JPH06502767A

JPH06502767A - ２−酵素自律性塩基配列複製による核酸増幅

Info

Publication number: JPH06502767A
Application number: JP4502286A
Authority: JP
Inventors: ファーイ，イオイン・デーヴィッド; クォー，デボラー・ヤンティス; ジンジェラス，トーマス・レイモンド; グワテリー，ジョン・クリストファー; ホウィットフィールド，クリスティナ・マリー
Original assignee: アクゾ・ノベル・ナムローゼ・フェンノートシャップ
Priority date: 1990-11-13
Filing date: 1991-11-13
Publication date: 1994-03-31
Also published as: IE913930A1; WO1992008800A1; IL100040A0; PT99500A; EP0572417A4; HUT69772A; ZA918965B; AU9131591A; HU9301369D0; FI932144A; NO931709D0; IL100040A; FI932144A0; EP0572417A1; CA2096013A1; NZ240574A; NO931709L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は一般に、核酸サンプル中の標的核酸セグメントを増幅するための方法とキットとに関する。本発明はまた、この方法とキットとの分子生物学、分子遺伝学、及び疾患の診断に用いられるような分析を含めた、核酸プローブハイブリダイゼーション分析における用途にも関する。

発明の背景分子生物学、分子遺伝学及び、血液由来病原菌もしくは欠陥遺伝子の検出による疾壱の診断のための核酸プローブハイブリダイゼーション分析の使用のような、それらの用途における研究の多くは、特定の核酸配列（すなわち、特定の配列を有する核酸セグメント）をバックグランドの非常に多数の、同じ長さ又は殆ど同じ長さの、異なる配列、時には同じ配列から検出又は単離することを含む。このような研究における基礎的な問題はこのようなバックグランド中の重要な、特定の核酸配列を検出又は単離し、可能ならば定量することである。例えば細胞培養物、組織標本及び血液サンプルのような、特定のセグメントを検出する必要があるか又は特定のセグメントを単離する必要がある生物学的物質が、せいぜいごく小さい断片のみが重要なセグメントを含む、ＲＮＡとＤＮＡとの複雑な混合物から典型的に構成されるので、この問題は困難であった。

核酸の複雑な混合物中に低レベルで存在する、重要な核酸セグメント（“標的セグメント）を検出する又はクローニング後に単離するという問題を扱うために、２つの基本的に異なるアプローチが採られてきた。

第１アプローチでは、被分析核酸サンプル中の核酸量（標的セグメントを含む）は変化せず：その代わりに、シグナル発生系が標的セグメントに付随し、サンプル中の標的セグメントの存在又はコピー数を表す、検出可能なシグナルを生ずる。

例えば、標的セグメントの少なくともサブセグメントの配列に相補的な配列を有し、例えばアルカリホスファターゼのような、酵素に結合した核酸プローブに、プローブと標的セグメントとの間のハイブリダイゼーションを行うがプローブとサンプル中の池の核酸セグメントとの間では知覚されつるハイブリダイゼーションを行わないというハイブリダイゼーション条件下で、サンプルを混合する。ハイブリッド形成することができないプローブを除去した後に、酵素の基質（例えば、アルカリホスファターゼのための発色体基質）を酵素による触媒作用が促進されるような条件下で加えると、原則として、標的セグメントにハイブリダイズした各プローブ分子に関して、酵素触媒反応により多数の検出可能な分子が迅速に形成される（発色体基質の場合にはアルカリホスファターゼによって目視的に着色される）。

サンプル中の標的核酸量を変化させずに核酸セグメントを検出するための多（の他の系が当該技術分野に公知である。例えば、標的核酸セグメントは放射性同位体（例えば、３２Ｐ）又は蛍光性部分によって標識したプローブによってハイブリダイゼーションに基づいて検出されている。或いは、自触媒作用によって複製可能なＲＮＡ分子（例えば、Ｑβファージ又はブロムモザイクウィルス（ＢＭＶｌＭｉｅｌｅ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１７１．２８１　（１９８３））のＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼの基質であるＲＮＡ）を含む又はこれに結合したプローブを用いて、サンプルの核酸によるプローブのハイブリダイゼーション及び非ハイブリッド形成プローブをサンプルから洗浄した後に、複製可能なＲＮＡの複製を対応ＲＮＡポリメラーゼによって誘導させ、最後に複製ＲＮＡ分子を検出することは公知である。標的セグメントに対するプローブがＱβレプリカーゼによって複製されることができるＲＮＡに結合する系はＣｈｕ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４．５５９１　（１９８６）と、米国特許第４．　９５７．　８５８号とに述べられており、ＢＭＶレプリカーゼによる系はＭａｒｓｈ等、Ｐｏ５ｉｔｉｖｅ　５ｔｒａｎｄ　ＲＮＶ　Ｖｉｒｕｓｅｓ（１９８６ＵＣＬＡシンボンウム議事録）、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｐｕｂｌ、Ｃｏ、、　ニューヨーク州、ニューヨーク（１９８７）に述べられている。

標的に付随するシグナルを増幅するこの第１アプローチは二つの重要な欠点を有する。第一に、多くの場合に、実際のサイズのサンプル中の標的セグメントのコピー数は非常に低いので、妥当に迅速なシグナル発生系に対しても、バックグランドを有意に越える、検出可能なシグナルの発生に要する時間は非実用的に長い。第二に、標的セグメントの如何なる分析においても、“バックグランド”によるシグナルが不可避である。シグナルが増幅される系では、シグナル発生と増幅が“バックグランド”シグナル発生分子から、標的に実際に付随するシグナル発生分子からと実質的に同じ速度で生ずる（例えば、標的セグメントの配列に殆ど同じであるが同一ではない配列を有するセグメントとハイブリット形成した、ガラス、プラスチック又は系の他の要素に付着するプローブ分子等）。従って、第一アプローチを用いる分析の感度は不可避な“バックグランド”シグナル発生分子によって根本的に限定される。

第ニアプローチは根本的に異なる。第ニアプローチは標的セグメント自体のコピー数を好ましくはサンプル中の他のセグメント、特に配列の類似性のために標的セグメントと誤って検出されるセグメントのコピー数を越える程度にまで高めることを含む。

この第二アプローチの例は、標的セグメントを収容する細胞が時には他の細胞よりも迅速に数を増加させられる、又は標的セグメントを含む特定の核酸（例えばプラスミド、ＲＮＡ）が数を増加させられる、種々な培養方法を含む。

この第ニアプローチの他の例はいわゆる“ポリメラーゼ連鎖反応“　（“ＰＣＲ ”）におけるＤＮＡ１ｌｉ的セグメントの増幅である。この方法は例えばある種の一本鎖ＤＮＡウィルスのゲノムの復製への以前から知られた自然発生プロセスの適応であり、あらゆる場合に、Ｈｏｎｇ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓｌ、２４３　（１９８１）：Ｃｏｏｋ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５．６５０２　（１９８０）；及びＺｏｌｌｅｒ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ　１００．４６８−５００（１９８３）に従うＤＮＡ調製に類似する。

ＰＣＲ方法によると、特定のセグメントがサイクル数と共にコピー数を指数関数的に増加させる、各サイクルは（１）標的セグメントとその補体（すなわち、標的セグメントの配列と相補的な配列のセグメント）の各々の３“−末端サブセグメントへのＤＮＡプライマーのアニーリング、（２）ＤＮＡポリメラーゼによる凸プライマーの伸長、及び（３）工程（２）から生ずる二本鎖の熱変性によって一本鎖にすることを含む。ＲＣＡ方法は５ａｉｋｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０゜１３５　（１９８５）と、Ｍｕｌｌｉｓ等、ヨーロッパ特許出願公開第０２００３６２号と第０２０１１８４号と、米国特許第４．６８３，１９５号と第４，６８３．２０２号とに述べられている。

核酸の複雑な混合物中に低レベルで存在する標的セグメントを検出するための第２アプローチのもう一つの実施方法はいわゆる転写に基づく増幅系（“ＴＡＳ” ）の使用によるものである。ＴＡＳは、標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントからの転写を可能にするために、標的配列含有セグメントに比べて、標的配列とプロモーターとが配置されたセグメントを含むように合成されたＤＮＡからのＲＮＡ転写体作製工捏を用いる。転写工程で作製されたＲＮＡが同様に転写可能なりＮＡを作製するための鋳型として役立つことができ、これが次に転写されて、さらにＲＮＡを作製することができるので、多重サイクルを実施することができる。標的セグメントの配列又はそれと相補的な配列を含むＲＮＡの約１０〜約１，０００コピーが、標的セグメントを含むセグメントのプロモーター駆動転写を組み入れる各二本鎖ＤＮＡから迅速に作製されるので、各サイクルによって増幅は非常に迅速に進行する。ＴＡＳ方法は共通に所有される米国特許出願第０６４，１４１号（１９８７年６月１９日出願）と第２０２．９７８号（１９８８年６月６日出願）（国際特許出願公報第ＷＯ３８／１０３１５号として公開）に述べられており、これらの特許の開示はここに参考文献として関係する。

標的核酸増幅のＴＡＳ方法はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの二つの性質：（１）各ポリメラーゼに特異的なごく少数の配列からの評価できる転写の開始、例えばＢｒｏｍ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４．３５２１　（１９８６）；及び（２）ＲＮＡポリメラーゼよって認識されるプロモーターの各コピーからの多数の転写体の迅速な作製（典型的には１０”−１０’／時）を利用することによって、特定標的セグメントのコピー数を迅速に増加させる。Ｍｉｌｌｉｇａｎ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５．８７８３　（１９８７）を参照のこと。

さらに、標準方法を用いることによって、ＴＡＳ系の使用はサンプル中に存在する標的核酸量の明白な測定を可能にする。

ＴＡＳ方法はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性とを利用し、これらの両方はリバーストランスクリブターゼ並びにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性とプライマーによって形成されつる。このプライマーは被増幅標的セグメントの末端を画定する。プライマーの少なくとも− ・つは、典型的には標的セグメントの３′末端とハイプリント形成するプライマーはプロモーターのセンス鎖（ｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ）の配列を有するセグメントを含み、標的セグメントの３゛末端の配列と相補的配列を有するプライマーのセグメントに転写のために機能的に結合して、プロモーターと標的セグメントとを含む二本鎖ＤＮＡの転写を開始させる。ＴＡＳ方法に用いられる代表的なプロモーターはＴ７フアーン、Ｔ３ファージ及びＳＰ６フアージのＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターである。

ＴＡＳ方法はＲＮＡ標的セグメントの増幅に用いることができる。このような増幅では、プライマーを用いて、標的セグメントを含むＲＮＡから、標的セグメントの配列を有するセグメントを含むＤＮＡのプロモーター駆動転写を組み入れる二本鎖ＤＮＡを作製し、標的セグメントの配列に相補的な配列を有するセグメントを含むＲＮＡを得る。

ＴＡＳ方法は二本鎖核酸の標的セグメントの増幅に用いることもできる。簡単には、サンプルの二本鎖核酸を変性し、プライマーとそれらの各類とでハイブリッド形成させる、■プライマー（”アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）”プライマー）は標的セグメントの３′末端とハイブリッド形成し、他方のプライマー（ “センス“プライマー）は標的セグメントの補体の３°末端とハイブリッド形成する。次にプライマーを適当なポリメラーゼによって伸長させ、生じた二本鎖を熱変性させ、冷却して各プライマーに再び、標的セグメントを含む二本鎖サンプル核酸の鎖とのみでなく、最初のプライマー伸長反応で作製された伸長生成物ともハイブリッド形成させる。このハイブリッド形成プライマーは適当なポリメラーゼによって触媒作用される反応において再び伸長され、初期プライマー伸長の伸長生成物とプライマーがハイブリッド形成することによって、２種類の二本鎖り　Ｎ　Ａが形成され、少なくともその一つは標的セグメントを含むセグメントに転写のために機能的に結合したプロモーターを含む。このようなプライマーを含む一本鎖ＤＮＡはプロモーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて、標的セグメントの配列に相補的なセグメントを含むＲＮＡを生じ、それによって実際に、標的セグメント自体を増幅させる。上記プロセスのハイブリダイゼーション、伸長、熱変性、ハイブリダイゼーション、伸長及び転写は鋳型として新たに作製した二本鎖ＤＮＡの鎖と生じたＲＮＡ転写体との両方を用いて繰り返すことができる。

プロセスで作製されたＲＮＡの自触媒複製を用いない限り、ＴＡＳ増幅方法は特に最初の一本鎖ＲＮＡ転写体を生じ、これは標的セグメントか又はその補体のいずれかの配列を有するセグメントを含み、第１ＲＮＡの配列に対して相補的配列の第２ＲＮＡに比べて太き（過剰である。従って、ＴＡＳは厄介な、反復ＰＣＲ熱サイクリング又は鎖分離の必要なく検出されることができる一本鎖ＲＮＡを豊富に形成する。

増幅の多重ラウンドが熱変性なしに進行するような、増幅の各ラウンド中に熱変性工程の必要性を除去する転写に基づく増幅の形式を提供することが望ましい。

従って、自律性であり、等温的に進行する転写に基づく増幅の形式を提供することが非常に望ましい。

発明の概要本発明は、自然にかつ等温的に進行する実質的に連続的で、自律性の標的核酸増幅方法の意外な発見を含む。自律性配列複製（以下では“３ＳＲ”）のこの方法は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ５ｅ　ｆ（活性及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性、及び標的セグメント又はその補体とハイブリッド形成することができ、鋳型として標的セグメント又はその補体を用いるプライマー伸長反応を開始させるプライマーを用いるＲＮＡ標的セグメントの増幅を提供する。プライマーの少なくとも一つはプロモーターセンス配列を形成する。ＲＮＡ５ｅｔ（活性は鋳型として前記ＲＮＡ鎖を用いるプライマー伸長反応において合成される前記二本鎖のＤＮＡ鎖を一本鎖にさせるＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖の消化（ｄ　ｉｇｅｓ　ｔ　１ｏｎ）を酵素触媒作用することによって、熱サイクリングの必要性を回避する。リバーストランスクリブターゼとＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとを組合せることによって４種の酵素活性を得ることができる。本発明はリバーストランスクリブターゼの固有ＲＮＡ５ｅＨ活性が必要なＲＮＡ５ｅＨ活性を与える３ＳＲ増幅方法と、リバーストランスクリブターゼのＲＮＡ５ｅＨ活性に例えば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＲＮＡｓｅＨのような他のＲＮＡ５ｅＨ活性供給源が追加されて、約１０５〜１０６倍の増加したレベルの増幅が達成される方法を包含する。

本発明はまた、ある種の反応条件下で、リバーストランスクリブターゼがリバーストランスクリブターゼ以外のＲＮＡ５ｅＨ活性供給源を反応媒質に追加せずに、４時間未満に約１０５〜約１０６倍にＲＮＡ標的セグメントを増幅することができる、非常に敏感な３ＳＲ増幅反応を与えるために充分なＲＮＡ５ｅＨ活性を有するという意外な発見を含む。前記のある種の反応条件の不存在下では、リバーストランスクリプターゼのＲＮＡ５ｅＨ活性に例えば大腸［（Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉ）’ＲＮＡ５ｅＨからの他のＲＮＡ５ｅＨ活性供給源を追加しない限り、約１０３〜１０４倍より大きい３ＳＲ増幅レベルが得られない。従って、本発明の他の実施態様では、本発明は標的核酸セグメントを４時間以内に、典型的には１／２〜２時間内に約１０５〜約１０６倍に増幅することができる標的核酸セグメントの２−酵素３ＳＲ増幅方法に関する。

本発明はさらに、３ＳＲ増幅方法の新規な改良に関する。これらの改良は３ＳＲによる標的セグメント増幅が２酵素のみによって進行することができ、２−酵素３ＳＲ反応と３−酵素３ＳＲ反応の両方で増加したレベルの増幅を生ずる、反応媒質と他の反応条件との改良を含む。

本発明はまた、約７００塩基を越える、比較的大きい標的セグメントを、さもない場合にはより小さい標的セグメントによってのみ達成可能なレベルにまで増幅することができる２−酵素３ＳＲ増幅方法を提供する。

本発明は、標的核酸セグメントの３ＳＲによる増幅キットと、３ＳＲによる増幅を含む方法によってサンプルを標的核酸の存在に関して分析するためのキットであって、３−酵素３ＳＲ増幅のための改良された反応媒質又は２−酵素３ＳＲ増幅のための改良された要素を含むキットを提供する。

図面の簡単な説明図１−は本発明の１実施態様の概略図である。種々な工程の全ては実際には高度に相互作用的に同時に生ずると理解されるが、図１は自律性配列複製（３ＳＲ）プロセスを段階的なプロセスとして説明する。３ＳＲ増幅反応のために必要な酵素活性はＲＮ　Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性（ＲＴ活性１．）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性（ＲＴ活性２）　、ＲＮＡ５ｅＨ活性（ＲＴ活性３）及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性である。黒い方形ブロックは第１プライマー（“Ａ”と名付ける）と第２プライマー（“Ｂ”と名付ける）のプロモーター供給セグメントを表す。

図２ａと２ｂは本発明の実施態様の種々な工程の詳細な概略図であり、以下で説明するように、３ＳＲ増幅反応中に安定に又は一時的に存在する核酸種を含む種々なサブセグメントを示す。

発明の詳細な説明その全体でここに参考文献として関係する、共通に所有される米国特許出願第２８５．４６７号、１９８８年１２月１６日出願は自発的にかつ等温的に進行する実質的に連続的な自律性標的核酸の増幅方法を開示する。この方法はハイブリッド形成核酸の熱変性の必要性を有利に回避する。この増幅方法は標的ＲＮＡセグメント、必要なプライマー、必要な酵素活性を提供する酵素及びヌクレオシド三リン酸基質の存在下で自発的にかつ等温的に進行するので、“自律性配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ） ”と名付けられ、以下では“３ＳＲ”と略記する。

意外にも判明したように、必要な４酵素活性を提供する酵素類、プライマー、リボヌクレオシド三リン酸と２′−デオキシリボヌクレオシド三リン酸及びＲＮＡを含む反応混合物をプライマーのハイブリダイゼーションと、適当なレベルにおける必要な４酵素活性との両方に適切な反応条件下に維持することが可能であるので、自律性配列複製を完成まで進行させることができる。

３ＳＲ方法は、鋳型として標的セグメント又はその補体をそれぞれ用いて、連鎖 −伸長反応を開始させる２ＤＮＡプライマーを用いる。該プライマーの少な（とも一方はプロモーターのセンス鎖を含む。連続的であり、実質的に等温的である３ＳＲ方法は少なくとも２酵素−リバーストランスクリブターゼ（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、及びＲＮＡ５ｅＨ活性を提供するため）と、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性とによって供給される４酵素活性を必要とする。３ＳＲに用いられるＲＮＡ５ｅＨ活性は、変性工程を必要とするＴＡＳとは異なり、ＲＮＡセグメントが伸長生成物の形成のための鋳型として作用する時にＤＮＡ伸長生成物を一本鎖にするために用いられる。本発明の３ＳＲ反応に用いられるリバーストランスクリプターゼのＲＮＡ５ｅＨ活性に任意に、例えば大腸ｍＲＮＡ５ｅＨのような、リバーストランスクリブターゼ以外のＲＮＡ５ｅＨ活性供給源を補助することができる。しかし、大ｐ４菌はＲＮＡ５ｅＨは他の２酵素の最適反応条件とは異なるそれ自身の最適反応条件を有し、大８１Ｊ菌ＲＮＡ５ｅＨは受容される純粋な形態で容易に単離されず、３ＳＲ増幅のために必要な他の２酵素よりもかなり高価であるので、増幅の前に種々な低濃度で存在する核酸標的セグメントを検出するために必要である高感廣増幅に有効なＲＮＡ５ｅＨ活性量を提供するために、リバーストランスクリブターゼから分離した酵素の必要性を除去することが非常に望ましい。

例えば、ＤＮＡ合成を含む、ＤＮＡプローブ又はプライマー調製：標的ＤＮＡセグメントへのプライマーの相同度（ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）に依存する多少のハイブリダイゼーション特異性を生ずるための緊縮（ｓ　ｔ　ｒ　ｉｎｇｅｎｃｙ）条件の変化を含むハイブリダイゼーション方法、ＲＮＡ−及びＤＮＡ−依存性ＤＮＡ重合反応とｃＤＮＡの合成；プロモーターの同定、単離、配列決定もしくは調製、又はさらに詳しくは、転写の触媒反応の前に、結合のためにバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるようなプロモーターもしくは部位、又は真核系を用いる場合に、例えばアデノウィルスがコードするＲＮＡポリメラーゼ及びブロモモザイクウィルスＲＮＡポリメラーゼのような、ウィルスＤＮＡ−及びＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるようなプロモーターもしくは部位、いわゆる転写エンハンサ− 配列を含む、ＲＮＡ転写体の作製を助成する条件；使用する試薬を含むポリメラーゼ連鎖反応方法；等のような、本発明の基本的方法を実施するための定義と方法と手段とを含む分子生物学の標準テキストブックが参考になる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕ−±ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９８２）と、これに記載された種々な参考文献、米国特許Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、２３９．１２８８　（１９８８）；Ｍｉ　Ｉ　ｌ　ｉｇａｎ等、Ｎｕｃ上ｅｉｃフｋｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１５．８７８３　（１９８７）；Ｍｉ　Ｉ　Ｉｅｒ等。

３．３７　（１９８４）；Ｏｕ等、ＰＮＡＳ　７９．５２３５　（１９８２）：ＣｈＵ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４．５５９１　（１９８６）：ヨーロッパ特許出願公開第（ＥＰＡ）１９４８０９号；Ｍａｒｓｈ等、Ｐｏ５ｉｔｉｖｅＳｔｒａｎｄ　ＲＮＡ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、３２７−３３６頁、ＡｌａｎＲ。

Ｌｉ５ｓ　（発行：ニューヨーク）（１９８７，ＵＣＬＡシンポジウム議事録、１９８６）；Ｍｉ　Ｉ　ｌｅｒ等、Ｊ、Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ、１８７，５３７　（１９８６）：５ｔｏｆ　ｌｅｔ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．４９１　（１９８８）：及びＭｕｒ　ａ　ｋ　ａｗａ等、ＤＮＡ　７．２８７　（１９８８）を参照のこと。

上記刊行物の全てはこの関連によってここに参考文献として関係する。

本発明に関連して“プライマー”なる用語は、適当なハイブリダイゼーション条件下で標的セグメント（又はその補体）とハイブリッド形成することができ、標的セグメント（又はその補体）の配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させることができるように、標的セグメントもしくはその補体のセグメントに充分な相同性を有するセグメントをその３′　−末端に有する一本鎖核酸を意味する。典型的なプライマーのハイブリッド形成セグメントは少な（とも約１０ヌクレオチド長さであり、より好ましくは１５−５０ヌクレオチド、最も好ましくは約１５−２５ヌクレオチド塩基長さである。“プライマー”は好ましくはＤＮＡである。

ここで用いる“アンチセンス　プライマー”は鋳型として標的セグメントを用いる連鎖−伸長反応で伸長すべき標的セグメントの３′−末端の配列に充分に相補的である配列を有するプライマーを意味し；　“センス　プライマー”はこのような標的セグメントの５゛　−末端の配列に同様に充分に相同である配列を有するプライマーを意味する。これらのプライマーは増幅されるべき標的セグメントの末端を画定する。最も好ましい実施態様では、センス　プライマーとアンチセンス　プライマーとが、標的セグメントの５゛　−末端及び標的セグメントの３゛−末端の補体との同−性又は非常に高度の相同性をそれぞれ有する、少なくともそれらの３“　−末端を含むセグメントをそれぞれ有する。例えば、ヨーロッパ特許出願第１２８０４２号（１９８４年１２月１２日発行）を参照のこと。

該プライマーの少なくとも一方、任意に両方はプロモーターセンス配列を有するセグメントを含む。“プロモーターセンス鎖”なる用語は、その二本鎖形管であるその補体とハイブリッド形成する時に（すなわち、二本鎖プロモーターとして）、プロモーターのポリメラーゼ結合配列に結合して、転写プロセスを開始させ、ＲＮＡ転写体を作製するＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される一本鎖核酸を意味する。原則とし、て、如何なるセンスプロモーター配列も使用可能であり、該配列を認識することができる、公知の入手可能なポリメラーゼが存在する。典型的に、公知の有用なプロモーターは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７又はＳＦ３からのような、ある一定のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼにと共に本発明の実施に用いることができるＲ、　Ｎ　Ａポリメラーゼの例に過ぎない。

また、ここで用いる“プロモーターセンス鎖”は、プロモーター（センス鎖）共通配列（すなわち、共通ポリメラーゼ結合部位のセンス配列）の５′　−モストヌクレオチドに隣接して、好ましくは１個以上のヌクレオチド、より好ましくは約４〜約１０個以上のヌクレオチドを含む。ここで用いる“プロモーター　センス配列′は、前記配列を組み入れるｃＤＮＡの完成時に、プロモーターの共通配列が完全に二本鎖であるように、充分な長さてなければならない。これらのｃＤＮＡでは、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼがプロモーターからの転写に適した条件下に有るときに、プロモーターから転写が生ずる。

バクテリオファージ　プロモーターがそれらの同起源のＲＮＡポリメラーゼに対する高い特異性のために好ましい。同様に高い特異性を有する、池のブロモ−クーとそれらの対応ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをバクテリオファージ　プロモーターの代わりに、本発明に従って用いることができ、本発明はこのような他のプロモーターとＲＮＡポリメラーゼを、前記プロモーターが前記ポリメラーゼに対して高度の特異性を示す限り、同様に包含するように意図する。

バクテリオファージ　プロモーター　センス配列の好ましいものはＴ７．　Ｔ３及びＳＰ６プロモーターの（＋）鎖であり、対応ＲＮＡポリメラーゼが結合するセグメントと、このポリメラーゼ結合セグメントの５′　−末端から少な（とも１個の、好ましくは約４〜約１０個までのヌクレオチド５゛を含む。好ましいプロモーターとそれらの対応ＲＮＡポリメラーゼは実施例と請求の範囲に述べるが、他の無数のプロモーターとそれらの対応ＲＮＡポリメラーゼが技術上公知であり、同様に用いることができる。

ＤＮＡプライマー中に任意に含まれる“可変なサブセグメント”は１種以上の機能を果たす。第一に、プロモーター配列を含むプライマーでは、可変なサブセグメントは好ましくは、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼによって好ましい転写開始配列を含む。１７ヌクレオチドＴ７プロモ一ター共通配列の３゛末端に隣接して配置されるバクテリオファージエフ転写開始配列５’　−ＧＧＧＡ −３゛　はインビボ転写に重要であると考えられるが、３ＳＲ増幅中の転写にとって重要であるとは思われない。以下の実施例ＩＸはＴ７プロモーターの１７ｎｔ共通配列から電接下流の転写開始配列における突然変異（ヌクレオチド変化又は欠失）によって生ずる、増幅レベルに対する影響を示す。転写開始配列はプロモーター供給セグメントを有するプライマーにとって任意である。標的ハイブリダイゼーションセグメントに隣接するプロモーター共通配列の３′−モスト　ヌクレオチドを有するこのようなプライマーは、　転写開始配列　５°−ＧＧＧＡ −３′が存在する場合に得られるレベルに匹敵する高レベルの増幅を生ずることができる。しかし、プロモーター共通配列の３゛−モスト　ヌクレオチドに隣接する少なくとも１〜約４個のヌクレオチド、好ましくは４個のヌクレオチドのセグメントを含むことが好ましい。Ｔ７共通配列の３゛−モスト　ヌクレオチドに隣接する転写開始配列の部位に挿入するために好ましい配列の例は配列５’　− ＧＡＡＡ−３°である。

第二に、プライマーの全てに対して、可変なサブセグメントは特定の非標的セグメントを任意に含むことができ、それによって増幅からのＲＮＡ生成物は核酸ブローブハイブリダイゼーション分析において検出されることができる。実際に、数個の異なる標的セグメントに対して、それらの３′　−末端におけるそれらの認識（“非標的”又は“非標的補体“）セグメントにおいて異なるが共通の可変サブセグメントを含む数セットのプライマーを用いることによって、同時に増幅（及び分析）が生ずることができる。可変サブセグメントはポリリンカー配列をも含むことができ、ポリリンカー配列は好都合にはこの後のクローニングの容易さのために複数の制限部位を含む。さらに、可変サブセグメントは例えばＱβウィルスのような、自己複製可能なＲＮＡの配列を含むことができ、これはその対応レプリカーゼ（例えば、Ｑβレプリカーゼ）の存在下で、このような可変サブセグメントを有するＲＮＡ転写体を増加させ、自己複製させることができる。

特に、前記プライマーのハイブリッド形成（非標的又は非標的補体）配列へのプライマーのプロモーター配列の結合に関連した“機能的に結合した”なる用語は、本発明に増幅方法において合成され、プライマーを組み入れた、究極的な“二本鎖核酸鋳型“又は°ｃＤＮＡ”の機能性を意味する。このように作製されたｃＤＮＡは、プライマーのプロモーターセンス鎖セグメントが標的の補体として標的にハイブリッド形成するプライマー３′−セグメントに”転写のために機能的に結合する”場合に、プロモーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの存在ＦでＲＮＡ転写体を作製することができる。

ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖を作製するためのプライマー伸長反応は周知である。特にレトロウィルスからのリバーストランスクリプターゼはＤＮＡ依存性１）ＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供するために有用であることが知られている。

”ＲＮＡ５ｅＨ活性の高感度増幅−有効量”とは、適当なプライマー（ＲＮＡ標的セグメントの３ＳＲ増幅用）と、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性（及びそれらの基質）とを含み、後前の３酵素活性が作用する温度範囲においてインキュベートされる反応混合物において、前記ＲＮＡ標的セグメ：／トを２〜４時間内に少なくとも約１０５倍に増幅させることがてきるＲＮＡ５ｅＨ活性員を意味する。ここで用いる“ＲＮＡ５ｅ［（の高感度増幅−有効量”なる用語は、増幅前に反応媒質中に１〜ｉｏ、０００分子のレベルで（例えば、約０．０５〜約１ｍｌの反応量で）存在する核酸標的セグメントを、公知の核酸ハイブリダイゼーション分析方法を用いて、検出するための３ＳＲ反応において必要な増幅レベルを表すことを意味する。３ＳＲ増幅反応のために有効であるＲＮＡ５ｅＨ活性量は、ＲＮＡ５ｅＨ活性の“高感度増幅−有効量”未満であり、このような場合に、３ＳＲ増幅反応において、検出のために必要な増幅レベルが約１０２倍未満から約１０４倍までであるような濃度で存在する標的核酸セグメントを増幅させるために充分である。

レトロウイルスリバーストランスクリプターゼによって有されることが知られているＲＮＡ５ｅＨ活性がある一定の条件下でＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を小オリゴヌクレオチド（例えば、約５−１０塩基未満の長さのオリゴリボヌクレオチド）に消化させるが、ＤＮＡ鎖は完全なままで残すことが公知である。しかし、ここに関係する上記米国特許出願第２８５．４６７号に述べられている反応条件下で、リバーストランスクリブターゼに固有のＲＮＡ５ｅＨ活性は高感度３ＳＲ増幅を生ずるために不充分である。米国特許出願第２８５，４６７号に述べられている反応条件下で、大腸菌ＲＮＡ５ｅＨの添加はリバーストランスクリブターゼ１吾固有のＲＮＡ５ｅＨ活性を補助し、増幅前に約１０”ｍｏＩ　ｅ／ｍ１の濃度で存在する核酸標的セグメントの、核酸ハイブリダイゼーションによる、検出のために必要な３ＳＲ増幅レベルを可能にする。

４リポヌクレオシド三リン酸、ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰＳｒＣＴＰ及びｒＧＴＰはここでは集合的に“ｒＮＴＰｓ”又は“ｒＸＴＰｓ”と呼ばれる。

例えば放射能標識又は、発色体反応に触媒作用を及ぼす酵素を用いる発色手段のような、検出可能なシグナルを形成する方法は技術上周知であり、詳細に報告されている。

本発明は、その態様の一つにおいて、５゛　−末端ヌクレオチドを含み、標的セグメントの５°　−末端ヌクレオチドから３°　一方向に少なくとも９ヌクレオチドを伸長させる５゛−サブセグメントと、３゛−末端ヌクレオチドを含み、標的セグメントの３°　−末端ヌクレオチドから５゛一方向に少なくとも９ヌクレオチドを伸長させる、５°　−サブセグメントと重複しない３“　−サブセグメントとを含む、標的ＲＮＡ分子の標的ＲＮＡセグメントの３ＳＲ増幅方法（例えば、図２ａ、工程１を参照）であって、反応媒質中で下記要素：（ａ）（１）３ °　−末端ヌクレオチドを有し、５′　一方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サブセグメントを３゛−末端に含む一本鎖ＤＮＡである第１ＤＮＡプライマー（前記第１プライマーの前記第１サブセグメントは標的セグメントの３° 　−サブセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの３゛−サブセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる）：及び（２）３′−末端ヌクレオチドを有し、５゛　一方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サブセグメントを３′−末端に含む一本鎖ＤＮＡである第２ＤＮＡプライマー（前記第２プライマーの前記第１サブセグメントは標的セグメントの５°　−サブセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの５°　−サブセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる）：但し前記プライマーの少なくとも一方は第１プロモーターのセンス鎖を含むプロモーター供給サブセグメントをさらに含み、前記センス鎖は前記プロモーター供給サブセグメントを含むプライマーの第１サブセグメントに、前記２プライマーの伸長生成物を含むｃＤＮＡの前記第１プロモーターからの転写に関して、機能的に結合する、但し前記第１プライマーがこのようなプロモーター供給サブセグメントを欠く場合には、前記標的ＲＮＡセグメントの前記５′　−サブセグメントの５゛　−末端ヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子の５′−末端ヌクレオチドである：（ｂ）前記反応媒質中でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ５ｅＨ活性及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を示す、少なくとも２酵素（前記反応媒質中の前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは前記第１プロモーターからの転写に触媒作用を及ぼすことができる）（ｃ）Ｉ）ＮＡ依荏性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の基質として必要なヌクレオシド三リン酸。

をインキュベートすることを含み、前記反応媒質中の前記酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ５ｅＨ活性及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を供給することにおいて有効である温度範囲において前記インキュベーションが生ずる方法を含む。

本発明は、その態様のもう一つにおいて、５゛−末端ヌクレオチドを含み、標的セグメントの５゛−末端ヌクレオチドから３′　一方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する５゛−サブセグメントと、３°　−末端ヌクレオチドを含み、標的セグメントの３“−末端ヌクレオチドから５°　一方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する、５゛　−サブセグメントと重複しない３′　−サブセグメントとを含む、標的ＲＮＡ分子の標的ＲＮＡセグメントの、高感度で高生産性の２酵素３ＳＲ増幅方法（例えば、図２ａ、工程１を参照）であって、反応媒質中で下記要素＝（ａ）（１）３°　−末端ヌクレオチドを有し、５゛一方向に少な（とも９ヌクレオチド伸長する第１サブセグメントを３°　−末端に含む一本鎖ＤＮＡである第１ＤＮＡプライマー（前記第１プライマーの前記第１サブセグメントは標的セグメントの３′−サブセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの３ ′−サブセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる）：及び（２）３°　−末端ヌクレオチドを有し、５゛一方向に少な（とも９ヌクレオチド伸長する第１サブセグメントを３゛−末端に含む一本鎖ＤＮＡである第２ＤＮＡプライマー（前記第２プライマーの前記第１サブセグメントは標的セグメントの５゛−サブセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの５°　−サブセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる）：但し前記プライマーの少なくとも一方は第１プロモーターのセンス鎖を含むプロモーター供給サブセグメントをさらに含み、前記センス鎖は前記プロモーター供給サブセグメントを含むプライマーの第１サブセグメントに、前記２プライマーの伸長生成物を含むｃＤＮＡの前記第１プロモーターからの転写に関して、機能的に結合する、但し前記第１プライマーがこのようなプロモーター供給サブセグメントを欠く場合には、前記標的ＲＮＡセグメントの前記５′　−サブセグメントの５゛　− 末端ヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子の５°　−末端ヌクレオチドである。

（ｂ）（１）前記反応媒質中でＤ　Ｎ　Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮ　Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び高感度増幅−有効量のＲＮＡ５ｅＨ活性を示すリバーストランスクリブターゼ、及び（２）前記反応媒質中で前記第１プロモーターからの転写に触媒作用を及ぼすＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、及び代）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＩ）ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の基質として必要なヌクレオシド三リン酸；をインキュベートすることを含み、前記反応媒質中の前記酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮ　Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ５ｅＨ活性及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を供給することにおいて有効である温度範囲において前記インキュベーションが生ずる方法を含む。

３ＳＲ増幅方法は少なくとも１種のプロモーター供給プライマーを必要とし、このプライマーはプロモーターのセンス配列を有するセグメントを含むプライマーであり、該セグメントはプライマーの３゛　−セグメントに転写に関して機能的に結合し、これを通してプライマーは標的セグメント又は標的セグメントの補体とハイブリッド形成する。第１プライマーと第２プライマーとはここではそれぞれ“アンチセンスプライマー”と“センスプライマー”とも呼ばれる。アンチセンスプライマーはプロモーター配列を含むために好ましいプライマーであるが、本発明の説明から明らかであるように、アンチセンスプライマーとセンスプライマーとはそれぞれプロモーター配列を含むことができ、状況によっては、センスプライマーのみがこのようなプロモーター配列を含む場合にも増幅が進行する。

センスプライマーのみがプロモーターのセンス鎖を含む後前の実施態様は、５゛ −サブセグメントの５°　−末端ヌクレオチドが完全な標的ＲＮＡ分子の５゛− 末端でもあるＲＮＡ標的セグメントを必要とする。

３ＳＲ増幅中に安定に又は一時的に存在する種々な核酸を定義するために下付き文字を用いる。これらの下付き文字は次の意味を有する。“１“−一部１プライマーに付随する配列；　“２”−一部２プライマーに付随する配列；　“ｔ”− 電標的セグメントの一部；　”Ｃ”−電標的セグメントの一部に相補的な配列；　“ｒ”−−ＲＮＡ；及び“ｄ”−−ＤＮＡ０例えば、以下で（３゛　−サブセグメント１ａｄ）と名付けられるセグメントは、ＲＮＡ標的（１）セグメントの３゛−サブセグメント（すなわち、プライマー　ハイブリッド形成セグメント）に相補的（Ｃ）であるＤＮＡ　（ｄ）配列であり、このハイブリッド形成セグメントは（３°−サブセグメント１、）と名付けられる。

アンチセンスプライマーがプロモーターセンス配列を含む本発明の２−酵素３ＳＲ方法を次に説明する。下記説明は反応媒質中のＲＮＡ標的セグメントの存在を想定する。その後に、本発明の方法を適用すべきである生物学的サンプル又は池の核酸サンプル中に標的ＲＮＡセグメントが最初に存在しない状況に対しては、標的ＲＮＡセグメントと同じ配列を有するセグメントを含む二本鎖ＤＮＡからのＲＮＡ標的セグメントの作製（２゛　−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに置換し、ＴをＵに置換する）をも説明する。

図１に関しては、本発明による２−酵素３ＳＲ増幅は式■の標的ＲＮＡセグメントによって開始される：５’−（５°　−サブセグメント、）　−（中間サブセグメント、）−（３゛　 −サブセグメント、）　−３’■ （５゛　−サブセグメント、）なる名称のサブセグメントはＲＮＡ標的セグメントの５°−モストヌクレオチドを含み、それから３°一方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する、少な（とも１０ヌクレオチドを有する既知配列のＲＮＡセグメントである。（３゛　−サブセグメント８、）はＲＮＡ標的セグメントの３′ −モストヌクレオチドを含み、それから５゛　一方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する、少な（とも１０ヌクレオチドを有する既知配列のＲＮＡセグメントである。

（中間サブセグメント０、）は（５′−サブセグメント、）と（３°−サブセグメント１．）とに隣接する０個以上のヌクレオチドのＲＮＡセグメントである。

（中間サブセグメント、）がヌクレオチド０個である場合には、（５°−サブセグメント５．）の３°−末端が（３°−サブセグメント、）の５゛−末端に隣接する。

３ＳＲ増幅プロセスの第１工程は第１（アンチセンス）プライマーのＲＮＡ標的（３゛　−サブセグメント１．）の３°　−サブセグメントとのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成するために鋳型として標的ＲＮＡを用いるリバーストランスクリブターゼのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によるその伸長とを含む。このようにして形成されたＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖は少なくとも（５゛　−ザブセグメント、）の５′−末端ヌクレオチドまで伸長する。図２ａ。

工程３を参照のこと。

第１プライマーは式ＩＩの核酸セグメントを含む一本鎖ＤＮＡである：５’−（プロモーター、、）　−（可変サブセグメント、ｄ）−（３′　−サブセグメンｌ−，，，）　−３’Ｉ（プロモーター８．）なる名称のセグメントは、好ましくはバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターである、第１プロモーターのセンス鎖の配列を有する一本鎖ＤＮＡセグメントであり；（３゜ −サブセグメント、ｃ６）は（３゛−サブセグメント、、）と同数のヌクレオチドを有し、（３゛−サブセグメント、）に充分に相補的である配列を有し、標的ＲＮＡとハイブリッド形成し、鋳型として標的ＲＮＡを用いて伸長反応を開始させる一本鎖ＤＮＡセグメントであり：　（可変サブセグメント１．）は（プロモーター１ｄ）の３′　−末端ヌクレオチドに隣接する、０〜５０ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡセグメントである。前記（可変サブセグメント１．）がヌクレオチド０個である場合には、プロモーターセンス鎖、（プロモーター１．）の３゛　 −末端は前記（３°　−ザブセグメント、３．）の５゛　−末端に隣接する。（可変サブセグメントＩｄ）は、例えば、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼによって認識されるネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）の転写−開始セグメントを白むことができる：バクテリオファージエフポリメラーゼの場合には、この転写 −開始セグメントは配列５°　−ＧＧＧＡ−３’　を有する。現在（ｐｒｅｓｅｎｔｌｙ）好ましい転写−開始セグメントは配列５’　−ＧＡＡＡ−３’　を有する。

本発明の改良反応媒質はリバーストランスクリプターゼの固有ＲＮＡ５ｅＨ活性の表現を可能にするので、このような反応媒質は本発明の２−酵素３ＳＲ増幅方法を可能にする。リバーストランスクリブターゼのこの固有ＲＮＡ５ｅＨ活性はＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を分解して、式ＩＩＩのＤＮＡセグメントを含む第１相補的ＤＮＡ鎖を生ずる。

５゛−（プロモーター＋ｄ）　（可変サブセグメント、、）　−（３°　−サブセグメント、、）　−（中間サブセグメント、、、）　−（５°　−サブセグメンｌ−，ｃｄ）　−３’ ＩＩセグメント（中間サブセグメンＩ−，ｃ、）と（５゛−サブセグメントｅ、）とはそれぞれ、（中間サブセグメント０．）と（５°−サブセグメント１．）とに相補的なりＮＡ上セグメントある。セグメントは（プロモーター７．）、（可変サブセグメント１．）及び（３°−サブセグメント０．）は式ＩＩで定義される。

ＲＮＡ標的セグメントが長さにおいてＲＮＡ標的セグメントに同じでない場合に、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖は３°　−サブセグメントから３′一方向に伸長する標的及び／又は−末鎖ＲＮＡ配列の５゛−サブセグメントを越えて５゛　一方向に伸長する（ＲＮＡ鎖に比べて’）ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖セグメントを含むことができる。

第２ＤＮＡプライマー（“センスプライマー”）は−末鎖第１相補的ＤＮＡとハイブリッド形成し、この第１相補的ＤＮＡにおいてプライマー伸長反応を開始させる。第２ＤＮＡプライマーは少なくとも１０ヌクレオチドの配列を含む一本鎖ＤＮＡであり、式ＩＶ（プロモーターなしプライマー）又は式ＩＶ（ａ）、プロモーター含有プライマーに対応する：５゛−（可変サブセグメント２．）　−（５’−サブセグメント、）−３’Ｖ５′−（プロモーター２．ｌ）　（可変サブセグメント２−）　（５°　−（５ °−サブセグメント５．）なる名称のセグメントは、第１相補的ＤＮＡ（（５′ −サブセグメント、Ｃ，）において）とハイブリッド形成し、鋳型として式ＩＩＩの第１相補的ＤＮＡを用いてプライマー伸長反応を開始させるために、（５゛　−サブセグメント、）の配列に充分に相同である配列を有するＤＮＡである。

（可変サブセグメント２．）なる名称のセグメントは（５′　−サブセグメント１、）の５゛　−末端に隣接するＯ〜１００ヌクレオチドのセグメントである。

第２プロモーターセンス配列は（プロモーターｚｄ）と呼ばれる。（可変サブセグメント１．）なる名称のセグメントと同様に、（可変サブセグメント３ｄ）は第２プロモーターセンス配列から成ることができ、第２プロモーターセンス配列は存在するならば第１プロモーター配列と同じであっても異なるものでもよい。

第１プロモーターと第２プロモーターとが異なる場合に（すなわち、第１プロモーターと第２プロモーターとが同じＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されない場合に）、反応媒質は任意に、第２プロモーターを認識する第２ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。

（可変サブセグメント２．）なる名称のセグメントが式ＩＶのプロモーターなしセンスプライマーの任意のセグメントである限り（このようなサブセグメントの封入が例えばハイブリダイゼーション分析のための非標的セグメントを形成するために望ましいことが理解されるとしても）、プロモーターなしセンスプライマーを用いる本発明の実施態様に関する以下の説明から、この任意セグメントを省略する。

リバーストランスクリプターゼのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は鋳型として第１相補的ＤＮＡを用いて第２プライマーを伸長させて、ＲＮＡ標的セグメントの補体である（すなわち、標的セグメントの配列に正確に相補的な配列を有する）ｃＤＮＡに転写に関して機能的に結合したプロモーターを含む第に末鎖ｃＤＮＡ（以下ではｃＤＮＡ　Ｉ）を形成する。図２ａ、工程６を参照のこと。

ｃｌ）ＮＡは上記で式ＩＩＩにおいて定義したような、第１相補的ＤＮＡ鎖と、式■又は式Ｖ　（ａ）のＤＮＡを含む第２相補的ＤＮＡ鎖とを含む５’　−（５ °−ザブセグメント、）−（中間サブセグメントｄ）−（３゛　−サブセグメント、）　−（可変サブセグメント１ｉｄ）−（プロモーター＋−）　３゜５゛−（プロモーター２，１）＝（可変サブセグメント２ｄ）　（５°−サブセグメンｌ−，，）　−（中間サブセグメント、）　−（３°−サブセグメント、、）　−（可変サブセグメント１ｅｄ）−（プロモーター、、、）　−３’ Ｖ　（ａ）セグメント（中間サブセグメント、）、（３゛−サブセグメントｄ）、（可変サブセグメント１９．）及び（プロモーター１ｅｄ）は、それぞれ（中間サブセグメント、。６）、（３°−サブセグメント。、）、（可変サブセグメンｌ”＋− ）及び（プロモーター、６）に相補的であるセグメントである。セグメント（プロモーター２．ｌ）、（可変サブセグメント２．）及び（５°　−サブセグメント、）は式［ＶとＩＶ　（ａ）と同様に定義される；第１及び第２相補的ＤＮＡ鎖から成るｃＤＮＡ　Ｉは第１プロモーターから、対応ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの存在下で転写されて、式Ｖｌ又は式Ｖｌ（ａ）のＲＮＡ転写体の多重コピーを作製する（図２ｂ、工程７を参照のこと）５ ′−（可変サブセグメント、、）　−（３°−サブセグメント１ｃＴ）−（中間サブセグメント。、）　−（５’　−サブセグメント、、）−３゜Ｉ５゛−（可変サブセグメント、、）　−（３’−サブセグメント１ｅｔ）−（中間サブセグメント。、）　−（５’　−サブセグメント１．）−（可変サブセグメント、、、）　−（プロモーター２−１）　３’Ｖｌ（ａ）セグメント（可変サブセグメント０．）は（可変サブセグメント１．ｌ）に対応するＲＮＡセグメントである：セグメント（３′−サブセグメント、ｅ、）、（中間サブセグメントｅ７）、（５′−サブセグメント、ｅ、）、（可変サブセグメント、Ｃ１）及び（プロモーター２ｅ、）はそれぞれ、（３′−サブセグメント、）、（中間サブセグメント、）、（５゛−サブセグメント、）、（可変サブセグメント２．）及び（プロモーター２．）に相補的である。

式Ｖｌ又は式ＶＩ（ａ）のＲＮＡ転写体の多重コピーの各々はそれぞれ、式■■ 又は式ＩＶ（ａ）の第２プライマーとハイブリッド形成することができ、ＤＮＡ −ＲＮＡ二本鎖を形成するためのプライマー伸長反応の鋳型として機能することができる。図２ｂ、工程８と９を参照のこと。リバーストランスクリプターゼの周ｑＲＮＡｓｅＨ活性はＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ転写体鎖を消化して、式Ｖｌｌ又は式ＶＩＩ（ａ）の第３相補的ＤＮＡを一本鎖にする：５’−（５°− ザブセグメントイ）−（中間−サブセグメントイ−（３′　−サブセグメント、、）　−（可変サブセグメント、ｅ、）　−３’ｌ１５°　−（プロモーター２．）　−（可変サブセグメント２−）　（５’　−ザブセグメント、、ｌ）　−（中間サブセグメント、、）　−（３’　−サブセグメント、、ｌ）　−（可変サブセグメント、、、ｌ）　−３’Ｖｌｌ（ａ）各セグメントは上記式Ｖ又は式Ｖ　（ａ）と同様に定義される。

次に、式ＴＩの第１プライマーはこの第３相補的ＤＮＡ鎖とハイブリッド形成し、伸長して、第４相補的ＤＮＡを形成する。図２ｂ、工程１２を参照のこと。

第４相補的ＤＮＡは式ＶＩＩＩ又は式ＶＩＩＩ（ａ）のセグメントである：３’ 　−（５”　−サブセグメント、、、）　−（中間−サブセグメント１ｅｄ）− （３′　−サブセグメント、、、）　−（可変サブセグメント１．）−３°　− （プロモーター２−）　（可変サブセグメントｚ−）　（５’　〜サブセグメント、、、）　−（可変サブセグメント１．）−各セグメントは上記式ＩＩＩと同様に定義される。第４相補的ＤＮＡのオーバーハンギング（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ）末端、プロモーターコード（ｅｎｃ。

ｄｉｎｇ）配列は第３相補的ＤＮＡの伸長のための鋳型として作用し、式ＶＩＩの第３相浦的Ｉ）　Ｎ　Ａ鎖と式Ｖｌｌｌの第４相補的鎖（又は式ＶＩ［（ａ）と式ＶＩＩＩ（ａ））から成るｃＤＮＡＩＩ（式Ｘ）を完成させる。

本発明の上記実施態様において、転写はアンチセンス転写体くアンチセンスプライマーのみがプロモーターセンス鎖を含む）又はセンス転写体とアンチセンス転写体の両方（各プライマーがプロモーターセンス鎖を含む）を生ずる。

センス転写体は式ＩＸで示される５′−（可変サブセグメント２．）　（５’　−サブセグメント、、）　−（中間サブセグメント、、）　−（３°−サブセグメント、、）　−（可変サブセグメンｈ−１）　（プロモーター＋−７）　３’Ｘ（５′−サブセグメント、）、（中間サブセグメント０．）及び（３゛　−サブセグメント１．）なる名称のセグメントは、式ＩのＲＮＡ標的セグメントと同じであ　。

るか又は実質的に相同である。セグメント（可変サブセグメント、ｅ、）と（プロモーター、ｅ、）はそれぞれ、（可変サブセグメント、４）と（プロモーター、６）に相補的なＲＮＡ配列である。

アンチセンス転写体は鋳型としてアンチセンス増幅ループに再び入り、ｃＤＮＡ　ＩＩの付加的コピーを作製する。図２ｂ、工程７〜１２゜式ＩＸのセンス転写体は上記アンチセンス増幅ループに類似した、不連続センス増幅ループに入る。

簡単には、センス転写体の多重コピーの各々はそれぞれ、式ＩＩの第１プライマーとハイブリッド形成することができ、リバーストランスクリブターゼの固有ＲＮＡ５ｅＨ活性によって一本鎖にされる、第１５相補的ＤＮＡを含むＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成する伸長生成物のための鋳型として機能することができる。図２ｂ、工程７ａ〜１０ａを参照のこと。式ＩＶ　（ａ）の第２プライマーはこれとハイブリッド形成し、伸長して、式ＶＩＩ（ａ）とＶｌｌＩ　（ａ）のＤＮＡ鎖から成るｃＤＮＡ　ＩＩに同じである二本鎖ｃＤＮＡを形成する。ｃＤＮＡ　ＩＩはその各末端に完全二本鎖プロモーターを有する（図２ｂ。

工ｆｕｌｉａ〜１２）。転写は２ＤＮＡ鎖の各々から進行し、センス転写体（すなわち、標的セグメントの配列を有するセグメントを含む転写体）とアンチセンス転写体（すなわち、標的セグメントの配列に相補的な配列を有するセグメントを含む転写体）との多重コピーを作製して、２相補的増幅ループに供給する。

上記反応サイクルによって標的セグメントを含むＲＮＡの１個以」二の分子が２時間以内に増幅されて、熱サイクリング又は酵素の反復添加を必要とせずに、標的セグメント又はその補体の配列を含むセグメントを有するＲＮＡ転写体１０６コピー以上を生ずる。本発明の改良反応媒質中で実施される本発明の３ＳＲ反応は、必要な４酵素活性を供給するために、リバーストランスクリブターゼとＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの２酵素のみを必要とするに過ぎない。

プロセスの上記説明は段階的であるが、実際には、種々な工程の全てが非常に複雑な、高度に相互作用式に同時に生ずることは理解されるであろう。

上記増幅機構はプロモーター供給セグメント（すなわち、プロモーターセンス配列を含む）を含むアンチセンスプライマーを用いるが、センスプライマーがプロモーター供給セグメントを含み、アンチセンスプライマーが含まない場合にも３ＳＲ増幅を実施することができる。この実施態様では、ＲＮＡ標的分子は５′一方向にＲＮＡ標的セグメントの５゛　−ヌクレオチドを越えて伸長すべきではない（すなわち、（５′　−サブセグメント２．）なる名称のサブセグメントの５ ″−ヌクレオチドは標的分子の５′−ヌクレオチドであるべきである）。標的セグメントの５°−末端ヌクレオチドが完全標的ＲＮＡ分子の５゛　−末端ヌクレオチドである場合には、増幅は図２ａと２ｂに示した工程に類似した］工程によって進行するが、作製される転写体は工程７ａ〜１２によって示される増幅ループに直接入るセンス転写体である。アンチセンス転写体は作製されない。

ＲＮＡ標的分子の５°　−末端ヌクレオチドがＲＮＡ標的セグメントの５゛−末端ヌクレオチドであることを保証する１方法は、ＲＮＡ標的分子の５°　−末端に存在する、所定核酸配列のＲＮＡ標的セグメントを増幅することである。このようにして、プロモーター供給センスプライマーのために適当な配列を供給することができる：例えば、適当なセンスプライマーは、ＲＮＡ標的分子の５゛−末端ヌクレオチドを含み、それから３゛　一方向に１９ヌクレオチド伸長するＲＮＡ標的分子の５゛　−末端における例えば２ｏヌクレオチドセグメントに相同な配列を有するセグメントに、転写に関して機能的に結合したプロモーターセンス鎖を有するＤＮＡセグメントを含む。アンチセンスプライマーは標的セグメントの３′−末端におけるセグメントに相補的である配列を有するＤＮＡセグメントから成る。

ＲＮＡ標的分子の５°　−末端ヌクレオチドが標的セグメントの５′−末端ヌクレオチドであるという限定を満たすＲＮＡセグメントを供給する第２方法は、標的配列をコードするＤＮＡセグメントから、ＴＡＳ増幅サイクルを実施することによって、このようなＲＮＡ標的分子を作製することである。従って、適当な標的ＲＮＡセグメントは標的配列をコードすることが知られている二本鎖ＤＮＡ（又は−末鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ）から得ることができる。例えば、二本鎖ＤＮＡが問題の標的セグメントをコードする場合には、第１ＤＮＡプライマーと第２ＤＮＡプライマーとを反応溶液に加え、この溶液を約９４℃〜１ｏｏ℃に１分間加熱し、次に１分間かけて４２°Ｃに冷却する。この加熱と４２℃での保持は、溶液の組成と共に、第１プライマーと第２プライマーとを前記二本鎖ＤＮＡの相補的２鎖にハイブリダイゼーションするために充分な緊縮条件と、プライマー伸長反応を開始させるための充分な安定性条件とを与える。リバーストランスクリプターゼ又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（及び、予め添加しない場合には、必要なヌクレオシド三リン酸）を加えて、伸長反応を重合させる。サーマス　アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１２７．１５５０　（１９７６）参照）、Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏｒｐ、米国、オハイオ州、クリーブランドからの５ｅｑｕｅｎａｓｅ”ブランド組換え体Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の周知のフレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及びウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼ　アルファを用いることができる。

核酸を含む溶液を再び１００℃に１分間加熱し、４２℃に１分間かけて冷却すると、この工程中に第１プライマーと第２プライマーとが先行（ｐｒｉｏｒ）プライマー伸長反応の伸長生成物とハイブリッド形成する。２−酵素３ＳＲの場合には、次にリバーストランスクリブターゼとＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとを加えて、ハイブリッド化プライマーが伸長してｃＤＮＡ合成を完成させ、このｃＤＮＡが転写されて、標的ＲＮＡ転写体を作製するようにする。これによって、３ＳＲ増幅が開始される。

このようなＴＡＳ増幅サイクルによって形成される標的ＲＮＡセグメントは用いる２種プライマーによって画定されるその５゛　−末端と３゛−末端とを有する。

それ故、このようなＲＮＡはＲＮＡ標的分子の５°−末端ヌクレオチドが標的ＲＮＡの５゛　−サブセグメントの５゛−末端ヌクレオチドであるという必要条件を満たす。しかし、このようなＴＡＳ増幅方法が３ＳＲ増幅に適したＲＮＡ標的セグメントの作製に、プライマーがプロモーター配列を有するか否かに関係なく、実際に常に使用可能である。実施例ＴＩを参照のこと。

本発明の好ましい実施態様では、問題の核酸の増幅可能な標的セグメントが少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少な（とも約５０ヌクレオチドを含む（中間サブセグメント、）を有し、任意に、第３及び第４ＤＮＡプライマーを用いて、さらに改良された増幅方法で（中間サブセグメント１．）を増幅させる３ＳＲ増幅の第２ラウンドを可能にする。また、（可変サブセグメント）が検出のために用いることができる非標的セグメントを有さない場合には、（中間サブセグメント１、）を核酸ハイブリダイゼーション分析による３ＳＲ作製転写体の検出に用いることができる。

本発明はその態様の幾つかにおいて、２酵素、レトロウイルスリバーストランスクリプターゼとＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがそれらだけで、リバーストランスクリプターゼ以外のＲＮＡ５ｅＨ活性の外因性供給源の不存在下で、ＲＮＡ　ｓ　ｅ　Ｈ活性の高感度増幅有効量を必要とする高感度３ＳＲ増幅のために必要な４酵素活性を供給することができるという発見を含む。リバーストランスクリプターゼの内因性ＲＮＡ５ｅＨ活性を強化するこのような方法の一つは、例えば塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等のようなマグネシウム含有塩　約２０〜４０ｍＭ：例えばＫＣＩ又はＮａＣｌ等のような塩化アルカリ金属　約１〜２５ｍＮ１１例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、β−メルカプトエタノール等のようなスルフヒドリル還元剤　約０〜２０ｍＭニスペルミジン　約０〜１０ｍＭ；リボヌクレオシド三リン酸　約１〜８ｍＭ：２’　−デオキシリボヌクレオシド三リン酸　約１１１Ｍ〜８ｍＭ：例えばジメチルスルホキシドのようなスルホキシド化合物　約Ｏ〜２５容量％を含む反応媒質中で反応を実施することを含む。

好ましい反応媒質は下記成分：ＭｇＣ１２２０〜４０ｍＭＫＣｌ　１〜２５ｍＭスペルミジン　１〜１０ｍＭＤＴＴ　１〜２０ｍＭｒＮＴＰｓ　１〜７ｍＭｄＮＴＰｓ　１０１〜２ｍＭジメチルスルホキシド０〜１５％（容量）と、前記反応媒質が約７．５〜約８．５のｐＨ１好ましくはｐＨ８，１を有するように適当な緩衝液（Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓｌ等）とを含む。ＡＭＶリバーストランスクリブターゼがＲＮＡ５ｅＨの供給源である場合には、ＤＭＳＯが必要である。本発明の前には、３ＳＲ反応は、約１０３より大きい増幅レベルが望ましい場合に、例えばＡＭＶリバーストランスクリブターゼとＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのような、レトロウイルスリバーストランスクリプターゼのみを必要な４酵素活性の供給源として用いることは支持できないと考えられていた。改良された反応媒質が意外にもレトロウイルスリバーストランスクリプターゼの固有のＲＮＡ５ｅＨ活性を、例えば大腸菌ＲＮＡ５ｅＨのような、他のＲＮＡ５ｅＨ活性供給源の不存在下でも、このような３ＳＲ増幅レベルを支持するように機能させることが本発明者によって判明した。

このような反応媒質に約１〜約２５重量％のヒドロキシル含有化合物を補充すると、達成可能な増幅レベルが意外に増加することも本発明者によって判明した。

ヒドロキシル含有化合物には、限定する訳ではなく、例えばメタノール、エタノール、プロ／！ノール、イソプロパツール、ブタノール、イソブタノール等のようなＣｌ　Ｃｌ。アルコール：例えばエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、及び水溶性であり、約２０．０００ダルトンまでの平均分子量を有するポリエチレングリコールのようなグリコール；例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラフィノース等のような、単糖、三糖及び三糖類：及び例えばソルビトール、グリセロール、グルシトール、マンニトール、イノシトール等のような糖アルコールがある。

それ故、本発明の改良反応媒質は好ましくは、下記化合物の１種以上を含む：（ｉ）Ｃｌ　Ｃｏｏアルコール；　（ｉｔ）式　ＨＯＣＨ２（ＣＨＯＨ）、ＣＨ２０Ｈの化合物［式中、ＸはＯ〜２０である］で示される化合物：　（ｔｉｔ）式：Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）　−ＯＨ［式中、ｎは２〜６００である］で示され、平均分子量約１゜０００〜約２０．０００、好ましくは約６．０００〜約１０，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール又はこのような化合物の混合物：及び（ｔｖ）単糖、三糖及び三糖類並びにこれらの誘導体から成る群からの糖。上記式の好ましい化合物はエタノール、グリセロール、ソルビトール、スクロース及びＰＥＧ−ｓｏｏｏを含む。以下の幾つかの実施例は２−酵素３ＳＲ又は３−酵素３ＳＲによって達成可能な増幅レベルに対するスルホキシド及びヒドロキシル含有化合物の効果を示す。

リバーストランスクリブターゼ（ＲＴ）の最も好ましいものは、５゛　→３゛エキソヌクレアーゼ活性を有さないＡＭＶリバーストランスクリプターゼ、組換え体ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ及びＨＩＶ−１リバーストランスクリブターゼである。

２−酵素３ＳＲ１：ＡＭＶリバーストランスクリブターゼを用いる場合には改良反応媒質に式　Ｒ＋　（Ｓｏ）　Ｒ２［式中、Ｒ１とＲ２は独立的にＣ，−Ｃ，アルキルであるか、又はＲ６とＲ２は飽和環状部分の一部として結合されることができる］のスルホキッド化合物を添加すべきである（好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０容量％）が、ＭＭＬＶｌｌ（ＩＶ−１又はその他のレトロウィルスに由来するリバーストランスクリブターセを用いる場合には、このようなスルホキッド化合物を省略することができる。

改良反応媒質は大腸菌ＲＮＡ５ｅＨの存在下で実施される３ＳＲ反応の増幅レベルをさらに改良する。再び、ＤＭＳＯ又はその他のスルホキシド含有化合物を用いて、ＡＭＶリバーストランスクリプターゼを用いるこのような３−酵素３ＳＲ反応のにおける増幅レベルを高めることができる。

本発明の２−酵素３　Ｓ　Ｒ反応にＭＭＬＶリバース１−ランスクリプターゼを用いる場合に、反応媒質に０．　１〜１０ｍ〜１のＭｎＣｌ２又は同様なマンカン化合物を添加すべきである。

２−酵素３ＳＲには、本発明の改良反応媒質中のｒＮＴＰ濃度は最も好ましくは約６ｍＭであるべきであるが、３−酵素３ＳＲにはこれより低濃度の改良反応媒質中のｒＮＴＰｆｉ度を用いることもできる。改良反応媒質中でｒＮＴＰレベルを４ｍＭから６ｍＭまで高めると、より低いｒＮＴＰａ度が太きくモル過剰の基質を示すとしても、１０倍以上までの増幅レベルの予想外の増加が得られる。約８ｍＭ又は９ｍＭより大きいｒＮＴＰａ度は２−酵素３ＳＲ反応で得られる増幅レベルを減する傾向がある。

以下の実施例ＩＩＩは本発明の改良反応媒質の２−酵素３ＳＲを支持する能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を実証するが、３−酵素３ＳＲを支持すると報告される先行技術反応媒質の同能力は実証しない。

現在、２−酵素３ＳＲ反応において増幅反応（１００μｌ）につきＡＭＶリバーストランスクリブターゼ約１０単位とＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ２０単位とを用いることが好ましい。興味深いことに、３−酵素３ＳＲ増幅は大腸菌ＲＮＡ５ｅＨのみを必要とするのではなく、有意に高濃度のリバーストランスクリプターゼ（３０単位）とＲＮＡポリメラーゼ（６０〜１００単位）をも必要とする。

標的セグメントの長さに関しては、１５００未満ヌクレオチドのプライマー間距離が、恐ら＜３ＳＲ反応実施に対するストリンジエンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）が無いために、好ましい。一般には、２−酵素又は３−酵素方法を用いて、反応媒質に約１〜約２５重量％のアルコール又はポリヒドロキシ化合物を加える場合に約２００ヌクレオチドより長い長さの標的セグメントがより効果的に増幅される。本発明の改良反応媒質に式　ＨＯＣＨ２（ＣＨＯＨ）えＣＨ，ＯＨ［式中、Ｘは０〜２０、より好ましくはＸは０〜５である］で示される糖アルコール約５〜約１５重量％を加えることが特に好ましく、最も好ましくは、化合物がソルビトール又はグリセロールである。

２−酵素３ＳＲ増幅を実施するための本発明の好ましい反応媒質は、下記成分を含む水溶液である緩衝液：　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，１，４０ｍＭＭｇＣ＋２．３０ｍＭＫＣｌ、２ＱｍＭＤＴＴ、ｌＱｍＭスペルミジン、４ｍＭヌクレオチド：　ｒＮＴＰ、５ｍＭｄＮＴＰ、１ｍＭプライマー・１５塩基標的結合領域を含むセンスプライマー　０．２５℃１ｇ；及びプロモーター配列（約２０塩基）に機能的に結合した１５塩基標的結合領域を含むアンチセンスプライマー　０．２５μｇ酵素：ＡＬｉＶリバーストランスクリプターゼ、１０単位／反応溶液１００μｍ（反応溶液は１０％ジメチルスルホキノド（ＤＭＳＯ）と１５％ソルビトールを含む）又は〜ｊＭＬＶリバーストランスクリブターゼ、１０００単位／反応溶液１００　ｔｌｌ（反応溶液は１ｍＭ　ＭｎＣｌ２と１５％ソルビトールとを含む）及びＴ　７　ＲＮ　Ａポリメラーゼ、２０単位／反応溶液１００μ１２−酵素又は３−酵素３ＳＲ増幅中の反応混合物の温度も達成される増幅レベルに対する明白な効果を有する。増幅は約り℃〜約５０°Ｃの温度において実施されるが、より好ましくは約３７°Ｃ〜約４７℃において、最も好ましくは約４２℃において増幅が実施される。本発明の２−酵素３ＳＲ方法において反応温度は特に重要であり、４２℃ における増幅は３７℃におけるよりも約１００倍効果的である。また、ＡＭＶリバーストランスクリブターゼを用いる場合に例えばソルビトール、グリセロール、エタノール等のようなアルコールもしくはポリヒドロキシル含有添加剤と、付加的にＤＭＳＯ等のスルホキシド化合物との存在下で、増幅速度は４２℃〜４５ °Ｃの温度範囲では２〜３倍大きくなる。

３　Ｓ　Ｒ反応は一方の増幅ループでは他方の増幅ループにおけるよりもより効果的である。それ故、センスプライマーとアンチセンスプライマーの両方がプロモーターコードセグメントを含む場合には、恐ら＜ｃＤＮＡの二本鎖プロモーターセグメントから下流の配列が転写速度に有意な効果を及ぼすために、センス生成物又はアンチセンス生成物のいずれかが優勢になる。

本発明は、そのもう一つの態様において、連鎖伸長反応を開始させることができるプライマーであって、プロモーターのポリメラーゼ結合部位のセンス鎖を有する（好ましくはプロモーターの共通配列の配列を有する）セグメントの５°　− モスト　ヌクレオチドに隣接し、それから５゛方向へ伸長する少な（とも１〜１０ヌクレオチドを有するプロモーターセンス鎖を含むプライマーに関する。本発明者は、プロモーターセンス鎖を有するプライマーのプロモーター供給セグメントの長さと配列とが３ＳＲの増幅レベルに明白な影響を及ぼすことを意外にも発見した。プロモーター共通配列の５′−ヌクレオチドによってそれらの５゛−末端において切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）プライマー（すなわち、プライマーの５゛　−末端が共通配列の５′−モスト　ヌクレオチドである）が本発明の改良反応媒質中で４２℃において１時間内に約１０５倍未満の増幅を示すことが判明した。技術上理解されているように、プロモーターは幾つかの部分を有する。

第一に、これは転写の開始時にポリメラーゼが結合する二本鎖ＤＮＡのセグメントであるポリメラーゼ結合セグメントを有する。プロモーターは転写に作用する少なくとも一つのポリメラーゼ結合セグメントを有さなければならない。共通配列は転写開始プロセスにおいてＲＮＡポリメラーゼの結合のために必要である、完全に二本鎖形の必要最小限の配列であると考えられる。任意に、ここで転写開始配列と名付けるセグメントを共通配列に直接隣接して（下流で）含むことが望ましい。Ｔ７プロモーターの共通配列をここに開示する。他のプロモーター共通配列は技術上周知である。例えば、Ｔ３共通配列のセンス鎖は５′−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ−３°であり、Ｔ３転写開始配列は５’　−ＧＧＧＡ− ３°である。また、ＳＦ３　プロモーターの２形式（ｖｅｒｓｉｏｎ）が周知である。ＳＰ６プロモーターのセンス鎖の共通配列（形式１）は５’　−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡ−３°であり、ＳＰ６プロモーターのセンス鎖の共通配列（形式２）は５’−ＡＡＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡ−３’であり；ＳＰ６プロモーターの形式１と２の両方の転写開始配列は５’　−ＧＡＡＧ−３ °である。標的セグメントの初期濃度が１００μｌアリコート中約０．０１〜１ ×１０”ｍｏ　ｌの濃度範囲一この濃度は疾病状態に特徴的な、例えばＨＩＶ− １ウイルスもしくは欠陥遺伝子の存在を検出するために通常の濃度である場合に、このような増幅レベルは標準核酸ノゾブリダイゼーション分析によって検出可能ではない。しかし、プロモーター共通配列の５゛−末端に隣接する１個程度の付加的ヌクレオチドを有するプロモーター供給プライマーは意外にも増幅において約１０倍の増加を示す、共通配列の５゛−末端に加えられた４−ヌクレオチド配列までの各付加的ヌクレオチドに対して、付加的な７倍〜１０倍の増加が達成される。

プロモーター共通配列に関して、オリゴヌクレオチドをその５°　−末端から４ヌクレオチドより大きく】０ヌクレオチドまで伸長させると、次の表に示すように、１〜４ヌクレオチドによって達成されるレベル以上に増幅が改良される。

次の表はＤＮＡプライマーのプロモーターセンス配列から上流の（５′　一方向に）長さとヌクレオチド配列とを調節した後に得られる３ＳＲ増幅レベルに関する予想外の結果を示す。

Ｔ７プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５′−末端のヌクレオチド配列の３ＳＲ増幅に及ぼす影響オリゴヌクレ配列長さ　増幅ＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　３．１Ｘ１０’８８−３４７　２　５６　＾訂ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴ＾ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾　１．９ｘｉｏ’９０− ５７８　３　５６　ＧＡＴＴ乃暉卯ＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　６．５Ｘ１０’９０−５７５　４５６　ＧＣＴ夏ハＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾　２．８Ｘ１０’９０−５７７　５　５６　ＧＣＧＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴ＾ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　５．５ＸｌＯ’９（１−５７４６５６ＧＣＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡσ醪へＧＧＧＡＴＧＴ＾ＣＴＡＴＴ＾ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾　１．　ｌＸｌ０’９０−４２７　７　５５　＾ＴＴＴＡ　ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴ＾ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　１．２Ｘ１０’９０− ４２８　８　５４　ＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴ＾ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　５．５Ｘ１０’９０−５７６　９　５４　ＧＴＴ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾　２．５Ｘ１０ ’ＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾　２．　ｌＸｌ０’９０−４２９　１１　５３　ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴ＾ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾　１．　ｌＸｌ０’９０−２０５　１２　５２　Ｔ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　＜１０’９０− ２０６　１３　５１　ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾　＜１０５１）、コード鎖配列を示す。下線を施した配列は標準１７ｎｔＴ７プロモ一ター配列に相当し、ＲＮＡ転写開始は＋１によって示す。配列ＧＧＧＡは１７配列からであり；前方への＋５ヌクレオチドはＨＩＶ−１配列であり；それに続く配列は各オリゴヌクレオチドで同じである。オリゴヌクレオチドを一直線に並べると、プライマー間の差異が示される。

２）、０．０５Ｘ１０−”ｍｏｌｅ　（＝１，０００分子）のＨＩＶ　ＲＮＡ標的と、３０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼと、２Ｕの大腸菌ＲＮＡ５ｅＨと、１５ＵのＡＭＶ　ＲＴと、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，１と、３０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚと、２０ｍＭ　ＫＣＩと、１０ｍＭ　ＤＤＴと、４ｍＭスペルミジンと、１ｍＭｄＸＴＰと、７ｍＭ　ｒＸＴＰと、０．１２５μｇのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む５０μｌ中で４２℃において、３ＳＲ反応を１〜２時間実施した。

同じコンパニオンプライマー、８９〜２５５（配列番号１４）（５°ＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＡ３’　）（Ｒａｔｎｅｒ等、１９８５）をこの表に挙げた各プライマーに用いた。作製されたＲＮＡ生成物は２１４ヌクレオチド長さである。増幅された標的を、キャプチャーオリゴヌクレオチド８６−２７３を含むビーズ　２５ｍｇとオリゴヌクレオチド８７− ８１の３２ｐ＝標識検出　１０１００ｆ　Ｉ　ｅとを用いるビーズベースド　サンドイッチ　ハイブリダイゼーション（Ｂ　Ｂ　Ｓ　Ｈ）によって定量した（Ｇｕａｔｅｌｌｉ等、１９９０）。８８−３４７を除いた全ての増幅値は、２回の３ＳＲ反応の平均であり、これらの増幅反応の各々は２回のＢ　Ｂ　Ｓ　Ｈ反応によって分析した。８８−３４７によって実施した３ＳＲ増幅は６回の３ＳＲ反応の平均を表す。

上記条件下で実施した増幅は、Ｔ７共通配列の５゛　−末端に、共通配列の５゛ −モスト　ヌクレオチドに隣接する少なくとも１個のヌクレオチドが配されない場合に、増幅が１０５倍より大きいレベルで検出されないことを示した。共通配列の５゛　−末端ヌクレオチドに隣接する１〜１０ヌクレオチド、好ましくは１〜・１ヌクレオチドを有する本発明のプロモーター含有プライマーは先行技術に述べられているプロモーター供給プライマーに比べて増幅レベルを有意に強化する。

理論に縛られるのを意図する訳ではないが、少なくとも、完全な二本鎖プロモーターセグメントを有するｃＤＮＡが完成されるまで、リバーストランスクリプターゼがＤＮＡ鋳型鎖に結合したまま残ることが、共通配列の５°−末端に隣接する１〜１０ヌクレオチド配列によって保証されると考えられる。

共通配列を含むプロモーターセグメント（恐らくポリメラーゼ結合セグメント）の完全な二本鎖性が、プロモーターからの効果的な転写のために重要であると考えられる。

以下の実施例に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、池に指示しない限り、ここに参考文献として関係するＲａｔｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）３１３．２７７−２８４　（１９８５）に開示されているＨ　Ｉ　Ｖ−１ゲノムの指定領域に一致するヌクレオチド配列を有する。他に指示しない限り、星印（＊）はセグメント５“　−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ−３’　を含むプロモーター供給オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５）を意味するが、この場合に下線を施した配列はＴ７バクテリオフアージＤＮノ＼依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターの１７− ヌクレオチド共通配列である。共通配列の５°　−末端における４　ｎ　を配列（５’　−ＡＡＴＴ−３°）はここでは、用語“プロモーターセンス鎖”の範囲内に含まれると定義され、共通配列の３′　−末端における４ｎｔセグメント（例えば、５°　−ＧＧＧ　Ａ　−３’　又は５”　−ＧＡＡＡ、−３’　等）はＴ７転写開始セグメントであり、これは上記で用いた用語では、プライマーの“ 可変サブセグメンビである。この可変サブセグメントに対応する配列はプロモーターセンス鎖に対応するプロモーターから作製される転写体中に生ずる。例えば、８８−３４７＊なる名称のプロモーター含有オリゴヌクレオチド　プローブはヌクレオチド６６６１−６６３１（６６３１を含む）に一致するＨ　Ｉ　Ｖ−１ゲノムのセグメントの補体であるセグメントと、転写開始配列５°　−ＧＧＧＡ −３’　に一致する４ｎｔ可変サブセグメントと、上記配列を有する２１ｎｔプロモーターセンス鎖とから成り、下記の完全な配列を有する：５−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧ＾−３゛（配列番号２）下記オリゴヌクレオチドプライマー（プライマー＃と名付ける）のヌクレオチド配列を上記慣習に従って開示する。これらのオリゴヌクレオチドの幾つかについてはこの明細書及び実施例において述べる。“センス”なる名称はプライマーがＨＩＶ−１ゲノムからの指定セグメントと同じ配列を有するセグメントを含むことを意味する。“アンチセンス“なる名称はプライマーがＨＩＶ−１ゲノムからの指定セグメントに配列において相補的であるセグメントを含むことを意味する。

オリゴヌクレオチド　センス又はアンチセンス　ＨＩＶ−１ヌクレオチドブライマー＃　位置のＥＮＶ領域８８−２１１”　（センス）６４５０−６４７９８９−２５５（配列番号１４）（センス）　６４５０−６４７９８ｇ−２９９（センス）　６４８６−６５１５８９−３３２　（センス）　６４９４−６５０８８８−３３　（センス）　６４１９−６４４０９０−１０６本　（センス）　６４１９−６４４６８８−３４８＊　（センス）　６４１９−６４４６８８−３４７本（配列番号２）（アンチセンス）　６６６１−６６３１８９−２６３本　（アンチセンス）　６８３０−６８０１８６−２７４　（アンチセンス）　６６９１−６６６１８８−３４６　（アンチセンス）　６８３０−６８０１９０−６６　（アンチセンス）　６９１８ −６８９１９０−６９　（アンチセンス）７１０１−７０７０８５−２３７　（アンチセンス＞　７２５５−７２２６８５−２３５　（アンチセンス）　７３３５−７３０６９０−７２本　（アンチセンス）７２５５−７２２６９０−７１本　（アンチセンス）　７３３５−７３０６９０−１８７本　（アンチセンス）　７８９９−７８７０８６−２７３　（センス）　６５９１−６６２０８７−８１　（センス）　６５５．１−６５７７８７−７９　（センス＞　６４１９−６４４３■）　プライマー１８８−２１１では、転写開始部位に相当する可変セグメントは、５’　−ＧＧＧＡ−３’　の代わりに、配列５’　−ＧＧＧＡＴＣ−３ ’　を有する。

本発明は、そのもう一つの態様において、核酸を含むサンプル中の少なくとも一つの特定ＲＮＡ標的セグメントを検出するために有用な方法であって、前記ＲＮＡ標的セグメントを上記方法によって増幅させ、前記標的セグメントの配列に同じもしくは相補的である配列を含むＲＮＡ転写体の存在を検出することを含む方法に関する。増幅された核酸生成物の検出は周知の核酸ハイブリダイゼーション方法によって実施することができる。実施例ＩＩは増幅生成物の検出のために好ましい方法であるビーズベースド　サンドイッチ　ハイブリダイゼーション方法を説明する。池の検出方法では、放射性同位体によって標識されたりボヌクレオシド三リン酸、又は発色性基質もしくは蛍光性基質、又は発色反応に触媒作用を及ぼしうる酵素を含む錯体によって結合されうる、例えばビオチニル基のような基を用いて、技術上周知であるように、増幅を実施し、このような標識ｒＮＴＰを含むＲＮＡ転写体のハイブリダイゼーション分析で存在を検出する。

ｌ−述したように、本発明は本発明の増幅方法を実施するためのキットをも含む。

本発明のキットは１センスプライマーと１アンチセンスプライマー（一方又は両方がプロモーターセンス鎖を含む）と、２−酵素３ＳＲ増幅を可能にする反応媒質の成分と、プライマーのプロモーターに対応するバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとリバーストランスクリブターゼのみとを含む。或いは、本発明のキットはＲＮＡ５ｅＨ活性を提供することができる、但しリバーストランスクリブターゼ以外の酵素と、本発明の改良された反応媒質を提供するための水溶液又はこのような改良された反応媒質を製造するための化合物（例えば、塩、緩衝液、ヒドロキシ化合物、ＤＭＳＯ、ヌクレオシド三リン酸）とを含めた、３−酵素３ＳＲの構成要素を含む。

本発明は改良された反応媒質をも包含する。

核酸ハイブリダイゼーション　プローブ分析（本発明に従って標的セグメントを増幅させることによる）の実施のための方法とキットは、さらに、本発明による増幅から生ずるＲＮＡ生成物を検出するために必要な工程と構成要素とを含みうる。熟練者は、技術上公知の、多くの核酸ブローブハイプリダイゼーンヨン分析方法のいずれかによって増幅プロセスからＲＮＡを検出するために必要である、種々な付加的工程と構成要素とを理解した。標識した増幅ＲＮＡのビーズ−キャプチャーを含む、好ましい核酸プローブ　ハイブリダイゼーション分析方法を以下の実施例ＩＩにおいて説明する。

次に、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。

（１９８３）によって既述されているように、５゛　−ホスホリル化８８−２９７（５’　−ＴＧＧＣＣＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴ −３′）（配列番号１６）を０．１Ｍメチルイミダゾール、ｐＨ６，０中の０．２５Ｍ　１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの存在下で１．６−ジアミツヘキサンと反応させることによって５゛　−アミノへキシルホスホルアミデート　オリゴヌクレオチドを調製した。管壁への核酸の非特異的吸着を阻止するために、新たにシラン化したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管においてこの反応を実施することが重要である。このアミン誘導体をＥｔＯＨ／ＬｉＣ１による２回の沈殿によって単離した。典型的には、Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド中のＮ−スクシニミジルブロモアセテート（Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ等、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５５．９５−１０２　（１９８６）参照）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液の１５０μｌアリコートを０．２Ｍ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，７１，１ｍｌ中の５°　−アミノへキシルホスホルアミデート　オリゴヌクレオチド誘導体　２゜５ｎｍｏｌに加えた。１時間の反応時間後に、オリゴヌクレオチドをエタノール／　Ｌ　ｉ　Ｃｌによって２回沈殿させた。

Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　ＧＦ２０００（Ｒｅａｃｔｉｆｓ　ＩＢＦ、フランスポインチット　ギラード）の誘導体化をこの樹脂の２０ｍ１懸濁液を用い、これをガラス濾過器にピペットで人ね、Ｎ２０　２００ｍ１で洗浄し、１０分間吸引乾燥させることによって実施した。乾燥サンプル（＃１１ｇ）を、油浴中で予め９０ ℃に加熱した蒸留済みエチレンジアミン２０ｍ１に徐々に加えた。９０℃における１時間後に、反応混合物を粉砕木３０ｍ１の添加によって冷却した。過剰なエチレンジアミンを０．２Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＯＩＭ　ＨＣＩの各４００ｍ１と、最後に０．１Ｍ　ＮａＣ１５００ｍ１とによって濾過器中で該樹脂を連続的に洗浄することによって除去した。＃液が２．　４．　６−１−リニトロベンゼンスルホン酸試薬によって陰性の試験を示すまで、洗浄を続けた。

ビーズ（１０ｇａ重量）を０．５Ｍ　ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９，７と最初に平衡化させることによって、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ−アミン　サポートからＴｒｉｓａｃｒｙｌ−スルフヒドリルへの転化を実施した。５０ｍｌ−８ａｒｓｔｅｄｔ円錐管中で量を４０ｍ１に調節し、固体Ｎ−アセチルホモシスティンチオラクトン（２，５ｇ）を加え、管を室温において１時間撹拌した。続いて、さらに１ｇの試薬を加え、サンプルを一晩振とうした。ビーズを０．１Ｍ　ＮａＣ１２５０ｍ１によって洗浄し、ガラスガラス濾過器を用いて濾過した。次にＴｒｉｓａｃｒｙ　ｌ−スルフヒドリルの１０ｇサンプルをＯ，ＩＭ　Ｎａ０Ａｃ、ｐＨ６，０３０ｍ１と平衡化させ、固体無水コハク酸２００ｍｇによって処理した。３０分間振とうした後に、さらに無水コハク酸２００ｍｇを墾濁液に加え、キャッピング反応をさらに３０分間進行させた。次に、ビーズを０．ＬＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，５，５０ｍ１中で平衡化させ、千オニステル結合を加水分解させた。１時間後に、サポートをＴＥ、ｐＨ８，０によって洗浄し、４°Ｃにおいて貯蔵した。５゜５゛−ノチオヒス（２−ニトロ安怠香酸）により滴定し、３−カルボキンレート−２１−ニトロチオフェルレートの放出を４１２ｎｍにおいてモニターすることによって、サポート中のスルフヒドリル基の濃度を算出した。

ｊｌｉ＆に、スルフヒドリルＴｒｉａｃｒｙｌへの５“　−ブロモアセチル誘導体化オリゴヌクレオチドの共有結合を次の操作によって実施した。上記反応によって得られた、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ−スルフヒドリル　サポート（１ｇ）を０．０５Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ８，０）と１．ｍＭ　ＥＤＴＡ中の２０ｍＭ　ＤＤＴ　３０ｍ１によって１時間還元した。次に、サポー）４０．０５Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ８，０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡの２５ｍ１によって４回洗浄し、その後に０．１Ｍリン酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＰ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ９，０２５ｍ１によって２回洗浄した。０．１Ｍ　ＴＥＡＰ、］、ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ９，０７ｍ１中に溶解したブロモアセチル誘導体化オリゴヌクレオチド　５ｎａｎｏｍｏｌｅをサポートに加え、管をＮ２によってパージし、シールした。

回転ミキサー上で一晩撹拌した後に、ヨード酢酸２００ｍｇを加え、混合物を室温において１時間放置した。ビーズを０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０，０，１Ｍ　ＮａＣｌ、］、ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．１％　ＳＤ３　３５ｍ１によって２回洗浄し、０、ＩＭ　Ｎａ２Ｐ２０ｙ、ｐＨ７，５４５ｍ１によって４回、次にＴＥ−ｐＨ８，０，４５ｍ１によって２回洗浄し、４℃において貯蔵した。

この実施例はＤＮＡ標的の３〜酵素３ＳＲ増幅によって検出可能な増幅レベルが観察されることを実証する。

正常也者と嚢胞性線維症患者の両方からの２．５Ｘ］、０５ＰＢＭＣの核酸を実施例１と同様に抽出した。沈殿した核酸を遠心によってペレット化した。ペレットを取り出し、７０％エタノールによって１回洗浄し、乾燥させてから、下記成分を含む１００μｌ中に再懸濁させた：４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８゜１１０％　ＤＭＳＯ１０％　グリセロール３ＱｍＭ　〜１ｇＣｌ。

２０ｍＭ　ＫＣｌ４ｍＭ　スペルミジンｌＱｍＭ　ジチオスレイトール１ｍＭ　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各々７ｍＭ　ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びｒＵＴＰの各々２５０ｎｇ　オリゴヌクレオチド　プライマーの各々９０−１５９　（５’　ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣ’ＴＴＣＴＧＴＡ−３’　）（配列番号１７）９０−１６１　（５°−ＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＡＧＡＡ−３’　）（配列番号１８）ベレットが完全に再懸濁されるまで、サンプルを撹拌した。対照として、上記緩衝液中に核酸ベレットの代わりに水を用いた。

サンプルを１００℃において１分間加熱し、４２℃に１分間冷却し、ＡＭＶリバーストランスクリブターゼ（ＲＴ）（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ、）１０単位を加えた。サンプルを４２℃において１５分間インキュベートし、次に１００℃に１分間加熱した。ＡＭＶ　ＲＴ　３０単位、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）１００単位及び大腸菌ＲＮａｓｅＨ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）４単位を加えた。サンプルを４２℃において１時間インキュベートした。次に、サンプルを一２０℃において冷凍した。次に、サンプルをＯｆ　ｉｇｏｂｅａｄｓＴＭ９０−２９４　（５°　−ＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣ−３’　）（配列番号１９）と、野生型嚢胞性線維症遺伝子を検出する３２ｐ−標識検出オリゴヌクレオチド９０−１６５　（５’　−ＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴ−３ °）（配列番号２０）又は嚢胞性線維症遺伝子内の３塩基−欠失突然変異を検出する９Ｏ−１６６（５’−ＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡ−３′）（配列番号２１）を用いるビーズベースド　サンドイッチ　ハイブリダイゼーションによって分析した。

典型的なビーズベースド　サンドイッチ　ハイブリダイゼーション（ＢＢＳＨ）方法では、ビーズ懸濁液の２５ｍｇアリコートを２ｍｌマイクロ−カラム（２Ｓ −ＧＳ、ｌ５ｏｌｏａｂ）に加え、ＴＥ溶液を注射器によってカラムに通すことによって除去する。４２℃に加熱した２Ｘハイブリダイゼーション溶液（２０％硫酸デキストラン、２０ｘＳＳＰＥ、０．２％５ＤＳ）１０Ｉｌｌと共に、ＴＥ２０μｌ中の標的をカラムに加える。ミクロ−カラムを撹拌し、４２℃において時々撹拌しながら２時間インキュベートする。ビーズを４２℃において平衡化させた２ｘＳＳＣ各１ｍｌによって６回洗浄する。カラムと洗液（ｗａｓｂ）のＣｅｒｅｎｋｏｖ計測を用いて、検出すべき標的量を測定する。全てのサンプルからカウンターバックグラウンドを控除し、検出される標的のｆｍを下記のように算（ビーズ上ｃｐｍ十洗液ｃｐｍ）標的なし　９０−１６５　２０　０．０１６２．５ｘｌＯ’野生型ｐ　ＢＭＣ９０−１６５２００，１１３Ｗ／Ｗ標的なし　９０−１６６　２１　０．０１８２．５ｘ１０５突然変異体ｐＢＭＣ９０−１６６２１２，２４３この実施例は、本発明の好ましい反応媒質による３７℃での２−酵素３ＳＲ反応によって検出可能な増幅レベルが観察されるが、３ −酵素３ＳＲ反応に適した先行技術反応媒質によっては観察されないことを示す。

ＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡの０．ｌＸ１０−”ｍｏｌｅを３７℃での２−酵素３ＳＲ又は３−酵素３ＳＲ反応において先行技術反応条件下又は本発明の改良反応条件下で増幅させた。改良条件下では、２−酵素３ＳＲ増幅が検出可能な増幅生成物量を生じたが、先行技術条件下では生じなかった。例えば、この実施例において以下に述べる好ましい媒質のような改良反応媒質によって、３−酵素３ＳＲ反応における高い増幅レベルが観察された。

各反応溶液はオリゴヌクレオチド　プライマー８８−２１１本と８８−３４７零各０．２５℃１ｇと、ＡＭＶリバーストランスクリブターゼ　１０単位と、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２０単位とを含有した。全反応量は１００μｍであった。“ 外因性添加ＲＮａｓｅＨ″欄の“＋”は反応媒質中の４単位の大腸菌ＲＮａ　ｓ　ｅＨの存在を示すが、“ＤＭＳＯ／ＰＥＧ−８０００“欄の“＋“は反応媒質に１０％ジメチルスルホキシドと５％ＰＥＧ−８０００を加えたことを意味する。

先行技術３ＳＲ好ましい３ＳＲ反応媒質　反応媒質４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，１４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，１２０ｍＭ　ＭｇＣ］ｚ　３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２２５ｍＭ　ＮａＣ１２０ｍＭ　ＫＣｌ５ｍＭ　ＤＴＴ　１０ｍＭ　ＤＴＴ２ｍＭ　スペルミジン　４ｍＭ　スペルミジン８０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ　φｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡｌｍＭ　ｄＮＴＰ　１ｍＭ　ｄＮＴＰ４ｍＭ　ｒＮＴＰ　７ｍＭ　ｒＮＴＰ反応生成物はオリゴヌクレオチド＃８６−２７３とオリゴヌクレオチド＃８７− ８１とによって誘導体化した０１　ｉｇｏｂｅａｄｓＴＭをプローブとして用いてビーズベースド　サンドイッチ　ハイブリダイゼーション（実施例ＩＩ）によって検出した。

３７℃におけるｅｎｖ領域での３ＳＲ反応緩衝液／　外因性添加　ＤＭＳＯ／　増幅ヌクレオチド　ＲＮａｓｅＨＰＥＧ−８０００倍率先行技術　＋　３．５ＸＩＯ７先行技術　〈１０４几１１技術　＋　〈１０４好ましい　＋　−１，７ｘ１０８好ましい　〈１０４好ましい　＋　１．１ｘｌＯ５実施例ＩＶ２−酵素もしくは３−酵素３ＳＲ反応に対する本発明の現在好ましい反応媒質をこの実施例は、２−酵素もしくは３−酵素３ＳＲ反応で得られる増幅レベルに対する、本発明の現在好ましい反応媒質（実施例１目参照）を１０％ＤＭＳＯ１１０％グリセロール及び／又は５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−８０００）と共に添加することの効果を実証する。

３ＳＲ反応に用いた反応条件は、反応を４２℃において１時間実施したこと以外は、実施例ＩＩＩに述べた“好ましい３ＳＲ反応媒質“と同じであった。

３ＳＲ反応は標的としてのＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡ　Ｏ，ｌＸｌ０−”ｍｏｌｅとプライマ一対８８−２９／８９−２６３本（約４００塩基間隔）を用いて実施した。増幅生成物はオリゴヌクレオチド８６−２７３によって誘導体化したＯ１ｉｇｏｂｅａｄｓ１′″と、プローブとしてのオリゴヌクレオチド８７−８１とを用いてビーズベースド　サンドイッチ　ハイブリダイゼーション（実施例ＴＩ）によって検出した。以下に示すように、１０％ＤＭＳＯと１０％グリセロールの存在下では強化された増幅レベルが得られた。

８８−２９９／８９−２６３本　−１０％　５％　ｌＸｌ０５８８−２９９／８９−２６３本　−１０％　１０％　２Ｘ１０７８８−２１１＊／８８−３４７木　４Ｕ　−−２，８Ｘ１０”８８−２１１本／８８−３４７本　４Ｕ−１０％　 −２，０Ｘ１０’８８−２１１＋／８８−３４７＊　４　Ｕ　１０％　１０％　 −３，９Ｘ１０’８８−２１１本／８８−３４７本　−−−Ｎ、Ｄ。

８８−２１１本／８８−３４７木　−−１０％　−Ｎ、Ｄ。

８ｇ−２１１本／８８−３４７本　−１０％　１０％　−１，３Ｘ１０’Ｎ、　Ｄ、：生成物検出されず２−酵素反応：１０Ｕ　ＡＭｖ　ＲＴ、２０Ｕ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ３− 酵素反応：３０Ｕ　ＡＭＶ　ＲＴ、１００Ｕ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ　大腸菌ＲＮａｓｅＨ実施例Ｖこの実施例は好ましい３ＳＲ反応媒質中の１０％ＤＭＳＯ及び５％ＰＥＧ−８０００の存在下と不存在下での２−酵素３ＳＲ増幅と３−酵素３ＳＲ増幅（各場合に、ｆ（ＩＶ−Ｉ　ＲＮＡ＠的　０．　１　ｘ　１．０−０−１ｓ　ｌ　ｅとプライマー対８８−２１１本／８８−３４７本）のレベルを比較する。生成物はオリゴヌクレオチド８６−２７３によって誘導体化した０１　ｉｇｏｂｅａｄｓ” と、プローブとしてのオリゴヌクレオチド８７−８１とを用いて、実施例ＩＩと同様に、ビーズベースド　サンドイッチ　ハイブリダイゼーションによって検出した。

２−酵素３ＳＲ反応に対する添加剤の効果温度　酵素　ＤＭＳＯＰＥＧ−８旦麿旦　増幅倍率４２℃　３種全て　８．０ＸｌＯ’ ４２℃　ＲＴ／Ｔ７　−　＜１０’ ４２℃　ＲＴ／Ｔ７　＋　１．ｌＸｌ０’４２℃　ＲＴ／Ｔ７　＋　＋　５．０ｘｌＯ’４５℃　ＲＴ／Ｔ７　＋　＋　１．７Ｘ１０’３０Ｕ　ＡＭＶ　ＲＴと、１００Ｕ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼと、存在する場合の（すなわち、“３種全て”）４Ｕ　大腸菌ＲＮａｓｅＨを反応媒質中に用いた。

この実施例はモロニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）　、ＨＩＶ−１及びトリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）からのリバーストランスクリブターゼ（ＲＴ）による２−酵素３ＳＲ反応を示す。ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼは有効量の固有ＲＮａｓｅＨ活性を提供するためにマンガンイオンを必要とする。

ａＳＲ系＋ｅｎｖ領域８８−２１１／８８−３４７Ｍ−ＭＬＶ　１００ＯＵ　６０Ｕ　４Ｕ　５％　−３Ｘ１．Ｏ’Ｍ−ＭＬＶ　１００ＯＵ　６０Ｕ　−５％　ｔｉｌｌ　３ｘｌＯ’Ｍ−ＭＬＶ１００ＯＵ　６００　−　−　１ｍＭ　２Ｘ１０’１１１Ｖ５ａｌ”　６００　−　−　−　ｌＸｌ０’ＢＩＶ１．ｈｌ　６０１１　４０　−　−　９Ｘ１０’ＡＭＶ　３０Ｕ　１０００　４０　１０％　１０％　−４Ｘ１０’ＡＭＶＩＯＵ　２０Ｕ　−１０％　１０％　−１，Ｘ１０’ 反応時間：１時間、温度＝４２℃、鋳型：Ｏ，１ｍｏｌｅ　ＨＩＶ　ＲＮＡ１／　ＨＩＶ−１リバーストランスクリプターゼ製剤の特異的活性は未知であった。

実施例ＶＩＩこの実施例は、４２℃又は４５℃でインキュベーションする、５％ＰＥＧ−８０００／１０％ＤＭＳＯの存在下及び不存在下の３−酵素３ＳＲ反応において得られる増幅レベルの増加を実証する。

ＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡ　Ｏ，ｌＸｌ０−”ｍｏｌｅを実施例ＩＩＩに述べた好ましい反応媒質中で下記セットのｅｎｖプライマ一対：８８−２１１／８８−３４７又は８７−７９／８８−３４７のいずれかを用いて、４２℃におけるＡＭＶリバーストランスクリブターゼ３０単位と、Ｔ７　ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ１００単位と、ＲＮａｓｅＨ４単位とを用いる３−酵素３ＳＲ反応において１時間増幅させた。

８８−２１１１／８８−３４７本　４．４Ｘ１０’　８．４ＸｌＯ’＋　２．３Ｘ１０”　１．５Ｘ１０” ８７−７９／８８−３４７本　４．５Ｘ１０’　１．５Ｘ１０’＋　１．７Ｘ１０’　５．６ＸｌＯ’ 実施例ＶＩＩ１１０％ＤＭＳＯの存在下及び不存在下での好ましい反応媒質中での３−酵素３ＳＲ増幅に対する温度の影響この実施例は１０％ＤＭＳＯの存在下及び不存在下での好ましい反応媒質（実施例［１参照）中での３−酵素３ＳＲ増幅に対する温度の影響を示す。標的はＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡ　Ｏ，ｌＸｌ０−”ｍｏｌｅであった。反応混合物各１００μｌは３０単位のＡＭＶ　ＲＴと、１００単位のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼと、４単位の大腸菌ＲＮａｓｅＨとを含有した。

ＤＭＳＯの存在下又は不存在下での３ＳＲ反応の温度依存性プライマー８８−２１１と８８−３４７　（ｅｎｖ領域）反応温度　−ＤＭＳＯ＋ＤＭＳＯ４２℃　９．ｌＸｌ０’　２．７Ｘ１０”４５℃　８．７Ｘ１０’　１．６Ｘ１０”４７°Ｃ７，４Ｘ１０’　＜１０’ ５０℃　＜１０’　＜１０’ 実施例ＩＸＴ７プロモーターの共通配列を含むオリゴヌクレオチドブライマーの５′末端と３゛　末端におけるヌクレオチド変化の影響この実施例は、Ｔ７プロモーターの共通配列を含むオリゴヌクレオチドブライマーの５゛末端と３゛末端におけるヌクレオチド変化の影響を示す。

［−（ＩＶ（ＲＮＡ標的　０．０５ｘｌＯ−”ｍｏｌｅ　（＃１，０００分子）、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ３０単位、大腸菌ＲＮａｓｅＨ２単位、ＡＭＶＲ７１５単位、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８，１）、３０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、２０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、４ｍＭスペルミジン、１ｍＭ　ｄＸＴＰ、７ｍＭ　ｒＸＴＰ、及びオリゴヌクレクレオチドプライマー０．１．２５１１ｇを含む５０７１１中で３ＳＲ反応を４２℃において１〜２時間実施した。この表に記載した各プライマーに対して同じコンパニオンブライマー、８９−２５５　（５ ’　ＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＡ３’　）（配列番号１４）（Ｒａｔｎｅｒ等、１９８５）を用いた。記載プライマーは標準１７ｎｔＴ７プロモ一ター配列（その５゛　ヌクレオチドが欠失した＃９０ −２０６を除く）をコードし、種々な長さと、共通１７ｎｔＴ７プロモ一ター配列に接する５゛　と３゛　フランキング配列に関する種々な組成とを有する。作製されたＲＮＡ生成物は２１４ヌクレオチド長さである。増幅された標的を、キャプチャーオリゴヌクレオチド８６−２７３を含むビーズ　２５ｍｇとオリゴヌクレオチド８７−８１の３２ｐ−標識検出　１００ｆ１００ｆとを用いるビーズベースド　サントイ・ソチハイブリダイゼーション（Ｂ　Ｂ　Ｓ　Ｈ）によって定量した（Ｇｕａｔ、ｅｌｌｉ等。

１９９０）。８８−３４７を除いた全ての増幅値は、２回の３ＳＲ反応の平均であり、これらの増幅反応の各々は２回のＢ　Ｂ　Ｓ　Ｈ反応によって分析した。

８８−３４７によって実施した３ＳＲ増幅は６回の３ＳＲ反応の平均を表す。

Ｔ７プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドブライマーの転写萌艙配烈見おけるヌクレオチドの３ＳＲ増幅に対する効果配列　オリゴ　長さ　増幅ＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾　２ＸｌＯ’２２　９０ −４２６　５６　ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ＾＾ＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　２．４Ｘ１０’ ２３　９０−１９９　５６　ＡＡＴＴ！＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ＾ＧＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾１．　ｌＸｌ０’２４　９０−２００　５６　ＡＡＴＴ！＾＾ＴＡＣＧ＾ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ＾＾ＴＧＴＡＣＴ＾ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　２．２Ｘ１０’２５　９０−２０１　５６＾＾ＴＴ黙ｙ匹肪ｑＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾１．８Ｘ１１１”２６　９０−２０２　５５八ＡＴＴηＮμｍ励煕耳観乃ＭＧＧ＾ＴＧＴＡＣＴ＾ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾２．ｏｘｔｏ’２７　９０−２０３　５４　ＡＡＴＴ乃旦煕９ｑ９ｑｙ＾Ｇ　ＡＴＧＴＡＣＴ＾ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾２゜５ｘ１０９２８　９０−２０４　５３　ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ　ＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾１．．９ＸｌＯ’２９　９０−４３０　５２　ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ　ＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧ＾２．８Ｘ１０”１）　コード鎖配列を示す。下線を施した配列は標準１７ｎｔＴ７プロモ一ター配列に相当し、ＲＮＡ転写開始は＋１によって示す。配列ＧＧＧＡは１７配列がらであり：前方への＋５ヌクレオチドはＨＩＶ−１配列であり：それに続く配列は各オリゴヌクレオチドで同じである。プライマー間の差異が示すために、オリゴヌクレオチドを一直線に並べる。

実施例ＸＨＩＶ−１からのＰＯＬ遺伝子の領域の増幅に対する添加剤の種々な組合せの効！この実施例はＨＩＶ−１からのＰ　ＯＬ遺伝子の７０７塩基領域の増幅に対する添加剤の種々な組合せの効果を示す。反応は標的としてのＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡ０．　Ｉ　Ｘ　１．０”ｍｏ　Ｉ　ｅと、開始オリゴヌクレオチドとしての９Ｏ− ２４９（（？ンス）５’　−ＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＴＡＧＡ −３’　（配列番号３０）と、８９−３９１　（７ンチセ：／ス）５’　−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＣＴＡＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧＡＣＡ−３’　（配列番号３１）とを用いて４２℃において２時間実施した。３−酵素反応は３０単位のＡＭＶ　ＲＴと、１００単位の７７　ＲＮＡポリメラーゼと、２単位の大腸菌ＲＮａｓｅＨを用いた。

２−酵素反応は１０単位のＡＭＶ　ＲＴと、２０単位のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼとを用いた。プローブとＯｆ　ｉｇｏｂｅａｄ”配列はそれぞれ、８９−５３４５°−ＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＴＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＡ−３’　（配列番号３２）と、８９−４１９　５’　−ＡＧＡＡＣＴＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣ−３’（配列番号３３）であった。

比りと二し虹弊λハλ甲１１ｉ＋（けＩｐ」特計Ｊ復擾贋迦μ則今ｅｏ効果増幅倍率１０％ＤＭＳＯ／１０％グリセロール　８．４ｘｌＯ’　１．２ｘｌＯ’１０％ＤＭＳＯ１５％ＰＥＧ−８０００４，６ｘｌＯ’　ｎ、ｄ。

１０％ＤＭＳＯ／１５％ソルビトール７．０ｘｌＯ’　１．３ｘｌＯ’ｎ、ｄ、　＝ビーズベースド　サンドイッチ　ハイブリダイゼーションによって検出される生成物なし本発明を多少特異的に説明したが、当該技術分野に通常に熟練した人に明らがな変更は、本発明の要旨から逸脱せずに行われつる。

本発明の種々な特徴は下記請求の範囲に述べる。

配列表（１）一般情報。

（ｉ）出願人：Ｆａｈｙ、Ｅｏｉｎ　ＤＫｗｏｈ、Ｄｅｂｏｒａｈ　Ｙ。

Ｇｉｎｇｅｒａｓ、Ｔｂｏｍａｓ　Ｒ。

Ｇｕａｔｅｌｌｉ、Ｊｏｈｎ　Ｃ。

Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ、Ｋｒ１ｓｔｉｎａ　Ｐｖｌ。

（Ｕ）発明の名称　２−酵素自立性配列複製による核酸増幅（ｔｉｉ）配列数＝３３（ｉｖ）通信光て先住所：（Ａ）受信人：Ｆｉｔｃｈ、Ｅｖｅｎ、Ｔａｂｉｎ＆Ｆｌａｎｎｅｒｙ（Ｂ）通り、ラサレ通り１３５（Ｃ）市：ンカゴ（Ｄ）州：イリノイ（Ｅ）国・アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号　６０６０３−４２７７（ｖ）コンピューター判読可能形：（Ａ）媒介タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター・ＩＢＭＰＣ互換性（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）ソフトウェア：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ＃１．２４（ｖｉ）現在の出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日゛（Ｃ）分類：（ｖｉ）代理人情報。

（Ａ）名前：Ｆｅｄｅｒ、５ｃｏｔｔ　Ｂ（Ｂ）参照／事件整理番号　５０１０１（Ｌｘ）遠距離通信情報・（Ａ）電話＋３１２−３７２−７８４２（Ｂ）ファックス：　３１２−３７２− ７８４８（２）配列番号１に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝５９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｎ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−４２５（尤）配列表示、配列番号１＾ＧＴＡＡＴＴＴＡＡ　ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧ　ＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧ　ＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴ　ＴＧＴＣＴＧＴＧ＾T９（２）配列番号２に関する情報：（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ・５６塩基対（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｆ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｙｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：８８−３４７（ｘｉ）配列表示・配列番号２＾＾ＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧ＾５６（２）配列番号３に関する情報。

（ｉ）配列特徴（Ａ）長さ　５６塩基対（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鎖構造　一本鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｆ）分子種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（咄）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント　９Ｏ−５７８（ｘｉ）配列表示：配列番号３ＧＡＴＴＴ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧＡ５６（２）配列番号４に関する情報・（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ・５６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｆ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（暢）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント″：９Ｏ−５７５（ｘｉ）配列表示、配列番号４ＧＣＴＴＴ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧＡ５Ｇ（２）配列番号５に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造・−末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（Ｕ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（糧）ゲノムにおける位Ｗｌ：（Ａ）染色体／セグメント・９Ｏ−５７７（尤）配列表示・配列番号５ＧＣＧ丁Ｔ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧＡ　５６（２）配列番号６に関する情報（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ、５６塩基対（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｉｔ）分子種類＋ＤＮＡ（ゲノム）（咄）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−５７４（ｘｌ）配列表示：配列番号６ＧＣＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧＡ　５６（２）配列番号７に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５６塩基対（Ｂ）種Ｍ：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｆ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−２４７（ｘｉ）配列表示：配列番号７ＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧ　ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ　ＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴ　ＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴ　ＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　５５（２）配列番号８に関する情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ：５６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（Ｕ分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｍ）ゲノムにおける位Ｉｔ：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−２４８（ｘｉ）配列表示：配列番号８ＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡ　ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ　ＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡ　ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴ　ＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴ　ＧＴＧＡ　５４（２）配列番号９に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（Ｕ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−５７６（ｘｉ）配ａ１表示：配列番号９ＧＴＴＡＡＴＡＣＧＡ　ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ　ＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡ　ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴ　ＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴ　ＧＴＧＡ　５４（２）配列番号１０に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ、５４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造；−末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｌ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位１ｉ１：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−５７９（ｘｉ）配列表示：配列番号１０ＧＣ丁ＡＡＴＡＣＧＡ　ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ　ＧＧＡＴＧＴＡＣＴＡ　ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴ　ＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴ　ＧＴＧＡ　５４（２）配列番号１１に関する情報（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ　５３塩基対（Ｂ）種類　核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（Ｕ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（暢）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−２４９（ｘｉ）配列表示：配列番号１１ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ　ＧＡＴＧＴＡＣＴＡＴ　ＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡ　ＧＣＡＴＴＧＴＣＴ　ＧＴＧＡ　５３（２）配列番号１２に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５２塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｉｆ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（糧）ゲノムにおける位置。

（Ａ）染色体／セグメント９Ｏ−２０５（対）配列表示：配列番号１２ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ　ＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴ　ＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧ　ＣＡＴＴＧＴＣＴＧ　ＴＧＡ　５２（２）配列番号１３に関する情報：（ｆ）配列特徴：（Ａ）長さ　５１塩基対（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｔ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（４）ゲノムにおける位ｒ１：（Ａ）染色体／セグメントコ９Ｏ−２０６（ｘｉ）配列表示　配列番号１３ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ　ＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡ　ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴ　ＧＡ　５１（２）配列番号１４に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：３１塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｉｔ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（咄）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：８９−２５５（］ｄ）配列表示・配列番号１４ＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＴ　ＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴ　Ａ　３１（２）配列番号１５に関する情報。

（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝２５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー、未知（ｉ４　）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位ｆｉｌ：（Ａ）染色体／セグメント：ＴＩＳを含むＴ７ネイテイブプロモーター（ｘｊ）配列表示：配列番号１５ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧ＾２５（２）配列番号１６に関する情報（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ、３０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造・−末鎖（Ｄ）トポロジー　未知（ｉｆ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：８８−２９７（対）配列表示：配列番号１６ＴＧＧＣＣＴＡ＾ＴＴ　ＣＣＡＴＧＴＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴ　３０（２）配列番号１７に関する情報。

（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：４８塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｎ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位！（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−１５９（ｘｉ）配列表示：配列番号１７ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡ＾訂ＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧ　ＣＴＴＣＴＧＴＡ　４８（２）配列番号１８に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝２８塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（Ｕ）分子種類：ＤＮＡ、（ゲノム）（４）ゲノムにおける位ｌ：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−１６１（ｘｌ）配列表示：配列番号１８ＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡ　ＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡ　ＴＧＧＧＡＧＡＡ　２８（２）配列番号１９に関する情報：（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ・２４塩基対（Ｂ）種類、核酸（Ｃ）鎖構造、−末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（１ｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｙｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：　９Ｏ−２９４（ｘｉ）配列表示：配列番号１９ＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴ　ＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴ　ＡＴＧＣ２４（２）配列番号２０に関する情報。

（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ・２７塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロン−二未知（ｉｆ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置。

（Ａ）染色体／セグメント：　９Ｏ−１６５（ｘｉ）配列表示、配列番号２０ＡＡＧ＾＾＾＾ＴＡＴ　ＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴ　ＧＴＴＴＣＣＴ　２７（２）配列番号２１に関する情報・（ｉ）配列特徴（Ａ　）長さ　２６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造　−末鎖（Ｄ）トポロジー・未知（１１）分子種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置・（Ａ）染色体／セグメント　９１１６６（対）配列表示−配列番号２１＾＾＾ＧＡＡＡＡＴＡ　ＴＣＡＴＴＧＧＴＧＴ　ＴＴＣＣＴ＾２６（２）配列番号２２に関する情報：（ｉ）配列特徴・（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｉｔ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｊ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−４２６（魁）配列表示：配列番号２２ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＡＡＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧ＾５６（２）配列番号２３に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５６塩基対（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鎖構造、−末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｉｔ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：　９Ｏ−１９９（ｎ）配列表示：配列番号２３ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧ＾５６（２）配列番号２４に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ、５６塩基対（Ｂ）種類、核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｆ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（糧）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：　９Ｏ−２００（ｘｉ）配列表示：配列番号２４ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧ＾＾ＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧ＾５６（２）配列番号２５に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５６塩基対（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子種類：ＤＮＡ　（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置。

（Ａ）染色体／セグメント＋９Ｏ−２０１（ｘｉ）配列表示：配列番号２６ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＣＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＣＴＧＴＧ＾５６（２）配列番号２６に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝５５塩基対（Ｂ）種類・核酸（Ｃ）鎖構造・−末鎖（Ｄ）トポロジー・未知（ｉｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−２０２（ｘｌ）配列表示：配列番号２６ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＡＴＧＴＡＣＴ　ＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴ　ＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　５５（２）配列番号２７に関する情報・（ｉ）配列特徴・（Ａ）長さ：５４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（Ｕ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−２０３（ｘｉ）配列表示：配列番号２７ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＡＴＧＴＡＣＴＡ　ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴ　ＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴ　ＧＴＧＡ　５４（２）配列番号２８に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５３塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｉｔ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（蝋）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：　９Ｏ−２０４（尤）配列表示：配列番号２８ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＴＧＴＡＣＴＡＴ　ＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡ　ＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧ　ＴＧ＾５３（２）配列番号２９に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５２塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｆ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（橿）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：９Ｏ−４３０（ｘｉ）配列表示：配列番号２９ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴ　ＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧ　ＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴ　ＧＡ　５２（２）配列番号３０に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２３塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｔ）分子種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｙｊ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント＋　９Ｏ−２４９（Ｘｌ）配列表示：配列番号３０ＧＡＡ＾＾＾＾ＴＡＡ　ＡＡＧＣＡＴＴＡＧＴ　ＡＧＡ　２３（２）配列番号３１に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝５６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｉｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：８９−３９１（Ｘｌ）配列表示：配列番号３１ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＣＴＡＡＣＴＴ　ＣＴＧＴＡＴＧＴＣＡ　ＴＴＧＡＣ＾５６（２）配列番号３２に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２７塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（１ｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（糧）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント：８９−５３４（ｘｌ）配列表示：配列番号３２ＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＴＡＧ＾＾ＡＴＡＧ　ＧＧＣＡＧＣＡ　２７（２）配列番号３３に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖構造ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二未知（ｎ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）（糧）ゲノムにおける位置：（Ａ）染色体／セグメント＋８９−４１９（ｘｉ）配列表示：配列番号３３＾Ｇ＾＾ＣＴＣＡＡＧ　ＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡ　ＡＧＴＴＣ２５浄書（内容に変更なし）手続補正書１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９１１０８４８８２、発明の名称２−酵素自律性塩基配列複製による核酸増幅３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所名　称　シス力・ダイアグノスティックス・インコーホレーテッド４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区別紙の通り（尚、上記（３）の書面の内容には変更なし）国際調査報告フロントページの続き（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ、　ＤＫ。

ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＳＤ、ＳＥ、５Ｕ（７２）発明者　クオー、デボラー・ヤンティスアメリカ合衆国カリフォルニア州９２００９゜カルズバッド、ジャカランダ・アヴエニュ（７２）発明者　ジンジェラス、トーマス・レイモンドアメリカ合衆国カリフォルニア州９２０２４． −エンシニタス、ジュニパー・ヒル・ドライヴ１５２８（７２）発明者　グワテリー、ジョン・クリストファーアメリカ合衆国カリフォルニア用９２１１７゜サンディエゴ、ルナ・アヴエニュー　２７７８（７２）発明者　ホウイツトフィールド、クリスティナ・マリ− アメリカ合衆国カリフォルニア用９４６１８゜オークランド、カレッジ・アヴエニュー

Claims

【特許請求の範囲】

１．５′−末端ヌクレオチドを含み、標的セグメントの５′−末端ヌクレオチドから３′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する５′−サブセグメントと、３′−末端ヌクレオチドを含み、標的セグメントの３′−末端ヌクレオチドから５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する、５′−サプセグメントと重複しない３′−サブセグメントとを含む、標的ＲＮＡ分子の標的ＲＮＡセグメントの３ＳＲ増幅方法であって，反応媒質中で次の要素：（ａ）（１）３′−末端ヌクレオチドを有し、５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サブセグメントを３′−末端に含む−本鎖ＤＮＡである第１ＤＮＡプライマーであって、前記第１サブセグメントが標的セグメントの３′−サブセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの３′−サプセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる第１ＤＮＡプライマー、及び（２）３′−末端ヌクレオチドを有し、５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サブセグメントを３′−末端に含む−本鎖ＤＮＡである第２ＤＮＡプライマーであって、前記第１サプセグメントが標的セグメントの５′−サプセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの５′−サプセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる第２ＤＮＡプライマー、但し前記プライマーの少なくとも−方は第１プロモーターのセンス鎖を含むプロモーター供給サブセグメントをさらに含み、前記センス鎖は前記プロモーター供給サプセグメントを含むプライマーの第１サプセグメントに、前記２プライマーの伸長生成物を含むｃＤＮＡの前記第１プロモーターからの転写に関して、機能的に結合する、また前記第１プライマーがこのようなプロモーター供給サプセグメントを欠く場合には、前記標的ＲＮＡセグメントの前記５′−サプセグメントの５′−末端ヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子の５′−末端ヌクレオチドであるとする；（ｂ）前記反応媒質中でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡｓｅＨ活性及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を示す、少なくとも２酵素、前記反応媒質中の前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは前記第１プロそ−ターからの転写に触媒作用を及ぼすことができるものとする；及び（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の基質として必要なヌクレオシド三リン酸をインキュベートすることを含み、前記反応媒質中の前記酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡｓｅＨ活性及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の供給に有効である温度範囲において前記インキュベーションが生ずる方法。
２．標的セグメントが約１５００ヌクレオチドよりも小さい長さであり、標的セグメントの５′−サプセグメントと３′−サブセグメントの両方が約１５〜５０ヌクレオチドを有し、前記インキュベーションが約４０℃において生ずる請求項１記載の方法。
３．リバーストランスクリプターゼがレトロウイルスリバーストランスクリプターゼである請求項２記載の方法。
４．反応媒質がリバーストランスクリプターゼ酵素、ＲＮＡｓｅＨ酵素、及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む請求項３記載の方法。
５．ＲＮＡｓｅＨ酵素が大腸菌ＲＮＡｓｅＨ酵素である請求項４記載の方法。
６．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性がＴ７、Ｔ３及びＳＰ６から成る群から選択されるバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼによって供給される請求項５記載の方法。
７．ＲＮＡ標的セグメントが約２００ヌクレオチド未満の長さである請求項６記載の方法。
８．標的ＲＮＡセグメントを増幅させるためにインキュベートした後に、標的ＲＮＡセグメント又は、前記標的ＲＮＡセグメントの配列に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントを核酸プローブハイブリダイゼーション分析において検出する請求項７記載の方法。
９．５′−末端ヌクレオチドを含み、標的セグメントの５′−末端ヌクレオチドから３′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する５′−サブセグメントと、３′−末端ヌクレオチドを含み、標的セグメントの３′−末端ヌクレオチドから５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する、５′−サプセグメントと重複しない３′−サプセグメントとを含む、標的ＲＮＡ分子の標的ＲＮＡセグメントの３ＳＲ増幅方法であって，標的ＲＮＡセグメントを含む反応媒質中で次の要素：（ａ）（１）３′−末端ヌクレオチドを有し、５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サプセグメントを３′−末端に含む−本鎖ＤＮＡである第１ＤＮＡプライマーであって、前記第１サブセグメントが標的セグメントの３′− サブセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの３′−サプセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる第１ＤＮＡプライマー、及び（２）３′−末端ヌクレオチドを有し、５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サプセグメントを３′−末端に含む−本鎖ＤＮＡである第２ＤＮＡプライマーであって、前記第１サブセグメントが標的セグメントの５′−サプセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの５′−サプセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる第２ＤＮＡプライマー、但し前記プライマーの少なくとも−方は第１プロモーターのセンス鎖を含むプロモーター供給サプセグメントをさらに含み、前記センス鎖は前記プロモーター供給サプセグメントを含むプライマーの第１サブセグメントに、前記２プライマーの伸長生成物を含むｃＤＮＡの前記第１プロモーターからの転写に関して、機能的に結合する、また前記第１プライマーがこのようなプロモーター供給サブセグメントを欠く場合には、前記標的ＲＮＡセグメントの前記５′−サプセグメントの５′−末端ヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子の５′−末端ヌクレオチドであるとする：（ｂ）（１）前記反応媒質中でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び高感度増幅−有効量のＲＮＡｓｅＨ活性を示すリバーストランスクリプターゼ、及び（２）前記反応媒質中で前記第１プロモーターからの転写に触媒作用を及ぼすＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；及び（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の基質として必要なヌクレオシド三リン酸をインキュベートすることを含み、前記反応媒質中の前記酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡｓｅＨ活性及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の供給に有効である温度範囲において前記インキュベーションが生ずる方法。
１０．反応媒質が２０〜４０ｍＭＭｇＣ１２、１〜２５ｍＭＫＣｌ、１〜２０ｍＭジチオスレイトール、１〜１０ｍＭスペルミジン、１〜７ｍＭｒＮＴＰ、０．１〜２ｍＭｄＮＴＰ、及び反応媒質を約ｐＨ８に維持するための有効量の緩衝液を含む請求項９記載の方法。
１１．標的セグメントが約１５００ヌクレオチドよりも小さい長さであり、標的セグメントの５′−サプセグメントと３′−サプセグメントの両方が約１５〜５０ヌクレオチドを有し、前記インキュベーションが約３７℃〜約４７℃の範囲内で生ずる請求項１０記載の方法。
１２．リバーストランスクリプターゼがレトロウイルスリバーストランスクリプターゼである請求項１１記載の方法。
１３．ｒＮＴＰの濃度が約６ｍＭであり、反応媒質が（ｉ）Ｃ１−Ｃ１０アルコール；（ｉｉ）式ＨＯＣＨ２（ＣＨＯＨ）×ＣＨ２ＯＨ［式中、ｘは０〜２０である］で示される糖アルコール；（ｉｉｉ）式：Ｈ（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎは２〜６００である］で示されるポリエチレングリコール化合物；（ｉｖ）単糖、二糖及び三糖類から成る群からの糖：及び（ｖ）式Ｒ１−（ＳＯ） −Ｒ２［式中、Ｒ１とＲ２は独立的にＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ１とＲ２は飽和環状化合物の−部として結合されることができる］で示されるスルホキシド化合物から成る群から選択される少なくとも１種の化合物約１〜約２５重量％をさらに含む請求項１２記載の方法。
１４．前記少なくとも１種の化合物がソルビトール、グリセロール、エタノール、スクロース、ポリエチレングリコール及びジメチルスルホキシドから成る群から選択される請求項１３記載の方法。
１５．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性がＴ７、Ｔ３及びＳＰ６から成る群から選択されるバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼによって与えられる請求項１４記載の方法。
１６．反応媒質が３０ｍＭＭｇＣ１２、２０ｍＭＫＣ１、１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭスペルミジン、６ｍＭｒＮＴＰ及び１ｍＭｄＮＴＰを含む請求項１５記載の方法。
１７．第１プライマーの第１サプセグメントの配列が標的セグメントの３′−サプセグメントの配列に正確に相補的であり、第２プライマーの第１サブセグメントの配列が標的セグメントの５′−サブセグメントの配列と同じである請求項１６記載の方法。
１８．標的ＲＮＡセグメントを増幅させるためにインキュベートした後に、棟的ＲＮＡセグメント又は、前記標的ＲＮＡセグメントの配列に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントを核酸プローブハイブリダイゼーション分析において検出する請求項１７記載の方法。
１９．リバーストランスクリプターゼがＡＭＶリバーストランスクリプターゼであり、反応媒質がさらに、式：Ｒ１−（ＳＯ）−Ｒ２［式中、Ｒ１とＲ２は独立的にＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ１とＲ２は飽和環状化合物の一部として結合されることができる］で示されるスルホキシド化合物約１〜約２５重量％を含む請求項１２記載の方法。
２０．反応媒質がジメチルスルホキシドを含む請求項１９記載の方法。
２１．ｒＮＴＰの濃度が約６ｍＭであり、反応媒質が（ｉ）Ｃ１−Ｃ１０アルコール；（ｉｉ）式：ＨＯＣＨ２（ＣＨＯＨ）■ＣＨ２ＯＨ［式中、ｘは０〜２０である］で示される糖アルコール；（ｉｉｉ）式：Ｈ（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎは２〜６００である］で示されるポリエチレングリコール化合物：及び（ｉｖ）単糖、二糖及び三糖類から成る群からの糖から成る群から選択される少なくとも１種、の化合物約１〜約２５重量％をさらに含む請求項２０記載の方法。
２２．前記化合物がソルビトール、グリセロール、エタノール、スクロース及びポリエチレングリコールから成る群から選択される請求項２１記載の方法。
２３．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性がＴ７、Ｔ３及びＳＰ６から成る群から選択されるバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼによって与えられる請求項２２記載の方法。
２４．水溶液が３０ｍＭＭｇＣｌ２、２０ｍＭＫＣ１、１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭスペルミジン、６ｍＭｒＮＴＰ及び１ｍＭｄＮＴＰを含む請求項２３記載の方法。
２５．第１プライマーの第１サプセグメントの配列が標的セグメントの３′−サブセグメントの配列に正確に相補的であり、第２プライマーの第１サブセグメントの配列が標的セグメントの５′−サブセグメントの配列と同じである請求項２４記載の方法。
２６．ＲＮＡ標的セグメントが少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、２ＤＮＡプライマーの標的ハイブリッド形成セグメントがそれぞれ約１５ヌクレオチド長さである請求項２５記載の方法。
２７．標的ＲＮＡセグメントを増幅させるためにインキュベートした後に、標的ＲＮＡセグメント又は、前記標的ＲＮＡセグメントの配列に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントを核酸プローブハイブリダイゼーション分析において検出する請求項２６記載の方法。
２８．リバーストランスクリプターゼがモロニーマウス白血病ウイルスリバーストランスクリプターゼであり、水溶液が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭマンガンイオンを含む請求項１２記載の方法。
２９．ｒＮＴＰの濃度が約６ｍＭであり、反応媒質が（ｉ）Ｃ１−Ｃ１０アルコール；（ｉｉ）式ＨＯＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨ［式中、ｘは０〜２０である］で示される糖アルコール；（ｉｉｉ）式：Ｈ（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎは２〜６００である］で示されるポリエチレングリコール化合物；（ｉｖ）単糖、二糖及び三糖類から成る群からの糖；及び（ｖ）式Ｒ１−（ＳＯ） −Ｒ２［式中、Ｒ１とＲ２は独立的にＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ１とＲ２は飽和環状化合物の一部として結合されることができる］で示されるスルホキシド化合物から成る群から選択される少なくとも１種の化合物約１〜約２５重量％をさらに含む請求項２８記載の方法。
３０．前記化合物がソルビトール、グリセロール、エタノール、スクロース、ポリエチレングリコール及びジメチルスルホキシドから成る群から選択される請求項２９記載の方法。
３１．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性がＴ７、Ｔ３及びＳＰ６から成る群から選択されるバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼによって与えられる請求項３０記載の方法。
３２．反応媒質が３０ｍＭＭｇＣｌ２、２０ｍＭＫＣ１、１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭスペルミジン、６ｍＭｒＮＴＰ及び１ｍＭｄＮＴＰを含む請求項３１記載の方法。
３３．ＲＮＡ標的セグメントが少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、２ＤＮＡプライマーの標的ハイブリッド形成セグメントがそれぞれ約１５ヌクレオチドの長さである請求項３２記載の方法。
３４．第１プライマーの第１サブセグメントの配列が標的セグメントの３′−サプセグメントの配列に正確に相補的であり、第２プライマーの第１サブセグメントの配列が標的セグメントの５′−サブセグメントの配列と同じである請求項３３記載の方法。
３５．標的ＲＮＡセグメントを増幅させるためにインキュベートした後に、標的ＲＮＡセグメント又は、前記標的ＲＮＡセグメントの配列に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントを核酸プローブハイブリダイゼーション分析において検出する請求項３４記載の方法。
３６．反応媒質が大腸菌ＲＮＡｓｅＨをさらに含む請求項１２記載の方法。
３７．反応媒質が式：Ｒ１−（ＳＯ）−Ｒ２［式中、Ｒ１とＲ２は独立的にＣ１ −Ｃ４アルキルであるか、又はＲ１とＲ２は飽和環状化合物の−部として結合されることができる］で示されるスルホキシド化合物をさらに含む請求項３６記載の方法。
３８．スルホキシド化合物がＤＭＳＯである請求項３７記載の方法。
３９．ｒＮＴＰの濃度が約６ｍＭであり、反応媒質が（ｉ）Ｃ１−Ｃ１０アルコール；（ｉｉ）式ＨＯＣＨ２（ＣＨＯＨ）■ＣＨ２ＯＨ［式中、ｘは０〜２０である］で示される糖アルコール；（ｉｉｉ）式：Ｈ（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎは２〜６００である］で示されるポリエチレングリコール化合物：及び（ｉｖ）単糖、二糖及び三糖類から成る群からの糖から成る群から選択される少なくとも１種の化合物約１〜約２５重量％をさらに含む請求項３８記載の方法。
４０．前記化合物がソルビトール、グリセロール、エタノール、スクロース及びポリエチレングリコールから成る群から選択される請求項３９記載の方法。
４１．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性がＴ７、Ｔ３及びＳＰ６から成る群から選択されるバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼによって与えられる請求項４０記載の方法。
４２．反応媒質が３０ｍＭＭｇＣ１２、２０ｍＭＫＣ１、１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭスペルミジン、６ｍＭｒＮＴＰ及び１ｍＭｄＮＴＰを含む請求項４１記載の方法。
４３．リバーストランスクリプターゼがＡＭＶリバーストランスクリプターゼ、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ及びＨＩＶ−１リバーストランスクリプターゼから成る群から選択される請求項４２記載の方法。
４４．リバーストランスクリプターゼがＡＭＶリバーストランスクリプターゼであり、ＲＮＡ標的セグメントが約４００ヌクレオチドより大きい長さを有し、反応媒質がさらに１０％ＤＭＳＯと１５％ソルビトールを含む請求項４３記載の方法。
４５．第１プライマーの第１サプセグメントの配列が標的セグメントの３′−サプセグメントの配列に正確に相補的であり、第２プライマーの第１サブセグメントの配列が標的セグメントの５′−サブセグメントの配列と同じである請求項４４記載の方法。
４６．標的ＲＮＡセグメントを増幅させるためにインキュベートした後に、標的ＲＮＡセグメント又は、前記標的ＲＮＡセグメントの配列に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントを核酸プローブハイブリダイゼーション分析において検出する請求項４５記載の方法。
４７．第１ＤＮＡプライマーが前記プロモーター供給セグメントを含み、第２プライマーがプロモーター供給セグメントを有さない請求項２４記載の方法。
４８．反応媒質に１０％ＤＭＳＯと１５％ソルビトールとが追加され、ＲＮＡ標的セグメントが約７００ヌクレオチド未満の長さを有する請求項４７記載の方法。
４９．プロモーター供給セグメントがＴ７プロモーターからである請求項４８記載の方法。
５０．第１プライマーの第１サプセグメントの配列が標的セグメントの３′−サプセグメントの配列に正確に相補的であり、第２プライマーの第１サプセグメントの配列が標的セグメントの５′−サプセグメントの配列と同じである請求項４９記載の方法。
５１．ＲＮＡ標的セグメントが少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、２ＤＮＡプライマーの標的ハイブリッド形成セグメントがそれぞれ約１５ヌクレオチドの長さである請求項５０記載の方法。
５２．第１プライマーが第１プロモーター供給サブセグメントを含み、第１プロモーターを供給して、２プライマーの伸長生成物を含むｃＤＮＡの転写を開始させ、第２プライマーが第２プロモーター供給サブセグメントを含み、第２プロモーターを供給して、２プライマーの伸長生成物を含むｃＤＮＡの転写を開始させ、反応媒質中の前記第１プロモーターが転写に触媒作用を及ぼす第１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、反応媒質中の前記第２プロモーターが転写に触媒作用を及ぼす第２ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、前記第１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと前記第２ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとが同−又は異なるものであり、反応媒質が前記第２ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む請求項２４記載の方法。
５３．第１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが前記第２ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとは異なるものであり、反応媒質中で前記第２ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは前記第２プロモーターを認識するが、前記第１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは認識せず、反応媒質が前記第２ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む請求項５２記載の方法。
５４．第１プライマーの第１サプセグメントの配列が標的セグメントの３′−サプセグメントの配列に正確に相補的であり、第２プライマーの第１サプセグメントの配列が標的セグメントの５′−サプセグメントの配列と同じである請求項５３記載の方法。
５５．ＲＮＡ標的セグメントが少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、２ＤＮＡプライマーの標的ハイブリッド形成セグメントがそれぞれ約１５ヌクレオチドの長さである請求項５４記載の方法。
５６．核酸を含むサンプル中の少なくとも一つの特定のＲＮＡ標的配列を検出するために有用なキットであって、本質的に次の要素二（ａ）（１）３′−末端ヌクレオチドを有し、５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サプセグメントを３′−末端に含む一本鎖ＤＮＡである第１ＤＮＡプライマーであって、前記第１サブセグメントが標的セグメントの３′−サプセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの３′−サプセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる第１ＤＮＡプライマー、及び（２）３′−末端ヌクレオチドを有し、５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サプセグメントを３′−末端に含む−本鎖ＤＮＡである第２ＤＮＡプライマーであって、前記第１サプセグメントが標的セグメントの５′−サブセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの５′−サプセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる第２ＤＮＡプライマー、但し前記プライマーの少なくとも−方は第１プロモーターのセンス鎖を含むプロモーター供給サブセグメントをさらに含み、前記センス鎖は前記プロモーター供給サプセグメントを含むプライマーの第１サプセグメントに、前記２プライマーの伸長生成物を含むｃＤＮＡの前記第１プロモーターからの転写に関して、機能的に結合する、また前記第１プライマーがこのようなプロモーター供給サプセグメントを欠く場合には、前記標的ＲＮＡセグメントの前記５′−サブセグメントの５′−末端ヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子の５′−末端ヌクレオチドであるとする：（ｂ）（１）前記反応媒質中でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び高感度増幅−有効量のＲＮＡｓｅＨ活性を示すリバーストランスクリプターゼ、及び（２）前記反応媒質中で前記第１プロモーターからの転写に触媒作用を及ぼすＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ：及び（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の基質として必要なヌクレオシド三リン酸から成るキット。
５７．核酸を含むサンプル中の少なくとも一つの特定のＲＮＡ標的配列を検出するために有用なキットであって、約２０〜４０ｍＭＭｇＣ１２、約１〜２５ｍＭＫＣｌ、約１〜２０ｍＭジチオスレイトール、約１〜１０ｍＭスペルミジン、約１〜８ｍＭｒＮＴＰ、約０．１〜２ｍＭｄＮＴＰ、及び反応媒質を約ｐＨ８に維持するための有効量の緩衝液を含む反応媒質を含むキット。
５８．反応媒質が３０ｍＭＭｇＣｌ２、２０ｍＭＫＣＩ、１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭスペルミジン、６ｍＭｒＮＴＰ、１ｍＭｄＮＴＰ、及び４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩを含み、ｐＨが約ｐＨ８．１である請求項５７記載のキット。
５９．転写に基づく増幅系において、標的セグメントの５′−末端ヌクレオチドを含み、そこから３′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する５′−サプセグメントと、標的セグメントの３′−末端ヌクレオチドを含み、そこから５′− 方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する、５′−サブセグメントと重複しない３′−サプセグメントとを含む標的核酸セグメントを増幅させるためのＤＮＡプライマー対であって、次の要素：（１）３′−末端ヌクレオチドを有し、５′− 方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サプセグメントを３′−末端に含む−本鎖ＤＮＡである第１ＤＮＡプライマーであって、その前記第１サプセグメントが標的セグメントの３′−サプセグメントと同ヒ長さであり、標的セグメントの３′−サプセグメントの配列と充分に相補的な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる第１ＤＮＡプライマー、及び（２）３′−末端ヌクレオチドを有し、５′−方向に少なくとも９ヌクレオチド伸長する第１サプセグメントを３′−末端に含む− 本鎖ＤＮＡである第２ＤＮＡプライマーであって、その前記第１サブセグメントが標的セグメントの５′−サブセグメントと同じ長さであり、標的セグメントの５′−サプセグメントの配列と充分に相同な配列を有し、反応媒質中で標的セグメントの配列を有する核酸が鋳型であるプライマー伸長反応を開始させる第２ＤＮＡプライマーを含み、前記プライマーの少なくとも−方がプロモーター供給サブセグメントを含み、該プロモーター供給サプセグメントは（ｉ）その５′−末端において１〜１０ヌクレオチドを有するＤＮＡセグメントを含み、該１〜１０ヌクレオチドＤＮＡセグメントが単−ホスホジエステル結合を通して（ｉｉ）第１プロモーターのセンス鎖のポリメラーゼ結合セグメントの５′−ヌクレオチドに結合し、前記ポリメラーゼ結合セグメントが前記第１プロモーターの前記センス鎖の共通配列と同じ長さを有し、前記プロモーター供給セグメントを含むプライマーの第１サプセグメントと、前記２プライマーの伸長生成物を含むｃＤＮＡの前記第１プロモーターからの転写に関して機能的に結合するＤＮＡプライマー対。
６０．プロモーター供給セグメントが１〜４ヌクレオチドを有する転写開始セグメントをさらに含み、前記転写開始配列が単−ホスホジエステル結合を通してプロモーター共通配列の３′−ヌクレオチドに結合する請求項５９記載のＤＮＡプライマー対。
６１．転写開始配列が５′−ＧＡＡＡ−３′である請求項６０記載のＤＮＡプライマー対。