行っ
た。図4にクローニングした構築物のランダム領域の配
列と、そのクローンの翻訳活性を測定した結果を示す。
翻訳活性を高めた潜在的翻訳制御配列の例を以下に示す
（図4A,図４B参照）。 (5'UTRに導入されたランダム配列) AGGUUGCAUAUUCCG (配列番号９) UCUAUUGGUUUCAAC（配列番号10） UAGAUAUCCGCGCUU（配列番号11） AUACUCGCGUUAUCA（配列番号12） ACAGUGCCUAAUCCU（配列番号13） ACUGCAAGUCCGCUC（配列番号14） GCAUAUUAGCACCGC（配列番号15） GAGCUGCCAGGUUGC（配列番号16） AGUACCAUACUCUU（配列番号17） AACCUUUGCUUUCGC（配列番号18） (3'UTRに導入されたランダム配列) UACUUAUAUCUCCAA（配列番号19） GUACCCACGGCGUUA（配列番号20） AACUACUUACCUUAA（配列番号21） CACAAGCCGCCUUAA（配列番号22） UUGUCGGUUGUCCAU（配列番号23） UCUGGAUACUCUCUG（配列番号24） AUACACUGUCCUAUA（配列番号25） CCAGAUAUAACCACA（配列番号26） UUUUCACACUCGCCU（配列番号27） GCGAUGAUACUUUGC（配列番号28）
れた２つの例、すなわちキャップをもつmRNAの5'UTRに
ランダム配列を導入した例と、キャップをもたないmRNA
の3'UTRにランダム配列を導入した例について、得られ
た高翻訳mRNA集団から個々のcDNAのクローニングを行っ
た。図4にクローニングした構築物のランダム領域の配
列と、そのクローンの翻訳活性を測定した結果を示す。
翻訳活性を高めた潜在的翻訳制御配列の例を以下に示す
（図4A,図４B参照）。 (5'UTRに導入されたランダム配列) AGGUUGCAUAUUCCG (配列番号９) UCUAUUGGUUUCAAC（配列番号10） UAGAUAUCCGCGCUU（配列番号11） AUACUCGCGUUAUCA（配列番号12） ACAGUGCCUAAUCCU（配列番号13） ACUGCAAGUCCGCUC（配列番号14） GCAUAUUAGCACCGC（配列番号15） GAGCUGCCAGGUUGC（配列番号16） AGUACCAUACUCUU（配列番号17） AACCUUUGCUUUCGC（配列番号18） (3'UTRに導入されたランダム配列) UACUUAUAUCUCCAA（配列番号19） GUACCCACGGCGUUA（配列番号20） AACUACUUACCUUAA（配列番号21） CACAAGCCGCCUUAA（配列番号22） UUGUCGGUUGUCCAU（配列番号23） UCUGGAUACUCUCUG（配列番号24） AUACACUGUCCUAUA（配列番号25） CCAGAUAUAACCACA（配列番号26） UUUUCACACUCGCCU（配列番号27） GCGAUGAUACUUUGC（配列番号28）
【００３２】分離した高活性集団から得られたクローン
の配列に共通する性質は一見してみあたらなかった。こ
のことはあるmRNAの翻訳を促進するUTR配列は一通りで
はないことを示している。in vitro進化によってある核
酸結合タンパク質の結合配列を選抜する場合、その配列
はある決まったものに収束していくことが多い（Szozta
k, J.W. (1992), Trends in Biochemical Sciences, 1
7:89-93）。ところが、翻訳反応という非常に複雑な生
化学反応では、UTR翻訳制御配列の選抜に影響を与える
因子は多種多様であると考えられる。すなわち翻訳反応
に関わるすべてのタンパク質やRNAが、その選抜に影響
を与える可能性を有している。UTR配列の選抜に多くの
因子が関わったいくつもの制御機構が関係しているため
に、ある決まった配列が現れない理由であると推定され
る。下記の実施例によって本発明をさらに説明するが、
本発明はこれらの具体例に限定されないものである。
の配列に共通する性質は一見してみあたらなかった。こ
のことはあるmRNAの翻訳を促進するUTR配列は一通りで
はないことを示している。in vitro進化によってある核
酸結合タンパク質の結合配列を選抜する場合、その配列
はある決まったものに収束していくことが多い（Szozta
k, J.W. (1992), Trends in Biochemical Sciences, 1
7:89-93）。ところが、翻訳反応という非常に複雑な生
化学反応では、UTR翻訳制御配列の選抜に影響を与える
因子は多種多様であると考えられる。すなわち翻訳反応
に関わるすべてのタンパク質やRNAが、その選抜に影響
を与える可能性を有している。UTR配列の選抜に多くの
因子が関わったいくつもの制御機構が関係しているため
に、ある決まった配列が現れない理由であると推定され
る。下記の実施例によって本発明をさらに説明するが、
本発明はこれらの具体例に限定されないものである。
【００３３】
【実施例】実施例１ UTRにランダム配列を導入したGUS
mRNAの作製 下記の順方向プライマーおよび逆方向プライマー： (1)5'-GCAGGCCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCTCTAGAACTAGTG
GATCC-(N)15-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT-3' (配
列番号１) (2)5'-(T)50-CGAGCTCGAGATTCACACTTCCTGATTATTGACCCACA
CT-3'(配列番号２) (3)5'-GCCTGCAGGGCCTAATACGACTCACTATAGGGATCCCTTATGTT
ACGTCCTGTAGAAACCCCA-3'(配列番号３) (4)5'-CCCTCGAGGTCGACGGTATCG-(N)15-GAGCTCGAGATTCACA
CTTCCTGATTATTGA-3'(配列番号４) (5)5'-(T)50-CCCTCGAGGTCGACGGTATCG-3'(配列番号５) をそれぞれ組合わせて、PCRによりランダム配列をGUS遺
伝子の5'UTRまたは3'UTRに導入し、図1に示すような二
本鎖DNA断片を調製した（LanarおよびKain、前掲）。
mRNAの作製 下記の順方向プライマーおよび逆方向プライマー： (1)5'-GCAGGCCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCTCTAGAACTAGTG
GATCC-(N)15-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT-3' (配
列番号１) (2)5'-(T)50-CGAGCTCGAGATTCACACTTCCTGATTATTGACCCACA
CT-3'(配列番号２) (3)5'-GCCTGCAGGGCCTAATACGACTCACTATAGGGATCCCTTATGTT
ACGTCCTGTAGAAACCCCA-3'(配列番号３) (4)5'-CCCTCGAGGTCGACGGTATCG-(N)15-GAGCTCGAGATTCACA
CTTCCTGATTATTGA-3'(配列番号４) (5)5'-(T)50-CCCTCGAGGTCGACGGTATCG-3'(配列番号５) をそれぞれ組合わせて、PCRによりランダム配列をGUS遺
伝子の5'UTRまたは3'UTRに導入し、図1に示すような二
本鎖DNA断片を調製した（LanarおよびKain、前掲）。
【００３４】3'UTRにランダム配列を導入した構築物
は、先ずプライマー(3)と(4)を用いて作製し、この断片
を鋳型としてプライマー(3)と(5)を用いてPCRを行って
ポリ（A）尾部を付加した。キャップをもったmRNAの合
成には、Ambion社のmMESSAGE mMACHINE T7 Kit(反応液
中にキャップアナローグを含む)を、またキャップをも
たないものには同社のMega Script T7 Kit（反応液中に
キャップアナローグを含まない）を用いて、in vitro転
写を行い、5'UTR、3'UTRにランダム配列を導入したmRNA
を調製した。
は、先ずプライマー(3)と(4)を用いて作製し、この断片
を鋳型としてプライマー(3)と(5)を用いてPCRを行って
ポリ（A）尾部を付加した。キャップをもったmRNAの合
成には、Ambion社のmMESSAGE mMACHINE T7 Kit(反応液
中にキャップアナローグを含む)を、またキャップをも
たないものには同社のMega Script T7 Kit（反応液中に
キャップアナローグを含まない）を用いて、in vitro転
写を行い、5'UTR、3'UTRにランダム配列を導入したmRNA
を調製した。
【００３５】実施例２ 小麦胚芽in vitro翻訳系での翻
訳反応 図1に示したmRNAを、全アミノ酸を含む100μlの小麦胚
芽in vitro翻訳系(Promega社)で、25℃、活性画分のmRNA
で10分、不活性画分のmRNAで30分間翻訳した（図2、ステ
ップｂ）。反応後、氷冷した100μlのU-Buffer(200mM T
ris-HCl, pH8.5,50mM KCl, 25mM MgCl2, 2mM EDTA, 100
μg/mlヘパリン,2%ポリオキシエチレン10-トリデシルエ
ーテル,1%デオキシコール酸ナトリウム)を加えて反応を
停止させた。この反応液を、ショ糖密度勾配（50mM Tri
s-HCl, pH8.5, 25mM KCl, 10mM MgCl2, 15-60%ショ糖）
をつけた溶液の入ったチューブに160μl載せ、125，000
ｇで３時間遠心した(DavisおよびAbe,前掲)。遠心後、
フラクションコレクターで約１mlずつ12フラクションに
分画した(図2、ステップｃ)。これらの画分からRNAを回
収し、SUPERSCRIPTTM ONE-STEPTM RT-PCR System（GIBC
OBRL社）によって二本鎖DNAを作製した(図2、ステップ
e)。このとき5'UTRにランダム配列を導入したmRNAに
は、順方向プライマー： 5'-GCAGGCCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCTCTAGAACTAGTGGAT
C-3'（配列番号６） と、逆方向プライマー(配列番号２)を用いた。3'UTRに
ランダム配列を導入したmRNAには、順方向プライマー
(配列番号３)および逆方向プライマー(配列番号５)を用
いた。これらの断片を用いてin vitro転写を行い、再度
mRNAを作製し(図2、ステップa)、図2に太線で示したサ
イクルを繰り返し行った。濃縮サイクルの3回目以降に
は競合体となるRNAを加えて翻訳反応を行った。
訳反応 図1に示したmRNAを、全アミノ酸を含む100μlの小麦胚
芽in vitro翻訳系(Promega社)で、25℃、活性画分のmRNA
で10分、不活性画分のmRNAで30分間翻訳した（図2、ステ
ップｂ）。反応後、氷冷した100μlのU-Buffer(200mM T
ris-HCl, pH8.5,50mM KCl, 25mM MgCl2, 2mM EDTA, 100
μg/mlヘパリン,2%ポリオキシエチレン10-トリデシルエ
ーテル,1%デオキシコール酸ナトリウム)を加えて反応を
停止させた。この反応液を、ショ糖密度勾配（50mM Tri
s-HCl, pH8.5, 25mM KCl, 10mM MgCl2, 15-60%ショ糖）
をつけた溶液の入ったチューブに160μl載せ、125，000
ｇで３時間遠心した(DavisおよびAbe,前掲)。遠心後、
フラクションコレクターで約１mlずつ12フラクションに
分画した(図2、ステップｃ)。これらの画分からRNAを回
収し、SUPERSCRIPTTM ONE-STEPTM RT-PCR System（GIBC
OBRL社）によって二本鎖DNAを作製した(図2、ステップ
e)。このとき5'UTRにランダム配列を導入したmRNAに
は、順方向プライマー： 5'-GCAGGCCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCTCTAGAACTAGTGGAT
C-3'（配列番号６） と、逆方向プライマー(配列番号２)を用いた。3'UTRに
ランダム配列を導入したmRNAには、順方向プライマー
(配列番号３)および逆方向プライマー(配列番号５)を用
いた。これらの断片を用いてin vitro転写を行い、再度
mRNAを作製し(図2、ステップa)、図2に太線で示したサ
イクルを繰り返し行った。濃縮サイクルの3回目以降に
は競合体となるRNAを加えて翻訳反応を行った。
【００３６】競合体mRNAにはホタルルシフェラーゼ遺伝
子を改変したものを用いた。キャップをもつmRNAを選抜
するときには、キャップをもつmRNAを競合体に用い、キ
ャップをもたないmRNAを選抜するときには、キャップを
もたないmRNAを競合体に用いた。図1で示した方法と同
様にして、前半の321塩基がORFになるように下記の２つ
のプライマー(配列番号７と８)： 5'-GCAGGCCTAATACGACTCACTATAGGGATCCAAATGGAAGACGCCAA
AAACATAAAGAA-3'(配列番号７) 5'-(T)50-CGAGCTCGAGATTTTAGTTCGCGGGCGCAACTGCAACTCCG
AT-3'(配列番号８) を設計し、PCRによって鋳型用DNA断片を得た。
子を改変したものを用いた。キャップをもつmRNAを選抜
するときには、キャップをもつmRNAを競合体に用い、キ
ャップをもたないmRNAを選抜するときには、キャップを
もたないmRNAを競合体に用いた。図1で示した方法と同
様にして、前半の321塩基がORFになるように下記の２つ
のプライマー(配列番号７と８)： 5'-GCAGGCCTAATACGACTCACTATAGGGATCCAAATGGAAGACGCCAA
AAACATAAAGAA-3'(配列番号７) 5'-(T)50-CGAGCTCGAGATTTTAGTTCGCGGGCGCAACTGCAACTCCG
AT-3'(配列番号８) を設計し、PCRによって鋳型用DNA断片を得た。
【００３７】実施例3 濃縮サイクルに伴う翻訳活性の
変化 キャップとポリ（A）鎖をもつmRNAの5'UTRにランダム配
列を導入した構築物を用いて濃縮サイクルを行い、その
サイクルに伴う翻訳活性の変化を測定した。その結果を
図3Aに示す。図中、縦軸は35S-Cysの取り込みによって
測定した翻訳活性を示し、横軸は濃縮サイクルの回数を
示す。翻訳活性の測定は35S-Cysを含む20μlの小麦胚芽
翻訳系を用いて行った。25℃で60分反応させた後、予め
98μlの１N NaOHが入ったチューブに、反応液２μl分
注した。この溶液を37℃、10分間保温した後、25% TCA/2
%カザミノ酸を900μl加え、４℃で1時間冷却した。15，
000rpmで5分間遠心した後、上清を除き、5％TCAで濯い
だ。このチューブに200μlの液体シンチレーターを加
え、液体シンチレーションカウンターで放射能を計測し
た(Herwynen, J.F.V.およびBeckler, G.S. (1995): In
Tymms, M.J. (ed.) InVitro Transcription and Transl
ation Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey,
Vol.37, pp.245-251)。
変化 キャップとポリ（A）鎖をもつmRNAの5'UTRにランダム配
列を導入した構築物を用いて濃縮サイクルを行い、その
サイクルに伴う翻訳活性の変化を測定した。その結果を
図3Aに示す。図中、縦軸は35S-Cysの取り込みによって
測定した翻訳活性を示し、横軸は濃縮サイクルの回数を
示す。翻訳活性の測定は35S-Cysを含む20μlの小麦胚芽
翻訳系を用いて行った。25℃で60分反応させた後、予め
98μlの１N NaOHが入ったチューブに、反応液２μl分
注した。この溶液を37℃、10分間保温した後、25% TCA/2
%カザミノ酸を900μl加え、４℃で1時間冷却した。15，
000rpmで5分間遠心した後、上清を除き、5％TCAで濯い
だ。このチューブに200μlの液体シンチレーターを加
え、液体シンチレーションカウンターで放射能を計測し
た(Herwynen, J.F.V.およびBeckler, G.S. (1995): In
Tymms, M.J. (ed.) InVitro Transcription and Transl
ation Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey,
Vol.37, pp.245-251)。
【００３８】同様に、キャップとポリ（A）鎖をもつmRN
Aの3'UTRにランダム配列を導入した構築物を用いた結果
を図3Ｂに、またポリ（A）鎖をもちキャップをもたない
mRNAの5'UTRにランダム配列を導入した構築物を用いた
結果を図3Cに、またポリ（A）鎖をもちキャップをもた
ないmRNAの3'UTRにランダム配列を導入した構築物を用
いた結果を図３Ｄにそれぞれ示した。
Aの3'UTRにランダム配列を導入した構築物を用いた結果
を図3Ｂに、またポリ（A）鎖をもちキャップをもたない
mRNAの5'UTRにランダム配列を導入した構築物を用いた
結果を図3Cに、またポリ（A）鎖をもちキャップをもた
ないmRNAの3'UTRにランダム配列を導入した構築物を用
いた結果を図３Ｄにそれぞれ示した。
【００３９】その結果、キャップ構造をもつmRNAについ
て、3'UTRについては活性の上昇が見られなかったのに
対し、5'UTRにおいて初期集団に対して約3倍の翻訳活性
の上昇したmRNA集団を分離することができた（図3AとB
の比較）。またキャップ構造をもたないmRNAについて、
3'UTRにランダム配列を導入したものでは約3倍の翻訳活
性の上昇が見られた(図3CとDの比較)。
て、3'UTRについては活性の上昇が見られなかったのに
対し、5'UTRにおいて初期集団に対して約3倍の翻訳活性
の上昇したmRNA集団を分離することができた（図3AとB
の比較）。またキャップ構造をもたないmRNAについて、
3'UTRにランダム配列を導入したものでは約3倍の翻訳活
性の上昇が見られた(図3CとDの比較)。
【００４０】実施例４ 翻訳が促進されたmRNA集団の配
列と翻訳活性 キャップとポリ（A）鎖をもつmRNAの5'UTRにランダム配
列を導入した構築物から得られた高活性集団の翻訳促進
配列の配列決定と翻訳活性を測定した(図4Ａ)。また、
ポリ（A）鎖をもちキャップをもたないmRNAの3'UTRにラ
ンダム配列を導入した構築物から得られた高活性集団の
翻訳促進因子の配列決定と翻訳活性を測定した(図4
Ｂ)。活性の測定は実施例３におけるのと同様に行っ
た。その結果、分離した高活性集団から得られたクロー
ンの配列に共通する性質は一見してみあたらなかった。
このことはあるmRNAの翻訳を促進するUTR配列は一通り
ではないことを示している。
列と翻訳活性 キャップとポリ（A）鎖をもつmRNAの5'UTRにランダム配
列を導入した構築物から得られた高活性集団の翻訳促進
配列の配列決定と翻訳活性を測定した(図4Ａ)。また、
ポリ（A）鎖をもちキャップをもたないmRNAの3'UTRにラ
ンダム配列を導入した構築物から得られた高活性集団の
翻訳促進因子の配列決定と翻訳活性を測定した(図4
Ｂ)。活性の測定は実施例３におけるのと同様に行っ
た。その結果、分離した高活性集団から得られたクロー
ンの配列に共通する性質は一見してみあたらなかった。
このことはあるmRNAの翻訳を促進するUTR配列は一通り
ではないことを示している。
【００４１】
【発明の効果】in vitro進化によって生じた配列を介す
る新たな制御機構の出現は、ある意味で、ウイルスが宿
主細胞の中で増殖するために独自の遺伝子発現制御機構
を獲得してきたことに似ている。このような観点から、
本発明によって翻訳制御配列を包括的、系統的に解析す
ることで、将来出現する可能性がある病原性ウイルスに
対する予防的な研究に役立つ可能性がある。
る新たな制御機構の出現は、ある意味で、ウイルスが宿
主細胞の中で増殖するために独自の遺伝子発現制御機構
を獲得してきたことに似ている。このような観点から、
本発明によって翻訳制御配列を包括的、系統的に解析す
ることで、将来出現する可能性がある病原性ウイルスに
対する予防的な研究に役立つ可能性がある。
【００４２】タンパク質も機能を変えずに発現量を調節
するために5'UTRや3'UTRによって翻訳効率、遺伝子発現
を制御することは進化上有効な手段であった。しかし、
これまで翻訳エンハンサーや翻訳リプレッサーとして知
られているUTR制御配列は、レポーター遺伝子などを用
いた他の遺伝子のUTRに導入した実験ではその効果の程
度が大きく異なる、全く働かない、逆の効果がでるなど、
様々な例が知られている。その理由として、mRNA分子は
一本鎖の柔軟な構造をもっているため、塩基配列が変化
することによって分子内塩基の相互作用に由来するその
立体構造もまた同様に変化するためと、考えられる。こ
れに対して、本発明では、たとえmRNAがどのような立体
構造や分子内相互作用をとろうとも、そのmRNAの翻訳効
率を確実に上昇、下降させる配列を得ることが可能であ
る。そのため、本発明は、目的遺伝子の発現を翻訳段階
において人為的に確実に操作するという新しい技術領域
を切り開くものである。
するために5'UTRや3'UTRによって翻訳効率、遺伝子発現
を制御することは進化上有効な手段であった。しかし、
これまで翻訳エンハンサーや翻訳リプレッサーとして知
られているUTR制御配列は、レポーター遺伝子などを用
いた他の遺伝子のUTRに導入した実験ではその効果の程
度が大きく異なる、全く働かない、逆の効果がでるなど、
様々な例が知られている。その理由として、mRNA分子は
一本鎖の柔軟な構造をもっているため、塩基配列が変化
することによって分子内塩基の相互作用に由来するその
立体構造もまた同様に変化するためと、考えられる。こ
れに対して、本発明では、たとえmRNAがどのような立体
構造や分子内相互作用をとろうとも、そのmRNAの翻訳効
率を確実に上昇、下降させる配列を得ることが可能であ
る。そのため、本発明は、目的遺伝子の発現を翻訳段階
において人為的に確実に操作するという新しい技術領域
を切り開くものである。
【００４３】本発明をin vivo翻訳系に適用した場合に
は、例えば植物組織においては、光、ホルモン、組織特
異的な発現、動物細胞では、組織、発生分化の過程、ホ
ルモンなど、様々な外的刺激を受けた環境下において特
異的な翻訳制御を目的遺伝子のmRNAに付与し、人為的な
遺伝子制御を可能にすると予測される。
は、例えば植物組織においては、光、ホルモン、組織特
異的な発現、動物細胞では、組織、発生分化の過程、ホ
ルモンなど、様々な外的刺激を受けた環境下において特
異的な翻訳制御を目的遺伝子のmRNAに付与し、人為的な
遺伝子制御を可能にすると予測される。
【００４４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOYOTA MOTOR CORPORATION, JUNICHI OBOKATA, and ISSEI NAGAO <120> Methods for screening potential translational control factors of m RNA <130> P00-0537 <140> <141> <160> 28 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: primer <220> <223> n: a or t or g or c <400> 1 gcaggcctaa tacgactcac tatagggccg ctctagaact agtggatccn nnnnnnnnnn 60 nnnnatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgt 94 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: primer <400> 2 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt cgagctcgag 60 attcacactt cctgattatt gacccacact 90 <210> 3 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: primer <400> 3 gcctgcaggg cctaatacga ctcactatag ggatccctta tgttacgtcc tgtagaaacc 60 cca 63 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: primer <220> <223> n: a or t or g or c <400> 4 ccctcgaggt cgacggtatc gnnnnnnnnn nnnnnngagct cgagattcac acttcctgat 60 tattga 66 <210> 5 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: primer <400> 5 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ccctcgaggt 60 cgacggtatc g 71 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: primer <400> 6 gcaggcctaa tacgactcac tatagggccg ctctagaact agtggatc 48 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: primer <400> 7 gcaggcctaa tacgactcac tatagggatc caaatggaag acgccaaaaa cataaagaa 59 <210> 8 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: primer <400> 8 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt cgagctcgag 60 attttagttc gcgggcgcaa ctgcaactcc gat 93 <210> 9 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 9 agguugcaua uuccg 15 <210> 10 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 10 ucuauugguu ucaac 15 <210> 11 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 11 uagauauccg cgcuu 15 <210> 12 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 12 auacucgcgu uauca 15 <210> 13 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 13 acagugccua auccu 15 <210> 14 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 14 acugcaaguc cgcuc 15 <210> 15 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 15 gcauauuagc accgc 15 <210> 16 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 16 gagcugccag guugc 15 <210> 17 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 17 aguaccauac ucuu 14 <210> 18 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 18 aaccuuugcu uucgc 15 <210> 19 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 19 uacuuauauc uccaa 15 <210> 20 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 20 guacccacgg cguua 15 <210> 21 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 21 aacuacuuac cuuaa 15 <210> 22 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 22 cacaagccgc cuuaa 15 <210> 23 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 23 uugucgguug uccau 15 <210> 24 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆａｃｔ ｏｒ ＜４００＞ ２４ ｕｃｕｇｇａｕａｃｕ ｃｕｃｕｇ
１５ ＜２１０＞ ２５ ＜２１１＞ １５ ＜２１２＞ ＲＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆａｃｔ ｏｒ ＜４００＞ ２５ ａｕａｃａｃｕｇｕｃ ｃｕａｕａ
１５ ＜２１０＞ ２６ ＜２１１＞ １５ ＜２１２＞ ＲＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ or <400> 26 ccagauauaa ccaca 15 <210> 27 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 27 uuuucacacu cgccu 15 <210> 28 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 28 gcgaugauac uuugc 15
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆａｃｔ ｏｒ ＜４００＞ ２４ ｕｃｕｇｇａｕａｃｕ ｃｕｃｕｇ
１５ ＜２１０＞ ２５ ＜２１１＞ １５ ＜２１２＞ ＲＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆａｃｔ ｏｒ ＜４００＞ ２５ ａｕａｃａｃｕｇｕｃ ｃｕａｕａ
１５ ＜２１０＞ ２６ ＜２１１＞ １５ ＜２１２＞ ＲＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ or <400> 26 ccagauauaa ccaca 15 <210> 27 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 27 uuuucacacu cgccu 15 <210> 28 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: translational control fact or <400> 28 gcgaugauac uuugc 15
【００４５】
配列番号１：プライマー 配列番号２：プライマー 配列番号３：プライマー 配列番号４：プライマー 配列番号５：プライマー 配列番号６：プライマー 配列番号７：プライマー 配列番号８：プライマー 配列番号９：翻訳制御因子 配列番号10：翻訳制御因子 配列番号11：翻訳制御因子 配列番号12：翻訳制御因子 配列番号13：翻訳制御因子 配列番号14：翻訳制御因子 配列番号15：翻訳制御因子 配列番号16：翻訳制御因子 配列番号17：翻訳制御因子 配列番号18：翻訳制御因子 配列番号19：翻訳制御因子 配列番号20：翻訳制御因子 配列番号21：翻訳制御因子 配列番号22：翻訳制御因子 配列番号23：翻訳制御因子 配列番号24：翻訳制御因子 配列番号25：翻訳制御因子 配列番号26：翻訳制御因子 配列番号27：翻訳制御因子 配列番号28：翻訳制御因子
【図１】ＵＴＲにランダム配列を導入したGUS mRNA の
作製。
作製。
【図２】小麦胚芽in vitro翻訳系での翻訳反応。図中の
網掛けの四角はランダム配列を、縞の四角は2回目以降
のサイクルでPCRプライマーがハイブリダイズする領域
を示す。
網掛けの四角はランダム配列を、縞の四角は2回目以降
のサイクルでPCRプライマーがハイブリダイズする領域
を示す。
【図３】濃縮サイクルに伴う翻訳活性の変化。図3Aはキ
ャップとポリ（A）鎖をもつmRNAの5'UTRにランダム配列
を導入した構築物、図3Bはキャップとポリ（A）鎖をも
つmRNAの3'UTRにランダム配列を導入した構築物、図3C
はポリ（A）鎖をもちキャップをもたないmRNAの5'UTRに
ランダム配列を導入した構築物、図3Dはポリ（A）鎖を
もちキャップをもたないmRNAの3'UTRにランダム配列を
導入した構築物の場合をそれぞれ示す。白丸は翻訳活性
の高いまたはほぼ未変化の構築物を、また黒塗りの四角
は翻訳活性の低い構築物をそれぞれ示す。
ャップとポリ（A）鎖をもつmRNAの5'UTRにランダム配列
を導入した構築物、図3Bはキャップとポリ（A）鎖をも
つmRNAの3'UTRにランダム配列を導入した構築物、図3C
はポリ（A）鎖をもちキャップをもたないmRNAの5'UTRに
ランダム配列を導入した構築物、図3Dはポリ（A）鎖を
もちキャップをもたないmRNAの3'UTRにランダム配列を
導入した構築物の場合をそれぞれ示す。白丸は翻訳活性
の高いまたはほぼ未変化の構築物を、また黒塗りの四角
は翻訳活性の低い構築物をそれぞれ示す。
【図４】翻訳が促進されたmRNA集団の翻訳促進因子の配
列と翻訳活性。図4Aはキャップとポリ（A）鎖をもつmRN
Aの5'UTRにランダム配列を導入した構築物、図4Bはポリ
（A）鎖をもちキャップをもたないmRNAの3'UTRにランダ
ム配列を導入した構築物の場合を示す。
列と翻訳活性。図4Aはキャップとポリ（A）鎖をもつmRN
Aの5'UTRにランダム配列を導入した構築物、図4Bはポリ
（A）鎖をもちキャップをもたないmRNAの3'UTRにランダ
ム配列を導入した構築物の場合を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA12 FA01 HA01 HA11 HA19 4B063 QA01 QA18 QQ53 QR32 QR62 QS25 QS34 QX07
Claims (13)
- 【請求項１】 非翻訳領域(UTR)に翻訳制御因子候補で
あるランダムオリゴヌクレオチド配列が導入されたmRNA
を合成し、未処理のものと比べて翻訳効率に変化の生じ
たmRNAを選択することを含む、mRNAの潜在的翻訳制御因
子をスクリーニングする方法。 - 【請求項２】 前記mRNAの選択が、(a)UTRに多様な翻訳
制御配列候補を含むmRNA集団をin vitroまたはin vivo
翻訳系に導入してポリソームを生成し、(b)翻訳効率に
変化の生じたｍRNAを含むポリソームを分離することに
よって行われる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 (c)前記分離されたポリソームからRNAを
抽出し、(d)該RN Aを鋳型にしてDNA断片を合成し、こ
のDNA断片を鋳型にしてmRNAを合成することをさらに含
む、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 (e)前記合成されたmRNAについて前記工
程(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返し、翻訳効率に変化
の生じた実質的に純粋なmRNAを単離し、（ｆ）該単離さ
れたmRNAについて、その中に導入された潜在的翻訳制御
因子の配列を決定することをさらに含む、請求項３に記
載の方法。 - 【請求項５】 前記合成されたmRNAが、キャップ構造ま
たはポリ（A）鎖、あるいはそれらの両方を含む、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記in vitro翻訳系が無細胞タンパク質
合成系であり、前記in vivo翻訳系が真核細胞である、
請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】 前記工程(b)でのポリソームの分離が該
ポリソームのサイズに基づいて行われる、請求項２に記
載の方法。 - 【請求項８】 前記の翻訳効率に変化の生じたｍRNAが
未処理のものと比べて翻訳効率が高いものまたは低いも
のである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 mRNAの潜在的翻訳制御因子をスクリーニ
ングする方法であって、 (a)5'非翻訳領域(5'UTR)に翻訳制御因子候補であるラン
ダムオリゴヌクレオチド配列が導入された、かつキャッ
プ構造およびポリ（A）鎖配列を含む、 ｍRNAを合成する工程、 (b)5'UTRに多様な翻訳制御配列候補を含む工程(a)から
のmRNA集団をin vitroまたはin vivo翻訳系に導入して
ポリソームを生成する工程、 (c)工程(b)で生成した天然型と比べて翻訳効率の高いｍ
RNAを含むポリソームをサイズに基いて分離する工程、 (d)工程(c)で分離されたポリソームからRNAを抽出する
工程、 (e)工程(d)で抽出されたRNAを鋳型にしてDNA断片を合成
し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmRNAを合成する工
程、 (f)工程(e)で得られたmRNAについて工程(b)〜(e)を少な
くとも1回繰り返し、未処理のものと比べて翻訳効率の
高いまたは低い実質的に純粋なmRNAを単離する工程、お
よび (g)工程(f)で単離されたmRNAについて、その中に導入さ
れた潜在的翻訳制御因子の配列を決定する工程を含む上
記方法。 - 【請求項１０】 mRNAの潜在的翻訳制御因子をスクリー
ニングする方法であって、 (a)３'非翻訳領域(3'UTR)に翻訳制御因子候補であるラ
ンダムオリゴヌクレオチド配列が導入された、かつキャ
ップ構造を含まずポリ（A）鎖配列を含む、ｍRNAを合成
する工程、 (b)3'UTRに多様な翻訳制御配列候補を含む工程(a)から
のmRNA集団をin vitroまたはin vivo翻訳系に導入して
ポリソームを生成する工程、 (c)工程(b)で生成した天然型と比べて翻訳効率の高いｍ
RNAを含むポリソームをサイズに基いて分離する工程、 (d)工程(c)で分離されたポリソームからRNAを抽出する
工程、 (e)工程(d)で抽出されたRNAを鋳型にしてDNA断片を合成
し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmRNAを合成する工
程、 (f)工程(e)で得られたmRNAについて工程(b)〜(e)を少な
くとも1回繰り返し、未処理のものと比べて翻訳効率の
高いまたは低い実質的に純粋なmRNAを単離する工程、お
よび (g)工程(f)で単離されたmRNAについて、その中に導入さ
れた潜在的翻訳制御因子の配列を決定する工程を含む上
記方法。 - 【請求項１１】 翻訳効率の高い天然型mRNAの翻訳制御
因子をスクリーニングする方法であって、 (a) 非翻訳領域に多様な翻訳制御配列を含むmRNA集団
をin vitroまたはin vivo翻訳系にかけてポリソームを
生成する工程、 (b) 工程(a)で生成した翻訳効率の高いｍRNAを含むポ
リソームをサイズに基いて分離する工程、 (c) 工程(b)で分離されたポリソームからRNAを抽出す
る工程、 (d) 工程(ｃ)で抽出されたRNAを鋳型にしてDNA断片を合
成し、さらにこのDNA断片を鋳型にしてmRNAを合成する
工程、 (e) 工程(d)で得られたmRNAについて工程(a)〜(d)を少
なくとも1回繰り返し、翻訳効率の高い実質的に純粋なm
RNAを単離する工程、および (f) 工程(e)で単離されたmRNAの翻訳制御因子の配列を
決定する工程を含む上記方法。 - 【請求項１２】 配列番号９〜28のいずれかに示される
配列からなる翻訳制御因子。 - 【請求項１３】 請求項１〜１１のいずれか一項に記載
のスクリーニング方法を使用することによって未処理の
ものと比べて翻訳効率に変化の生じたmRNAを単離する方
法。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP2000291084A JP4723713B2 (ja) | 2000-09-25 | 2000-09-25 | ｍＲＮＡの潜在的翻訳制御因子のスクリーニング方法 |
| US09/816,089 US6558906B2 (en) | 2000-09-25 | 2001-03-26 | Methods of screening potential translational regulatory elements of messenger RNA |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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|---|---|
| JP2002095483A true JP2002095483A (ja) | 2002-04-02 |
| JP4723713B2 JP4723713B2 (ja) | 2011-07-13 |
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|---|---|
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- 2000-09-25 JP JP2000291084A patent/JP4723713B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-26 US US09/816,089 patent/US6558906B2/en not_active Expired - Fee Related
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| Title |
|---|
| JPN6010037177, 長尾一生， 小保方潤一, "Ｉｎ ｖｉｔｒｏ分子進化を用いた植物翻訳制御因子の解析", 日本植物生理学会年会要旨集, 20000320, Ｖｏｌ．４０ｔｈ, ｐ．１９７ * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2003106675A1 (ja) * | 2002-06-12 | 2005-10-13 | 学校法人慶應義塾 | 翻訳テンプレートおよびそのライブラリー、それらから合成される蛋白質および蛋白質のライブラリー、ならびにそれらを構成する要素、ならびにそれらの製造法および利用方法 |
| JP4747292B2 (ja) * | 2002-06-12 | 2011-08-17 | 学校法人慶應義塾 | 翻訳テンプレートおよびそのライブラリー、それらから合成される蛋白質および蛋白質のライブラリー、ならびにそれらを構成する要素、ならびにそれらの製造法および利用方法 |
| US9227956B2 (en) | 2013-04-17 | 2016-01-05 | Pfizer Inc. | Substituted amide compounds |
| WO2016143799A1 (ja) * | 2015-03-09 | 2016-09-15 | 国立大学法人名古屋大学 | 無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤及びその利用 |
| JPWO2016143799A1 (ja) * | 2015-03-09 | 2017-11-16 | 国立大学法人名古屋大学 | 無細胞タンパク質合成系に用いるための翻訳促進剤及びその利用 |
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