CN1738914A - 使用编码双链启动子一条链的引物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过使用编码双链启动子一条链的启动子引物获得环形单链DNA转录底物而由RNA聚合酶来制备对应于靶序列的转录产物的方法、组合物和试剂盒。本发明对于研究、诊断和治疗应用例如制备对应于mRNA的cDNA、制备有义或反义探针、检测基因或生物体特异性序列或制备RNAi等具有广阔的适用性。

Description

使用编码双链启动子一条链的引物的方法

                相关申请的交叉引用

[0001]本申请要求递交于2002年11月21日的美国临时专利申请流水号No.60/428,013的优先权。特此明确将所有优先权申请的全部公开内容并入作为参考。

           有关联邦政府资助的研究或开发的声明

[0002]不适用。

                       发明领域

[0003]本发明总体上涉及通过使用编码双链启动子一条链的启动子引物获得环形单链DNA转录底物而由RNA聚合酶来制备对应于靶序列的转录产物的方法、组合物和试剂盒。本发明对于研究、诊断和治疗应用例如制备对应于mRNA的cDNA、制备有义或反义探针、检测基因或生物体特异性序列或制备RNAi具有广阔的适用性。

                       发明背景

相关领域的说明

[0004]本领域众所周知，若将靶序列插入到克隆载体中转录启动子如但不限于T7 RNA聚合酶启动子或另外的T7型RNA聚合酶启动子的下游，并将所得的克隆在转录条件下与识别相应启动子的RNA聚合酶温育，或将所述克隆转化进能够表达此RNA聚合酶的宿主细胞中，则该靶序列可在体外或体内转录(例如参见Studier，FW等，pp.60-89in Methods in Enzymology，Vol.185，Goeddel，DV编辑，AcademicPress，1990，特此并入作为参考)。在合适的条件下，此系统也可用于在体外或在体内在适当的宿主细胞中表达由包含基因的靶序列编码的蛋白。

[0005]转录一个或多个靶核酸序列有益的原因有多种。例如，体外转录被频繁地用在制备对应于样品中的mRNA序列的探针的方法中，以描述相对于另一类或相对于相似类型的特定类型细胞中基因响应不同的条件或刺激物的表达谱。当前基因表达谱分析典型地是通过同时将由一个或多个样品制备的标记探针与将多达数百种或数千种不同基因序列连接到表面上的阵列或微阵列进行杂交进行的。在有些情况下，特定基因的表达或表达的缺乏可能与病态如但不限于癌症的存在或状态有关，或可指示之。

[0006]许多为此类目的制备对应于靶序列的探针的方法是本领域公知的。涉及体外转录以制备探针用于基因表达谱分析的方法的实例描述在：Murakawa等， DNA 7：287-295，1988；Phillips和Eberwine， Methods in Enzymol.Suppl.10：283-288，1996；Ginsberg等， Ann.Neurol.45：174-181，1999；Ginsberg等， Ann. Neurol.48：77-87，2000；VanGelder等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87：1663-1667，1990；Eberwine等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3010-3014，1992；美国专利No.5,021,335；5,168,038；5,545,522；5,514,545；5,716,785；5,891,636；5,958,688；6,291,170以及PCT专利申请WO 00/75356和WO 02/065093中。

[0007]又有其它方法使用体外转录作为用于扩增和检测一种或多种靶核酸序列的步骤的一部分，以便为医疗目的检测作为致病因子的病原体如病毒或微生物病原体的存在，或检测与疾病或疾病状态相关的基因序列。将体外转录用于此目的的方法的实例包括美国专利No.5,130,238；5,194,370；5,399,491；5,409,818；5,437,990；5,466,586；5,554,517；5,665,545；6,063,603；6,090,591；6,100,024；6,410,276；Kwoh等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173，1989；Fahy等，In：PCR Methods and Applications，pp.25-33，1991；PCT专利申请号WO89/06700和WO 91/18155以及欧洲专利申请No.0427073 A2和0427074 A2。

[0008]单链DNA模板用于转录的用途并不常见。不过，Milligan等(Nucleic Acids Res.，15：8783-8798，1987)证明双链DNA模板并非是利用T7 RNA聚合酶合成RNA所必需的，条件是单链DNA模板含有双链-17至+1 T7启动子区。并且，利用非共价地固定在固相支持物上的单链DNA模板通过与互补启动子序列退火合成RNA的方法描述在美国专利No.5,700,667中。另外，授予Aono Toshiya等的日本专利No.JP4304900公开了利用具有双链T7 RNA聚合酶启动子的环形单链模板合成RNA。JP4304900中公开的用于转录的环形底物是通过连接线性探针获得的，该线性探针具有当其与样品中的靶序列退火时彼此邻近的靶互补性3′-和5′-端序列。

[0009]然而，所有上文所引述的通过复制靶核酸序列获得探针和转录底物的方法涉及合成包含可操作地连接于双链模板的双链转录启动子的线性双链DNA。

[0010]本领域通过靶序列复制获得探针或转录底物的方法使用双链DNA模板的原因是可以理解的，如果详细研究这些方法的过程的话。例如，Van Gelder等在美国专利No.5,545,522、5,716,785和5,891,636中描述的方法利用启动子引物合成双链转录底物。首先，利用这样的启动子引物反转录mRNA靶，该引物包含位于互补于一个或多个mRNA靶序列的3′-端部分5′端的启动子序列。然后，利用RNA或来自第一链cDNA的发夹作为引物合成第二链cDNA。由于RNA聚合酶以5′-至-3′的方向转录模板链，使用根据此法的启动子引物，启动子序列能够以正确的取向结合到靶序列上的唯一方法是在第二链cDNA的3′-端复制启动子引物的启动子序列。也就是说，该启动子引物的启动子序列利用第二链cDNA作为模板指导RNA转录。用于转录的模板链因此具有与样品中的mRNA靶序列完全相同的Watson-Crick碱基配对序列，且转录产物包含反义RNA。Van Gelder等的启动子引物中所用的单链启动子序列为有功能双链启动子的一条链，在文中称之为“反义启动子”，而相应的启动子引物在文中称之为“反义启动子引物”。类似地，双链启动子中可操作地连接于模板链的启动子序列在文中称之为“有义启动子序列”，而包含此序列的启动子引物称之为“有义启动子引物”。

[0011]本发明部分地提供了利用有义启动子引物以获得对应于靶序列的转录产物的新方法。该法制备包含编码靶序列的单链DNA模板的转录底物，该ssDNA模板可操作地连接于有功能的双链启动子。本发明的另外方面将会因下文的说明书而被理解。

                       发明简述

[0012]本领域的方法使用反义启动子引物，而本发明的有些实施方案提供了使用有义启动子引物的方法。从而，作为实例，但并非就用于转录的启动子序列或相应的RNA聚合酶而言限制本发明，尽管美国专利No.5,545,522、5,716,785和5,891,636的启动子引物中所用的反义T7启动子序列和+1碱基为：

[0013](5′TAATACGACTCACTATAG 3′)；

[0014]能够用于本发明有些实施方案的启动子引物中的对应有义T7启动子序列和+1碱基为：

[0015](5′CTATAGTGAGTCGTATTA 3′)。

[0016]本发明提供了通过转录环形转录底物用于产生对应于样品中的靶核酸序列的转录产物的方法、组合物和试剂盒。如图1所示，获得环形转录底物的方法的第一步是有义启动子引物通过利用靶序列作为模板的引物延伸。然后利用连接酶在连接条件下连接所得的含有义启动子的第一链cDNA，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA。环形转录底物是通过使互补反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火获得的。该环形转录底物包含可操作地连接于对应于靶序列的单链模板的双链转录启动子。

[0017]本发明也包括获得线性转录底物的方法。在一个实施方案中，如图2所示，含有义启动子的环形第一链cDNA(如上文所述获得)利用本文下面所述的方法线性化。然后，所得的含有义启动子的线性第一链cDNA接着与反义启动子寡核苷酸复合以获得线性转录底物。备选地，可线性化环形转录底物以获得包含可操作地连接于单链模板的双链转录启动子的线性转录底物。环形和线性转录底物都可用于产生对应于靶核酸序列的转录产物。

[0018]本发明也包括用于扩增由转录底物转录而获得的转录产物的量的方法。如图3所示，一个实施方案使用由第一转录底物转录而获得的转录产物，以通过根据本文所述本发明方法利用有义启动子引物产生附加的转录底物。

[0019]本发明也包括通过使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的第一链或第二链cDNA退火获得转录底物的方法实施方案，其使用连接于或固定于表面上的包含反义启动子寡核苷酸的寡核苷酸，其中含有义启动子的第一链或第二链cDNA与固定的反义启动子寡核苷酸复合以获得固定的转录底物，其被用以获得对应于靶核酸的转录产物。反义启动子寡核苷酸的固定使得利用测量棒(dipsticks)、阵列等的方法和测定成为可能。使用固定的环形或线性转录底物检测对应于靶序列的转录产物的方法分别示于图4和图5。

[0020]如果转录底物是通过使用有义启动子引物引发第一链cDNA的合成并使用靶核酸作为模板获得的，则该转录底物的转录产生有义转录产物。

[0021]然而，在本发明的有些实施方案中，获得了反义转录产物。用于获得反义转录产物的一个方法示于图6。简要地，该法使用包含反义启动子序列的引物以引发第一链cDNA的合成。然后，在通过连接而环化第一链cDNA之后，利用链置换引物和链置换DNA聚合酶通过滚环复制获得多联体第二链cDNA。该第二链cDNA包含有义启动子序列。反义启动子寡核苷酸与有义启动子序列的退火允许转录就靶核酸的靶序列而言的反义转录产物。

[0022]在另一个实施方案中(未图解说明)，根据本发明使用有义启动子引物获得用于合成反义转录产物的转录底物。在本发明的这些实施方案中，与包含靶序列的靶核酸互补的第一链cDNA的合成是利用缺乏启动子序列的引物进行的。如果第一链cDNA的序列已知，则可使用在其3′-端具有与第一链cDNA的特定3′序列互补的序列的有义启动子引物来引发第二链cDNA的合成。备选地，第一链cDNA可“加尾”，并利用诸如本领域公知的或如本文所述的那些方法在该第一链cDNA的3′-端添加与靶序列并不互补的附加序列(如，美国专利No.5,962,272以及Schmidt，WM和Mueller，MW，Nucleic Acids Res.，27：e31，1999。添加在第一链cDNA的3′-端的附加序列可作为用于本发明的有义启动子引物退火的独特引发位点。用于结合有义启动子引物的尾巴和/或附加序列是尤为有用的，如果第一链cDNA 3′-部分的序列未知、或者利用有义启动子引物引发构成靶核酸的多种靶序列的合成的话(如，引发对应于样品中实质上所有mRNA分子的第一链cDNA的合成)。使用第一链cDNA作为模板(包括尾巴或附加序列，若存在的话)的有义启动子引物的引物延伸导致合成了含有义启动子的第二链cDNA，通过使用连接酶在连接条件下连接，其可用以获得含有义启动子的环形第二链cDNA。然后，通过使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第二链cDNA退火，可获得本发明的环形转录底物。该环形转录底物可利用本文所述的方法线性化，以获得线性转录底物。备选地，可线性化含有义启动子的环形第二链cDNA，然后与反义启动子寡核苷酸退火，以获得线性转录底物。所得环形或线性转录底物的转录产生就起始靶核酸而言为反义转录产物的转录产物。

[0023]而本发明的另一方面是用于检测和/或定量任何类型的被分析物的信号传递系统，不受限制地包括蛋白、碳水化合物、核酸或其它被分析物。本发明这方面的实施方案使用信号探针(SignalProbes)，包括RCT信号探针或LINT信号探针，其包含连接于信号模板3′-端的有义启动子，以检测和/或定量ABS-oligo，所述ABS-oligo包含与含有反义启动子序列的寡核苷酸相连接的被分析物结合物质。信号探针-ABS-oligo的转录指示着样品中被分析物的存在和/或数量。在本发明的这个方面，模板序列不是通过复制样品中的靶序列获得的。相反，由RNA聚合酶转录以检测和/或定量被分析物的模板作为被分析物结合物质以及被分析物的“信号”使用。本发明使用信号探针的实施方案使得简单测定和方法(诸如但不限于图7和8中举例说明的那些)能够实现。

                    附图的简要说明

[0024]如下附图构成本说明书的一部分，并为进一步演示本发明的某些方面而包含在内。通过参照一个或多个这些附图、结合文中提供的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。

[0025]图1--本发明使用有义启动子引物获得环形转录底物的

实施方案的示意图。

[0026]图2--本发明用于通过使含有义启动子的环形第一链cDNA线性化、并将其与反义启动子寡核苷酸复合而获得线性转录底物的实施方案的示意图。

[0027]图3--使用具有转录终止序列的有义启动子引物以获得环形转录底物、而后者被用以获得附加转录产物的方法或测定的实施方案的示意图。所述测定能够以逐步或连续的方式进行。

[0028]图4--用于检测对应于样品中靶核酸的靶序列的转录产物的测定法的示意图。在该例中，含有义启动子的第一链cDNA与固定在固相支持物如测量棒或珠子上的反义启动子序列退火。所得的固定化环形转录底物通过滚环转录进行转录，且转录产物利用分子信标检测。

[0029]图5--使用通过线性化含有义启动子的环形第一链cDNA并与固定在固相支持物上的反义启动子寡核苷酸复合制备的线性转录底物来制备对应于靶核酸中靶序列的转录产物的测定法的示意图。转录产物可通过任何本领域公知的多种方法检测。

[0030]图6--使用反义启动子引物的实施方案。启动子引物的引物延伸和第一链cDNA的连接制备出含反义启动子的环形第一链cDNA，其可作滚环复制的模板用，其产物为含有义启动子的线性第二链cDNA。反义启动子寡核苷酸的退火制备出多联体线性转录底物，其用于制备转录产物。

[0031]图7--利用包含其上连接有含反义启动子序列的多核苷酸的二抗的被分析物结合物质，使用RCT信号探针检测被分析物的测定法的示意图。反义启动子序列与RCT信号探针的有义启动子复合，由此产生底物，用于通过识别此双链启动子并在转录条件下由此起始滚环转录的RNA聚合酶进行转录。在该例中，利用分子信标检测转录产物，其指示着被分析物的存在。如果用具有已知量的被分析物的对照进行，则也可确定被分析物的水平。

[0032]图8--利用包含其上连接有含反义启动子序列的多核苷酸的二抗的被分析物结合物质，使用LINT信号探针检测、并在合适的条件下定量样品中的被分析物的方法的实施方案。在该实施方案中，反义启动子序列与LINT信号探针的有义启动子复合，由此产生底物，用于通过识别此双链启动子并在转录条件下由此起始线性失控转录(run-off transcription)的RNA聚合酶进行转录。转录产物可通过任何本领域公知的多种方法检测。

                       发明详述

[0033]本发明涉及用于合成对应于样品中或来自样品的一个或多个靶核酸序列的RNA的新的方法、组合物和试剂盒。靶序列可包括含任何来源的RNA或DNA的一个或多个靶核酸的至少一部分。作为举例但并非限制，利用本发明的方法所转录的靶核酸序列可包括对应于样品中一个到基本上所有mRNA分子的第一链cDNA。备选地，所转录的靶核酸序列可包括特定生物体基因组DNA中的特定序列。本发明通过提供获得包含可操作地连接于用于转录的单链模板的双链启动子的环形DNA转录底物的方法，克服了本领域的缺陷，并提供独特体系以合成具有期望序列的RNAs。环形转录底物可用以合成RNA，作为探针使用阵列或微阵列进行表达研究、用于RNase保护研究、用于原位杂交研究、用于Southern和Northern印迹分析、用于合成明确的RNA:DNA杂交体、用于RNA干涉(RNA interference)、用于体外翻译、用于微注射或用于核酸扩增。本发明也允许合成用于这些或其它应用的衍生化RNA。

[0034]一般而言，设想本文所述的RNA或转录产物探针将可作为试剂在液相杂交中、以及在采用固相的实施方案中用于检测相应基因的表达。在涉及固相的实施方案中，将测试DNA(或RNA)吸附或以其它方式固定到所选择的基质或表面上。然后使该固定了的单链核酸与所选择的探针在期望条件下进行杂交。所选择的条件将取决于以所需的特定标准为基础的特定环境(例如，取决于G+C含量、靶核酸类型、核酸来源、杂交探针大小等)。在洗涤杂交表面以除去非特异性结合的探针分子之后，利用标记检测、甚至定量杂交。

用于制备对应于靶核酸序列的转录产物的方法

本发明的一个方面包括用于制备对应于靶核酸中的靶序列的转录产物的方法，该方法包括：

[0035](a)获得靶核酸；

[0036](b)获得有义启动子引物，该有义启动子引物包括含有义转录启动子的5′-端部分以及互补于靶的3′-端部分；

[0037](c)使有义启动子引物与靶核酸退火，以形成靶核酸-有义启动子引物复合体；

[0038](d)使靶核酸-有义启动子引物复合体与DNA聚合酶在聚合反应条件下接触，以获得互补于靶序列的第一链cDNA；

[0039](e)获得第一链cDNA；

[0040](f)在连接条件下连接第一链cDNA，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

[0041](g)获得反义启动子寡核苷酸(oligo)；

[0042](h)使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得环形转录底物；

[0043](i)获得环形转录底物；和

[0044](j)使环形转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触，其中获得转录产物。

[0045]本发明包括使用任何利用环形转录底物合成转录产物的聚合酶，该环形转录底物是通过环化经由有义启动子引物在靶序列上的引物延伸所获得的引物延伸产物而获得的，该有义启动子引物在其5′-端部分包括编码转录启动子有义链的序列，且在其3′-端部分包括靶互补序列，并且其中通过将有义启动子序列与引物延伸产物的3′-端连接，并将所得的环形ssDNA与包含了互补于其中的有义启动子序列的反义启动子序列的寡核苷酸复合(除了启动子引物中使用单链有义假启动子(pseudopromoter)替换双链启动子的有义链)，而使有义启动子可操作地或者功能性地结合于或连接于包含靶序列的引物延伸产物。从而，本发明的方法可使用已知或能够获得对其而言合适的有义启动子序列的任何RNA聚合酶。

[0046]本发明优选的启动子包括用于T7-型RNA聚合酶的启动子。“T7-型RNAPs”意指T7、T3、phi、phiIIH、W31、gh1、Y、A1122、SP6和线粒体RNAPs、以及这些RNAPs的突变形式( Sousa等，美国专 利No.5,849,546；Padilla R和Sousa，R，Nucleic Acids Res.， 15：el38，2002；Sousa，R和Mukheriee，S，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.，73：1-41，2003)，例如但不限于：T7 RNAP Y639F突变酶、T3 RNAP Y573F突变酶、SP6 RNAP Y631F突变酶、在639和784位上都具有改变的氨基酸的T7 RNAP、在573和785位上都具有改变的氨基酸的T3 RNAP、或在631和779位上都具有改变的氨基酸的SP6 RNAP、或者其它突变形式的在本发明的方法中有作用的RNAP。

[0047]本发明的有义启动子也包括为RNA聚合酶(RNAP)所识别从而可在本发明的方法中发挥作用的单链假启动子或合成启动子。本发明的“假启动子”或“合成启动子”可以是任何经鉴定和/或经选择有作为可用来通过特异性结合该启动子的RNA聚合酶进行体外转录的启动子之功能、且在转录反应中作为RNA聚合酶的启动子发挥作用的单链序列。也就是说，被RNA聚合酶所识别的单链假启动子或合成启动子不适合用于本发明使用信号探针的方面，特此并入作为参考。在一些实施方案中也可使用噬菌体N4 vRNAP的单链启动子，在该情况下，在方法或试剂盒中使用野生型或突变形式的N4 mini-vRNAP，两者都在本文别处讨论。

[0048]如果假启动子或合成启动子作为有义启动子用于本发明的方法或测定法之中，则该法中使用用于鉴定和/或选择该假启动子或合成启动子的RNA聚合酶。作为举例但并非限制，包含ssDNA假启动子的有义启动子包括可如Ohmichi等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：54-59，2002，特此并入作为参考)所述获得，并用于本发明使用大肠杆菌RNAP或T7型噬菌体RNAP的方法或测定法的有义启动子引物之中。如果单链假启动子或合成启动子用于本发明的有义启动子引物中，则利用本发明的方法获得的含有义启动子的环形单链cDNA包括不与反义启动子寡核苷酸退火的环形转录底物。因此，在这些实施方案中无需反义启动子寡核苷酸。噬菌体N4 vRNAP的单链启动子也可用于一些实施方案之中，在这种情况下，该法或试剂盒中使用野生型或突变形式的N4 mini-vRNAP，两者都在文中别处讨论，并且在这些实施方案中无需反义启动子寡核苷酸。

A. 定义和一般方法

1. 转录产物

[0049]如本文所用的术语“转录产物”可包括RNA，或者考虑到本发明某些聚合酶，包括但不限于T7 RNAP Y639F突变酶或在639和784位都具有改变的氨基酸的T7 RNAP突变酶( Sousa等，美国专利No. 5,849,546；Pailla，R和Sousa，R.Nucleic Acids Res.，15：el38 2002；Sousa，R和Mukher jee，S，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.， 73：1-41，2003)，使用碱基取代的核糖核苷酸如5-烯丙基氨基-UTP，或者非规则核苷酸底物如dNTPs，或者2′-取代的2′-脱氧核糖核苷酸，例如但不限于2′-氟、2′-氨基、2′-甲氧基或2′-叠氮基取代的2′-脱氧核糖核苷酸的能力，除RNA之外，转录产物可包括DNA，或修饰的DNA，或修饰的RNA，或其混合物。转录产物并非必然地与靶序列具有完美的序列互补性或同一性。例如，转录产物可包括核苷酸类似物如脱氧肌苷或脱氧尿苷，有目的的序列改变如通过包含有可与靶序列杂交但并不互补的序列的引物而引入的序列改变，和/或在转录期间发生的序列差错。

[0050]同样，出于多种原因，本发明的核酸或多核苷酸可能包括一个或多个修饰的核酸碱基、糖部分或核苷间键。作为举例，使用含修饰碱基、糖部分或核苷间键的核酸或多核苷酸的一些原因包括但不限于：(1)修饰T_m；(2)改变多核苷酸对一种或多种核酸酶的敏感性；(3)提供用于连接标记的部分；(4)提供标记或标记的淬灭剂；或(5)提供用于附着到处于溶液之中或结合在表面上的另一分子上的部分如生物素。

2. 样品/靶/靶核酸/靶序列

[0051]根据本发明的“样品”或“生物学样品”以其最广泛的含义使用。样品是由生物或环境来源收集的或与之相关的任何标本，或者其包括或包含生物学材料，不论其是整体还是部分，并且不论是活的还是死的。

[0052]生物学样品可能是植物或动物，包括人，体液(如血液或血液级分、尿液、唾液、痰、脑脊髓液、胸膜液、乳、淋巴液或精液)，拭样(如口腔或子宫颈试样)，固体(如粪便)，微生物培养物(如细菌、真菌、寄生虫、原生动物或病毒的平板或液体培养物)，或者细胞或组织(如新鲜或石蜡包埋的组织切片、毛囊、小鼠尾巴剪碎物、叶或人、动物、植物、微生物、病毒或其它细胞、组织、器官或完整生物体的部分，包括亚细胞级分或细胞提取物)，还有液体和固体食物以及饲料产品和成分，如乳制品、蔬菜、肉类及肉类副产品和废物。生物学样品可从所有的家禽植物或动物以及野生动物或植物各科中获得。

[0053]环境样品包括环境材料如表面物质、土壤、水、空气或工业样品，以及由食品和乳制品加工仪器、器械、设备、器具、可弃型及非可弃型物件获得的样品。这些例子不应解释为限制适用于本发明的样品类型。

[0054]简言之，样品包括来自含有或可能含有天然存在的靶核酸的任何来源的标本。

[0055]对其实施本发明的测定法的样品可以是未加工的生物学材料标本，如血清或其它体液、组织培养基或食物原料。更典型地，对作为通过各种处理以除去将会干扰靶核酸或其扩增产物检测的物质而来源于未加工标本的加工标本的样品实施所述方法。用于加工粗样品以获得更适合用于本发明的测定法的样品的方法是本领域所熟知的。

[0056]“被分析物”是指在测定中待确定其在样品中的存在、浓度或含量的物质。被分析物有时被称之为测定的“靶物质”或“靶分子”或“靶被分析物”。被分析物也可被更具体地称呼。本发明的实施方案涉及作为天然存在的核酸的被分析物，且该分析物可被称之为“靶核酸”或“靶多核苷酸”或“靶寡核苷酸”或“靶序列”，视特定的情形而定。本发明的组合物、试剂盒或方法可用于“被分析物特异性试剂”以检测样品中的靶核酸被分析物或另一被分析物或被分析物结合物。

[0057]就本发明而言，被分析物常与当且仅当存在被分析时存在于样品中的生物学实体有关。此类生物学实体包括类病毒(例如，被分析物为核酸或其片断)、病毒(例如，被分析物为病毒基因组或病毒基因组的片断)、其它微生物(例如，被分析物为该微生物基因组或RNA的片断)、异常细胞如癌细胞(例如，被分析物为癌基因)、或者异常基因(例如，被分析物为包括使得该基因异常的改变的碱基的基因片断，或由于自异常基因转录而包括改变的碱基的信使RNA片断)。

[0058]根据被分析物的描述，显然本发明具有广泛的适用性，包括在通常采用核酸探针进行杂交测定的应用中。从而，在其它应用中，本发明可用于诊断植物和动物包括人的疾病，以及对产品如食品、血液和组织培养物进行污染物测试。

[0059]本发明的“靶”是作为实施生物学测定或诊断性测定的原因或基础的生物学有机体或材料。作为举例但并非限制，可实施本发明的测定法以检测作为可指示既有疾病或将来疾病风险的病毒的靶(如据信导致AIDS的HIV)，或者作为可指示抗生素抗性的基因的靶(如传染性病原细菌中的抗生素抗性基因)，或者作为若不存在则可能指示疾病的基因的靶(例如，必需基因的缺失)。在根据本发明的测定法的形成中，重要的是鉴定产生足够特异、精确和灵敏的测定结果以有意义地与靶的存在和状况关联起来的靶被分析物。

[0060]作为“靶多核苷酸”或“靶核酸”的靶被分析物包括至少一种核酸分子或至少一种核酸分子的一部分，无论所述分子是DNA、RNA还是DNA和RNA兼而有之，并且其中每一个分子至少部分地具有明确的核苷酸序列。靶多核苷酸也可与测定中所用的其它分子具有至少部分的互补性，所述其它分子例如但不限于：引物、剪接模板寡核苷酸、连接夹板寡核苷酸(ligation splint oligos)、俘获探针或检测探针。靶多核苷酸可以是单链或双链的。本发明的靶多核苷酸可以是任意长度的。不过，其必需包括具有足够的序列特异性和长度的多核苷酸序列，以便可用于其期望目的。作为举例但并非限制，用序列互补的检测探针待检测的靶核酸必须具有具备足够的序列特异性和长度的序列，以便在其中不是靶多核苷酸的序列并不杂交的测定杂交条件下仍为检测探针所杂交。具有对本发明的测定法而言足够的序列特异性和长度的靶多核苷酸可利用本领域技术人员公知的方法，通过比较和分析靶及可能存在于样品中的其它序列已知的核酸序列而鉴定。例如，许多病毒、细菌、人以及许多其它生物学有机体的核酸(如基因和信使RNA)的序列可利用公共或私人的数据库检索，并且序列比较、折叠结构以及杂交熔点温度(即T_m)可利用本领域技术人员公知的计算机软件获得。

[0061]术语“靶核酸来源”或“靶多核苷酸来源”是指任何含有天然存在的靶核酸RNA或DNA的样品。

[0062]从而，本发明的方法可对来自多种来源的核酸实施，包括未纯化的核酸或利用任何本领域合适的方法纯化的核酸，所述方法例如但不限于：各种“离心(spin)”柱，阳离子膜及滤膜，或者盐析技术，对此广泛多样的产品可由商业上获得(如MasterPure^TM DNA&RNAPurification Kits from Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)。本发明的方法也可对分离自类病毒、病毒或标本细胞和如Gillespie和Spiegelman( J.Mol.Biol.12：829-842，1965)所述沉积到固相支持物上的核酸实施，所述支持物包括测试棒上的固相支持物和微量滴定板孔的内壁。该法也可用分离自标本并通过“斑点”印迹(Kafatos，等， Nucl.Acids Res.7：1541-1552，1979)；White和Bancroft， J.Biol.Chem.257：8569-8572，1982)、Southern印迹(Southern，E.， J.Mol.Biol.98：503-517，1975)、″northern″印迹(Thomas， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201-5205，1980)以及电印迹(Stellwag和Dahlberg， Nucl.Acids Res.8：299-317，1980)沉积到固相支持物上的核酸进行。该法也可对点样到膜上、载片上、或芯片上作为阵列或微阵列的核酸实施，或者可实施该法以制备探针用于制备探针用于根据与点样到这些表面之一或在其上合成的核酸的杂交而检测或定量样品中存在的核酸。标本的核酸也可通过应用于水相杂交(Britten和Kohne， Science 161：527-540，1968)以及水/有机相间杂交(Kohne等， Biochemistry 16：5329-5341，1977)的本发明的方法测定。水/有机相间杂交具有以极快的动力学进行的优势，但当有机相可溶的连接部分如生物素结合于核酸亲和分子时，并不合适。

[0063]本发明的方法也可对通过扩增天然存在的靶核酸所获得的扩增产物进行，条件是只有样品中存在靶核酸时，靶核酸的靶序列才能由所用的方法扩增。合适的扩增方法包括但不限于：PCR、RT-PCR、NASBA、TMA、3SR、LCR、LLA、SDA(如Walker等， Nucleic Acids Res.20：1691-1696，1992)、RCA、多重置换扩增(Molecular Staging)、ICAN^TM或UCAN^TM(TAKARA)、环-AMP(EIKEN)以及SPIA^TM或Ribo-SPIA^TM(NuGEN Technologies)。使用是另一扩增法产物的核酸作为本发明测定法的靶核酸存在多种原因，例如但不限于为获得更为灵敏的靶检测、更大的特异性，或者减少获得测定结果所需的时间。

[0064]本发明的方法也可对分离自标本并通过斑点印迹沉积到固相支持物上、或通过吸附到微量滴定板孔的壁上、或测试棒的固相支持物材料上、膜上、载片上或芯片如阵列或微阵列上的核酸实施。

[0065]更进一步，本发明的方法适用于检测来自标本如固定的或石蜡包埋的切片、或来自固定在固相支持物上的微生物如复制平板的细菌或酵母的全细胞中的细胞核酸。在有些实施方案中，本发明的方法可用于制备对应于靶序列转录产物，以检测活细胞中的靶核酸。

[0066]靶核酸可以是任何来源的纯化或非纯化形式的核酸。例如，包含DNA的靶核酸可以是dsDNA或ssDNA如线粒体DNA、叶绿体DNA、染色体、质粒或其它附加体、细菌、酵母、病毒、类病毒、支原体、霉菌或其它微生物的基因组、或者真菌、植物、动物或人的基因组。包含RNA的靶核酸可以是tRNA、mRNA、rRNA、线粒体RNA、叶绿体RNA、微小RNA、或其它RNA分子，但不限于此。靶核酸叶可以是DNA和RNA的混合物，包括但不限于上述核酸或其片断的混合物或DNA-RNA杂交体。靶核酸可以仅仅是复杂混合物如生物学样品的一小部分，并且可通过本领域公知的操作由各种生物材料获得。众多用于纯化特定靶核酸的方法是本领域公知的，如果进一步纯化是必要的话。

[0067]术语“靶核酸序列”或“靶序列”是指待转录以制备转录产物的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包含一个或多个靶核酸内的一个或多个序列。靶序列也可以具有在本发明的有些实施方案的过程中添加以促进靶序列与用于特定目的的另一多核苷酸连接的“复合序列(compleing sequences)”。例如，复合序列可提供互补序列，本发明的方法中所用的寡核苷酸(如引物和/或剪接模板)可与该互补序列退火或复合。复合序列通常包含通过手段诸如本文所讨论的那些手段添加的“尾”序列，包括但不限于通过在mRNA的帽子结构处停顿的反转录酶向第一链cDNA中非依赖模板地添加dCMP(存在或不存在锰阳离子时)和/或利用TdT可控地核糖核苷酸加尾。如果在本发明的方法的过程中向靶序列添加复合序列，期望选择不影响利用所得的包含靶序列的转录底物所制备的转录产物的特异性的复合序列。

[0068]靶核酸可以是单链或双链RNA、DNA或混合的RNA和DNA。靶核酸有时更具体地以核酸类型称呼。作为举例但并非限制，靶核酸可以是“靶RNA”或“RNA靶”或“靶mRNA”或者“靶DNA”或“DNA靶”。类似地，靶序列可被称之为“靶RNA序列”或“RNA靶序列”，或称之为“靶mRNA序列”或者“靶DNA序列”等。在有些实施方案中，靶序列包含一个或多个完整的靶核酸，例如特定样品中的一个或所有全长mRNA分子。在其它实施方案中，靶序列仅包含一个或多个靶核酸分子的一部分。当靶核酸最初为单链时，术语“靶序列”也意指互补于该“靶序列”的序列。当“靶序列”最初为双链时，术语“靶序列”可以指该序列的有义链或其互补物，或两者，视方法的期望目的而定。就其实际序列而言，靶序列可以是已知或未知的。在有些情况下，术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”及其变型是可互换使用的。

3. cDNA/第一链cDNA/第二链cDNA/反转录酶/RNaseH

[0069]在本发明有些重要的实施方案中，转录底物的靶序列包括cDNA。一般而言，“cDNA”是指使用DNA聚合酶(包括但不限于RNA-依赖性DNA聚合酶或反转录酶)利用至少部分靶核酸作为模板通过引物延伸合成的“互补DNA”，且该cDNA与至少一部分靶核酸模板“同源”或“碱基配对”。在本发明作为优选实施方案的有些实施方案中，cDNA是使用反转录酶和由生物学样品获得的包含信使RNA(mRNA)的靶核酸作为模板通过反转录引物延伸获得的，且该cDNA与mRNA同源。本领域与由mRNA制备cDNA有关的方法包括合成包含第一链cDNA和第二链cDNA的双链cDNA，它们通常是利用不同的方法相继合成的。然而在本文，即使当本发明的方法导致合成仅一条互补于mRNA的DNA链时，我们也常称之为“第一链cDNA”(即术语“第一链cDNA”并不旨在暗示也存在第二链cDNA)。在有些实施方案中，术语“第一链cDNA”或“cDNA”是指通过反转录任何RNA分子获得的单链DNA分子，即使其并非mRNA。在其它实施方案中，术语“第一链cDNA”或“cDNA”是指使用包含单链DNA或双链DNA的一条链的靶核酸作为模板进行DNA聚合反应通过引物延伸获得的单链DNA分子。

[0070]如果本发明的启动子引物用于靶序列的引物延伸，则启动子序列位于所得第一链cDNA的5′-端。即使启动子引物的启动子序列为有义启动子序列，它也并非如通过与反义启动子寡核苷酸复合而获得功能性双链启动子所需的那样可操作地连接于靶序列的3′-端。因此，通过启动子引物的引物延伸所获得的产物在文中简单地称之为“第一链cDNA”或称之为“第一链cDNA引物延伸产物”或称之为“引物延伸产物”。然而，一旦该启动子序列连接至通过引物延伸获得的靶序列的3′-端，则所得的环形分子在文中称之为“含有义启动子的环形第一链cDNA”。类似地，由含有义启动子的环形第一链cDNA线性化以获得在靶序列3′-端具有有义启动子的线性分子所得的分子在文中称之为“含有义启动子的线性第一链cDNA”。这些指明了相应环形或线性第一链cDNA中靶序列3′-端有义启动子的存在的术语如此使用，从而使读者将会理解，环形或线性转录底物分别地可通过使反义启动子寡核苷酸与相应的含有义启动子的环形或线性第一链cDNA复合(或退火)获得。

[0071]基于对本说明书的阅读，读者将会理解，转录底物不能够通过使有义启动子寡核苷酸与“含反义启动子的第一链cDNA”退火获得(因为有义启动子序列必需连接在模板链上靶序列的3′-端)。也就是说，功能性双链转录启动子只能通过使反义启动子寡核苷酸与模板链上的有义启动子复合获得。因此，读者将会理解，环化含反义启动子的第一链cDNA将不会通过与有义启动子寡核苷酸复合产生转录底物。然而，含反义启动子的环形第一链cDNA的滚环DNA复制产生多联体“含有义启动子的线性第一链cDNA”，通过与反义启动子寡核苷酸复合，其可用于获得多联体线性转录底物。转录产物就靶核酸而言为反义转录产物。

[0072]“RNA-依赖性DNA聚合酶”或“反转录酶”为能够由RNA模板合成互补DNA拷贝(″cDNA″)的酶。所有已知的反转录酶也具有由DNA模板制备互补DNA拷贝的能力；从而，它们既是RNA-又是DNA-依赖性的DNA聚合酶。“模板”是被核酸聚合酶复制的核酸分子。如果核酸包含两条链(即为“双链”)，并且有时候即使核酸仅包含一条链(即为“单链”)，被复制的那条链为“模板”或“模板链”。所合成的拷贝与模板互补。RNA和DNA都总是以5′-至-3′的方向合成的，并且核酸双链体的两条链总是如此排列，从而两条链的5′端处于双链体相反的两端(而且必然地，3′端亦是如此)。RNA和DNA模板都需要引物以通过DNA聚合酶起始合成。可用于本发明的方法之中的反转录酶的实例包括但不限于：AMV反转录酶，MMLV反转录酶，Tth DNA聚合酶，rBst DNA聚合酶大片段，也称之为IsoTherm^TM DNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)，以及BcaBEST^TM DNA聚合酶(Takara Shuzo Co，Kyoto，Japan)。在有些情况下，使用突变形式的反转录酶如缺乏RNase H活性的MMLV反转录酶。又在其它实施方案中，IsoTherm^TM DNA聚合酶最为合适。在其它实施方案中，优选野生型酶。一般而言，就所用的反转录酶而言，本发明不受限制，只要它能发挥作用用于其期望目的。

[0073]在本发明其中使用反转录酶和互补并退火于包含靶核酸的3′-端的引物合成包含ssDNA靶序列的第一链cDNA来获得转录底物的实施方案中，引物可包含寡聚(dT)_n或修饰的寡聚(dT)_n，或者它可包含寡聚d(T)_nX锚定引物，其中“X”包含针对特定mRNA的特异性碱基或用于引发样品中所有mRNA分子的随机核苷酸(即用所有四种核苷酸的混合物合成)，或者引物可包含具有与特定mRNA分子的序列互补的特异性序列的寡核苷酸，或者在有些情况下，它可包含具有随机序列的寡核苷酸(即对引物的每一个位置，都用所有四种核苷酸的混合物合成)。

[0074]如果靶核酸为RNA如mRNA，并期望在利用有义启动子引物反转录之后除去与第一链cDNA退火的RNA，这可通过数种手段之一实现。作为举例但并非限制，RNA可通过RNase H处理、通过碱如但不限于氢氧化钠或氢氧化钾处理除去，或者RNA可通过热变性而从杂交体上除去。在有些应用的优选实施方案中，RNA通过用于反转录(或引物延伸)的反转录酶的RNase H活性除去，反转录酶例如但不限于MMLV反转录酶。备选地，在有些实施方案中，通过在本发明的单链结合(SSB)蛋白如但不限于大肠杆菌SSB(EcoSSB)的存在下实施反转录或温育杂交体，而使RNA从第一链cDNA上解离下来。

[0075]在本发明的有些实施方案中，特别是在用于获得附加轮的转录产物的实施方案中，也使用单独的RNase H酶，不论所述反转录酶是否具有RNase H活性。如果在用于获得多轮转录的实施方案中期望RNase H活性，但不添加单独的RNase H酶，则可使用MMLV反转录酶(野生型RNase H-阳性)。在有些用于获得多轮转录、其中也添加单独的RNase H酶的实施方案中，可使用AMV反转录酶。Kacian等(美国专利No.5,399,491)公开了与向转录介导的、使用MMLV或AMV反转录酶的扩增测定中添加不同含量的单独RNase H酶的效应有关的信息，特此将该文献和信息并入作为参考，并构成本书面公开的一部分。

[0076]“核糖核酸酶H”或“RNase H”为降解RNA:DNA双链体中的RNA部分的酶。RNase H可以是核酸内切酶或核酸外切酶。除其聚合酶活性之外，多数野生型反转录酶具有RNase H活性。不过，存在无相伴的聚合酶活性的其它来源的RNase H。降解可能导致RNA从RNA:DNA复合体中分离。备选地，RNase H可简单地在多个位置上切割RNA，从而部分RNA熔掉，或者允许酶展旋部分RNA。当用在本发明的实施方案中时，能够使用的RNaseH酶包括但不限于大肠杆菌RNase H、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)RNase H以及黄色栖热菌(Thermus flavus)RNase H(美国专利No.5,268,289、5,459,055和5,500,370，特此并入作为参考)。后两种酶是热稳定的，因而在反应中维持更为一致的活性，并且更易于贮存和运输，在多数使用单独的RNase H酶的实施方案中是优选的。其它能够使用的RNase H酶是由Sagawa等在PCT专利公开号WO 02/16639和在PCT专利公开号WO00/56877以及AU 00/29742中描述的那些，特此将其全部并入作为参考。在其它实施方案中，期望使用不太热稳定的酶，例如大肠杆菌RNase H，因为在反应混合物中更易于失活该酶。

[0077]Kacian等在特此并入作为参考的美国专利No.5,399,491中公开推断的RNase H切割位点的数目、分布和位置部分地决定了给定引物的有效性，且扩增可通过包含有意的错配或插入序列以影响推断的RNase H切割位点的数目、分布和位置而予以改善。从而，在本发明用于在反转录以制备第一链cDNA之后从RNA:DNA杂交体中除去RNA的优选过程中，测定RNA靶序列，然后进行分析以确定RNase H降解将在何处导致在第一链cDNA合成之后从双链体中切下或除去RNA区段。本发明的过程包括进行实验以确定所用的反转录酶和/或单独的RNase H酶中存在的RNase H对RNA靶序列的降解对靶序列扩增的影响，所述酶包括但不限于AMV反转录酶及RNase H-正和RNase H-负的MMLV反转录酶，以及大肠杆菌RNase H或者在70℃稳定10分钟以上的热稳定RNase H酶(美国专利No.5,268,289、5,459,055和5,500,370，特此并入作为参考)，例如但不限于Hybridase^TM热稳定RNase H(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)、Tth RNaseH和Tfl RNase H，或者反转录酶和单独的RNase H的不同组合。

[0078]在选择引物(包括本发明的启动子引物)用于反转录RNA靶序列以制备第一链cDNA方面，优选如此选择引物，从而它将与基本上不被反应混合物中存在的RNase H降解的RNA区段杂交。如果存在实质性降解，则RNA链中引物区的切口可能终止或抑制DNA合成并防止引物的延伸。因此，期望选择将与RNA靶中如此定位的序列杂交的引物，以致当将RNA暴露于RNase H时，不存在将会防止形成引物延伸产物的实质性降解。

4. 转录底物

[0079]如本文所用，根据本发明的“转录底物”包含可操作地连接于转录启动子的靶序列，其中RNA聚合酶能够特异性地与转录启动子结合，并在合适的转录条件下合成对应于靶序列的转录产物。为可操作地连接于靶序列，有义转录启动子在靶序列的3′-，并且如果RNA聚合酶的相应启动子必须是双链的才有功能，则使包含反义启动子序列的寡核苷酸与连接于靶序列的有义启动子序列退火。如果有义转录启动子包含如文中别处所描述的业已经过选择或鉴定的单链假启动子或合成启动子，则转录底物可包含单链DNA(即，不与反义启动子寡核苷酸退火)。

[0080]本发明的转录底物也可具有位于转录启动子序列5′-和/或3′-的附加核酸序列，但转录底物并非必需有此附加的其它序列。作为举例但并非限制，转录底物可具有启动子序列5′-的转录起始位点。同样，在本发明的有些实施方案中，转录底物可分别地具有一个或多个转录终止序列，一个或多个DNA切割位点，以如文中别处所述允许可用于获得线性转录底物的环形第一链cDNA可控地线性化，一个或多个复制起点(″ori′s″)(优选为用于单链复制子例如但不限于噬菌体M13复制子的ori)，可选择或可筛选的标记，例如但不限于抗生素抗性基因或β半乳糖苷酶基因，或者一个或多个转座子识别序列，例如Tn5型转座子的外端(″OE″)或嵌合端(″ME″)序列，其双链形式时可被转座酶识别和使用进行体外或体内转座，或者一个或多个为重组酶(例如但不限于cre-lox系统)所识别的位点和/或用于特殊目的的其它序列和遗传元件，包括但不限于为RNA聚合酶所转录的序列，从而在RNA转录产物中提供附加的互补性区域，用于引物退火进行反转录，以制备cDNA用于附加轮的转录。在多数实施方案中，本发明的转录底物的靶序列或模板部分为单链，然而本领域的其它方法中使用双链DNA模板以获得对应于靶序列的转录产物。

[0081]既然除启动子序列之外，本发明的转录底物为单链，术语“3′-”和“5′-”在文中就本发明而言是用来指特定核酸序列或遗传元件(例如但不限于转录启动子)相对于包含转录底物的DNA模板链内其它序列或遗传元件的位置或取向的。从而，尽管认为转录期间5′-至-3′方向的RNA合成是以“下游”方向进行的，但转录底物上的有义转录启动子序列在文中被称为位于靶序列的3′-。本领域技术人员将会理解在核酸化学和结构的环境下，特别地与规则核酸核苷酸糖部分的3′-和5′-位有关的这些术语。作为举例，为线性转录底物上“靶序列3′-”的有义转录启动子是指相对于同一链上的靶序列，位于或靠近转录底物3′-端的有义启动子序列。如果第一核酸序列为一条链上第二序列的3′-，该第一序列的互补物将是互补链上第二序列互补物的5′-。本发明的描述将被理解为是就序列或遗传元件在特定的核酸链内相对的5′或3′位及取向而言的，除非明确地说明为相反的。

5. 核酸、多核苷酸及其类似物

[0082]本发明的“核酸”或“多核苷酸”为包含成串“单核苷”也称之为“核苷”的聚合物分子，其中一个核苷戊糖的3′-位通过核苷间键例如但不限于磷酸二酯键与下一个核苷戊糖的5′-位相连。连接于磷酸基团的核苷被称之为“核苷酸”。连接于该串中下一个核苷酸5′-位的核苷酸被称之为“其5′”或“5′核苷酸”，而连接于该5′核苷酸3′-位的核苷酸被称之为“其3′”或“3′核苷酸”。核酸的戊糖可以是核糖，在这种情况下，核酸或多核苷酸被称之为“RNA”，或者它可以是2′-脱氧核糖，在这种情况下，核酸或多核苷酸被称之为“DNA”。备选地，特别是核酸为化学合成的时候，核酸可由DNA和RNA两种单核苷酸组成。在RNA和DNA中，每一个戊糖都共价连接于四种常见或“规则”核酸碱基(每一种也被称之为“碱基”)之一。与糖相连的三种主要的天然存在的碱基(腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤)对于DNA和RNA是共有的，但一个碱基是不同的；DNA具有另外的碱基胸腺嘧啶，而RNA具有另外的碱基尿嘧啶。本领域技术人员普遍认为小的多核苷酸为“寡核苷酸”。如本文所用的术语“寡核苷酸”被定义为包含两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选大约10到200个核苷酸，但是对于寡核苷酸的长度没有明确的限制。确切的大小将取决于许多因素，它们依次又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。

[0083]为实现本发明的目的，对于本发明的核酸或多核苷酸的组成没有限制，包括任何剪接模板寡核苷酸，引物，包括启动子引物，连接夹板寡核苷酸，检测探针，例如但不限于分子信标(Tyagi等的美国专利No.5,925,517和6,103,476以及Alland等的6,461,817，特此并入作为参考)，俘获探针，寡核苷酸，或测定法或方法中所用或所鉴定的其它核酸，只要每一种核酸发挥其期望用途的作用。作为举例但并非限制，单核苷酸中的核酸碱基可包括鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶核苷，或者备选地，一个或多个核酸碱基可包括黄嘌呤、烯丙基氨基-尿嘧啶、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基及其它烷基腺嘌呤、2-丙基及其它烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞核嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-甲基-腺嘌呤、7-脱氮-7-甲基-鸟嘌呤、7-脱氮-7-丙炔基-腺嘌呤、7-脱氮-7-丙炔基-鸟嘌呤及其它7-脱氮-7-烷基或7-芳基嘌呤、N2-烷基-鸟嘌呤、N2-烷基-2-氨基-腺嘌呤、嘌呤6-氮杂尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶及6-氮杂胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基-腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫醇烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤以及8-卤代鸟嘌呤、8-氨基-鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫醇烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它8-取代的鸟嘌呤、其它氮杂及脱氮尿嘧啶、其它氮杂及脱氮胸苷、其它氮杂及脱氮胞嘧啶、氮杂及脱氮腺嘌呤、氮杂及脱氮鸟嘌呤或5-三氟甲基尿嘧啶及5-三氟甲基胞嘧啶。更进一步，它们可包含由生物素部分、地高辛配基部分、荧光或化学发光部分、淬灭部分或一些其它部分衍生的核酸碱基。本发明不局限于所列的核酸碱基，提供此列表是表明可用于方法中特定目的的碱基的宽广范围。

[0084]在本发明的有些实施方案中，也可以使用如美国专利No.5,539,082、5,641,625、5,700,922、5,705,333、5,714,331、5,719,262、5,736,336、5,773,571、5,786,461、5,817,811、5,977,296、5,986,053、6,015,887和6,020,126(及其中的参考文献)中所述的包含“肽核酸”(PNA)的分子或包含核酸和PNA两者的分子。一般而言，PNA分子是由包含例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元的主链组成的核酸类似物，核酸碱基与其中每一个单元通过合适的接头例如但不限于氮杂、酰胺基、脲基或亚甲基羰基接头连接。PNA分子中的核酸碱基根据Watson-Crick碱基配对规则结合互补的单链DNA或RNA。然而，PNA/DNA或PNA/RNA双链体或杂交体的Tm′s高于DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA双链体的Tm′s。PNA提供比具有相似碱基序列的核酸更紧密的结合和更大的稳定性(如参见美国专利No.5,985,563)。同样，由于PNA并非天然存在的，PNA分子高度地抗蛋白酶和核酸酶的活性。PNA可根据本领域公知的方法制备，例如但不限于上文提及的专利及其中的参考文献中所述的方法。

[0085]当本发明使用包含核酸和肽核酸(PNA)两部分的分子时，一部分或两部分都可使用修饰碱基。例如，通过在构成本发明的2′-脱氧寡核苷酸的核苷酸亚单位和肽核酸亚单位中使用某些修饰碱基可提高结合亲和力。此类修饰碱基可包括5-丙炔基嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基-腺嘌呤。其它修饰嘧啶和嘌呤预期也会提高高分子对核酸互补链的结合亲和力。

[0086]就本发明的核酸或多核苷酸而言，一个或多个糖部分可包括核糖或2′-脱氧核糖，或者备选地，一个或多个糖部分可以是其它糖部分，例如但不限于2′-氟-2′-脱氧核糖或2′-O-甲基-核糖，它们提供对有些核酸酶的抗性，或者2′-氨基-2′-脱氧核糖或2′-叠氮-2′-脱氧核糖，通过使它们与可见、荧光、红外荧光或其它可检测的染料或者具有亲电子、光反应性或其它反应性化学部分的化学品进行反应，它们可用于标记转录产物。

[0087]发明核酸或多核苷酸的核苷间键可以是磷酸二酯键，或者备选地，一个或多个核苷间键可包括修饰的键，例如但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenate)或二硒代磷酸酯键，它们抗有些核酸酶。

[0088]本领域公知有许多方法用于制备具有特定序列的核酸或者含特定核酸碱基、糖、核苷间键、化学部分及其它组成和特征的核酸。可利用这些方法中的任何一种或任意组合制备本发明的核酸、多核苷酸或寡核苷酸。所述方法包括但不限于：

[0089](1)化学合成(通常但并非总是使用核酸合成仪)；

[0090](2)合成后的化学修饰或衍生化；

[0091](3)在核酸克隆载体中克隆天然存在的或合成的核酸(如参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory ApproachSecond Edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY以及Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition，2001，Cold Spring HarborLaboratory Press)，所述载体例如但不限于质粒，噬菌体(如M13或λ)，噬菌粒，粘粒，fosmid，YAC或BAC克隆载体，包括用于产生单链DNA的载体。

[0092](4)利用具有DNA模板依赖性DNA聚合酶活性的酶进行引物延伸，例如但不限于Klenow、T4、T7、rBst、Taq、Tfl或Tth DNA聚合酶，包括突变、截短(如外切-)或化学修饰形式的此类酶；

[0093](5)PCR(如参见Dieffenbach，C.W和Dveksler编辑，PCR Primer：A Laboratory Manual，1995，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)；

[0094](6)利用具有反转录酶活性的酶进行反转录(包括isothermal合成及RT-PCR)，所述酶例如但不限于衍生自鸟类成髓细胞瘤病毒(AMV)、马洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(rBst)或嗜热栖热菌(Tth)的反转录酶；

[0095](7)使用具有RNA聚合酶活性的酶进行体外转录，例如但不限于SP6、T3或T7 RNA聚合酶，Tth RNA聚合酶、大肠杆菌RNA聚合酶或SP6或T7 R&DNA^TM聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)或其它酶。

[0096](8)使用限制性酶和/或修饰酶，包括但不限于核酸外切酶或核酸内切酶、激酶、连接酶、磷酸酶、甲基化酶、糖基化酶、末端转移酶，包括含此类修饰酶及用于制备核酸中的特定修饰的其它试剂的试剂盒；

[0097](9)使用多核苷酸磷酸化酶以制备新的随机化核酸；

[0098](10)其它组合物，例如但不限于核酶连接酶以连接RNA分子；和/或

[0099](11)上述任一或本领域公知的其它技术的任意组合。

[00100]寡核苷酸和多核苷酸，包括嵌合(即复合)分子以及具有修饰碱基、糖或核苷间键的寡核苷酸在商业上可获得(如TriLinkBiotechnologies，San Diego，CA，USA或Integrated DNATechnologies，Coralville，IA)。

[00101]文中互换使用的多核苷酸或寡核苷酸的“部分”或“区域”是2个或更多碱基的连续序列。在其它实施方案中，区域或部分至少大约任意3、5、10、15、20、25个连续核苷酸。

6. 连接/连接酶

[00102]“连接”是指一个核酸分子的5’-磷酸化端与同一个或另一个核酸分子的3’-羟基端通过称作“连接酶”的酶结合起来。备选地，在本发明的有些实施方案中，连接是通过连接于核酸一端的I型拓扑异构酶实现的(见美国专利No.5,766,891，特此并入作为参考)。术语“将……连接”、“连接”和“连接酶”在文中常以一般含义使用，并且表示包括用以将一个核酸的5’-端连接到同一个或另一个核酸的3’-端的任何合适的方法和组合物。本发明不同的实施方案中优选不同的连接酶，如在文中别处所讨论的那样。

[00103]一般而言，如果待连接的核酸包含RNA，则连接酶例如但不限于T4 RNA连接酶、核酶连接酶、Tsc RNA连接酶(Prokaria Ltd.，Reykjavik，Iceland)或另外的连接酶可用于末端的非同源连接。当5′-磷酰基端邻近于与互补序列退火的3′-羟基端时，T4 DNA连接酶也可用于连接RNA分子(如参见Tyagi的美国专利No.5,807,674，特此并入作为参考)。

[00104]如果待结合的核酸包含DNA，且当5′-磷酸化和3′-羟基端与互补DNA退火从而两端靠近时连接这两端(例如，当使用“连接夹板”或“连接夹板寡核苷酸”时)，则可使用酶例如但不限于T4 DNA连接酶、Ampligase DNA连接酶(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)、Tth DNA连接酶、Tfl DNA连接酶或Tsc DNA连接酶(ProkariaLtd.，Reykjavik，Iceland)。然而，本发明不局限于使用特定的连接酶，并且可使用任何合适的连接酶。更进一步，Faruqui在美国专利No.6,368,801中公开了T4 RNA连接酶可有效地连接当与RNA链杂交时彼此靠近的核酸的DNA两端。从而，T4 RNA连接酶在本发明将DNA两端在包含RNA或修饰RNA的连接夹板寡核苷酸上连接的实施方案中是合适的连接酶，修饰的RNA例如但不限于利用DuraScribe^TM T7转录试剂盒(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)制备的含2′-F-dCTP和2′-F-dUTP的修饰RNA。有关在同源连接模板上的连接，特别是使用“连接夹板(ligation splint)”或“连接夹板寡核苷酸”(如文中别处所讨论的那样)的连接，与另一序列“邻近”的区域、部分或序列直接地与该区域、部分或序列邻接。

[00105]在其它包括线性ssDNA分子内连接的实施方案中，连接可在缺乏连接夹板时使用能够催化ssDNA非同源连接的连接酶实现，这种连接酶例如但不限于ThermoPhage^TM RNA连接酶II(ProkariaLtd.，Reykjavik，Iceland)，其衍生自侵染栖热菌(Thermusscotoductus)的噬菌体TS2126。

7. DNA聚合酶/链置换DNA聚合酶/链置换/滚环复制

[00106]“DNA-依赖性DNA聚合酶”为从DNA模板合成互补DNA(″cDNA″)拷贝的酶。实例有来自大肠杆菌的DNA聚合酶I以及噬菌体T7 DNA聚合酶。所有已知的DNA-依赖性DNA聚合酶都需要互补引物以起始合成。已知在合适的条件下，DNA-依赖性DNA聚合酶可由RNA模板合成(即“反转录”)互补DNA拷贝，该过程也被称之为“反转录”，对于此应用，该DNA聚合酶也可被称之为“反转录酶”。

[00107]有些DNA聚合酶能够在由该聚合酶合成新DNA链时置换与模板链互补的链。该过程被称为“链置换”，且具有此活性的DNA聚合酶在文中被称之为“链置换DNA聚合酶”。使用本发明的方法用于链置换DNA合成的模板可以是线性或环形ssDNA。如果DNA模板为单链环，引发的DNA合成绕着环一圈一圈地进行，持续置换出复制链之前的链，该过程被称为“滚环复制”。“滚环复制”导致合成环形模板的串联体拷贝。DNA聚合酶在本发明包括对线性模板链置换或滚环复制的实施方案中的适合性可通过评估其实施滚环复制的能力而容易地确定。作为举例但并非限制，聚合酶实施滚环复制的能力可通过在滚环复制测定中使用该聚合酶确定，例如象由Fire和Xu( Proc. Natl.Acad.Sci.USA 92：4641-4645，1995)所述的那些测定，特此并入作为参考。为使用线性或环形模板进行链置换聚合反应，优选DNA聚合酶为链置换DNA聚合酶且缺乏5′-至-3′核酸外切酶活性，因为5′-至-3′核酸外切酶活性若存在的话，可能导致破坏合成链。也优选公开的链置换合成法中所用的DNA聚合酶具有高度的持续合成能力。除了所用的特定酶之外，DNA聚合酶链置换的能力可随反应条件而变。链置换和DNA聚合酶持续性能能力(processivity)也可使用Kong等( J. Biol.Chem.268：1965-1975，1993及其中引用的参考文献，特此将它们全部并入作为参考)中描述的方法测定。

[00108]本发明优选的链置换DNA聚合酶为rBst DNA聚合酶大片断(也称为IsoTherm^TM DNA聚合酶(EPICENTRE Technologies，Madison，WI，USA)、BcaBEST^TM DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Kyoto，Japan)、RepliPHI^TM DNA聚合酶(EPICENTRE Technologies，Madison，WI，USA)、29 DNA聚合酶(美国专利No.5,576,204和5,001,050)、SequiTherm^TM DNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)以及MMLV反转录酶。其它能够使用的链置换DNA聚合酶包括但不限于：噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto等，Gene 84：247，1989)、噬菌体PRDI DNA聚合酶(Jung等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：8287，1987)、VENTDNA聚合酶(Kong等，J.Biol，Chem，268：1965-1975，1993)DNA聚合酶I的Klenow片断(Jacobsen等， Eur.J.Biochem.45：623-627，1974)、T5 DNA聚合酶(Chatterjee等， Gene 97：13-19，1991)、PRD1 DNA聚合酶(Zhu和Ito， Biochim.Biophys.Acta 1219：267-276，1994)、修饰的T7 DNA聚合酶(Tabor和Richardson， J.Biol.Chem.262：15，330-15，333，1987；Tabor和Richardson， J.Biol.Chem.264：6447-6485，1989)、Sequenase^TM(U.S.Biochemicals，Cleveland，OH，USA)以及T4 DNA聚合酶全酶(Kaboord和Benkovic， Curr.Biol.5：149-157，1995)，特此将所有这些参考文献并入作为参考。链置换DNA聚合酶可在本发明的有些实施方案中用于环形第一链cDNA或环形第二链cDNA的链置换滚环复制。IsoTherm^TM DNA聚合酶(rBst DNA聚合酶大片断；Epicentre)最为优选，因为除了具有链置换DNA聚合酶活性，它也可作为反转录酶用于由RNA靶核酸合成第一链cDNA(如Jendrisak等的美国专利No.6,030,814)。BcaBEST^TM DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Kyoto，Japan)也可用作为反转录酶以及链置换DNA聚合酶。

[00109]链置换可通过使用链置换因子如解旋酶而易化。认为任何能够在链置换因子的存在下进行滚环复制的DNA聚合酶都适合用在本发明包括链置换或滚环复制的实施方案中，即使该DNA聚合酶在缺乏此种因子时并不进行滚环复制。可用于滚环复制的链置换因子包括但不限于：BMRF1聚合酶辅助亚单位(Tsurumi等， J.Virology 67：7648-7653，1993)、腺病毒DNA结合蛋白(Zijderveld和van der Vliet，J.Virology 68：1158-1164，1994)、单纯疱疹病毒蛋白ICP8(Boehmer和Lehman， J.Virology 67：711-715，1993)；Skaliter和Lehman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10，665-10，669，1994)、单链DNA结合蛋白(SSB；Rigler和Romano， J.Biol.Chem.270：8910-8919，1995)以及小牛胸腺解旋酶(Siegel等， J.Biol.Chem.267：13，629-13，635，1992)。

8. (使)杂交/杂交

[00110]术语“(使)杂交”和“杂交”是指足够互补以经由Watson-Crick碱基配对形成复合体的核苷酸序列之间复合体的形成。就本发明而言，彼此“杂交”或“退火”的核酸序列应当形成足够稳定以作期望目的之用的“杂交体”或“复合体”。作为举例但并非限制，当引物或剪接模板寡核苷酸分别与样品中的靶核酸或与“加尾”的靶序列杂交或退火时，每一个相应的复合体或杂交体应当足够稳定，以分别地作DNA聚合酶通过退火引物的引物延伸复制靶序列所必需的引发功能之用，或者利用退火的剪接模板寡核苷酸作为模板以延伸靶序列的3′-端。

9. RNA聚合酶启动子

[00111]在本发明的某些实施方案中，可使用为DNA-依赖性RNA聚合酶特异性识别的启动子序列，例如但不限于由Chamberlin和Ryan在The Enzymes.San Diego，Calif.，Academic Press，15：87-108，1982中以及由Jorgensen等， J.Biol.Chem.266：645-655，1991所描述的那些。数种RNA聚合酶启动子序列特别有用，包括但不限于：衍生自SP6(如Zhou和Doetsch， Proc.Nat.Acad.Sci.USA90：6601-6605，1993)、T7(如Martin和Coleman， Biochemistry 26：2690-2696，1987)以及T3(如McGraw等， Nucl.Acid.Res.13：6753-6766，1985)的启动子。也可使用衍生自噬热栖热菌的RNA聚合酶启动子序列(参见如Wendt等， Eur.J.Biochem.191：467-472，1990；Faraldo等， J.Bact.174：7458-7462，1992；Hartmann等， Biochem.69：1097-1104，1987；Hartmann等， Nucl. Acids Res.19：5957-5964，1991)。启动子序列的长度将根据所选的启动子而变。例如，T7 RNA聚合酶启动子长度可仅有大约25个碱基而作为功能性启动子起作用，而其它启动子序列需要50个或更多碱基以提供功能性启动子。

[00112]在本发明其它的实施方案中，使用被来自T7-样噬菌体的RNA聚合酶所识别的启动子。业已发现研究过的所有T7-样噬菌体的遗传结构本质上与T7的相同。根据本发明的T7-样噬菌体的实例包括但不限于：大肠埃希氏杆菌噬菌体T3、φI、φII、W31、H、Y、A1、122、cro、C21、C22及C23；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)噬菌体gh-1；鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)噬菌体SP6；粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)噬菌体IV；柠檬细菌(Citrobacter)噬菌体ViIII以及克雷伯氏杆菌(Klebsiella)噬菌体No.11(Hausmann， Current Topics in Microbiology and Immunology 75：77-109，1976；Korsten等， J.Gen.Virol.43：57-73，1975；Dunn等， Nature New Biology 230：94-96，1971；Towle等， J.Biol.Chem.250：1723-1733，1975；Butler和Chamberlin，J.Biol.Chem.257：5772-5778，1982)。

[00113]本发明的有些实施方案也包括使用大肠杆菌噬菌体N4RNA聚合酶(N4 vRNAP)(Rothman-Denes，L.B.和Schito，G.C.，Virology，60：65-72，1974；Falco，S.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：520-523，1977；Falco，S.C.等，J.Biol.Chem.，255：4339-4347，1980；Kazmierczak，K.M.等，EMBO J.，21：5815-5823，2002，特此将其全部并入作为参考)，且所述ssDNA寡核苷酸的启动子序列包含被大肠杆菌噬菌体N4 vRNAP所识别的保守启动子序列，其中所述启动子序列包含5-碱基对的茎和3-碱基的环的发夹结构(Glucksmann，M.A.等，Cell，70：491-500，1992；Haynes，L.L.和Rothman-Denes，L.B.，Cell，41：597-605，1985)，特此将该参考文献和该启动子作为本发明的一部分并入作为参考。作为举例但并非限制，可使用包含如下序列的启动子：

[00114]P1：3′-CAACGAAGCGTTGAATACCT-5′；或

[00115]P2：3′-TTCTTCGAGGCGAAGAAAACCT-5′；或

[00116]P3：3′-CGACGAGGCGTCGAAAACCA-5′。

[00117]与其它已知的RNA聚合酶形成对照，N4 vRNAP在体外以体内的特异性转录单链含启动子的模板(Falco，S.C等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3220-3224，1978；Haynes，L.L.和Rothman-Denes，L.B.，Cell，41：597-605，1985，特此将其全部并入作为参考)。在本发明最为优选的实施方案中，RNA聚合酶包含N4vRNAP转录活性的1,106个氨基酸的结构域(文中命名为“mini-vRNAP”)，其对应于N4 vRNAP的氨基酸998-2103(KrystynaM.Kazmierczak，博士论文，University of Chicago，2001；Kazmierczak，K.M.，等，EMBO J.，21：5815-5823，2002，特此并入作为参考)，且反应条件如其中所述的那样。

10. 反应条件

[00118]合适的用于实施本发明的方法的反应介质和条件是允许根据本发明方法的核酸转录及其它反应进行的那些。就本发明采用野生型或突变T7 RNAP酶的转录反应而言，体外转录的反应条件是随AmpliScribe^TM T7-Flash^TM转录试剂盒或者AmpliScribe^TM T7高产转录试剂盒或者DuraScribe^TM T7转录试剂盒提供的或者用T7 R&DNA^TM聚合酶掺入除2’-氟代脱氧核糖核苷酸以外的2’-取代的脱氧核糖核苷酸的那些，每种情况下都依据制造商EPICENTRE Technologies，Madison，WI的说明进行。如果利用本发明的方法使用T3或SP9 RNAP用于转录，则体外转录的反应条件是随AmpliScribe^TM T3高产转录试剂盒或AmpliScribe^TMT3-Flash^TM高产转录试剂盒或随AmpliScribe^TM SP6高产转录试剂盒提供的那些，每种情况下都依据制造商EPICENTRETechnologies，Madison，WI的说明进行。

[00119]如果mini-vRNAP或mini-vRNAP Y678F酶用于具有单链启动子的单链DNA模板的体外转录，例如但不限于为了获得由RCT信号探针所得的转录产物的附加扩增的用途，则通过设置以所给出的顺序添加的、含如下终浓度组分的反应混合物，制备如下的体外转录反应：0.1微摩尔含N4 vRNAP启动子的DNA寡核苷酸；1.0微摩尔EcoSSB蛋白；1×转录缓冲液，含40mM Tris-HCl(pH 7.5)，6mM MgCl₂，2mM亚精胺和10mM NaCl；1mM DTT；0.5mM各NTP(ATP、CTP、GTP和UTP)；不含RNase的去离子水，从而在添加RNAP后终体积将是50微升；以及0.1微摩尔的mini-vRNAP或mini-vRNAP Y678F酶。在本发明的有些实施方案中，使用各0.5mM终浓度的2′-F-dUTP和2′-F-dCTP替换UTP和CTP，以获得抗核糖核酸酶A-型酶的修饰RNA的合成。其它修饰的核苷三磷酸也可用于替换或作为规则NTPs的补加物用于特定应用。然后于37℃温育反应混合物以允许由模板合成RNA。反应后可接着进行PAGE凝胶上的凝胶电泳。

[00120]利用其它RNA聚合酶进行体外转录的反应条件是本领域所熟知的，并且可由公共出版物获得。

[00121]本发明并不局限于这些反应条件和反应物浓度。本领域技术人员将会知晓通过简单的实验能够发现其它可使用本发明RNA聚合酶的合适反应条件，并且任何这些反应条件也包括在本发明的范围之内。此类介质和条件是本领域技术人员公知的，并且在各种出版物中有描述，例如美国专利No.5,679,512和PCT公开号WO99/42618，特此并入作为参考。例如，缓冲液可以是Tris缓冲液，尽管也可以使用其它缓冲液，只要该缓冲液组分对本发明方法的酶组分是非抑制性的。pH优选从大约5到大约11，更优选从大约6到大约10，甚至更优选从大约7到大约9，并且最优选从大约7.5到大约8.5。反应介质也可包括二价金属离子如Mg⁺²或Mn⁺²，其游离离子的终浓度在从大约0.01到大约10mM的范围之内，并且最优选从大约1到6mM。反应介质也可以包括对介质的总离子强度产生贡献的其它盐如KCl。例如，盐如KCl的范围优选从大约0到大约100mM，更优选从大约0到大约75mM，并且最优选从大约0到大约50mM。反应介质可进一步包括能够影响反应性能但并非所述方法的酶组分的活性所必需的添加剂。此类添加剂包括蛋白如BSA以及非离子去污剂如NP40或Triton。也可以包括能够维持具巯基酶的活性的试剂如DTT。此类试剂是本领域公知的。适当的情形下，也可以包括并不抑制方法中所采用的RNase活性的RNase抑制剂例如但不限于胎盘核糖核酸酶抑制剂(如RNasin，Promega Corporation，Madison，WI，USA)或抗体RNase抑制剂。本发明的方法的任何一方面可在相同或可变的温度下发生。优选地，反应等温进行，这避免了繁琐的热循环过程。反应在允许本发明的寡核苷酸与本发明方法的靶序列和/或第一链cDNA杂交、且并不实质性抑制所采用酶的活性的温度下进行。温度可以在优选大约25℃到大约85℃的范围内，更优选大约30℃到大约75℃，并且最优选大约37℃到大约70℃。在包括RNA转录的过程中，转录步骤的温度低于在前步骤的温度。在这些过程中，转录步骤的温度可在优选大约25℃到大约85℃的范围内，更优选大约30℃到大约75℃，并且最优选大约37℃到大约55℃。

[00122]如在美国专利No.6,048,696和6,030,814中以及德国专利号DE4411588C1中所公开的那样(特此将其全部都并入作为参考，并构成本发明的一部分)，在许多实施方案中优选在DNA聚合酶或反转录酶反应中使用终浓度大约0.25M、大约0.5M、大约1.0M、大约1.5M、大约2.0M、大约2.5M或者在大约0.25M和2.5M之间的甜菜碱(三甲基甘氨酸)，以便降低DNA聚合酶的终止，并提高使用DNA聚合酶的反应的特异性。

[00123]在本发明的方法中可用来合成反转录或引物延伸产物的核苷酸和/或核苷酸类似物如脱氧核糖核苷三磷酸，是以确定为最佳或可用于特定期望用途的量提供的。

[00124]本发明反应的寡核苷酸组分通常过量于待扩增的靶核酸序列的数目。它们可以提供为大约或至少大约下列任一量：10、10²、10⁴、10⁶、10⁸、10¹⁰、10¹²倍于靶核酸的量。启动子引物、剪接模板、连接夹板寡核苷酸、阻滞序列寡核苷酸、链置换引物等分别可提供为大约或至少大约下列任一浓度：50nM、100nM、500nM、1000nM、2500nM、5000nM或10,000nM，但也可以使用更高或更低的浓度。作为举例但并非限制，某浓度的一个或多个寡核苷酸可能适宜于产生另一应用或过程中所用的一个或多个靶核酸序列。本发明并不局限于特定浓度的寡核苷酸，只要所述浓度在本发明的特定方法中有效即可。

[00125]在有些实施方案中，前述组分在过程起始之际同时添加。在其它实施方案中，组分是以任意顺序在过程期间合适的时间点之前或之后添加的，如反应所需和/或所允许的那样。此类时间点可由本领域技术人员容易地确定。用于根据本发明的方法的核酸反应的酶通常是在样品之中或来自于其中的双链靶核酸变性的步骤之后，和/或在反应的引物和/或寡核苷酸与变性的双链或单链靶核酸杂交之后添加的到反应混合物之中的，正如由其热稳定性和/或本领域技术人员所公知的其它考虑所确定的那样。

[00126]反应可在多个时间点停止，并在稍后的时间再继续。时间点可由本领域技术人员容易地确定。用于停止反应的方法是本领域公知的，例如，包括将反应混合物冷却至抑制酶活性的温度。用于再继续反应的方法也是本领域公知的，例如，包括将反应混合物的温度升至允许酶活性的温度。在有些实施方案中，在反应再继续之前、之际或之后补充一种或多种反应组分。备选地，可令反应不加中断地进行(即从开始到结束)。

11. 转录产物或由其获得或衍生的组合物的检测及鉴定

[00127]在有些实施方案中，产物的检测指示着靶序列的存在。在有些实施方案中也可以实施定量分析，包括实时分析。直接和间接的检测法(包括量化)是本领域所熟知的。例如，通过比较由包含未知量的含靶序列多核苷酸的测试样品扩增到的产物与具有已知数量的含靶序列多核苷酸的参照样品的产物的含量，能够确定测试样品中靶序列的含量。本发明的方法也可扩展到序列变异的分析以及靶核酸的测序。所扩增的核酸可使用任何合适的操作测序。许多此类操作是已知的。优选的用于由一些实施方案产生的扩增序列的测序形式为由Jalanko等， Clinical Chemistry 38：39-43，1992；Nikiforov等，Nucleic Acids Research 22：4167-4175，1994以及Kobayashi等，Molecular and Cellular Probes 9：175-182，1995描述的nanosequencing法，以及如PCT申请WO 97/20948中所述的引物延伸序列分析，特此将其全部并入作为参考。此外，检测可通过例如检查来自RNA产物的翻译产物实现。

B. 用于获得包含靶序列的ssDNA的方法

1. 用于获得靶序列的一般方面和方法

[00128]获得靶序列的初始步骤是使得靶核酸成为单链。如果靶核酸为双链DNA(dsDNA)，则初始步骤为靶变性。变性步骤可以是热变性或任何本领域公知的其它方法，如碱处理。

[00129]在本发明其中样品中的靶核酸为DNA的一些实施方案中，ssDNA靶序列包含存在于生物学样品之中的ssDNA或者通过样品中的dsDNA变性所获得的ssDNA。

[00130]在其它实施方案中，ssDNA靶序列包含因为“引物延伸反应”所获得的ssDNA，所述反应是指使用存在于样品之中的ssDNA或变性dsDNA作为模板和寡核苷酸作为引物，在DNA聚合反应条件下的体外或体内DNA聚合反应。“引物”为寡核苷酸(寡核苷酸)，通常具有游离的3′-OH基团，其中至少3′-部分的寡核苷酸互补于模板的一部分，且通过氢键及其它分子力，该寡核苷酸与模板“结合”(或“复合”或“退火”或“杂交”)，以产生引物/模板复合体用于通过DNA聚合酶起始合成，并且在DNA合成过程中，其通过在其互补于模板的3′-端添加共价键合的碱基而得以延伸(即“引物延伸”)。其结果就是引物延伸产物。几乎所有已知的DNA聚合酶(包括反转录酶)都需要寡核苷酸与单链模板复合(“引发”)以起始DNA合成，而RNA复制和转录(由DNA复制RNA)一般不需要引物。

[00131]在有些实施方案中，样品中的靶核酸或引物延伸产物或两者，通过本领域公知的方法制成更小的DNA片断以产生DNA靶序列。在有些使用含DNA靶核酸的样品的实施方案中，ssDNA靶核酸是利用链置换法获得的，例如但不限于Takara Shuzo Company，Kyoto，Japan的PCT专利申请号WO 02/16639、WO 00/56877和AU 00/29742；BectonDickinson and Company的美国专利No.5,523,204、5,536,649、5,624,825、5,631,147、5,648,211、5,733,752、5,744,311、5,756,702和5,916,779；Nanogen/Becton Dickinson Partnership的美国专利No.6,238,868、6,309,833和6,326,173；Bio Merieux的美国专利No.5,849,547、5,874,260和6,218,151；Gen-Probe，Inc.的美国专利No.5,786,183、6,087,133和6,214,587；Wick等的美国专利No.6,063,604；Kurn的美国专利No.6,251,639；Eiken KagakuKabushiki Kaishi，Tokyo，Japan的美国专利No.6,410,278和PCT申请号WO 00/28082；Auerbach的美国专利No.5,591,609、5,614,389、5,773,733、5,834,202和6,448,017；以及Lizardi的美国专利No.6,124,120和6,280,949中描述的方法，特此将其全部并入作为参考。又在另一个实施方案中，ssDNA靶序列是由滚环复制反应获得的。若需要界定的话，DNA靶序列的3′-端可通过使用本领域公知的任何合适的方法界定，例如但不限于本文题为“用于界定仅包含较大RNA或DNA靶核酸一部分的靶序列5′-和3′-端的方法”的小节中所讨论的方法。

[00132]如果靶核酸为RNA，则获得靶序列的初始步骤包括通过RNA靶的反转录合成单链第一链cDNA，这是指利用存在于样品中的RNA为模板以及互补于该RNA模板的至少一部分序列的核酸寡核苷酸作为引物，以使用RNA-依赖性DNA聚合酶(即反转录酶)在反应条件下合成ssDNA的体外反应。用于由RNA合成cDNA的技术是本领域公知的。

[00133]在有些实施方案中，用于本发明方法的第一链cDNA是利用类似于美国专利No.5,168,038、5,021,335和5,514,545中描述的那些的方法在组织切片的细胞或组织中原位合成的，特此将其并入作为参考。从而，第一链cDNA是通过使组织切片的细胞或组织在杂交条件下与引物接触合成的，其中引物与细胞或组织中的一个或多个靶序列杂交。

[00134]本发明包括用于制备包括含有义启动子的环形第一链cDNA的转录底物的方法，该第一链cDNA互补于组织切片的细胞或组织中包含靶核酸的靶序列，该方法包括：

[00135](a)使组织切片中的细胞或组织在杂交条件下与有义启动子引物接触，该有义启动子引物包含：(i)包含用于能够使用转录底物中的该启动子合成RNA的RNA聚合酶的有义转录启动子的5′-磷酸化部分，和(ii)互补于包含该靶核酸的靶序列的3′-端；

[00136](b)使组织切片中含有义启动子引物的细胞或组织与反转录酶在反转录条件下接触，从而获得互补于靶序列的第一链cDNA；

[00137](c)获得含有义启动子的线性第一链cDNA；

[00138](d)连接含有义启动子的线性第一链cDNA，从而获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

[00139](e)使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，从而获得环形转录底物。

[00140]细胞或组织中的环形转录底物可与在转录条件下使用该启动子的RNA聚合酶温育，其中转录产物得以获得。

[00141]引物可具有与样品中RNA靶的特定已知序列互补的序列，或者引物可具有包含所有可能的或许多可能的序列的混合体的序列，例如但不限于包含随机六聚体引发序列的引物。随机引物序列可利用寡核苷酸合成仪，通过在化学合成互补于靶序列的寡核苷酸的每个核苷酸位置期间纳入与四种规则碱基中每一个(即所有四种核苷酸)互补的核苷酸试剂制备。在本发明使用含mRNA靶样品的实施方案中，ssDNA靶序列包含通过利用寡核苷酸引物反转录mRNA所制备的第一链cDNA，所述引物包含与特定mRNA的已知序列互补的特异性序列，或者如果所述mRNA在其3′-端具有(A)尾巴，则利用寡聚(dT)引物或者寡聚(dT)锚定引物。在本发明的其它实施方案中使用有义启动子引物，其既可作引发合成第一链cDNA靶序列之用，又可将有义转录启动子结合到靶序列上。

2. 用于界定仅包含较大RNA或DNA靶核酸一部分的靶序列5′-和 3′-端的方法

[00142]当本发明的方法用于获得对应于一个或多个核酸分子的完整序列(例如但不限于样品中基本上所有多聚腺苷酰化的mRNA分子的完整序列(排除帽子结构))的转录产物时，没必要设计方法来界定序列的5′-和3′-端。可是，如果本发明的方法用于获得对应于仅包含样品中较大RNA或DNA核酸一部分的靶序列的转录产物，则需要方法来限定成为转录模板的靶序列。

[00143]有两种一般途径用于限定成为转录模板序列的靶序列的末端。在第一种直接途径中，使用方法确定存在于样品之中的靶核酸分子本身的大小和末端序列。在第二种间接途径中，不是改变存在于样品之中的靶核酸分子的大小和末端序列，而是使用方法确定分别通过样品中的RNA或DNA的至少一条链反转录或引物延伸而合成的一个或多个第一链cDNA分子的大小和末端序列。

[00144]就直接途径而言，本领域公知许多用于在特定序列或其附近切割核酸分子方法，并且可使用限定用于本发明应用的靶核酸的大小和末端序列的任何方法。作为举例但并非限制，样品中包含dsDNA分子或ssDNA分子的、合适的互补DNA寡核苷酸与之退火的DNA，可用限制性核酸内切酶消化，条件是存在将提供合适的5′-端和/或3′-端序列的限制性位点。备选地，可使用一个或多个具有含FokI限制酶位点的双链区段和与第一链cDNA上的期望切割位点结合的单链区段的DNA寡核苷酸。正如本领域所熟知的那样，这类寡核苷酸可与限制性酶FokI一起使用，以便在几乎任何期望的序列上切割单链DNA(Szybalski，W.， Gene 40：169-173，1985；Podha jska A.J.和Szybalski W.，Gene 40：175，1985，特此并入作为参考)。

[00145]作为进一步的举例但并非限制，存在于样品中的ssRNA靶核酸可用核糖核酸酶H在包含至少3到4个脱氧核糖核苷酸的互补寡核苷酸与之退火的区域切割。备选地，线性DNA寡核苷酸可与样品中的RNA在编码能够切割RNA:DNA杂双链体的限制性酶的识别位点的位置上退火。用该酶切割靶RNA:DNA寡核苷酸将会产生明确的末端。备选地，具有与RNA靶序列上旨在成为转录底物的区域互补的序列的RNA或DNA寡核苷酸或多核苷酸可与RNA退火，而RNA上所述寡核苷酸或多核苷酸未与之退火的序列可利用单链特异性核糖核酸酶如RNase A或RNase T1消化。更进一步，具有已知序列的RNA或DNA核酸可利用5′-核酸酶或Cleavase^TM酶以及特异性寡核苷酸在特定位点切割，如由Kwiatkowski等( Molecular Diagnosis 4：353-364，1999)以及在授予Third Wave Technologies(Madison，WI，USA)的美国专利No.6,001,567和相关专利中所描述的那样，特此将其并入作为参考。

[00146]一般地，就第二种间接途径而言，用于样品中RNA反转录的或者用于样品中DNA的至少一条链引物延伸的引物的5′-端限定了第一链cDNA靶序列的5′-端。从而，被反转录或引物延伸以制备第一链cDNA靶序列的样品靶核酸无需具有确定的3′-端。

[00147]为在第一链cDNA上产生明确的3′-端(即对应于靶序列的5′-端)，可使用许多方法获得本发明的靶序列。作为举例但并非限制，如果第一链cDNA中存在着对应于将提供合适的3′-端序列的限制性核酸内切酶位点的特定序列，则互补DNA寡核苷酸可与该序列退火，且该位点可用限制性酶切割。用于提供双链限制性位点的互补DNA寡核苷酸可任选地在其3′-端具有2′，3′-双脱氧核糖核苷酸或另一终止子核苷酸，从而它不能被DNA聚合酶延伸。备选地，靶序列的3′-端可利用具有含FokI限制性酶位点的双链区段以及与第一链cDNA上的期望切割位点结合的单链区段的DNA寡核苷酸界定(Szybalski，W.，Gene 40：169-173，1985；Podha jska A.J.和Szybalski W.， Gene 40：175，1985)。更进一步，可如上文所讨论的那样，使用5′-核酸酶在明确的3′-端切割第一链cDNA。

[00148]除了上述方法，第一链cDNA的3′-端也可由其它方法限定。本发明一种优选的方法是使用“阻断寡核苷酸(blockingoligo)”或“阻滞序列(blocker sequence)”，如Laney等在美国专利No.5,679,512中，以及Kurn在美国专利No.6,251,639中所公开的那样，特此将两篇专利都并入作为参考。“阻滞序列”或“阻滞寡核苷酸”是多核苷酸，其通常为单链的合成多核苷酸，并且包含可与靶核酸区段杂交并且优选与之互补的序列，其中阻断寡核苷酸与靶核酸退火，从而在期望位置上阻断第一链cDNA 3′-端的进一步引物延伸。本发明为获得ssDNA靶序列的链置换法的有些实施方案包括使用阻断寡核苷酸。阻断寡核苷酸包含以亲和力优选为高亲和力与靶核酸结合的核苷酸，从而该阻滞序列在引物延伸的过程中，优选在大于约30％、更优选大于约50％、甚至更优选大于约75％、并且最优选大于约90％的引物延伸事件中抗DNA聚合酶的置换。阻滞多核苷酸的长度和组成应当是这样的，使得可避免本发明方法的条件下的过量随机非特异性杂交。阻滞多核苷酸的长度优选从大约3到大约30个核苷酸，更优选从大约5到大约25个核苷酸，甚至更优选从大约8到大约20个核苷酸，并且最优选从大约10到大约15个核苷酸。在其它实施方案中，阻滞多核苷酸为至少大约以下任一：3、5、8、10、15个；并且少于大约以下任一：20、25、30、35个。应当理解长度可更大或更小，如本发明方法的反应条件下适合的话。阻滞多核苷酸与靶核酸上其期望的结合序列的互补性优选为至少大约25％，更优选至少大约50％，甚至更优选至少大约75％，并且最优选至少大约90％。在有些实施方案中，与DNA靶核酸杂交的阻滞序列结合于该DNA，从而使影响引物延伸的聚合酶对阻滞序列的置换被基本上或者至少被充分地抑制。用于实现此类结合的合适的方法包括本领域公知的技术，例如使用如Flanagan等( Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：3513-3518，1999)所述的含G-夹钳杂环修饰的胞嘧啶类似物以及如Kumar等( Bioorg.Med.Chem.Lett.8：2219-2222，1998)以及如Wahlestedt等( Proc.Natl.Acad.Sci. USA 97：5633-5638，2000)所述的闭锁核酸，特此将其全部并入作为参考。其它合适的方法包括在适当的情形下使用具有高GC含量和/或交联的序列。这些用于获得增强的结合的方法中的任何一种可单独或者组合使用。备选地，可使用包含肽核酸(″PNA″)的分子。

[00149]更进一步，可用来限定第一链cDNA 3′-端的另一方法是在反转录或引物延伸期间，使用具有短DNA合成延伸循环的热循环仪合成第一链cDNA。引物延伸产物的长度可在某些程度上受DNA合成循环长度的控制。可通过控制在升温变性模板上生长的第一链cDNA之前DNA合成的温度和时间间隔确定条件以限定第一链cDNA大约的链长。

[00150]此外，将要成为模板序列用于转录反应的第一链cDNA的3′-端可通过首先利用限定末端序列的任何合适的扩增法扩增靶核酸序列来界定。作为举例但并非限制，它可利用PCR、RT-PCR、NASBA、TMA、3SR、连接链式反应(LCR)、连接的线性扩增(BioRad)、SDA、RCA、ICAN^TM(Takara：Sagawa等PCT专利申请号WO 02/16639以及PCT专利申请号WO00/56877和AU 00/29742中)或Kurn(美国专利No.6,251,639)的链置换法制备，特此将其全部并入作为参考。

[00151]如果靶序列的3′-端无需处于确切的定位，并且可以是随机或不精确的，这是本发明有些实施方案中的情况，有许多其它方法可用于制备较小的DNA分子片断，不论是对靶核酸、靶序列或是其它。作为举例但并非限制，靶核酸可通过物理手段片断化，例如通过注射器针头或其它管口进进出出的运动或通过超声波破碎，优选伴随着随后的末端修复，例如使用T4 DNA聚合酶或试剂盒如End-It^TM DNA末端修复试剂盒(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)。能够使用的另外又一种方法是在反转录或引物延伸期间通过利用dUTP取代反应中的部分TTP，将dUMP随机掺入到第一链cDNA中。dUMP将取代TMP以基于dUTP与TTP比率的频率随机掺入。然后，第一链cDNA可通过用可由Epicentre Technologies(Madison，WI，USA)获得的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)和核酸内切酶IV(endo IV)处理而在dUMP掺入位点切割(如参见美国专利No.6,048,696，特此并入作为参考)。UNG水解含尿嘧啶而不是胸腺嘧啶的单链和双链DNA中脱氧核糖与尿嘧啶之间的N-糖苷键。它对RNA中的尿嘧啶残基或对dUTP没有活性。Endo IV在脱碱基位点切割磷酸二酯键。对于有些应用使用热不稳定的UNG(如来自Epicentre Technologies，Madison，Wisconsin，USA的HK^TM-UNG)可能是有用的。(同样，在合成寡核苷酸内的特定位点处，或者例如在本发明启动子引物内3′-靶序列互补性部分和启动子序列之间掺入dUMP，会引入特异切割位点，其可用于在任何时候通过用UNG和endo IV处理来切割含该位点的所得核酸。)更进一步，在有些情况下，第一链cDNA的3′-端可通过用核酸外切酶III处理来界定(Henikoff，S.， Gene 28：351，1984)。又在其它情况下，与DNA靶核酸退火的第一链cDNA的3′-端可在反应中存在或不存在dNTPs时与T4 DNA聚合酶或未修饰的T7 DNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)温育；这些酶在缺乏dNTPs时具有3′-至-5′核酸外切酶活性，但在dNTPs存在时聚合酶活性占优势。这些仅仅是可用于界定第一链cDNA 3′-端的一些方法，且本发明并不局限于这些方法，它们仅仅是作为实例提供的。

C. 用于获得转录底物的方法

1. 引言

[00152]在第一个一般实施方案中，第一链cDNA是利用在其5′-部分包含有义转录启动子且在其3′-端包含与靶序列互补的序列的有义启动子引物作为引物，以及靶核酸序列作为模板，通过反转录或引物延伸获得的。环形转录底物是通过连接第一链cDNA以获得含有义启动子的环形第一链cDNA，然后使反义启动子寡核苷酸与该有义启动子序列退火获得的。在另一个实施方案中，通过线性化含有义启动子的环形第一链cDNA(例如，并非限制本发明，使用尿嘧啶-N-糖基化酶和核酸内切酶IV)获得具有靶序列3′-的有义启动子的线性转录底物，然后通过反义启动子寡核苷酸的退火获得环形转录底物。

[00153]又在另一个实施方案中，包含第二链cDNA的转录底物是通过如下获得的：

[00154](a)利用反转录酶或DNA聚合酶以及在其5′-部分包含反义转录启动子且在其3′-端包含与靶序列互补的序列的反义启动子引物合成线性第一链cDNA；

[00155](b)连接所得的线性第一链cDNA以获得具有反义转录启动子的环形第一链cDNA；

[00156](c)利用环形第一链cDNA作为模板，具有互补于第一链cDNA上的序列的3′-端的引物，以及DNA聚合酶，优选链置换DNA聚合酶，通过DNA合成，优选滚环复制DNA合成，获得含有义启动子的线性第二链cDNA；和

[00157](d)退火反义启动子寡核苷酸以获得线性转录底物。如果第二链cDNA是通过滚环复制获得的，则所获得的线性转录底物为多联体线性转录底物。在该实施方案中，转录底物的转录产物包括反义转录产物。

[00158]上述用于获得本发明方法的转录底物的过程的实施方案仅仅是作为实例提供的，而并不旨在限制本发明。上述及文中的说明将揭示用于获得用以制备对应于本发明方法中靶核酸的转录产物的转录底物的方法和过程的众多其它实施方案，并使之对本领域技术人员来说显而易见，并且本发明包括所有那些用于获得本发明方法所用转录底物的方法和过程。

[00159]在其中靶序列包含mRNA的实施方案中，不论是单一种类的mRNA还是特定样品中的所有mRNA，转录产物随后都可用于多种应用。作为举例但并非限制，转录产物可用于体外或体内翻译，作为RNAi用于在体内沉默一个或多个基因，用于点样到表面上以制备表达阵列或微阵列，或者用于制备用于阵列或微阵列的杂交探针进行基因表达谱分析或作他用。又在其它实施方案中，本发明的方法可用于由mRNA制备第一链cDNA，其又可用于诸如cDNA末端随机扩增(RACE)的技术或者制备杂交探针。

[00160]“连接夹板”或“连接夹板寡核苷酸”是用于提供用来通过使用连接酶或具有连接酶活性的另一种酶连接一核酸的两末端(即“分子内连接”)或两核酸的两末端(即“分子间连接”)的退火位点或“连接模板”的寡核苷酸。连接夹板握住彼此邻近的末端，并在待连接的5′-磷酸化末端和3′-羟基化末端之间“建立连接接点”。例如，当连接夹板用于将有义启动子连接寡核苷酸连接于包含靶序列的第一链cDNA 3′-端时，该连接夹板寡核苷酸具有与靶序列(包括“加尾的”靶序列，如果有的话)3′-端互补的序列，以及与5′-磷酸化的启动子连接寡核苷酸5′-端互补的第二邻近序列。可用于连接与包含DNA的连接夹板退火了的合适末端的连接酶包括但不限于AmpligaseDNA连接酶(EPICENTRE Technologies，Madison，WI)、Tth DNA连接酶、Tfl DNA连接酶、Tsc DNA连接酶(Prokaria，Ltd.，Reykjavik，Iceland)或T4 DNA连接酶。当利用包含DNA的连接夹板使得相应末端靠近时，这些连接酶可用于分子间及分子内连接两者。如果使用包含RNA的连接夹板，则可使用T4 DNA连接酶使与连接夹板退火了的末端相连。在有些实施方案中，催化5′-磷酸化末端与3′-羟基末端非同源分子内连接的连接酶可在本发明的方法中用于环化单链DNA而无需连接夹板。作为举例但并非限制，对于使用ThermoPhage^TM RNA连接酶II(Prokaria，Ltd.，Reykjavik，Iceland)连接ssDNA，连接夹板并非是必需的。

[00161]在有些实施方案中，残留的线性核酸，例如但不限于连接夹板寡核苷酸，在反应期间使用噬菌体T7的基因6核酸外切酶除去。该核酸外切酶自双链结构的5’-端开始消化DNA。它已被成功地用于在PCR扩增后产生单链DNA(Holloway等， Nucleic Acid Res.21：3905-3906，1993；Nikiforov等， PCR Methods and Applications 3：285-291，1994，特此并入作为参考)。噬菌体T7的基因6核酸外切酶可以在连接后连同滚环DNA聚合酶一起添加，以除去未连接的寡核苷酸。为保护链置换反应的产物免于降解，用于滚环复制的链置换引物可在其5’-端含有3或4个硫代磷酸酯键，以使得该分子抗核酸外切酶(Nikiforov等， PCR Methods and Applications 3：285-291，1994)。当它们与滚环DNA产物结合时，该核酸外切酶降解未保护的线性分子。根据本说明书，本领域技术人员将会理解并知晓其中本发明用于除去单链DNA寡核苷酸的这种过程可被有利地使用的本发明的其它实施方案，并且本发明包括所有此类实施方案。

[00162]连接夹板或连接夹板寡核苷酸提供退火位点或“连接模板”，在其上一个或两个不同核酸(例如但不限于启动子连接寡核苷酸和第一链cDNA靶核酸序列)的5′-磷酸化末端和3′-羟基末端能够杂交，从而在用于通过连接酶(或拓扑异构酶或具有连接酶活性的其它酶)结合的连接反应中使得这两个末端彼此靠近。连接夹板包括足够数目和组成的核苷酸，并以足够的浓度存在，从而5′-和3′-端的互补序列在连接条件下保持与连接夹板退火，以允许进行末端连接。因此，在多数实施方案中，连接夹板包含至少大约4个核苷酸直至大约20个核苷酸，但本发明并不局限于核苷酸的特定数目。连接夹板合适的序列(和T_m)、大小及浓度可由本领域技术人员凭经验确定。在本发明多数实施方案中，优选连接夹板的3’-末端核苷酸为双脱氧核苷酸或另一终止核苷酸，从而连接夹板寡核苷酸不能作反应中聚合酶的引物之用。在多数其中存在着靶核酸序列多轮转录的实施方案中，连接夹板寡核苷酸中的其它核苷酸包括脱氧核苷酸。然而，在有些实施方案中，该其它核苷酸可包括核糖核苷酸和/或嘌呤核糖核苷酸以及2′-氟-嘧啶核苷酸，它们赋予对RNaseA型核酸酶的抗性。连接夹板寡核苷酸的组成也将取决于所用的连接酶和连接条件。作为举例，Ampligase热稳定连接酶(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)将只连接与DNA连接夹板退火的DNA的5′-磷酰基和3′-羟基末端，而不会连接与RNA退火的DNA末端。然而，业已报道T4 RNA连接酶有效地连接与RNA连接夹板退火的DNA末端(Faruqui等，美国专利No.6,368,801，特此并入作为参考)。连接夹板寡核苷酸可在寡核苷酸合成仪上合成，这通常是优选的，或者可使用文中别处所讨论的方法酶促合成。

[00163]

2. 利用启动子引物获得转录底物

a. 使用启动子引物和反义启动子寡核苷酸的方法

[00164]“启动子引物”是一种引物，一般具有游离的3′-OH基团，它在其3′-端包含与靶序列互补的序列，并且它在其5′-部分编码转录启动子。5′-端部分的转录启动子可以是“有义启动子”或“反义启动子”。如本文所定义的那样，可操作地连接于被转录的模板链序列3′-端的双链启动子的启动子序列为“有义启动子序列”，而包含该序列的启动子引物为“有义启动子引物”。双链启动子中互补于有义启动子的序列在本文中被定义为“反义启动子”，而包含该序列的启动子引物为“反义启动子引物”。

[00165]在本发明多数实施方案中使用有义启动子引物。如果使用有义启动子引物，则包含功能性双链启动子的“环形转录底物”可通过使“反义启动子寡核苷酸”与通过有义启动子引物在模板(其通常为靶核酸)上进行引物延伸、然后连接所得的第一链cDNA以获得“含有义启动子的环形第一链cDNA”所获得的分子进行退火而获得。也就是说，反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA的退火得到环形转录底物。如果所述含有义启动子的环形第一链cDNA利用本发明说明书中别处所描述的方法在其中有义启动子序列的3′-处线性化，则获得“含有义启动子的线性第一链cDNA”。“线性转录底物”是通过使反义启动子寡核苷酸与所述含有义启动子的线性第一链cDNA退火获得的。

[00166]反义启动子寡核苷酸也用在本发明用于获得转录底物的其它实施方案中，例如在其中反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的线性第二链cDNA复合以获得转录底物的实施方案中，如文中别处所描述的那样。

[00167]如本文所定义的“反义启动子寡核苷酸”包括含有用于反义转录启动子的序列的寡核苷酸，其中RNA聚合酶可使用反义启动子寡核苷酸与连接于模板序列3′-端的有义启动子之间的双链复合体以在转录条件下制备互补于模板的转录产物。

[00168]启动子引物在其3′-端可具有与靶核酸中的特定已知序列互补的序列，在这种情况下它被称之为“具体序列启动子引物”。不过，启动子引物的其它实施方案也可用在本发明的方法之中。“寡聚(dT)启动子引物”在其3′-端具有寡聚(dT)序列，并且主要地用在本发明涉及具备多聚腺苷酰化[即poly(A)尾巴]的mRNA分子的实施方案中，尽管寡聚(dT)启动子引物也可用在其中另一靶核酸用poly(A)或poly(dA)加尾的实施方案中。“锚定寡聚d(T)启动子引物”除在其3′-部分具有寡聚(dT)序列，也在寡聚(dT)序列的3′-处具有一个(或小数目的)核苷酸，称之为“锚核苷酸”，其与刚好在poly(A)序列之前的mRNA靶序列的3′-部分退火。从而，锚核苷酸起着将锚定寡聚(dT)启动子引物的mRNA互补部分“锚定”至mRNA靶序列蛋白编码序列开始之处的作用。锚核苷酸可包含针对特定mRNA的特异性碱基或随机化的核苷酸(即用所有四种核苷酸的混合物合成)以引发样品中的所有mRNA分子。“随机序列启动子引物”在其3′-端具有随机序列，例如但不限于随机八聚体序列或随机六聚体序列。在多数情况下，随机序列启动子引物在其靶序列互补部分包含具有所有可能序列(如所有可能的六聚体)的引物混合物。随机序列启动子引物可通过在化学合成该引物靶序列互补部分随机序列(如六聚体序列)的每一个核苷酸位置期间包含所有四种规则核苷酸试剂来制备。随机序列启动子引物可用在本发明其中期望扩增样品中的所有靶核酸序列，或者以随机方式扩增所有靶核酸序列，例如为制备所有靶核酸序列的文库的那些实施方案中。然而，尽管所有的序列都可能被扩增，随机序列启动子引物的使用并不必然地只产生全长拷贝的靶核酸(如来自细胞的mRNA分子的全长cDNA拷贝)。从而，本发明使用随机序列启动子引物的实施方案通常在并不需要靶核酸序列全长拷贝的时候使用，例如为获得用于一些应用的杂交探针。

[00169]在本发明其中本发明的转录底物包含利用靶核酸作为模板通过启动子引物的反转录或引物延伸获得的第一链cDNA的实施方案中，启动子引物中的转录启动子包含位于该启动子引物5′-部分的有义启动子序列。因此，利用靶核酸作为模板通过反转录酶或DNA聚合酶催化的启动子引物的延伸获得的线性第一链cDNA中的转录启动子并不可操作地作为启动子用于靶序列的转录，因为启动子并未可操作地连接于靶序列的3′-端。本发明的方法通过使用连接酶或其它连接手段，将线性第一链cDNA 5′-部分的单链有义转录启动子连接于靶序列的3′-端解决了该问题，由此形成“含有义启动子的环形第一链cDNA”，通过将反义启动子寡核苷酸与该有义启动子序列退火，其可用于获得环形转录底物。该环形转录底物可通过使用能够结合单链启动子且转录连接于其上的靶序列的RNA聚合酶进行转录而用于制备对应于靶序列的转录产物。

[00170]从而，在本发明的一个实施方案中，利用在其3′-端具有与靶序列互补的序列且在其5′-部分具有转录启动子的启动子引物获得本发明的环形转录底物(图1)。在与靶核酸退火之后，利用该启动子引物使用DNA聚合酶或反转录酶在合适的反应条件下引发第一链cDNA的合成，以便获得线性第一链cDNA。

[00171]然后在合适的连接条件下使用连接酶，或者在合适的连接条件下使用另外的连接方法，例如但不限于拓扑异构酶(如参见美国专利No.5,766,891，特此并入作为参考)，连接第一链cDNA，以获得含启动子的环形第一链cDNA。通过将线性第一链cDNA的磷酸化5′-端连接于其3′-端，转录启动子连接到靶序列上，以致使用本发明的RNA聚合酶在转录条件下的体外转录将合成对应于靶序列的转录产物。

[00172]在图1的实例中，靶序列可包括包含样品中所有mRNA分子的靶核酸，且通过转录底物的转录制备的转录产物包括具有与有义mRNA实质上相同序列的RNA。如果环形转录底物中没有导致转录终止的序列(即转录终止子序列)，转录绕环形转录底物一圈一圈地继续多次，并产生有义转录产物的多联体(串联体)(即，包含与样品中mRNA靶核酸序列相同的核酸序列的串联拷贝)，该多联体可用于本发明的某些应用。

[00173]在本发明的有些实施方案中，一个或多个转录终止序列被掺入到启动子引物中靶序列互补3’-区和转录启动子5’-部分之间，以允许合成单拷贝而不是串联体的有义转录产物。例如，如果启动子引物中存在转录终止序列，则在利用本发明的RNA聚合酶体外转录环形转录底物之后，转录产物可在长度上对应于单拷贝的mRNA靶核酸序列。转录终止序列是本领域公知的，且本领域技术人员将会知晓如何寻找有关该序列的信息，以及用于鉴定另外的能够使用的终止序列的实验方法。作为举例但并非限制，有关转录终止序列的信息可在Reznikoff，W.S.等编辑的题为″RNA Polymerases and theRegulation of Transcription″的书中(Elsevier SciencePublishing Co.，Inc.，New York，1987)以及Miller，J.H.的题为″A Short Course in Bacterial Genetics.A Laboratory Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria″的书的第17部分中(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1992)中找到，特此将两者都并入作为参考。

[00174]又在另一个实施方案中，通过连接第一链cDNA获得的含有义启动子的环形第一链cDNA在用于体外转录之前被线性化，以便形成“含有义启动子的线性第一链cDNA”，其与反义启动子寡核苷酸退火以获得本发明的线性转录底物(图2)。

[00175]作为举例但并非限制，含有义启动子的环形第一链cDNA的可通过用尿嘧啶-N-糖基化酶(″UNG″)和核酸内切酶IV(″endo IV″)(如参见美国专利No.6,048,696，特此并入作为参考)处理而线性化，如果合成的启动子引物在靶序列互补性3’-区及其5’-部分的转录启动子之间具有dUMP核苷酸的话。然而，含dUMP核苷酸的启动子引物的使用只能用在本发明以分步方式进行的实施方案中，因为连续反应中UNG的存在将会从启动子引物的靶互补部分切下启动子引物的转录启动子部分，从而破坏启动子引物产生更多转录底物的能力。本领域有许多已知的用于线性化环形DNA分子的其它方法，它们可用在本发明的实施方案中，并且本领域的技术人员将会知晓或者知道如何寻找合适的方法用于本发明。作为举例但并非限制，许多能够使用的此类方法在本文题为“用于界定仅包含较大RNA或DNA靶核酸一部分的靶序列5′-和3′-端的方法”的小节中有描述。

[00176]本发明的其它实施方案包括使用启动子引物用于合成第二链cDNA作为本发明的转录底物。在那些实施方案中，通过(a)利用在其5′-部分具有包含互补于有义转录启动子的序列(即它包含反义启动子引物)的序列的启动子引物合成第一链cDNA，或者(b)使用包含有义转录启动子的启动子引物用于合成第二链cDNA，可将转录启动子掺入到第二链cDNA中。启动子引物中所用的启动子序列可基于有关用于本发明RNA聚合酶的有义启动子的序列、以及有关核酸碱基互补性的规则及DNA和RNA聚合酶合成DNA及RNA的方向性的知识确定。作为举例，如果期望有义转录启动子在通过由mRNA的反转录获得的第一链cDNA的引物延伸制备的第二链cDNA中，人们可从将具有已知序列的有义转录启动子置于转录底物中待由本发明的RNA聚合酶扩增的靶核酸序列的3′-端向后推算，以分别确定用于第一链cDNA合成或用于第二链cDNA合成的启动子引物所需的合适的有义或反义序列(以及该序列就靶序列而言的位置)。

[00177]在本发明的有些实施方案中，启动子引物上可存在不止一个启动子。作为举例但并非限制，启动子引物可编码两个启动子序列，这两者都编码第一链cDNA上的有义启动子(例如，用于本发明两个不同的RNA聚合酶)。备选地，启动子引物的第一启动子序列及所得的第一链cDNA可包含有义启动子，而第二启动子序列可包含反义启动子，在这种情况下，第二链cDNA中的第一启动子序列将是反义的，而第二启动子序列将是有义的。在包括通过使用来自第一轮的RNA获得第二转录底物用于转录的附加轮次转录的实施方案中，当设计反应时，有必要考虑启动子序列在后继轮次的转录中的命运。

[00178]除了转录启动子序列和靶互补序列之外，本发明的启动子引物也可以具有为转录启动子序列5′-和/或3′-的附加核酸序列，但启动子引物并非必须具有此类附加的其它序列。作为举例但并非限制，启动子引物可具有启动子序列5′-的转录起始位点。在本发明的有些实施方案中，启动子引物可具有一个或多个转录终止序列，一个或多个DNA切割位点(例如但不限于可利用尿嘧啶-N-糖基化酶和核酸内切酶IV或文中别处所讨论的其它切割方法切割的dUMP残基)，以允许作为转录底物的环形第一链cDNA的可控的线性化，一个或多个复制起点(″ori′s″)(优选为单链复制子例如但不限于噬菌体M13复制子的ori)，可选择或可筛选的标记，例如但不限于分别为抗生素抗性基因或β半乳糖苷酶基因，或者一个或多个能够被转座酶识别和使用进行体外或体内转座的转座子识别序列(如OE或ME序列)，或者一个或多个被重组酶识别的位点(例如但不限于cre-lox系统)，和/或用于特殊目的的其它序列或遗传元件。在阅读本发明的说明书之后，本领域技术人员将会知晓功能性启动子5′-的序列将会被本发明的RNA聚合酶转录，从而将知晓相对于启动子引物中的启动子序列在何处安置特定的附加序列或遗传元件。在本发明的有些实施方案中，启动子引物具有5′-磷酸，或其5′-端在本发明方法的过程中使用酶磷酸化，所述酶例如但不限于多核苷酸激酶(如T4 PNK)。在启动子引物上提供5’-磷酸基团的主要原因在于允许继启动子引物对靶序列的反转录或引物延伸之后连接线性第一链cDNA，以获得含启动子的环形第一链cDNA。

[00179]使用本发明启动子引物的实施方案的许多实例在下文描述。本发明包括所有使用有义启动子引物的方法，其中双链形式的转录启动子可被能够利用转录底物合成RNA的RNA聚合酶使用，且并不局限于仅仅所提供的实施方案的实例。

[00180]有关使用启动子引物的方法，本发明的一个实施方案包括使用有义启动子引物制备环形转录底物用于制备对应于靶核酸中的靶序列的转录产物的方法，该方法包括：

[00181]a.获得用于合成第一链cDNA的有义启动子引物，该启动子引物包含与待转录靶序列的3′-端互补的3′-端序列，和包含有义转录启动子序列的5′-端部分，以及任选的其5′-端的磷酸酯基团或拓扑异构酶部分；

[00182]b.使该启动子引物与靶核酸退火；

[00183]c.用DNA聚合酶在DNA合成条件下引物延伸与靶核酸退火了的启动子引物，以获得与启动子引物与之退火的靶序列互补的第一链cDNA；

[00184]d.任选地，除去与第一链cDNA退火的靶核酸；

[00185]e.连接第一链cDNA，其中第一链cDNA的5′-端共价连接于第一链cDNA的3′-端，以获得环形第一链cDNA，其中环形第一链cDNA包括含有义启动子的环形第一链cDNA；和

[00186]f.使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得环形转录底物。

[00187]本发明的另一个实施方案包括用于获得线性转录底物以制备对应于靶核酸中靶序列的转录产物的方法，该方法包括：

[00188]a.通过实施上文刚刚描述的方法步骤(a)至(e)获得含有义启动子的环形第一链cDNA环形转录底物；

[00189]b.在所述含有义启动子的环形第一链cDNA中有义启动子引物部分的转录启动子3′-和靶互补序列5′-的位点处线性化该含有义启动子的环形第一链cDNA，其中获得了含有义启动子的线性第一链；和

[00190]c.使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的线性第一链cDNA退火，以获得线性转录底物。

[00191]本发明的一个一般实施方案包括用于制备对应于靶核酸中靶序列的转录产物的方法，该方法包括：

[00192]a.获得转录底物，选自环形转录底物和线性转录底物；

[00193]b.使该转录底物在转录条件下与识别该转录底物中的启动子并由其制备转录产物的RNA聚合酶接触；以获得转录产物；和

[00194]c.获得转录产物。

[00195]靶核酸可以是DNA或RNA。作为举例但并非限制，靶序列可包括含有单一种类的mRNA的靶核酸，或者靶序列可包括可含有样品中的所有mRNA的靶核酸。

[00196]从而，本发明的一个实施方案是使用有义启动子引物制备对应于包括含有mRNA的靶核酸的靶序列的转录产物的方法，该方法包括：

[00197]a.获得包含mRNA的靶核酸；

[00198]b.获得在其3′-端包含互补于靶序列3′-端的靶互补部分的有义启动子引物，其中靶互补序列选自寡聚(dT)序列，锚定寡聚(dT)X(anchored oligo(dT)X)序列，靶特异性序列以及随机序列，而5′-端任选地包含磷酸酯或拓扑异构酶部分；

[00199]c.使该启动子引物与靶核酸退火；

[00200]d.用DNA聚合酶在DNA合成条件下引物延伸与靶核酸退火了的启动子引物，以获得与启动子引物与之退火的靶序列互补的第一链cDNA；

[00201]e.任选地，除去与第一链cDNA退火的RNA；

[00202]f.连接第一链cDNA，其中5′-端共价连接于该第一链cDNA的3′-端，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

[00203]g.使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得环形转录底物；

[00204]h.使环形转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触以获得转录产物；和

[00205]i.获得转录产物。

[00206]在另一个实施方案中，线性化所述环形有义启动子第一链cDNA以获得线性有义启动子第一链cDNA，然后使反义启动子引物与其中的有义启动子序列退火，以获得线性转录底物。然后，使该线性转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触以获得转录产物，且获得转录产物。

[00207]用于获得转录底物以及用于制备对应于靶序列的转录产物的方法可以逐步的方式实施，或者，在合适的反应条件下，它们可在单个反应混合物中连续实施。

[00208]从而，本发明的一个实施方案包括用于获得靶核酸中靶序列附加轮次的转录的方法(图3)，该方法包括：

[00209]a.获得转录产物；

[00210]b.获得在其3′-端包含互补于靶序列3′-端的靶互补部分以及在其5′-端任选地包含磷酸酯基团或拓扑异构酶部分的有义启动子引物；

[00211]c.使该启动子引物与转录产物退火；

[00212]d.用DNA聚合酶在DNA合成条件下引物延伸与转录产物退火了的启动子引物，以获得第一链cDNA；

[00213]e.任选地，除去与第一链cDNA退火的RNA；

[00214]f.连接第一链cDNA，其中5′-端共价连接于该第一链cDNA的3′-端，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

[00215]g.使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得环形转录底物；

[00216]h.使环形转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触以获得附加转录产物；和

[00217]i.获得附加转录产物。

[00218]在另一个实施方案中，线性化所述环形有义启动子第一链cDNA以获得线性有义启动子第一链cDNA，然后使反义启动子引物与其中的有义启动子序列退火，以获得线性转录底物。然后，使该线性转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触以获得转录产物，且获得转录产物。

[00219]本发明方法的不同实施方案也可用于制备对应于靶核酸序列内部的靶序列的转录产物。作为举例，有些实施方案可用于制备对应于诸如但不限于基因组DNA中野生型或突变序列的序列的转录产物。在这些实施方案中，需要一个或多个方法以限定被转录的靶序列的3′-端，所述方法例如但不限于使阻断寡核苷酸与靶核酸退火，如文中别处所讨论的那样。一般而言，为用于本发明的方法，靶核酸必须是单链的。因此，双链核酸必须变性。

[00220]从而，本发明使用启动子引物的一个实施方案是用于制备对应于仅包括含单链DNA或RNA的靶核酸的一部分的靶序列的转录产物的方法，该方法包括：

[00221]a.获得包含单链DNA或RNA的靶核酸；

[00222]b.获得在其3′-端包含互补于靶序列3′-端的靶互补部分以及在其5′-端任选地包含磷酸酯基团或拓扑异构酶部分的有义启动子引物；

[00223]c.获得阻断寡核苷酸，该阻断寡核苷酸包含与靶核酸上的序列紧密退火的序列，以界定利用靶核酸作为模板的启动子引物的引物延伸产物的3′-端，其中阻断寡核苷酸不被引物延伸产物所置换，并且其中阻断寡核苷酸本身不能够由DNA聚合酶进行引物延伸；

[00224]d.使启动子引物和阻断寡核苷酸与靶核酸退火；

[00225]d.用DNA聚合酶在DNA合成条件下引物延伸与靶核酸退火了的启动子引物，以获得第一链cDNA；

[00226]f.任选地，除去与第一链cDNA退火的靶核酸；

[00214]g.连接第一链cDNA，其中5′-端共价连接于该第一链cDNA的3′-端，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

[00228]h.任选地，在所述含有义启动子的环形第一链cDNA中启动子引物的启动子序列3′-和靶互补部分5′-的位点处线性化该含有义启动子的环形第一链cDNA，以获得含有义启动子的线性第一链cDNA；

[00229]g.使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火以获得环形转录底物；或者使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的线性第一链cDNA退火以获得线性转录底物；

[00230]h.使环形转录底物或线性转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触以获得转录产物；和

[00231]i.获得转录产物。

[00232]k.任选地，重复步骤b至k以获得附加轮次的转录，以获得转录产物。

[00233]又在本发明的其它实施方案中，包含反义启动子的环形第一链cDNA被用作为模板利用链置换DNA聚合酶和至少一个链置换引物进行DNA合成，并且在有些实施方案中，使用数个链置换引物。如本文所用，“链置换引物”是能够由本发明的链置换DNA聚合酶进行引物延伸的寡核苷酸或多核苷酸，其中发生链置换DNA合成。一般而言，链置换在更大程度上是所用DNA聚合酶和反应条件而非引物的性质。从而，链置换引物的组成和性质可大为变动。例如，在本发明的有些实施方案中，链置换引物可以是与环形DNA模板可杂交的寡核苷酸，其中通过链置换DNA聚合酶由滚环复制所得的DNA合成产物导致链置换引物延伸产物的置换，产生环形模板的串联互补ssDNA拷贝。在其它实施方案中，优选链置换引物具有互补于环形DNA模板中序列的3′-部分和非互补的5′-部分，因此具有“襟翼”，该突出的襟翼似乎在有些情况下促进引物的置换。当对线性DNA模板实施链置换时，可设计链置换引物以具有特殊的核苷酸组成和/或结构，并且可使用另外的方法和反应组分以通过从模板上释放链置换引物而促进链置换。

[00234]本发明的链置换DNA聚合酶可以是任何导致链置换的DNA聚合酶。本发明优选的链置换DNA聚合酶缺乏5′-核酸外切酶活性，包括结构依赖性5′-核酸酶活性。优选的链置换DNA聚合酶包括rBstDNA聚合酶大片断，也称为“IsoTherm^TM DNA聚合酶”(EpicentreTechnologies，Madison，Wisconsin，USA)、Bca DNA聚合酶(TAKARAShuzo Company，Kyoto，Japan)、RepliPHI^TM DNA聚合酶(EpicentreTechnologies，Madison，Wisconsin，USA)、φ29 DNA聚合酶(美国专利No.5,198,543和5,001,050，特此并入作为参考)、SequiTherm^TM DNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，Wisconsin，USA)、MMLV反转录酶以及Sequenase DNA聚合酶(USB，Cleveland，Ohio，USA)。在这些实施方案中，使用环形第一链cDNA作为模板，利用链置换引物引发第二链DNA的合成。一旦DNA合成已完全绕环形第一链cDNA模板行进了一周，则置换出第二链cDNA，从而将置换出的单链第二DNA链释放到反应介质中。由于转录启动子在环形第一链cDNA模板的每一轮DNA合成中至少一次存在，该释放的单链“含有义启动子的第二链cDNA”可在反义启动子寡核苷酸退火之后用于获得线性转录底物。随着第二链cDNA继续生长，形成越来越长的反义RNA串联体。所获得的线性转录底物可在转录条件下被本发明的RNA聚合酶利用，以制备就靶核酸序列而言的反义转录产物。因而，这不同于以前使用有义启动子引物利用第一链cDNA作为模板制备有义转录产物的实施方案。反义RNA可用于许多应用，例如但不限于作为探针用于核酸阵列或微阵列。随着第二链cDNA继续生长，形成越来越长的反义RNA串联体。

[00235]如上文所讨论的那样，有些实施方案通过首先获得包含反义转录启动子的环形第一链cDNA，获得用于制备对应于靶核酸中靶序列的转录产物的转录模板，其中环形第一链cDNA随之用作为模板通过链置换DNA聚合酶进行含有义启动子的线性第二链cDNA的链置换DNA合成。线性转录底物是通过将反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的线性第二链cDNA退火获得的。

[00236]从而，本发明的一个实施方案包括用于制备对应于靶核酸中靶序列的转录产物的方法(图6)，该方法包括：

[00237]a.获得包含单链DNA或RNA的靶核酸；

[00238]b.获得包含互补于靶序列的3′-端部分以及任选的其5′-端的磷酸酯基团或拓扑异构酶部分的反义启动子引物；

[00239]c.任选地，获得阻断寡核苷酸，该阻断寡核苷酸包含与靶核酸上的序列紧密退火的序列，以界定启动子引物利用靶核酸作为模板的引物延伸产物的3′-端，其中阻断寡核苷酸并不被引物延伸产物所置换，并且其中阻断寡核苷酸本身并不能够被DNA聚合酶进行引物延伸；

[00240]d.使启动子引物以及任选的阻断寡核苷酸与靶核酸退火；

[00241]e.用DNA聚合酶在DNA合成条件下引物延伸与靶核酸退火了的启动子引物，以获得第一链cDNA；

[00242]f.任选地，除去与第一链cDNA退火的靶核酸；

[00243]g.连接线性第一链cDNA，其中5′-端共价连接于该第一链cDNA的3′-端，以获得环形第一链cDNA；

[00244]h.获得链置换引物；

[00245]i.使链置换引物与环形第一链cDNA退火；

[00246]j.获得链置换DNA聚合酶；

[00247]k.使链置换引物与之退火的环形第一链cDNA与链置换DNA聚合酶在DNA合成条件下接触，以获得含有义启动子的线性第二链cDNA；

[00248]l.获得该含有义启动子的线性第二链cDNA；

[00249]m.使反义启动子寡核苷酸与该含有义启动子的线性第二链cDNA退火并获得线性第二链转录底物；

[00250]n.获得在转录条件下利用启动子转录该线性第二链转录底物的RNA聚合酶；

[00251]o.使该线性第二链转录模板与RNA聚合酶在转录条件下接触，以获得反义转录产物；和

[00252]p.获得该反义转录产物；和

[00253]q.任选地，重复步骤b到q以获得反义转录产物附加轮次的转录。

b. 本发明启动子引物和反义启动子寡核苷酸的组成

[00254]在本发明优选的实施方案中，启动子引物包含DNA核苷酸。启动子引物也可以包含用于特殊目的的一个或多个修饰核苷酸。作为举例但并非限制，启动子引物可在有义转录启动子的3′-以及与靶核酸序列互补的序列的5′-包含一个或多个dUMP核苷酸，其提供用于如文中别处所讨论的那样利用UNG和endo IV线性化含有义启动子的第一链cDNA(在退火反义启动子寡核苷酸获得环形转录底物之前)，或者在有些情况下，线性化环形转录底物的位点。不过，本发明并不局限于包含DNA核苷酸或修饰的DNA核苷酸的启动子引物，并且在有些情况下，启动子引物可包含RNA或修饰的RNA核苷酸，或者DNA和RNA核苷酸或修饰核苷酸兼而有之。

[00255]启动子引物的核酸靶互补部分可与样品中RNA靶的特定已知序列互补，或者它可以包含所有可能或许多可能序列的混合物，例如但不限于随机六聚体序列。随机引物序列可通过在化学合成启动子引物中mRNA互补部分的每一个核苷酸位置期间纳入与所有四种规则碱基互补的核苷酸试剂制备。在本发明使用含mRNA靶核酸的样品的实施方案中，这是优选的实施方案，启动子引物的3′-端包含互补于特定mRNA已知序列的特异性序列，或者如果mRNA在其3′-端具有poly(A)尾巴，则启动子引物的3′-端可包含寡聚(dT)序列。又在本发明关于mRNA靶核酸的其它实施方案中，启动子引物的3′-端可包含随机序列，例如但不限于六聚体序列。

[00256]本发明的启动子引物在其5′-部分包含转录启动子。在多数实施方案中，转录启动子包含能够结合本发明的RNA聚合酶的有义启动子序列。然而，本领域技术人员将会理解，由于转录启动子位于利用启动子引物通过RNA靶核酸反转录所合成的线性第一链cDNA的5′-的事实，本发明的RNA聚合酶不能够使用该转录启动子合成与互补于RNA靶核酸的第一链cDNA互补的RNA。不过，如果将线性第一链cDNA的5′-端连接于其3′-端以形成环形第一链cDNA，则本发明的RNA聚合酶能够使用该转录启动子合成与互补于RNA靶核酸的第一链cDNA互补的RNA；从而，该实施方案的环形第一链cDNA包含本发明的转录底物。从而，本发明这些实施方案优选的启动子引物在其5′-端被磷酸化以促进在连接条件下本发明连接酶对线性第一链cDNA的连接。作为举例但并非限制，启动子引物的5′-端可利用T4多核苷酸激酶和ATP在本领域公知的合适的反应条件下磷酸化。在其它实施方案中，启动子引物在其5′-端具有I型拓扑异构酶部分，以促进在连接条件下拓扑异构酶介导的线性第一链cDNA的连接(如美国专利No.5,766,891，特此并入作为参考)。

[00257]一般而言，反义启动子寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸。修饰核苷酸或修饰键应当只有在仔细确定它们不实质上影响反义启动子寡核苷酸与有义启动子序列复合或结合RNA聚合酶的能力，或者不影响RNA聚合酶利用模板链起始转录的能力之后用于反义启动子寡核苷酸中。不过，修饰的核苷酸可用于特殊目的。类似地，修饰的键，例如但不限于抗某些核酸酶的α-硫代磷酸酯糖键可用于特殊目的。反义启动子寡核苷酸可具有任意长度，只要它足够长以包含反义启动子序列，当其与有义启动子退火时，构成功能性双链启动子，在转录条件下可被RNA聚合酶利用以制备转录产物。包含反义启动子的寡核苷酸可包含为反义启动子序列3′-或5′-的附加核苷酸，只要附加核苷酸并不以独立于反义启动子序列与有义启动子引物的有义启动子序列复合的方式结合期望的靶序列或本发明方法的另一组分，或以其它方式负面影响所述方法的结果即可。如果为了诸如但不限于连接标记成分的目的而在反义启动子寡核苷酸中使用修饰核苷酸，优选修饰核苷酸如果可能的话是在并不构成反义启动子序列的核苷酸中。如果当实施诸如使用DNA聚合酶的引物延伸或使用连接酶的连接等步骤时，反应之中存在着反义启动子寡核苷酸，则设计该反义启动子寡核苷酸，使它不能参与这些反应。例如，这通过合成在其3′-端具有双脱氧核苷酸或另一终止核苷酸从而其不能被引物延伸以及在其5′-端不具有磷酸酯基团(其可参与连接反应)的反义启动子寡核苷酸而实现。

D. 用于环化线性ssDNA的连接酶和连接方法

[00258]根据上文用于获得转录底物的方法的描述，将会是清楚的是其可用于在各种实施方案中连接线性ssDNA以获得环形ssDNA。本发明并不局限于用于环化线性ssDNA分子的特定连接酶，并且不同的连接酶和连接方法可用在不同的实施方案中以实现特定目的。在使用连接酶的实施方案中，被连接以获得环形ssDNA的线性ssDNA的5′-端必需具有5′-磷酸酯基团或该5′-端必需在本发明方法的过程中利用多核苷酸激酶例如但不限于T4多核苷酸激酶磷酸化。

[00259]催化非同源分子内连接的连接酶如但不限于ThermoPhage^TM RNA连接酶II(Prokaria，Ltd.，Reykjavik，Iceland)是合适的利用制造商的反应条件用于连接线性ssDNA以形成环形ssDNA的连接酶。

[00260]对钝端无活性的NAD-依赖性DNA连接酶如但不限于Ampligase热稳定DNA连接酶(Epicentre Technologies，Madison，Wisconsin，USA)、Tth DNA连接酶、Tfl DNA连接酶和Tsc DNA连接酶(Prokaria Ltd.，Reykjavik，Iceland)可用于连接当与互补DNA分子退火时彼此靠近的DNA末端的5′-磷酸酯和3′-羟基端，并且在本发明使用包含DNA的连接夹板寡核苷酸的实施方案中是合适的连接酶。然而，本发明并不局限于使用特定的连接酶，并且可使用任何合适的连接酶。例如，T4 DNA连接酶可用在本发明使用连接夹板的实施方案中。更进一步，Faruqui在美国专利No.6,368,801中公开T4 RNA连接酶能够有效地连接当与RNA链杂交时彼此靠近的核酸的DNA末端。从而，T4 RNA连接酶在其中将DNA末端连接于包含RNA或修饰RNA的连接夹板上的实施方案中是本发明合适的连接酶，修饰的RNA例如但不限于利用DuraScribe^TM T7转录试剂盒(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)制备的含2′-F-dCTP和2′-F-dUTP的修饰RNA。

[00261]本发明也不限于在本发明各实施方案中使用将5′-端共价连接同一或不同核酸分子的3′-端的连接酶。作为举例，可使用其它连接方法，例如但不限于拓扑异构酶介导的连接(如美国专利No.5,766,891，特此并入作为参考)。

E. 实施本发明方法的方式

[00262]根据应用及其需求和限制，本发明的方法可以以分步的方式实施，实施一个组的反应，在进行下一组的反应之前，继之以反应产物的纯化或试剂的去除或酶的失活或试剂的添加，或者，在其它应用的其它实施方案中，所述方法可作为连续组的多重反应在单个反应混合物中实施。作为举例但并非限制，利用含启动子的第一链cDNA作为模板进行转录的每一个用于转录的不同反应可单独地进行。仍作为举例，在其中本发明的方法用作为诊断测定的一部分的有些实施方案中，所有反应可在单个反应混合物中进行，且可检测转录反应的产物，甚至无需分离。

[00263]本发明也包括本发明方法和组合物的部分或亚集。因此，除整体方法之外，本发明包括本发明方法中由此得以进行的所有单个步骤。

F. 本发明应用范围的实例

[00264]本领域技术人员将会理解本发明是新颖的，且范围极为广泛，并且提供了用于许多应用的与制备对应于生物学样品中包含RNA(包括mRNA)或DNA的靶核酸序列的转录产物有关的方法、过程、组合物和试剂盒的改进。这些方法可用于诸如但不限于制备全长cDNA及cDNA文库、改善基因表达分析以及检测靶序列的应用中。作为进一步举例但并非限制，本发明包括改进的方法、过程、组合物和试剂盒，其改进了关于如下的方法及应用：

1.体外扩增核酸分子

2.体外扩增DNA序列

3.体外扩增基因组DNA序列

4.体外扩增RNA序列

5.扩增mRNA

6.扩增rRNA

7.合成RNA

8.合成修饰的RNA，例如但不限于含2′-氟-核苷酸的RNA

9.合成DNA

10.检测样品中核酸序列的存在

11.检测样品中可指示靶生物体存在的靶核酸序列的存在

12.检测样品中靶核酸被分析物的存在

13.检测样品中DNA序列的存在

14.检测样品中RNA序列的存在

15.检测样品中基因的存在(或可检测水平的不存在)

16.检测样品中靶生物体的存在

17.检测样品中病毒的存在

18.检测样品中细菌的存在

19.检测样品中病原生物体的存在

20.检测样品中有益生物体的存在

21.鉴定和定量与RNA和DNA结合蛋白相关的核酸

22.检测癌基因

23.检测抑癌基因

24.定量病毒、微生物、基因、mRNA、rRNA、核酸被分析物或用于无论何种目的无论何种类型的任何其它核酸的水平

25.用作为探针

26.作为探针用于阵列或微阵列

27.制备能够引入到血清中人、动物或其它真核细胞而无需使用转染剂的dsRNA或修饰dsRNA。

28.体外合成dsRNA或修饰dsRNA用作为RNAi

29.体外合成dsRNA或修饰dsRNA用于siRNA

30.制备沉默由病毒或其它传染因子编码的基因的RNAi或修饰RNAi。

31.制备沉默由病毒或其它传染因子编码的基因的siRNAi或修饰siRNA。

32.制备沉默与由病毒或其它传染因子编码的生物学分子有关和/或互作的、由植物、动物、人、真菌或其它真核宿主基因编码的基因的RNAi或修饰RNAi。

33.制备沉默与由病毒或其它传染因子编码的生物学分子有关和/或互作的、由植物、动物、人、真菌或其它真核宿主基因编码的基因的siRNAi或修饰siRNA。

34.制备沉默由植物、动物、人、真菌或其它真核宿主基因编码的非必需疾病易感基因的RNAi或修饰RNAi。

35.制备沉默由植物、动物、人、真菌或其它真核宿主基因编码的非必需疾病易感基因的siRNAi或修饰siRNA。

36.制备沉默由植物、动物、人、真菌或其它真核宿主基因编码的非必需基因的RNAi或修饰RNAi，其中基因沉默产生有益效果。

37.制备沉默由植物、动物、人、真菌或其它真核宿主基因编码的非必需基因的siRNAi或修饰siRNA，其中基因沉默产生有益效果。

38.制备沉默由植物、动物、真菌或其它真核宿主基因编码的非必需基因的RNAi或修饰RNAi，其中基因沉默导致提高产率、产生生物学分子、香味或其它商业上有益的效果，例如但不限于耐寒性、耐盐性、缩短的生长季节、或提高的营养物利用效率。

39.制备沉默由植物、动物、真菌或其它真核宿主基因编码的非必需基因的siRNAi或修饰siRNA，其中基因沉默导致提高产率、产生生物学分子、香味或其它商业上有益的效果，例如但不限于耐寒性、耐盐性、缩短的生长季节、或提高的营养物利用效率。

40.诊断传染生物体的存在和/或水平

41.诊断疾病

42.检测环境样品中核酸的存在

43.定性和定量地区分那些mRNA分子存在于不同类型的细胞中、或不同条件下的相同类型细胞中、或者相同或不同条件下或响应特定的刺激物或处理的相同或不同类型的细胞中

44.定性和定量地分析不同定义的条件下细胞中的基因表达类型

45.定性和定量地分析相同定义的环境条件下不同类型细胞中的基因表达类型

46.定性和定量地分析细胞中随时间推移的基因表达类型

47.定性和定量地分析响应特定刺激物的基因表达

48.制备存在于一种类型的细胞之中而不存在于另一种类型的细胞之中的、或者在某些条件下存在于一种类型的细胞之中但在其它条件下不存在的mRNA分子和/或cDNA分子文库(即差减文库)。

49.作图和克隆对应于mRNA 5′-端的序列，包括但不限于由特定基因通过可变剪接和启动子使用所产生的那些

50.产生改善的模板用于更为精确的cDNA末端快速扩增(″RACE″)技术(如参见Flouriot等， Nucleic Acids Res.27：e8(I-iv)，1999)。

51.制备和/或扩增mRNA用于体外或体内翻译，包括但不限于偶联或逐步的转录和翻译。

52.扩增存在于活细胞例如但不限于来自患者的肿瘤或癌细胞之中的RNA和/或DNA或修饰的RNA和/或DNA，以引入到树突细胞中(如参见Steinman等的美国专利No.5,994,126和6,475,483，特此并入作为参考)或来自患者的其它细胞中，以加强或提高体内应答，例如但不限于患者的免疫应答，目标是降低患者瘤或癌中细胞的大小或数目。

53.制备和/或扩增来自于患者和/或存在于病毒或其它传染因子之中的RNA和/或DNA或修饰的RNA和/或DNA，其中RNA和/或DNA分别是用作为RNA疫苗和/或DNA疫苗的。

54.制备能够引入到血清中人、动物或其它真核细胞内而无需使用转染剂的RNA或修饰RNA。

55.制备含2′-氟-2′脱氧核苷酸，例如但不限于替换对应规则核苷酸的2′-F-dCMP和2′-F-dUTP的修饰RNA。

56.通过将扩增产物连接到固相支持物上生产扩增核酸的阵列或微阵列。

57.检测样品中靶核酸序列的突变或突变形式

58.定量样品靶核酸的含量。

[00265]含2′-F-dCMP和2′-F-dUTP的修饰RNA分子抗RNase A型核糖核酸酶(Sousa等，美国专利No.5,849,546)，特从纳入作为参考。Capodici等(J.Immunology 169：5196-5201，2002)，特从纳入作为参考，证明利用DuraScribe^TM T7转录试剂盒(EpicentreTechnologies，Madison，WI，USA)制备的含2′-氟的dsRNA分子并不需要转染剂递送到细胞中，甚至在血清的存在下也是如此。Kakiuchi等(J.Biol.Chem.257：1924-1928，1982)，特从纳入作为参考，证明使用[(2′-F-dI)_n.：(2′-F-dC)_n.双链体比[(rI).subn.：(rCn.]双链体抗原性低40-100倍，并且并不象[(rI)_n.：(rC)_n.]双链体那样诱发干扰素应答。

I. 本发明利用包含样品中靶核酸序列的转录底物制备转录产物 的实施方案的试剂盒和组合物

[00266]本发明重要的组合物是有义启动子引物。可提供有义启动子引物进行一个特异性靶序列引物延伸，或者可提供有义启动子引物进行多个靶序列的扩增，例如但不限于包含样品中所有mRNA靶的靶序列。在后一种情况下，可提供包含寡聚(dT)_n序列、或锚定寡聚(dT)_nX序列或随机化序列如随机六聚体或随机八聚体序列的有义启动子引物。更进一步，可提供多个特异性有义启动子引物，以允许扩增同一样品中多个不同的靶序列。同样，可提供编码被不同RNA聚合酶识别的不同有义启动子序列的多个不同的有义启动子引物，例如但不限于编码T7、T3和SP6 RNAPs的有义启动子的有义启动子引物。

[00267]本发明的另一种组合物可以是与互补有义启动子退火以获得具有功能性双链启动子的环形或线性转录底物的反义启动子寡核苷酸。

[00268]还有另外一种本发明反义启动子寡核苷酸的组合物可以是被固定或连接在固相支持物上的包含反义启动子的寡核苷酸。优选地，包含反义启动子的反义启动子寡核苷酸在其5′-端处或附近固定到固相支持物上，且反义启动子序列离该固相支持物表面有足够远的距离，从而含有义启动子的环形第一链cDNA或含有义启动子的线性第一链cDNA中的有义启动子能够与该反义序列退火，从而当支持物与利用双链启动子制备转录底物的RNA聚合物在反应介质中在合适的转录条件下温育的时候，分别制备功能性的固定化环形或线性转录底物。优选地，固相支持物具有这样的化学组成和结构，从而它不非特异性地与来自样品或包含本发明组合物如但不限于有义启动子引物的核酸结合。优选地，固相支持物具有这样的化学组成和结构，从而它并不非特异性地与酶、辅因子或包括本发明方法的反应中的其它物质结合。并非限制本发明，固相支持物可包括测试棒，膜，例如硝酸纤维素或尼龙膜，珠子，用于制备阵列或微阵列的芯片或载片等。一些将反义启动子寡核苷酸固定或连接到表面或固相支持物上的固相支持物和方法可用于本发明，它们由Marble等在美国专利No.5,700,667及其中的参考文献中公开，特此将所有这些方法并入作为参考。其它可用于本发明的固相支持物也是本领域公知的并且可以使用。用于将包含寡核苷酸的分子连接到表面或其它物质上的众多其它方法是本领域公知的，并且任何已知的用于连接或固定包含反义启动子寡核苷酸的分子的、可用来制备包含固定的反义启动子寡核苷酸的组合物的方法都包括在本发明之中。包括固定在固相支持物上的包含反义启动子的寡核苷酸的组合物也可用于通过退火由含反义启动子的环形第一链cDNA滚环复制所获得的含有义启动子的线性第二链cDNA制备功能性转录底物来制备反义转录产物。

[00269]本发明的试剂盒可包含一个或多个有义启动子引物，反义启动子寡核苷酸以及关于其在本发明方法中用途的使用说明。反义启动子寡核苷酸可在溶液中，或者它可包含固定在固相支持物上的寡核苷酸，如上文所讨论的那样。

[00270]本发明的另一种试剂盒可包含一个或多个反义启动子引物和反义启动子寡核苷酸，连同关于其在本发明方法中用途的使用说明，例如用于制备转录底物以获得反义转录产物的方法。类似地，试剂盒中的反义启动子寡核苷酸可在溶液中，或者它可包含固定在固相支持物上的寡核苷酸，如上文所讨论的那样。

[00271]还有另一种本发明的试剂盒可包含一个或多个有义启动子引物或者一个或多个反义启动子引物，无论是溶液中或是固定在固相支持物上的反义启动子寡核苷酸，和优化的用于环化含启动子的线性第一链cDNA的连接酶组合物，以及使用说明。

[00272]而本发明的另一种试剂盒可包含一个或多个有义启动子引物，无论是溶液中或是固定在固相支持物上的反义启动子寡核苷酸，优化的用于环化含启动子的第一链cDNA的连接酶组合物，和诸如但不限于尿嘧啶-N-糖基化酶的优化组合物，用于线性化具有利用具有dUMP残基的有义启动子引物所引入的dUMP残基的含有义启动子的环形第一链cDNA，以及合适的使用说明。

[00273]还有另一种本发明的试剂盒可包含一个或多个有义启动子引物或者一个或多个反义启动子引物，无论是溶液中或是固定在固相支持物上的反义启动子寡核苷酸，优化的用于环化含启动子的线性第一链cDNA的连接酶组合物，任选的用于线性化含有义启动子的环形第一链cDNA的优化组合物，和优化的利用所获得的转录底物中的双链启动子制备转录产物的RNA聚合酶组合物，以及使用说明。

[00274]另一种试剂盒可包含作为各个单独组合物、或作为单个优化的组合的组合物、或作为小数目组合物实施本发明的连续转录扩增反应所必需的所有组合物，所述反应例如但不限于图3示意图中所示的反应。

[00275]其它试剂盒可包含上述单独或组合的组合物，和/或其它组合物，例如但不限于：

[00276](a)合适的DNA聚合酶或反转录酶，以利用有义或反义启动子引物制备含启动子的第一链cDNA；

[00277](b)合适的链置换DNA聚合酶，例如但不限于IsoTherm^TMDNA聚合酶(EPICENTRE Technologies，Madison，WI)，用于滚环复制含反义启动子的环形第一链cDNA；

[00278]酶可在试剂盒中分别地提供，或者组合到含最佳比例的各个酶的单一即用溶液中。含在使用启动子引物的方法中使用的酶的试剂盒可与启动子引物一起提供，或者不含启动子引物，以飨希望制备他们自己的针对特定靶序列的启动子引物的客户。

[00279]试剂盒可用于特定的方法，例如但不限于用于制备对应于来自无论是在相同的条件下或是在不同的环境条件下特定类型的细胞或不同细胞的mRNA的转录产物的试剂盒，用于基因表达谱分析，包括产生有义或反义探针用于微阵列，用于扩增RNA或DNA序列的试剂盒，包括用于在单个反应混合物中实施靶核酸序列多轮次转录的试剂盒，用于制备对应于假使存在于样品中、可诊断或指示病原体、疾病基因、突变等位基因等的特定靶核酸序列的转录产物的试剂盒，用于被分析物特异性测定的试剂盒，其中被分析物是核酸，用于制备RNAi包括siRNA或修饰的RNAi或siRNA(包括但不限于使用DuraScribe^TMT7转录试剂盒(EPICENTRE Technologies，Madison，WI)的含2′-F-dCTP和2′-F-dUTP的RNAi或siRNA)的试剂盒，或者本领域技术人员通过阅读本发明文中的说明将会理解的任何广阔范围的试剂盒。

[00280]一般而言，本发明的试剂盒也将包括试剂盒中组分的描述以及关于其在本发明特定过程或方法中使用的说明。一般而言，本发明的试剂盒也将包括其它组分，例如但不限于缓冲液，核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，在有些实施方案中包括修饰核苷酸，DNA聚合或反转录酶增强剂，例如但不限于甜菜碱(三甲基甘氨酸)，以及一价或二价阳离子的盐，例如但不限于醋酸钾或氯化钾和/或氯化镁，酶底物和/或辅因子，例如但不限于ATP或NAD等特定应用的方法或方法组合的一个或多个反应或过程的最佳条件所需的组分。本发明的试剂盒可包含用于特定过程的一组单独的试剂或者用于以逐步或连续方式实施的方法的多个过程的系列组别的单独试剂，或者试剂盒可包含组合到单个反应混合物或多个试剂的小数目混合物中的多个试剂，其中每一种都在单个试管中实施多个反应和/或过程。一般而言，为实施本发明方法的特定过程或本发明完整方法的试剂盒的各种组分将被优化，从而它们具有适当量的试剂和条件，以在所述过程和/或方法中共同运作。

[00281]本发明的试剂盒也可以包括附加组分，例如反应缓冲液，对照底物，大小标志物，检测组合物或检测试剂等，它们都可以以一定量提供以匹配各组分用于规定数目的期望反应的需求，但试剂盒无需含有这些组分。更进一步，试剂盒可任选地含有详细的说明书和解决问题的指导。

[00282]试剂盒的组分可作为溶液或作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，干粉可通过添加合适的溶剂予以重配，在此情况下，所述溶剂也可以在另一容器中提供。

[00283]如本文说明书中所用，“一(a)”或“一种(an)”可表示一个或多个。如本文权利要求(书)中所用，当与单词“包含(comprising)”结合使用时，单词“一(a)”或“一种(an)”可表示一个或不止一个。如本文所用，“另一种(another)”可表示至少第二个或更多。

IX. 本发明的信号传递系统(Signaling System)

[00284]关于本发明的此方面，“信号传递系统”意味着并包括构成通过检测由可操作地与被分析物结合物质复合的寡核苷酸转录而得到的转录本以检测样品中被分析物的存在或数量的方法的众多物质，组合物和环境条件。

[00285]利用转录检测被分析物的其它方法是本领域公知的，包括由Zhang等( Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：5497-5502，2001)、由Eberwine在PCT专利申请号WO 02/14476以及由Hudson等在美国专利No.6,100,024描述的方法。

[00286]然而，本申请人相信本文提供的方法、组合物和试剂盒比他人以前业已描述过的那些更易于使用和制备，并且可更容易地使用以检测广泛多样的被分析物。

A.本发明的信号探针

[00287]图7和图8显示了使用信号探针作为本发明信号传递系统的一部分的本发明方法的两个实施方案。如本文所定义的那样，信号探针包含识别双链启动子以在转录条件下转录的RNA聚合酶的有义启动子，以及连接在该有义启动子5′-的单链模板。如果信号探针与互补于该有义启动子序列的反义启动子序列复合或退火，则获得了允许在转录条件下转录模板的同族RNA聚合酶的功能性启动子。RNA聚合酶可以是需要双链启动子的任何RNA聚合酶，只要使用包含双链启动子的启动子序列即可。也就是说，被RNA聚合酶所识别的单链假启动子或合成启动子并不适合于本发明使用信号探针的方面。合适的RNA聚合酶为T7型RNA聚合酶，优选为选自T7 RNAP、T3 RNAP和SP6RNAP的RNA聚合酶，且启动子为被各自RNAP识别的同族双链启动子。特定RNA聚合酶的“同族启动子”为被该特定RNA聚合酶特异性识别的启动子。类似地，特定启动子的“同族RNA聚合酶”为比识别一个或多个其它启动子序列的另一RNA聚合酶以实质上更大的特异性识别该特定启动子的RNA聚合酶，从而允许特异性转录与该启动子连接的模板，即使是在不被该特定RNA聚合酶识别为启动子的其它序列的存在下亦如此。因此模板编码“信号序列”并且能够但非必需编码一个或多个用于特殊目的的其它序列。作为举例但并非限制，模板也可以编码一个或多个转录终止序列。

[00288]本发明包括两类信号探针。图7中所用的RCT信号探针在本文中定义为环形信号探针，其中模板链连接于包含有义启动子序列的序列的3′-端和5′-端。RCT信号探针可通过滚环转录(RCT)进行转录，虽然如上文所提到的那样，RCT信号探针的模板也可以编码转录终止序列。本发明的第二类信号探针LINT信号探针在图8中使用，并且如此命名以指“线性转录(LINear Transcription)”。LINT信号探针为线性信号探针，其中有义启动子序列为模板的3′-。尽管LINT信号探针的模板也可以编码除信号序列外的一个或多个其它序列，但除非期望终止由一个序列到另一个的转录，转录终止子序列并非是必需的，因为线性模板上发生“失控(run-off)”转录。一般而言，RCT和LINT信号探针两者都包含脱氧核糖核苷酸，尽管不影响信号序列转录的其它核苷酸包括修饰核苷酸可用于特定目的。类似地，修饰键例如但不限于抗某些核酸酶的α-硫代磷酸酯糖键可用于特定目的。

B.连接于包含反义启动子的寡核苷酸的被分析物结合物质(ABS)

[00289]本发明这方面另一个重要的组合物是连接于包含反义启动子序列的寡核苷酸的被分析物结合物质，其中反义启动子包含功能性双链启动子的一条链。从而，构成连接于被分析物结合物质的寡核苷酸的反义启动子序列能够与信号探针的有义启动子序列复合或退火，以获得同族RNA聚合酶的功能性双链启动子。另外，反义启动子序列为信号探针中的有义启动子序列提供了结合位点，由此使得信号探针能够与被分析物结合物质复合或退火，后者又可被固定或结合到表面或固相支持物上。

[00290]信号探针中的模板序列编码一旦在转录条件下被RNA聚合酶转录就可利用本领域公知的许多任何方法检测的序列。作为举例但并非限制，转录产物可利用一个或多个与转录产物的互补序列退火的分子信标检测。备选地，模板序列可编码Q-β复制酶的底物，此酶可复制该底物并由此进一步放大信号。由这些实例，应当清楚本发明就可由连接于信号探针中有义转录启动子5′-的模板序列编码的转录产物而言并不受限制。如本文下面所讨论的那样，被分析物结合物质可以是用于检测广泛多样的被分析物的广泛多样的组合物，并且所有这些都包括在本发明之中。一般而言，连接于ABS的寡核苷酸(或称“oligo”)包含脱氧核糖核苷酸，尽管不影响有义启动子序列结合或信号序列转录的其它核苷酸包括修饰核苷酸可用于特定目的。类似地，修饰的键例如但不限于抗某些核酸酶的α-硫代磷酸酯糖键可用于特定目的。连接于ABS的寡核苷酸可以是任何长度，只要它足够长以包含包含反义启动子序列即可，该反义启动子当与本发明的信号探针退火时，制得可被RNA聚合酶用来在转录条件下制备转录产物的功能性双链启动子。包含反义启动子的寡核苷酸可包括为反义启动子序列3′-或5′-的附加核苷酸，只要附加核苷酸并不以独立于反义启动子序列与信号探针的有义启动子序列或本发明方法或测定法的另一组分复合的方式结合信号探针或本发明方法或测定法的另一组分，或以其它方式负面影响所述方法或测定法的结果即可。任何合适的无论是共价的或是非共价的方法都可用于将寡核苷酸的5′-端或5′-部分连接于ABS或作为接头以将寡核苷酸结合至ABS的另一化学制剂。作为举例但并非限制本发明，寡核苷酸可具有生物素部分，它可与具有连接的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白部分的ABS结合。重要的是所述方法和连接寡核苷酸的位点并不实质上影响特定测定法发挥作用所必需的ABS与被分析物或另一分子如一抗结合的能力。

[00291]本发明包含使用本发明的RNA聚合酶作为任何类型的被分析物的信号传递系统的方法、组合物和试剂盒，所述被分析物除了为靶核酸的被分析物之外，包括诸如但不限于抗原、抗体和其它物质的被分析物。

C.使用信号探针和ABS-oligo检测被分析物的方法

[00292]因此，本发明包括用于检测样品中或来自样品的被分析物的方法，该方法包括：

[00293]1.获得被分析物结合物质-寡核苷酸(″ABS-oligo″)，其中ABS-oligo包含与包含识别该启动子的RNA聚合酶的双链启动子反义启动子部分的序列的寡核苷酸结合在一起的ABS；

[00294]2.获得信号探针，其中信号探针包含结合于模板3′-端的有义启动子，其中有义启动子与ABS-oligo的反义启动子充分互补，以形成复合体，后者可用于利用与该复合体结合的RNA聚合酶进行模板转录；

[00295]3.使ABS-oligo与假如样品中存在被分析物则被分析物结合于其上的表面在允许该ABS-oligo结合所述表面上的被分析物(如果存在的话)的条件下进行接触；

[00296]4.在允许除去未结合的ABS-oligo的条件下洗涤表面；

[00297]5.使表面与信号探针在允许该信号探针与表面上的ABS-oligo(如果存在的话)复合的复合条件下进行接触；

[00298]6.任选地，在允许除去未结合的信号探针的条件下洗涤表面；

[00299]7.使表面与RNA聚合酶在允许使用ABS-oligo与信号探针之间的复合体转录由模板编码的产物的条件下进行接触；

[00300]8.如果存在的话，检测由模板编码的转录产物。

[00301]上述方法中所用的信号探针可以是RCT信号探针或LINT信号探针。根据所用的特定信号探针，以及利用此法用不含被分析物的样品是否检测到任何“背景”转录产物(即“信号”)，在允许除去未结合的信号探针的条件下洗涤表面的步骤是任选的。如果没有洗涤步骤而获得背景信号，则应当进行除去未结合的信号探针的洗涤步骤。因为双链启动子序列通常是本发明RNA聚合酶转录所需要的，未结合信号探针的存在可能不产生背景信号，在这种情况下，不需要洗涤步骤。对于使用LINT信号探针的方法可能不需要洗涤步骤。然而，已知有些RNA聚合酶能够利用包含小于约150个核苷酸的环形ssDNA分子的模板通过滚环转录合成RNA，即使所述模板并不包含启动子序列(美国专利No.5,714,320；6,077,668；6,096,880和6,368,802)。作为举例但并非限制，T7 RNAP对缺乏启动子序列的环形ssDNA模板的转录活性对越小的环形模板(例如包含大约25到大约50个核苷酸的环形模板)越高。因此，可能需要除去未结合RCT信号探针的洗涤步骤，特别是对于不超过约150个核苷酸的RCT信号探针，并且特别是对于不超过约50个核苷酸的RCT信号探针。然而，该洗涤步骤是否为特定的测定法所需，将取决于许多因素，包括检测水平，样品中被分析物的含量，信号探针中所用的模板，以及特定测定法背景信号的可接受水平。因此，洗涤步骤的需要是由本发明每一特定方法(和“测定法”)确定的。

[00302]本发明也包括另外的用于扩增由信号探针和ABS-oligo之间的复合体转录所获得的转录产物的量的方法、组合物和试剂盒。因此，本发明的一个实施方案包括用于扩增模板互补转录产物的量的方法，该方法包括：

[00303]a.通过转录与ABS-oligo复合的信号探针的模板获得转录产物；

[00304]b.获得包含互补于转录产物3′-端的3′-端部分以及任选的位于其5′-端的磷酸酯基团或拓扑异构酶部分的有义启动子引物；

[00305]c.使有义启动子引物与转录产物退火；

[00306]d.用RNA-依赖性DNA聚合酶在DNA合成条件下引物延伸与转录产物退火的启动子引物，以获得第一链cDNA；

[00307]e.任选地，去除与第一链cDNA退火的RNA；

[00308]f.连接第一链cDNA，其中5′-端共价连接于第一链cDNA的3′-端，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

[00309]g.使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得用于转录的环形底物；

[00310]h.使用于转录的环形底物与RNA聚合酶在转录条件下进行接触，以获得附加转录产物；和

[00311]i.获得所述附加转录产物。

[00312]在另一个实施方案中，线性化含有义启动子的环形第一链cDNA以获得含有义启动子的线性第一链cDNA，然后使反义启动子引物与其中的有义启动子序列退火以获得用于转录的线性底物。然后，使该用于转录的线性底物与RNA聚合酶在转录条件下接触，以获得附加转录产物，并获得所述附加转录产物。

[00313]尽管单链启动子不能用于获得用于转录的包含信号探针-ABS-oligo复合体的底物，上文所述利用有义启动子引物复制模板用于扩增由信号探针和ABS-oligo之间的复合体转录所获得转录产物的数量的方法，可使用包含可被能够利用单链启动子制备转录产物的RNA聚合酶所识别的单链有义启动子的有义启动子引物。从而，包含通过诸如Ohmichi等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：54-59，2002)所描述的方法获得的单链假启动子或合成启动子、或者单链噬菌体N4启动子例如但不限于P2启动子的有义启动子引物，可用在上述用于扩增转录产物量的方法的实施方案中。如果使用单链启动子，则使用该启动子的同族RNA聚合酶进行作为转录底物的含有义启动子的环形第一链cDNA或含有义启动子的线性第一链cDNA的转录。从而，在使用单链启动子的这些实施方案中，无需反义启动子寡核苷酸以获得用于转录的环形或线性底物，用以扩增由信号探针和ABS-oligo之间的复合体转录所获得的转录产物。

[00314]还有本发明扩增来自信号探针和ABS-oligo之间的复合体转录的转录产物的信号的另一种方法是，使用信号探针中编码复制酶(例如但不限于Q-β复制酶)底物的模板序列，并使来自信号探针和ABS-oligo之间的复合体转录的转录产物与复制酶在复制条件下进行接触，并获得所复制的转录产物，对该转录产物进行检测。

D.由信号探针的模板编码的信号序列的检测

[00315]来自信号探针和ABS-oligo之间的复合体转录的转录产物可通过本领域公知的任何方法检测。作为举例但并非限制，可包括Q-β复制酶的底物，其在由复制酶在复制条件下复制之后，利用嵌入性染料如但不限于溴化乙锭可检测。转录产物也可包括编码蛋白如绿色荧光蛋白的序列，其在信号序列翻译之后可检测。并非限制，它也可以包含由探针例如但不限于分子信标可检测的序列，如Tyagi等(Tyagi等的美国专利No.5,925,517和6,103,476，以及Alland等6,461,817，特此将其全部并入作为参考)所述。

E.信号传递系统用于不同被分析物

[00316]本发明的信号传递系统可用于广泛的被分析物和被分析物结合物质。作为举例但并非限制，被分析物可以是抗原而被分析物结合物质可以是抗体，或者被分析物可以是核酸，而被分析物结合物质可以是另一互补核酸。如下文所讨论的那样，存在可发现其特异性结合对的大量其它物质，它们都落在本发明的范围之内。

[00317]为了检测样品中的被分析物，本发明这方面的测定法使用与被分析物在“结合条件”下“结合”的被分析物结合物质。被分析物结合物质也可被称为被分析物的“亲和分子”、“亲和物质”、“特异性结合物质”或“结合分子”，其又利用连于该被分析物结合物质的转录信号传递系统通过制备转录产物检测。

[00318]“被分析物”可以是在测定法中确定其在样品中的存在、浓度或量的任何物质。作为举例但并非限制，被分析物可以是生物化学分子或生物聚合物或生物聚合物的片断，例如蛋白或肽，包括糖蛋白或脂蛋白，酶，激素，受体，抗原或抗体，核酸(DNA或RNA)，多糖或脂质。

[00319]为核酸、多核苷酸、寡核苷酸或者核酸或多核苷酸片断的被分析物结合物质，包括由DNA或RNA或者DNA和RNA单核苷酸两者(包括修饰的DNA或RNA单核苷酸)构成的核酸，也可根据本发明用以检测不包含核酸的被分析物。例如，由Gold和Tuerk在美国专利No.5,270,163中描述的称之为″SELEX″的方法可用来选择用作为根据本发明的被分析物结合物质的核酸。SELEX允许从至少其一部分具有随机序列的大群核酸分子中选择对特定被分析物具有高亲和力的核酸分子。例如，一群所有可能的25聚体的寡核苷酸(即在每一位置上都具有四种可能核酸碱基中的一种)将含有4²⁵(或10¹⁵)个不同的核酸分子，其中每一个都具有不同的三维结构和不同的被分析物结合性质。根据美国专利No.5,270,163、5,567,588、5,580,737、5,587,468、5,683,867、5,696,249、5723,594、5,773,598、5,817,785、5,861,254、5,958,691、5,998,142、6,001,577、6,013,443及6,030,776中描述的方法，特此并入作为参考，可使用SELEX以选择对于并非核酸和多核苷酸的特定被分析物具有高亲和力的被分析物结合核酸。一经使用SELEX选择，则核酸亲和分子可通过众多已知的体内或体外技术制备，作为举例但并非限制，包括自动化核酸合成技术、PCR或体外转录。

[00320]对其它天然存在的分子如但不限于蛋白分子具有亲和力的天然存在的核酸或多核苷酸序列也是本领域公知的。实例包括但不限于某些核酸序列例如操纵子，启动子，复制起点，被类固醇激素-受体复合体所识别的序列，限制性核酸内切酶识别序列，核糖体核酸等等，已知它们与某些蛋白紧密结合。例如，在两个众所周知的系统中，lac阻遏蛋白和噬菌体λ阻遏蛋白分别与其各自的称作“操纵基因”的特异性核酸序列结合，以阻断其相应mRNA分子转录的起始。含此类特异性序列的核酸可在本发明中用作为相应蛋白或该核酸对其具有亲和力的其它分子的被分析物结合物质。在这些情况下，具有特异性序列的核酸可根据本发明此方面用作为其结合的相应特异性蛋白、糖蛋白、脂蛋白、小分子或其它被分析物的被分析物结合物质。通常称之为“足迹法”的若干技术之一(如参见Galas，D.和Schmitz，A， Nucleic Acids Res.5：3161，1978)可用于鉴定结合蛋白的核酸的序列。其它方法也是本领域技术人员公知的，并且可用于鉴定核酸序列用作为特异性的被分析物结合物质用于本发明。

[00321]肽核酸(PNA)或包含核酸和PNA两者的分子也可根据本发明用作是核酸或多核苷酸的被分析物的被分析物结合物质。PNA作为本发明的被分析物结合物质在用于核酸被分析物的测定中提供更紧密的结合(和更大的结合稳定性)(如参见美国专利No.5,985,563)。同样，由于PNA并非是天然存在的，PNA分子高度抗蛋白酶和核酸酶活性。PNA/DNA或PNA/RNA复合体的抗体介由其特异性结合相应复合体而不结合单个分子的能力，可在本发明中用于俘获、识别、检测、鉴定或定量生物学样品中的核酸(美国专利No.5,612,458)。

[00322]本发明也考虑由诸如但不限于美国专利No.5,539,083、5,831,014和5,864,010中所述方法的方法制备的随机肽核酸组合文库，可用于制备被分析物结合物质用于测定中以分析所有类型被分析物，包括作为核酸、蛋白和其它被分析物的被分析物，不限于此。正如使用核酸的SELEX法中的情况一样，制备随机肽和肽核酸文库以包含极大数目的对被分析物具有不同结合亲和力的分子。在从文库中选择被分析物的合适的亲和分子之后，所选的亲和分子可在本发明中用作为被分析物结合物质。

[00323]被分析物结合物质也可以是具有并非氨基酸的修饰主链的寡核苷酸或多核苷酸，例如但不限于美国专利No.5,602,240、6,610,289、5,696,253或6,013,785中描述的修饰寡核苷酸。

[00324]本发明也考虑被分析物结合物质可由随机肽(即包含至少四个天然存在的氨基酸)组合文库制备。制备随机肽文库的一种方法是将如为SELEX所制备的随机DNA序列置于噬菌体T7 RNA聚合酶启动子或类似启动子的下游，然后使用诸如但不限于如美国专利No.5,324,637、5,492,817或5,665,563中所述的偶联转录-翻译的方法，或者逐步转录继之以翻译。备选地，可将如为SELEX所制备的随机DNA序列克隆到DNA载体中位点上，一经插入，其编码含所述随机序列的重组MDV-1 RNA，后者可由Q-β复制酶复制(如MDV-1(+)RNA中核苷酸63和64之间；见美国专利No.5,620,870)。含随机DNA序列的该重组MDV-1 DNA位于该DNA载体中T7 RNA聚合酶启动子或类似启动子的下游。然后，在转录之后，含随机序列的该MDV-1 RNA可通过如美国专利No.5,556,769中所述的偶联复制-翻译用于制备包含至少四个天然存在的氨基酸的随机肽文库。可通过使文库中的肽与被分析物结合，分离未结合的肽，并通过本领域公知的手段鉴定一个或多个与被分析物结合的肽而从文库中选择被分析物结合物质。备选地，可使用高通量筛选法筛选文库中的所有个体肽，以鉴定能够用作为被分析物结合物质的那些肽。尽管这些方法对被分析物结合肽的鉴定困难且烦琐，本领域的方法正在改进，且时间支出和所需的努力可能因鉴定用在将会大量常规使用的本发明测定法中的被分析物结合物质而证明是正确的。

[00325]许多其它被分析物结合物质也可用在本发明这方面的方法之中。

[00326]对于抗原被分析物(其本身可以是抗体)，可获得抗体包括单克隆抗体作为被分析物结合物质。对于仅包括一种抗体的样品中的某些抗体被分析物，可采用抗体结合蛋白如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)A蛋白作为被分析物结合物质。

[00327]对于因具有被凝集素特异性结合的碳水化合物部分而有别于样品中的其它物质的被分析物，例如糖蛋白和糖蛋白类，或者多糖和多糖类，合适的被分析物结合物质为凝集素。

[00328]对于是激素的被分析物，可采用激素受体作为被分析物结合物质。相反地，对于是激素受体的被分析物，可采用激素作为被分析物结合物质。

[00329]对于是酶的被分析物，可采用酶抑制剂作为被分析物结合物质。对于是酶抑制剂的被分析物，可采用酶作为被分析物结合物质。

[00330]通常，被分析物分子和该被分析物分子的亲和分子作为特异性的“结合对”而相关，即其相互作用仅仅是通过非共价键如氢键、疏水相互作用(包括芳族分子的堆叠)、范德瓦尔斯力以及盐桥。并非束缚于理论，本领域认为这些类非共价键部分地是由于结合对中涉及的分子的互补形状或结构导致结合的。

[00331]根据本发明这方面的术语“结合”是指被分析物结合物质或亲和分子与被分析物之间因为非共价键，例如但不限于氢键、疏水相互作用、范德瓦尔斯键以及离子键，而导致的相互作用。

[00332]基于对“结合”的定义以及本发明可用的广泛多样的亲和分子和被分析物，显然“结合条件”因不同的特异性结合对而变。本领域技术人员能够容易地确定条件，由此在样品中可能存在的亲和分子和被分析物之间发生结合。尤其是，本领域技术人员能够容易地确定条件，由此可使得发生被本领域认为是“特异性结合”的亲和分子和被分析物之间的结合。正如本领域所理解的那样，此种特异性通常是由于亲和分子对被分析物比对样品中其它物质和组分(如试管壁、固相支持物)的更高亲和力。在某些情况下，特异性可能也涉及或者可能是由于亲和分子与被分析物比与样品中其它物质和组分显著更为快速的结合。

[00333]“杂交”是用来指使包含核酸、或肽核酸(PNA)分子、或共价连结、结合或连接的核酸-PNA分子的亲和分子与包含核酸的被分析物在也称之为“杂交条件”的“结合条件”下温育的过程的术语。含互补序列的两核酸聚合物彼此发现并通过碱基配对互作退火的能力是广为认可的现象。Marmur和Lane( Proc.Nat.Acad.Sci.USA 46：453，1960)以及Doty等 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 46：461，1960)初次观察的“杂交”过程业已经过改进成为现代生物学的必要工具。“杂交”也指单链核酸、PNA或连接的核酸-PNA亲和分子中互补核酸碱基与单链核酸被分析物的“结合”或“配对”，这是根据碱基配对规则进行的(如，腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶配对，而鸟嘌呤与胞核嘧啶配对)。本领域技术人员将能够建立和制造包括测定的特定核酸被分析物的结合条件或杂交条件的条件。在特定核酸被分析物、被分析结合物质的结合条件的建立和制造中，以及在特定被分析物和俘获探针的杂交条件的建立和制造中，可在杂交溶液中添加某些添加剂。作为举例但并非限制，可添加葡聚糖硫酸盐或聚乙二醇以加速杂交速率(如Chapter 9，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或者可向杂交溶液中添加甜菜碱以消除T_m对碱基对组成的依赖性(Rees，W.A.等， Biochemistry 32：137-144，1993)。

术语“同源性程度”或“互补性程度”用来指一条链上的核酸碱基(如亲和分子)与另一条链上的核酸碱基(如被分析物)“互补”或“能够配对”的程度或频率。互补性可以是“部分的”，意味着仅有些核酸碱基根据碱基配对规则是匹配的，或者互补性可以是“完全的”或“全部的”。当亲和分子上的核酸碱基最大程度地与被分析物上的核酸碱基“结合”或“杂交”时，长度(即构成核酸和/或PNA亲和分子以及核酸被分析物的核酸碱基的数目)、以及亲和分子与被分析物之间的“同源性”或“互补性”程度对结合或杂交的效率和强度具有重大的影响。术语“熔点温度”或“T_m”作为互补性程度的指征使用。T_m为双链核酸分子群在限定条件下半数解离为单链的温度。基于杂交中所用核酸分子将与靶多核苷酸近乎完全同源或互补的假设，业已建立了用于估计与互补序列杂交或“退火”的给定单链序列的T_m的方程式。例如，本领域寡聚脱氧核苷酸的通用方程式为：当核酸处于含1M NaCl的水溶液中时，T_m＝81.5℃+0.41(％G+C)(参见如Aderson和Young，Quantitative Filter Hybridization，in NucleicAcid Hybridization，1985)。可获得关于核酸的其它更为复杂的方程式将最近的邻居及其它结构效应考虑在内以计算T_m。结合对于PNA亲和分子通常比对于核酸亲和分子更强。例如，10聚体同型胸腺嘧啶PNA与其互补10聚体同型腺嘌呤DNA结合的T_m为73℃，而对应10聚体同型胸腺嘧啶DNA与相同的互补10聚体同型腺嘌呤DNA的T_m为23℃。用于计算核酸T_m的方程式不适合于PNA。优选地，利用本领域的方程式计算的T_m凭经验核实，且适合于特定测定法的杂交或结合条件通过经验上提高或降低杂交严谨度而调整。如本文所用，术语“严谨性”用于指进行核酸杂交的温度、离子强度、以及其它化合物存在的条件。在“高严谨性”条件下，核酸碱基配对将只发生在具有高频率互补碱基序列的核酸片断之间。从而，当期望彼此并非完全互补的核酸杂交或退火到一起时，常常需要“弱”或“低”严谨性条件。

[00334]有关互补性，对于本发明有些测定法重要的是确定是否杂交代表完全或部分互补性。例如，当期望简单地检测病原DNA(例如来自病毒、细菌、真菌、支原体、原生动物)存在或不存在时，唯一重要的是当相关序列存在时，杂交方法确保杂交。在本发明的那些实施方案中，可选择部分互补探针和完全互补探针都将杂交的条件。

F. 用于本发明信号传递系统的试剂盒和组合物

[00335]本发明这方面重要的组合物是信号探针。包含信号探针的组合物可包含如上所述的RCT信号探针或LINT信号探针。更进一步，可提供多个特异性信号探针，每一个包含不同RNA聚合酶的有义启动子，例如但不限于T7、T3或SP6 RNAP的启动子和/或不同的模板，以检测和/或定量同一样品中的多个不同被分析物，或检测样品中同一被分析物的多个不同部分。作为举例但并非限制本发明，可提供检测包含抗体的不同被分析物结合物质的不同信号探针，所述抗体识别包含不同蛋白的抗原、或包含同一蛋白上不同抗原决定簇的抗原。如果使用包含多个不同模板的信号探针，该模板可编码可由多个不同检测分子检测的转录产物，检测分子例如但不限于与不同转录产物退火以制造可检测的荧光信号的多个不同分子信标。每一个不同的分子信标可以但不必需具有由淬灭部分淬灭的不同荧光部分，其中来自一个荧光部分的信号可与来自另一个荧光部分的信号区别开来。

[00336]本发明的另一个重要的组合物是如上所述的连接于包含有义启动子序列的寡核苷酸的被分析物结合物质(即ABS-oligo)。也如文中别处所讨论的那样，被分析物结合物质(ABS)可以是紧密且特异性地结合被分析物的任何物质，以在ABS并不结合的其它物质的存在下获得与该被分析物的特异性结合。

[00337]试剂盒可包含信号探针和RNA聚合酶以及在使用信号探针的方法中所用的其它组合物，但对于希望制备其自己的用于特殊被分析物的ABS-oligo的客户则没有ABS-oligo。

[00338]本发明的试剂盒可包含一个或多个信号探针，和用于检测被分析物和/或用于定量样品中被分析物的ABS-oligo，以及其在本发明方法中的使用说明。

[00339]本发明的另一种试剂盒可包含一个或多个信号探针，一个或多个用于检测一个或多个被分析物和/或定量样品中一个或多个被分析物的ABS-oligos，和优化的利用通过信号探针与ABS-oligo复俣所获得的转录底物中的双链启动子制备转录产物的RNA聚合酶组合物，以及使用说明。

[00340]还有本发明的另一种试剂盒包括用于扩增由信号探针和结合于被分析物的ABS-oligo之间的复合体转录所获得的模板互补转录产物的量的试剂盒，该试剂盒包括：

[00341]1.包含互补于由信号探针的模板编码的转录产物3′-端的3′-端部分以及任选包含位于其5′-端的磷酸酯基团或拓扑异构酶部分的有义启动子引物；

[00342]2.任选地，利用由信号探针的模板编码的转录产物作为模板引物延伸有义启动子引物的RNA-依赖性DNA聚合酶；

[00343]3.任选地，用于连接通过引物延伸有义启动子引物所获得的第一链cDNA的连接酶；

[00344]4.能够与第一链cDNA引物延伸产物的有义启动子复合，以获得结合启动子并在转录条件下由其起始转录的RNA聚合酶的功能性双链转录启动子的反义启动子寡核苷酸，

[00345]5.任选地，利用双链启动子的RNA聚合酶；

[00346]6.任选地，所述方法的其它优化反应缓冲液和组合物，或者作为各个单独的组合物，或者作为单一优化的组合的组合物，或者作为小数目的组合物；和

[00347]7.其在本发明方法中的使用说明。

[00348]酶可在试剂盒中分别地提供，或者组合到含最佳比例的各个酶的单一即用溶液中。

[00349]包含在使用信号探针的方法中所用的酶和/或其它组合物的试剂盒可与信号探针一起提供，或者不含信号探针，以飨希望制备他们自己的包含不同模板序列的信号探针的客户。

[00350]试剂盒可用于检测和/或定量特异性被分析物，例如但不限于，用于包括病原体、疾病基因、突变等位基因等的被分析物特异性测定的试剂盒。

[00351]一般而言，本发明的试剂盒也将包括试剂盒中组分的描述以及关于其在本发明特定过程或方法中的使用说明。一般而言，本发明的试剂盒也将包括其它组分，例如但不限于缓冲液，核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，在有些实施方案中包括修饰核苷酸，DNA聚合或反转录酶增强剂，例如但不限于甜菜碱(三甲基甘氨酸)，以及一价或二价阳离子的盐，例如但不限于醋酸钾或氯化钾和/或氯化镁，酶底物和/或辅因子，例如但不限于ATP或NAD等特定应用的方法或方法组合的一个或多个反应或过程的最佳条件所需的组分。本发明的试剂盒可包含用于特定过程的一组单独的试剂或者用于以逐步或系列方式实施的方法的多个过程的系列组别的单独试剂，或者试剂盒可包含组合到单个反应混合物或多个试剂的小数目混合物中的多个试剂，其中每一种都在单个试管中实施多个反应和/或过程。一般而言，为实施本发明方法的特定过程或本发明完整方法的试剂盒的各种组分将被优化，从而它们具有适当量的试剂和条件，以在所述过程和/或方法中共同运作。

[00352]本发明的试剂盒也可以包括附加组分，例如反应缓冲液，对照底物，大小标志物，检测组合物或检测试剂等，它们都可以以一定的量提供以匹配各组分用于规定数目的期望反应的需求，但试剂盒不必需含有这些组分。更进一步，试剂盒可任选地含有详细的说明书和解决问题的指导。

[00353]试剂盒的组分可作为溶液或作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，干粉可通过添加合适的溶剂予以重配，在此情况下，所述溶剂也可以在另一容器中提供。

[00354]通过阅读本发明文中的说明，本领域技术人员将会理解包含在本发明之内的广泛的其它试剂盒。

[00355]如本文说明书中所用，“一(a)”或“一种(an)”可表示一个或多个。如本文权利要求(书)中所用，当与单词“包含(comprising)”结合使用时，单词“一(a)”或“一种(an)”可表示一个或不止一个。如本文所用，“另一(another)”可表示至少第二个或更多。

Claims (6)

1.用于制备对应于靶核酸中的靶序列的转录产物的方法，该方法包括：

(a)获得靶核酸；

(b)获得有义启动子引物，该有义启动子引物包括含有有义转录启动子的5′-端部分以及互补于靶的3′-端部分；

(c)使有义启动子引物与靶核酸退火，以形成靶核酸-有义启动子引物复合体；

(d)使靶核酸-有义启动子引物复合体与DNA聚合酶在聚合反应条件下接触，以获得互补于靶序列的第一链cDNA；

(e)获得第一链cDNA；

(f)在连接条件下连接第一链cDNA，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

(g)获得反义启动子寡核苷酸；

(h)使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得环形转录底物；

(i)获得环形转录底物；和

(j)使环形转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触，其中获得转录产物。

2.根据权利要求1的方法，其中反义启动子寡核苷酸包含固定在固相支持物上的寡核苷酸。

3.用于在或从样品中检测被分析物的方法，该方法包括：

a)获得被分析物结合物质-寡核苷酸(″ABS-oligo″)，其中ABS-oligo包含连接于寡核苷酸的ABS，所述寡核苷酸包含双链启动子中对于识别该启动子的RNA聚合酶而言为反义启动子部分的序列；

b)获得信号探针，其中信号探针包含连接于模板3′-端的有义启动子，其中有义启动子与ABS-oligo的反义启动子充分互补以形成复合体，通过使用与该复合体结合的RNA聚合酶，该复合体可用于所述模板的转录；

c)使ABS-oligo与假如样品中存在被分析物则被分析物结合于其上的表面在被分析物结合条件下进行接触，所述条件允许假使被分析物存在的话，该ABS-oligo结合所述表面上的被分析物；

d)在允许除去未结合的ABS-oligo的条件下洗涤表面；

e)使表面与信号探针在允许该信号探针与假使存在的话在表面上的ABS-oligo复合的复合条件下进行接触；

f)任选地，在允许除去未结合的信号探针的条件下洗涤表面；

g)使表面与RNA聚合酶在允许使用ABS-oligo与信号探针之间的复合体转录由模板编码的产物的条件下进行接触；和

h)如果存在的话，检测由模板编码的转录产物。

4.用于扩增模板互补性转录产物的量的方法，该方法包括：

a)获得转录产物；

b)获得包含互补于转录产物3′-端的3′-端部分以及任选的位于其5′-端上的磷酸酯基团或拓扑异构酶部分的有义启动子引物；

c)使有义启动子引物与转录产物退火；

d)用RNA-依赖性DNA聚合酶在DNA合成条件下对与转录产物退火的启动子引物进行引物延伸，以获得第一链cDNA；

e)任选地，去除与第一链cDNA退火的RNA；

f)连接第一链cDNA，其中5′-端共价连接于第一链cDNA的3′-端，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

g)使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得用于转录的环形底物；

h)使用于转录的环形底物与RNA聚合酶在转录条件下进行接触，以获得附加的转录产物；和

i)获得所述附加转录产物。

5.权利要求4的方法，其中有义启动子引物包含从由为RNA聚合酶所用以产生附加转录产物的假启动子或合成启动子组成的组中选择的单链有义启动子，并且其中不使用反义启动子来获得附加的转录产物。

6.权利要求4的方法，其中有义启动子引物包含N4启动子，而用于转录的RNA聚合酶选自N4 vRNAP、mini-vRNAP以及突变的mini-vRNAP，并且其中不使用反义启动子来获得附加的转录产物。

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