JPH06503477A - 真核無細胞抽出物中での転写と翻訳の共役 - Google Patents
真核無細胞抽出物中での転写と翻訳の共役Info
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.RNAがDNAから転写され且つRNAがタンパク質に翻訳される水準にマ グネシウム濃度を高めるのに十分な量のマグネシウム化合物を真核無細胞抽出物 に加えることからなる上記抽出物中でDNAからの転写と翻訳を共役させる方法 。 2.上記抽出物がウサギ網状赤血球溶解物である請求項1に記載の方法。 3.上記最終マグネシウム濃度が約2.5mMから約3.5mMである請求項2 に記載の方法。 4.上記最終マグネシウム濃度が約2.6mMから約3.0mMである請求項2 に記載の方法。 5.ポリアミンが上記溶解物に添加される請求項2に記載の方法。 6.上記ポリアミンがスペルミジンである請求項5に記載の方法。 7.上記スペルミジンを上記溶解物に加えて約0.2mMから約0.4mMの濃 度にする請求項6に記載の方法。 8.上記溶解物のカリウム濃度を約40mMから約100mMに調整する請求項 2に記載の方法。 9.内因性リボヌクレアーゼを効果的に不活性化するのに十分な量のリボヌクレ アーゼインヒビターを上記溶解物に添加することを含む請求項2に記載の方法。 10.上記リボヌクレアーゼインヒビターがRNasinである請求項9に記載 の方法。 11.転写と翻訳の共役に必要な追加成分を上記溶解物に添加することを含む請 求項2に記載の方法。 12.上記追加成分の1つがRNAポリメラーゼからなる請求項11に記載の方 法。 13.上記ポリメラーゼがSP6、T7およびT3RNAポリメラーゼからなる 群から選択される請求項12に記載の方法。 14.DNA鋳型が上記溶解物に添加される請求項2に記載の方法。 15.上記DNA鋳型か複数のクローニング領域を有する請求項14に記載の方 法。 16.ポリメラーゼプロモーター配列が上記複数のクローニング領域の1方の末 端に位置している請求項15に記載の方法。 17.上記複数のクローニング領域へのクローニングによってRNAポリメラー ゼプロモーターが5′末端にそしてポリA配列が3′末端に位置する遺伝子が生 じるように、上記鋳型が上記複数のクローニング領域の反対側末端にポリA配列 を有する請求項16に記載の方法。 18.上記プロモーター配列に対応しているポリメラーゼが上記溶解物に添加さ れる請求項16に記載の方法。 19.上記DNA鋳型が、ポリメラーゼ鎖反応として知られる方法によって製造 された超コイル分子、共有的閉環状分子、線状分子またはDNA断片からなる群 から選択される形態である請求項14に記載の方法。 20.DNAからRNAの転写を可能にするのに十分な量のリボヌクレオチド三 リン酸が上記溶解物に添加されることを含む請求項2に記載の方法。 21.上記溶解物に上記リボヌクレオチド三リン酸が各々0.4mM添加される 請求項20に記載の方法。 22.上記抽出物が小麦胚芽抽出物である請求項1に記載の方法。 23.上記最終マグネシウム濃度が約3.0mMから約5.25mMである請求 項22に記載の方法。 24.上記最終マグネシウム濃度が約4.0mMから約4.75mMである請求 項22に記載の方法。 25.ポリアミンが上記抽出物に添加される請求項22に記載の方法。 26.上記ポリアミンがスペルミジンである請求項25に記載の方法。 27.上記スペルミジンを上記抽出物に添加して約0.2mMから0.9mMの 濃度にする請求項26に記載の方法。 28.上記抽出物のカリウム濃度が約50mMから約150mMに調整される請 求項22に記載の方法。 29.内因性リボヌクレアーゼを効果的に不活性化するのに十分な量のリボヌク レアーゼインヒビターが上記溶解物に添加されることを含む請求項22に記載の 方法。 30.上記リボヌクレアーゼインヒビクーがRNasinである請求項29に記 載の方法。 31.転写と翻訳の共役に必要な追加成分が上記溶解物に添加されることを含む 請求項22に記載の方法。 32.上記追加成分の1つがRNAポリメラーゼからなる請求項31に記載の方 法。 33.上記ポリメラーゼがSP6、T7およびT3RNAポリメラーゼからなる 群から選択される請求項32に記載の方法。 34.DNA鋳型か上記抽出物に添加される請求項22に記載の方法。 35.上記DNA鋳型が複数のクローニング領域を有する請求項34に記載の方 法。 36.ポリメラーゼプロモーター配列が上記複数のクローニング領域の1方の末 端に位置している請求項35に記載の方法。 37.上記複数のクローニング領域へのクローニングによってRNAポリメラー ゼプロモーターが5′末端にそしてポリA配列か3′末端に位置する遺伝子が生 じるように、上記鋳型が上記複数のクローニング領域の反対側末端にポリA配列 を有する請求項36に記載の方法。 38.上記プロモーター配列に対応しているポリメラーゼが上記抽出物に添加さ れる請求項36に記載の方法。 39.上記DNA鋳型が、ポリメラーゼ鎖反応として知られる方法によって製造 された超コイル分子、共有的閉環状分子、線状分子またはDNA断片からなる群 から選択される形態である請求項34に記載の方法。 40.DNAからRNAの翻訳を可能にするのに十分な量のリボヌクレオチド三 リン酸が上記抽出物に添加されることを含む請求項22に記載の方法。 41.上記リボヌクレオチド三リン酸が0.4mMのCTP、0.4mMのUT P、0.5mMのGTPおよび1.6mMのATPの値で上記抽出物に添加され る請求項40に記載の方法。 42.請求項1に従って調製された、修正された真核無細胞抽出物、43.請求 項42に記載の抽出物を含有する容器からなるキット。 44.請求項5または請求項25に従って調製された、修正された真核無細胞抽 出物。 45.請求項44に記載の抽出物を含有する容器からなるキット。 46.請求項12または請求項32に従って調製された、修正された真核無細胞 抽出物。 47.請求項46に記載の抽出物を含有する容器からなるキット。 48.特定のポリメラーゼプロモーター配列を有するDNA鋳型から溶液中で転 写と翻訳の共役によってタンパク質を製造する方法であって、該方法は真核無細 胞抽出物の標準的な調製物の溶液を調製し、転写と翻訳を支えるのに十分な濃度 のリボヌクレオチド三リン酸、アミノ酸および上記鋳型DNAの上記プロモータ ーに対応しているポリメラーゼで上記抽出物溶液を修正し、そしてRNAが上記 DNA鋳型から転写され且つ該RNAがタンパク質に翻訳される水準に最終マグ ネシウム濃度を上昇させるのに十分な量のマグネシウム化合物を上記抽出物溶液 に添加することからなる方法。 49.上記抽出物溶液混合物中のマグネシウムの最終濃度が約0.5mM上昇さ せられる請求項48に記載の方法。 50.上記抽出物がウサギ網状赤血球溶解物である請求項48に記載の方法。 51.上記最終マグネシウム濃度が約2.5mMから約3.5mMである請求項 50に記載の方法。 52.上記最終マグネシウム濃度が約2.6mMから約3.0mMである請求項 50に記載の方法。 53.ポリアミンが上記溶液に添加される請求項50に記載の方法。 54.上記ポリアミンがスペルミジンである請求項53に記載の方法。 55.上記スペルミジンを上記溶液に添加して約0.2mMから約0.4mMの 濃度にする請求項54に記載の方法。 56.上記溶液のカリウム濃度が約40mMから約100mMに調整される請求 項50に記載の方法。 57.内因性リボヌクレアーゼを効果的に不活性化するのに十分な量のリボヌク レアーゼインヒビターが上記溶液に添加されることを含む請求項50に記載の方 法。 58.上記リボヌクレアーゼインヒビターがRNasinである請求項57に記 載の方法。 59.転写と翻訳の共役に必要な追加成分が上記溶液に添加されることを含む請 求項50に記載の方法。 60.上記追加成分の1つがRNAポリメラーゼを含む請求項59に記載の方法 。 61.上記ポリメラーゼがSP6、T7およびT3RNAポリメラーゼからなる 群から選択される請求項60に記載の方法。 62.上記DNA鋳型が、ポリメラーゼ鎖反応として知られる方法によって製造 された超コイル分子、共有的閉環状分子、線状分子またはDNA断片からなる群 から選択される形態である請求項50に記載の方法。 63.上記DNA鋳型が複数のクローニング領域を有する請求項50に記載の方 法。 64.ポリメラーゼプロモーター配列が上記複数のクローニング領域の1方の末 端に位置している請求項63に記載の方法。 65.上記複数のクローニング領域へのクローニングによってRNAポリメラー ゼプロモーターが5′末端にそしてポリA配列が3′末端に位置する遺伝子が生 じるように、上記鋳型が上記複数のクローニング領域の反対側末端にポリA配列 を有する請求項64に記載の方法。 66.上記溶液に上記リボヌクレオチド三リン酸が各々0.4mM添加される請 求項50に記載の方法。 67.上記抽出物が小麦胚芽抽出物である請求項48に記載の方法。 68.上記最終マグネシウム濃度が約3.0mMから約5.25mMである請求 項67に記載の方法。 69.上記最終マグネシウム濃度が約4.0mMから約4.75mMである請求 項68に記載の方法。 70.ポリアミンが上記溶液に添加される請求項67に記載の方法。 71.上記ポリアミンがスペルミジンである請求項70に記載の方法。 72.上記溶液に上記スペルミジンを添加して約0.2mMから約0.9mMの 濃度にする請求項71に記載の方法。 73.上記溶液のカリウム濃度が約50mMから約150mMに調整される請求 項67に記載の方法。 74.内因性リボヌクレアーゼを効果的に不活性化するのに十分な量のリボヌク レアーゼインヒビターが上記溶液に添加されることを含む請求項67に記載の方 法。 75.上記リボヌクレアーゼインヒビターがRNasinである請求項74に記 載の方法。 76.転写と翻訳の共役に必要な追加成分が上記溶液に添加されることを含む請 求項67に記載の方法。 77.上記追加成分かRNAポリメラーゼからなる請求項76に記載の方法。 78.上記ポリメラーゼがSP6、T7およびT3RNAポリメラーゼからなる 群から選択される請求項77に記載の方法。 79.上記DNA鋳型が、ポリメラーゼ鎖反応として知られる方法によって製造 された超コイル分子、共有的閉環状分子、線状分子またはDNA断片からなる群 から選択される形態である請求項67に記載の方法。 80.上記DNA鋳型が複数のクローニング領域を有する請求項67に記載の方 法。 81.ポリメラーゼプロモーター配列が上記複数のクローニング領域の1方の末 端に位置している請求項80に記載の方法。 82.上記複数のクローニング領域へのクローニングによってRNAポリメラー ゼプロモーターが5′末端にそしてポリA配列が3′末端に位置する遺伝子が生 じるように、上記鋳型が上記複数のクローニング領域の反対側末端にポリA配列 を有する請求項81に記載の方法。 83.上記リボヌクレオチド三リン酸が0.4mMのCTP、0.4mMのUT P、0.5mMのGTPおよび1.6mMのATPの値で上記溶液に添加される 請求項67に記載の方法。
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1997
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WO2000068412A1 (fr) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Wakenyaku Co., Ltd. | Preparation contenant un extrait de cellules pour la synthese d'une proteine exempte de cellules, et moyen de synthese d'une proteine exempte de cellules |
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