JP2002320497A - エキソヌクレアーゼ含有溶解物を用いる無細胞ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系、またはエキソヌクレアーゼを含む細胞系における、安定化された線状短鎖ＤＮＡからのタンパク質発現方法 - Google Patents
エキソヌクレアーゼ含有溶解物を用いる無細胞ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系、またはエキソヌクレアーゼを含む細胞系における、安定化された線状短鎖ＤＮＡからのタンパク質発現方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、エキソヌクレアーゼ含有溶解物を
用いる無細胞in vitro転写／翻訳系、またはエキソヌク
レアーゼを含む細胞系において安定化された線状短鎖Ｄ
ＮＡの転写及びそれに続く翻訳の段階を含むタンパク質
発現方法に関する。 【解決手段】 本発明の方法は、線状短鎖ＤＮＡの安定
性が、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼから保護する
１または複数の以下の手段： ａ）鋳型の３’末端へのエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド類似体または他の分子の取り込み、 ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド含有ＰＣＲプ
ライマー対の使用による線状短鎖ＤＮＡの作製、 ｃ）５’プライマーを相補鎖の３’末端に連結すること
による、ＰＣＲ反応によって作製される鋳型の保護、 ｄ）線状の鋳型の両末端に結合するＤＮＡ配列特異的結
合分子による鋳型の保護、 ｅ）競合的または非競合的阻害剤の添加によるエキソヌ
クレアーゼの不活性化、 ｆ）鋳型の環状化による環状の閉じた鋳型の形成、によ
って改善されることを特徴とする。
用いる無細胞in vitro転写／翻訳系、またはエキソヌク
レアーゼを含む細胞系において安定化された線状短鎖Ｄ
ＮＡの転写及びそれに続く翻訳の段階を含むタンパク質
発現方法に関する。 【解決手段】 本発明の方法は、線状短鎖ＤＮＡの安定
性が、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼから保護する
１または複数の以下の手段： ａ）鋳型の３’末端へのエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド類似体または他の分子の取り込み、 ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド含有ＰＣＲプ
ライマー対の使用による線状短鎖ＤＮＡの作製、 ｃ）５’プライマーを相補鎖の３’末端に連結すること
による、ＰＣＲ反応によって作製される鋳型の保護、 ｄ）線状の鋳型の両末端に結合するＤＮＡ配列特異的結
合分子による鋳型の保護、 ｅ）競合的または非競合的阻害剤の添加によるエキソヌ
クレアーゼの不活性化、 ｆ）鋳型の環状化による環状の閉じた鋳型の形成、によ
って改善されることを特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エキソヌクレアー
ゼ含有溶解物を用いる無細胞in vitro転写／翻訳系、又
はエキソヌクレアーゼを含む細胞系における、安定化さ
れた線状短鎖ＤＮＡの転写、及びそれに続く翻訳の段階
を含むタンパク質発現方法であって、線状短鎖ＤＮＡの
安定性が、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼから保護
するための以下に示す１又は複数の手段によって改善さ
れる方法に関する： ａ）鋳型の３’末端へのエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド類似体又は他のエキソヌクレアーゼ耐性分子の取
り込み、 ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド含有ＰＣＲプ
ライマー対の使用による線状短鎖ＤＮＡの作製、 ｃ）５’末端を相補鎖の３’末端に連結することによ
る、ＰＣＲ反応によって作製される鋳型の保護、 ｄ）線状の鋳型の両末端に結合するＤＮＡ配列特異的結
合分子による鋳型の保護、 ｅ）競合的又は非競合的阻害剤の添加によるエキソヌク
レアーゼの不活性化、 ｆ）鋳型の環状化による環状の閉じた鋳型の形成。
ゼ含有溶解物を用いる無細胞in vitro転写／翻訳系、又
はエキソヌクレアーゼを含む細胞系における、安定化さ
れた線状短鎖ＤＮＡの転写、及びそれに続く翻訳の段階
を含むタンパク質発現方法であって、線状短鎖ＤＮＡの
安定性が、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼから保護
するための以下に示す１又は複数の手段によって改善さ
れる方法に関する： ａ）鋳型の３’末端へのエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド類似体又は他のエキソヌクレアーゼ耐性分子の取
り込み、 ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド含有ＰＣＲプ
ライマー対の使用による線状短鎖ＤＮＡの作製、 ｃ）５’末端を相補鎖の３’末端に連結することによ
る、ＰＣＲ反応によって作製される鋳型の保護、 ｄ）線状の鋳型の両末端に結合するＤＮＡ配列特異的結
合分子による鋳型の保護、 ｅ）競合的又は非競合的阻害剤の添加によるエキソヌク
レアーゼの不活性化、 ｆ）鋳型の環状化による環状の閉じた鋳型の形成。
【０００２】
【従来の技術】無細胞ＤＮＡ-依存的in vitro 転写/翻
訳は、環状二重らせんＤＮＡの発現及び長鎖線状ＤＮＡ
の発現を実施する際においては非常にうまく機能する。
短鎖線状ＤＮＡ片の発現における試みは、限定的な成功
をおさめているにすぎない。使用するＤＮＡが小さくな
るほど、感知できる程度の量の遺伝子産物を得るのは難
しくなる。このような困難性は、エキソヌクレアーゼの
存在によることが立証された。すなわち、大腸菌のS30
溶解物がin vitroで転写及び翻訳されるときに、エキソ
ヌクレアーゼＶが線状ＤＮＡの分解に関与していること
が示された。エキソヌクレアーゼＶは３つのサブユニッ
ト(遺伝子産物recB、recC、redD)から構成される。この
エキソヌクレアーゼは線状ＤＮＡの切断をその３’末端
から開始する。
訳は、環状二重らせんＤＮＡの発現及び長鎖線状ＤＮＡ
の発現を実施する際においては非常にうまく機能する。
短鎖線状ＤＮＡ片の発現における試みは、限定的な成功
をおさめているにすぎない。使用するＤＮＡが小さくな
るほど、感知できる程度の量の遺伝子産物を得るのは難
しくなる。このような困難性は、エキソヌクレアーゼの
存在によることが立証された。すなわち、大腸菌のS30
溶解物がin vitroで転写及び翻訳されるときに、エキソ
ヌクレアーゼＶが線状ＤＮＡの分解に関与していること
が示された。エキソヌクレアーゼＶは３つのサブユニッ
ト(遺伝子産物recB、recC、redD)から構成される。この
エキソヌクレアーゼは線状ＤＮＡの切断をその３’末端
から開始する。
【０００３】このエキソヌクレアーゼのサブユニットを
変異させて溶解活性を除去することにより、この問題を
解決することが試みられた。Yangら（(1980) PNAS vol.
77,No. 12, pp 7029-7033）は、エキソヌクレアーゼＶ
を欠失させた後の大腸菌株CF300（遺伝子recB、recCの
除去、recB21株）を用いる、線状ＤＮＡ鋳型からの改善
されたタンパク質合成について記載する。
変異させて溶解活性を除去することにより、この問題を
解決することが試みられた。Yangら（(1980) PNAS vol.
77,No. 12, pp 7029-7033）は、エキソヌクレアーゼＶ
を欠失させた後の大腸菌株CF300（遺伝子recB、recCの
除去、recB21株）を用いる、線状ＤＮＡ鋳型からの改善
されたタンパク質合成について記載する。
【０００４】Leavel Bassetら（J Bacteriol. (1983),
vol. 156 No. 3 , pp 1359-1362）は、さらに、rec B21
株のＲＮａｓｅ及びポリヌクレオチドホスホリラーゼ遺
伝子(rna-19 pnp-7)を変異させ(CLB7株)、線状ＤＮＡ鋳
型を用い、１時間のインキュベーションの後、有意に高
度なタンパク質発現を達成した。
vol. 156 No. 3 , pp 1359-1362）は、さらに、rec B21
株のＲＮａｓｅ及びポリヌクレオチドホスホリラーゼ遺
伝子(rna-19 pnp-7)を変異させ(CLB7株)、線状ＤＮＡ鋳
型を用い、１時間のインキュベーションの後、有意に高
度なタンパク質発現を達成した。
【０００５】Lesleyら（J. Biol. Chem (1991), vol. 2
66 No. 4 , pp. 2632-38）は、SL119株と称されるエキ
ソヌクレアーゼＶ欠失recD BL21株を使用し、ＰＣＲで
作製した鋳型からin vitroでタンパク質を合成する方法
について初めて記載した。線状鋳型を用いるin vitro転
写/翻訳のためのSL119株の溶解物は、市販の物が入手可
能である(Promega)。
66 No. 4 , pp. 2632-38）は、SL119株と称されるエキ
ソヌクレアーゼＶ欠失recD BL21株を使用し、ＰＣＲで
作製した鋳型からin vitroでタンパク質を合成する方法
について初めて記載した。線状鋳型を用いるin vitro転
写/翻訳のためのSL119株の溶解物は、市販の物が入手可
能である(Promega)。
【０００６】しかし、上記の手段の欠点は、これらの変
異体はすべて増殖が遅く、また、これらの株から得られ
た溶解物は合成速度がかなり遅いことである。エキソヌ
クレアーゼが細菌の代謝において重要な役割を担ってい
ることは明らかである。従ってエキソヌクレアーゼが存
在する溶解物又は細胞培養物を使用することが重要であ
ると考えられる。
異体はすべて増殖が遅く、また、これらの株から得られ
た溶解物は合成速度がかなり遅いことである。エキソヌ
クレアーゼが細菌の代謝において重要な役割を担ってい
ることは明らかである。従ってエキソヌクレアーゼが存
在する溶解物又は細胞培養物を使用することが重要であ
ると考えられる。
【０００７】一本鎖核酸は、アンチセンスの分野におけ
る核酸に関する文献、及び以下の引用文献に記載される
ように、両末端を保護するか若しくは修飾ヌクレオチド
ビルディングブロックを用いて核酸を修飾することによ
り、エキソヌクレアーゼによる分解から保護された。
る核酸に関する文献、及び以下の引用文献に記載される
ように、両末端を保護するか若しくは修飾ヌクレオチド
ビルディングブロックを用いて核酸を修飾することによ
り、エキソヌクレアーゼによる分解から保護された。
【０００８】一本鎖ＤＮＡ/ＲＮＡ分子は、その末端を
アルキル基で保護することにより、及び塩基を修飾する
ことにより保護できる（Pandolfiら, (1999) Nucleosid
es &Nucleotides. 18(9), 2051-2069）。Verheijenら，
(2000) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1
0, 801-804は、一本鎖ＤＮＡ分子の安定性が、その末端
を４-ヒドロキシ-Ｎ-アセチルプロリノール、Ｌ-セリノ
ール又は３’-３’-ホスホジエステル結合で保護するこ
とによって増大することを示す。純粋な又は混合のホス
ホロチオエート結合及び化学的に修飾されたオリゴヌク
レオチド、例えば、メチルホスホネート及びホスホロア
ミデートは、より安定で、エキソヌクレアーゼによって
よりゆっくり分解される（Kandimallaら, NAR (1997) v
ol. 25. No. 2, pp 370-378）。Tohdaら（(1994) Journ
al of Biotechnology 34 (1994) 61-69）は、ホスホロ
チオエートを含むＲＮＡがヌクレアーゼに対してより安
定であり、そのため翻訳効率も高いことを示している。
しかし、全体としては、タンパク質は少量しか産生され
ない。Tangら（(1993) NAR, vol. 21, No. 11, pp 2279
-2735）は、ヘアピンループ構造が、エキソヌクレアー
ゼによる分解から一本鎖ＤＮＡの３’末端を保護するこ
とを示す。Hiraoら（(1993) FEBS, vol. 321, No. 2,
3, 169-172）は、ＤＮＡ断片d(GCGAAGC) が形成するヘ
アピンが、大腸菌抽出物由来のヌクレアーゼに対して極
めて耐性であることを示す。Yoshizawaら（(1994) NAR,
Vol. 22, No. 12, pp 2217-2221）は、同じヘアピンと
のハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡ ３’末端の
安定化が、大腸菌抽出物を用いたin vitro翻訳の効率を
200倍に増大させることを示す。Good及びNielsen（(199
8) PNAS USA 95, 2073-2076）は、ペプチド主鎖に結合
した塩基を含む合成分子(ペプチド核酸、ＰＮＡ)が大腸
菌抽出物内における加水分解に対して耐性であり、アン
チセンス分子として使用できることを示す。Burdick及
びEmlen（(1985) J. Immunology 135, 2593-2597）は、
ＤＮＡ−アンチＤＮＡ免疫複合体において、ＩｇＧ分子
が、自らに結合しているＤＮＡを核酸分解から保護でき
ることを記載する。
アルキル基で保護することにより、及び塩基を修飾する
ことにより保護できる（Pandolfiら, (1999) Nucleosid
es &Nucleotides. 18(9), 2051-2069）。Verheijenら，
(2000) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1
0, 801-804は、一本鎖ＤＮＡ分子の安定性が、その末端
を４-ヒドロキシ-Ｎ-アセチルプロリノール、Ｌ-セリノ
ール又は３’-３’-ホスホジエステル結合で保護するこ
とによって増大することを示す。純粋な又は混合のホス
ホロチオエート結合及び化学的に修飾されたオリゴヌク
レオチド、例えば、メチルホスホネート及びホスホロア
ミデートは、より安定で、エキソヌクレアーゼによって
よりゆっくり分解される（Kandimallaら, NAR (1997) v
ol. 25. No. 2, pp 370-378）。Tohdaら（(1994) Journ
al of Biotechnology 34 (1994) 61-69）は、ホスホロ
チオエートを含むＲＮＡがヌクレアーゼに対してより安
定であり、そのため翻訳効率も高いことを示している。
しかし、全体としては、タンパク質は少量しか産生され
ない。Tangら（(1993) NAR, vol. 21, No. 11, pp 2279
-2735）は、ヘアピンループ構造が、エキソヌクレアー
ゼによる分解から一本鎖ＤＮＡの３’末端を保護するこ
とを示す。Hiraoら（(1993) FEBS, vol. 321, No. 2,
3, 169-172）は、ＤＮＡ断片d(GCGAAGC) が形成するヘ
アピンが、大腸菌抽出物由来のヌクレアーゼに対して極
めて耐性であることを示す。Yoshizawaら（(1994) NAR,
Vol. 22, No. 12, pp 2217-2221）は、同じヘアピンと
のハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡ ３’末端の
安定化が、大腸菌抽出物を用いたin vitro翻訳の効率を
200倍に増大させることを示す。Good及びNielsen（(199
8) PNAS USA 95, 2073-2076）は、ペプチド主鎖に結合
した塩基を含む合成分子(ペプチド核酸、ＰＮＡ)が大腸
菌抽出物内における加水分解に対して耐性であり、アン
チセンス分子として使用できることを示す。Burdick及
びEmlen（(1985) J. Immunology 135, 2593-2597）は、
ＤＮＡ−アンチＤＮＡ免疫複合体において、ＩｇＧ分子
が、自らに結合しているＤＮＡを核酸分解から保護でき
ることを記載する。
【０００９】EP 0 967 274は、ダンベル形状の線状二本
鎖ＤＮＡ分子を調製する方法を記載する。この方法にお
いては、プラスミドを制限酵素で切断し、得られた二本
鎖の非共有結合によって閉じた分子の末端を、制限エン
ドヌクレアーゼで分解して一本鎖突出部を形成させ、続
いてマッチしたヘアピンオリゴマーを、得られた一本鎖
突出部に連結させることによって修飾し、ダンベル形状
の構築物を形成する。この構築物はＴ７ＤＮＡポリメラ
ーゼのエキソヌクレアーゼに対して増大した安定性を有
する。
鎖ＤＮＡ分子を調製する方法を記載する。この方法にお
いては、プラスミドを制限酵素で切断し、得られた二本
鎖の非共有結合によって閉じた分子の末端を、制限エン
ドヌクレアーゼで分解して一本鎖突出部を形成させ、続
いてマッチしたヘアピンオリゴマーを、得られた一本鎖
突出部に連結させることによって修飾し、ダンベル形状
の構築物を形成する。この構築物はＴ７ＤＮＡポリメラ
ーゼのエキソヌクレアーゼに対して増大した安定性を有
する。
【００１０】保護戦略を有しない他の無細胞発現系は、
従来技術において記載されている：US 5571690におい
て、Hechtは、ＰＣＲ反応で作製された鋳型からのタン
パク質の無細胞合成方法について記載する。この方法で
は、プラスミド由来のファージプロモーター領域を含む
全遺伝子配列を増幅する。in vitro 転写の後、ウサギ
網状赤血球からの溶解物を翻訳のために使用する。この
方法により、転写の後、５’ＣＡＰで修飾されたｍＲＮ
Ａを用いて57μg/mlのタンパク質を産生することができ
た。Martemyanovら（(1997) FEBS Lett. 414, 268-27
0）は、２段階ＰＣＲ反応において作製した鋳型からの
タンパク質の無細胞合成のために、大腸菌由来のS30抽
出物を使用する。この方法では、まず標的遺伝子を、２
個の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用い
たＰＣＲ反応で増幅し、続いて、いわゆるメガプライマ
ーを用いる第２のＰＣＲ反応に付して、Ｔ７プロモータ
ーとリボソーム結合部位を増幅した遺伝子に結合させ
る。これにより放射能で検出可能な量のタンパク質を産
生できるにすぎなかった。Yangら（(2000) J. Bacterio
l.182, 295-302）は、大腸菌由来のS30抽出物を用い、
ＰＣＲ反応で作製した鋳型からのタンパク質の無細胞合
成を実証する。この方法においては、放射能で検出可能
な量のタンパク質を産生できるにすぎなかった。Nakano
ら（(1999) Biotechnol. & Bioeng. 64, 194-199）は、
中空繊維リアクター中で大腸菌由来のS30抽出物を用い
て、ＰＣＲ反応で作製した鋳型から、反応混合物1mlあ
たり少なくとも80μgのタンパク質を産生する。US 6027
913においてSommerは、１段階ＰＣＲ反応で作製した鋳
型からのタンパク質の無細胞合成のために、網状赤血球
由来の抽出物を使用した。この方法では、Ｔ７プロモー
ター及びリボソーム結合部位を標的遺伝子に結合する。
この方法を用いても、少量のタンパク質が産生されるに
すぎなかった。
従来技術において記載されている：US 5571690におい
て、Hechtは、ＰＣＲ反応で作製された鋳型からのタン
パク質の無細胞合成方法について記載する。この方法で
は、プラスミド由来のファージプロモーター領域を含む
全遺伝子配列を増幅する。in vitro 転写の後、ウサギ
網状赤血球からの溶解物を翻訳のために使用する。この
方法により、転写の後、５’ＣＡＰで修飾されたｍＲＮ
Ａを用いて57μg/mlのタンパク質を産生することができ
た。Martemyanovら（(1997) FEBS Lett. 414, 268-27
0）は、２段階ＰＣＲ反応において作製した鋳型からの
タンパク質の無細胞合成のために、大腸菌由来のS30抽
出物を使用する。この方法では、まず標的遺伝子を、２
個の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用い
たＰＣＲ反応で増幅し、続いて、いわゆるメガプライマ
ーを用いる第２のＰＣＲ反応に付して、Ｔ７プロモータ
ーとリボソーム結合部位を増幅した遺伝子に結合させ
る。これにより放射能で検出可能な量のタンパク質を産
生できるにすぎなかった。Yangら（(2000) J. Bacterio
l.182, 295-302）は、大腸菌由来のS30抽出物を用い、
ＰＣＲ反応で作製した鋳型からのタンパク質の無細胞合
成を実証する。この方法においては、放射能で検出可能
な量のタンパク質を産生できるにすぎなかった。Nakano
ら（(1999) Biotechnol. & Bioeng. 64, 194-199）は、
中空繊維リアクター中で大腸菌由来のS30抽出物を用い
て、ＰＣＲ反応で作製した鋳型から、反応混合物1mlあ
たり少なくとも80μgのタンパク質を産生する。US 6027
913においてSommerは、１段階ＰＣＲ反応で作製した鋳
型からのタンパク質の無細胞合成のために、網状赤血球
由来の抽出物を使用した。この方法では、Ｔ７プロモー
ター及びリボソーム結合部位を標的遺伝子に結合する。
この方法を用いても、少量のタンパク質が産生されるに
すぎなかった。
【００１１】しかし、上記の方法は満足できるものでは
ない。ウサギ網状赤血球からの真核細胞溶解物は比較的
ヌクレアーゼが少ないが、このような溶解物は大量を経
済的に産生することができないという欠点を有する。そ
れらは、非常に少量のタンパク質収量を可能にするにす
ぎない。同様のことが小麦胚芽からの溶解物にも当ては
まり、これは細心の注意を払って調製する必要があり、
そうしなければ周囲の組織に由来する翻訳阻害因子によ
って、ひどく汚染されてしまう(JP 236 896/2000)。
ない。ウサギ網状赤血球からの真核細胞溶解物は比較的
ヌクレアーゼが少ないが、このような溶解物は大量を経
済的に産生することができないという欠点を有する。そ
れらは、非常に少量のタンパク質収量を可能にするにす
ぎない。同様のことが小麦胚芽からの溶解物にも当ては
まり、これは細心の注意を払って調製する必要があり、
そうしなければ周囲の組織に由来する翻訳阻害因子によ
って、ひどく汚染されてしまう(JP 236 896/2000)。
【００１２】これとは対照的に、大腸菌溶解物はずっと
大量のタンパク質を産生する。しかし、大腸菌から溶解
物を調製するために記載された方法では、線状ＤＮＡ鋳
型を用いた場合、最大約１時間という比較的短い反応期
間のみが許容される。なぜなら、その後は、これらのＤ
ＮＡ鋳型はこの溶解物に含まれるエキソヌクレアーゼに
よって完全に分解されるからである。大腸菌エキソヌク
レアーゼ変異体（すなわち、エキソヌクレアーゼ欠失
株）から得られた溶解物は、例えばA19株などの対応す
る野生型株よりも合成効率が有意に低い。
大量のタンパク質を産生する。しかし、大腸菌から溶解
物を調製するために記載された方法では、線状ＤＮＡ鋳
型を用いた場合、最大約１時間という比較的短い反応期
間のみが許容される。なぜなら、その後は、これらのＤ
ＮＡ鋳型はこの溶解物に含まれるエキソヌクレアーゼに
よって完全に分解されるからである。大腸菌エキソヌク
レアーゼ変異体（すなわち、エキソヌクレアーゼ欠失
株）から得られた溶解物は、例えばA19株などの対応す
る野生型株よりも合成効率が有意に低い。
【００１３】ｍＲＮＡを保護する方法では、保護された
ｍＲＮＡを溶解物に添加する前に、まずin vitro転写を
実施しなければならないという欠点を有する。そうする
と今度は、共役反応及び連続ＲＮＡ合成が不可能とな
る。ＲＮＡを保護する方法は、Tohdaら (1994) Journal
of Biotechnology 34 (1994) 61-69, Yoshizawaら, (1
994) NAR, vol. 22, pp 2217-2221に記載されている。
ｍＲＮＡを溶解物に添加する前に、まずin vitro転写を
実施しなければならないという欠点を有する。そうする
と今度は、共役反応及び連続ＲＮＡ合成が不可能とな
る。ＲＮＡを保護する方法は、Tohdaら (1994) Journal
of Biotechnology 34 (1994) 61-69, Yoshizawaら, (1
994) NAR, vol. 22, pp 2217-2221に記載されている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】すなわち従来技術で
は、好適な試薬で修飾又は処理することによりエキソヌ
クレアーゼから二本鎖ＤＮＡを保護し、これをエキソヌ
クレアーゼ含有無細胞溶解物又はエキソヌクレアーゼを
含む細胞系におけるタンパク質発現に使用する方法は提
供されていない。従って、課題は、特に、ＤＮＡを保護
するための保護的手段ではあるが、タンパク質の発現を
可能にし、かつタンパク質の発現を阻害又は妨害しな
い、二本鎖ＤＮＡを保護する方法を開発することであ
る。
は、好適な試薬で修飾又は処理することによりエキソヌ
クレアーゼから二本鎖ＤＮＡを保護し、これをエキソヌ
クレアーゼ含有無細胞溶解物又はエキソヌクレアーゼを
含む細胞系におけるタンパク質発現に使用する方法は提
供されていない。従って、課題は、特に、ＤＮＡを保護
するための保護的手段ではあるが、タンパク質の発現を
可能にし、かつタンパク質の発現を阻害又は妨害しな
い、二本鎖ＤＮＡを保護する方法を開発することであ
る。
【００１５】従って本発明の課題は、エキソヌクレアー
ゼ含有溶解物を用いる無細胞ＤＮＡ依存的in vitro転写
／翻訳系、又はエキソヌクレアーゼを含む細胞系におけ
るタンパク質発現に使用するための、好適な試薬で修飾
又は処理することによりエキソヌクレアーゼから二本鎖
ＤＮＡを保護する方法である。
ゼ含有溶解物を用いる無細胞ＤＮＡ依存的in vitro転写
／翻訳系、又はエキソヌクレアーゼを含む細胞系におけ
るタンパク質発現に使用するための、好適な試薬で修飾
又は処理することによりエキソヌクレアーゼから二本鎖
ＤＮＡを保護する方法である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
り、エキソヌクレアーゼ含有溶解物を用いる無細胞invi
tro転写／翻訳系又はエキソヌクレアーゼを含む細胞系
における、安定化された線状短鎖ＤＮＡの転写、及びそ
れに続く翻訳を含むタンパク質発現方法であって、線状
短鎖ＤＮＡの安定性が、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレア
ーゼから保護するための以下に示す１又は複数の手段に
よって改善されることを特徴とする方法によって達成さ
れる： ａ）鋳型の３’末端へのエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド類似体又は他のエキソヌクレアーゼ耐性分子の取
り込み、 ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド含有ＰＣＲプ
ライマー対の使用による線状短鎖ＤＮＡの作製、 ｃ）５’末端を相補鎖の３’末端に連結することによる
鋳型の保護、 ｄ）線状の鋳型の両末端に結合するＤＮＡ配列特異的結
合分子による鋳型の保護、 ｅ）競合的又は非競合的阻害剤の添加によるエキソヌク
レアーゼの不活性化、 ｆ）鋳型の環状化による環状の閉じた鋳型の形成。
り、エキソヌクレアーゼ含有溶解物を用いる無細胞invi
tro転写／翻訳系又はエキソヌクレアーゼを含む細胞系
における、安定化された線状短鎖ＤＮＡの転写、及びそ
れに続く翻訳を含むタンパク質発現方法であって、線状
短鎖ＤＮＡの安定性が、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレア
ーゼから保護するための以下に示す１又は複数の手段に
よって改善されることを特徴とする方法によって達成さ
れる： ａ）鋳型の３’末端へのエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド類似体又は他のエキソヌクレアーゼ耐性分子の取
り込み、 ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド含有ＰＣＲプ
ライマー対の使用による線状短鎖ＤＮＡの作製、 ｃ）５’末端を相補鎖の３’末端に連結することによる
鋳型の保護、 ｄ）線状の鋳型の両末端に結合するＤＮＡ配列特異的結
合分子による鋳型の保護、 ｅ）競合的又は非競合的阻害剤の添加によるエキソヌク
レアーゼの不活性化、 ｆ）鋳型の環状化による環状の閉じた鋳型の形成。
【００１７】
【発明の実施の形態】手段ａ）において、ジデオキシヌ
クレオシド三リン酸を取り込むことにより、エキソヌク
レアーゼ耐性ヌクレオチド類似体を鋳型の３’末端に取
り込むことができる。あるいは、例えば、５’−ホスホ
チオエート保護ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌク
レオシド三リン酸を取り込むことも可能である。しか
し、酵素による取り込みに、ターミナルトランスフェラ
ーゼを使用する場合は、同様にエキソヌクレアーゼ耐性
であるパラニトロフェニルリン酸などのその他の分子を
取り込むこともできる。これらの分子は化学反応によっ
ても取り込むことができる。
クレオシド三リン酸を取り込むことにより、エキソヌク
レアーゼ耐性ヌクレオチド類似体を鋳型の３’末端に取
り込むことができる。あるいは、例えば、５’−ホスホ
チオエート保護ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌク
レオシド三リン酸を取り込むことも可能である。しか
し、酵素による取り込みに、ターミナルトランスフェラ
ーゼを使用する場合は、同様にエキソヌクレアーゼ耐性
であるパラニトロフェニルリン酸などのその他の分子を
取り込むこともできる。これらの分子は化学反応によっ
ても取り込むことができる。
【００１８】手段ｂ）において、エキソヌクレアーゼ耐
性ヌクレオチドを含むＰＣＲプライマー対を使用する場
合は、５’−ホスホチオエート保護ヌクレオシド三リン
酸又はデオキシヌクレオシド三リン酸を取り込むことが
できる。化学的なオリゴヌクレオチド合成において取り
込むことができ、オリゴヌクレオチドに取り込まれた後
それに続くＰＣＲ反応において当業者に公知の熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼの一つに対するプライマーとして機
能する、リン酸エステル及びデオキシリボースのヌクレ
オシド塩基の類似体のすべてを使用することも考えられ
る。
性ヌクレオチドを含むＰＣＲプライマー対を使用する場
合は、５’−ホスホチオエート保護ヌクレオシド三リン
酸又はデオキシヌクレオシド三リン酸を取り込むことが
できる。化学的なオリゴヌクレオチド合成において取り
込むことができ、オリゴヌクレオチドに取り込まれた後
それに続くＰＣＲ反応において当業者に公知の熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼの一つに対するプライマーとして機
能する、リン酸エステル及びデオキシリボースのヌクレ
オシド塩基の類似体のすべてを使用することも考えられ
る。
【００１９】手段ｃ）において、２個のヘアピン形成型
オリゴヌクレオチドアダプターを鋳型の遊離末端に連結
することにより、５’末端を相補鎖の３’末端に結合す
ることができる。オリゴヌクレオチドアダプターは、本
発明の意味において、例えば、配列番号１：５’-PO4-C
GCA CGC GTT TTC GCG TGC G-OH-３’である。オリゴヌ
クレオチドアダプターは、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結する。
オリゴヌクレオチドアダプターを鋳型の遊離末端に連結
することにより、５’末端を相補鎖の３’末端に結合す
ることができる。オリゴヌクレオチドアダプターは、本
発明の意味において、例えば、配列番号１：５’-PO4-C
GCA CGC GTT TTC GCG TGC G-OH-３’である。オリゴヌ
クレオチドアダプターは、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結する。
【００２０】手段ｃ）において、プライマーの化学合成
の際にプライマー配列中の１又は数個のヌクレオシドモ
ノマー単位を、１又は数個のデオキシリボースリン酸又
は対応する無塩基類似体、例えば、（1-ホスホ-(3,4)-
ヒドロキシブタンジオール）と置換し、これらのＰＣＲ
プライマーをＰＣＲで使用することにより、５’末端を
相補鎖の３’末端に結合することができる。これらのデ
オキシリボースリン酸又は無塩基類似体は、ポリメラー
ゼ反応の停止をもたらし、その結果、鋳型の５’末端に
一本鎖ＤＮＡ末端が生じる。この遊離の５’末端は、そ
れ自身でヘアピン型ループを形成し、その５’末端は、
例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて相補鎖の３’末端
に連結することができる。無塩基リンカーの代わりにヌ
クレオチド類似体を、その塩基又はリボースが例えばシ
リル基によって修飾されたプライマーに取り込み、ポリ
メラーゼによる伸長を阻止する同様の方法も考えられ
る。
の際にプライマー配列中の１又は数個のヌクレオシドモ
ノマー単位を、１又は数個のデオキシリボースリン酸又
は対応する無塩基類似体、例えば、（1-ホスホ-(3,4)-
ヒドロキシブタンジオール）と置換し、これらのＰＣＲ
プライマーをＰＣＲで使用することにより、５’末端を
相補鎖の３’末端に結合することができる。これらのデ
オキシリボースリン酸又は無塩基類似体は、ポリメラー
ゼ反応の停止をもたらし、その結果、鋳型の５’末端に
一本鎖ＤＮＡ末端が生じる。この遊離の５’末端は、そ
れ自身でヘアピン型ループを形成し、その５’末端は、
例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて相補鎖の３’末端
に連結することができる。無塩基リンカーの代わりにヌ
クレオチド類似体を、その塩基又はリボースが例えばシ
リル基によって修飾されたプライマーに取り込み、ポリ
メラーゼによる伸長を阻止する同様の方法も考えられ
る。
【００２１】手段ｃ）において、ソラレンなどの化学的
架橋剤を２個のＰＣＲプライマーの５’末端に取り込
み、ＰＣＲ反応の後に、例えば、ソラレンの場合には強
光の作用下で反応させて化学結合をつくることにより、
５’プライマーを相補鎖の３’末端に結合することがで
きる。
架橋剤を２個のＰＣＲプライマーの５’末端に取り込
み、ＰＣＲ反応の後に、例えば、ソラレンの場合には強
光の作用下で反応させて化学結合をつくることにより、
５’プライマーを相補鎖の３’末端に結合することがで
きる。
【００２２】手段ｃ）において、ＰＣＲの後、それに続
く塩基を用いた化学反応によって、又はウラシルＮ-グ
リコシラーゼを用いた酵素反応によって再度取り除かれ
３’突出部を形成する、１又は数個のヌクレオチド又は
ヌクレオチド類似体（例えば、ウリジン）をＰＣＲプラ
イマーに取り込むことによって、５’プライマーを相補
鎖の３’末端に結合することができる。この３’突出部
はそれ自身がヘアピン型のループを形成するように本発
明に従って構築され、この３’末端は相補鎖の５’末端
の反対側に正確に位置し、ＤＮＡギャップを、続いて、
例えばＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結によって閉じ、ダ
ンベル形状の内部の閉じた環となる。例えば、以下のオ
リゴヌクレオチドは、この目的で、センスプライマーと
して使用することができる（x1-xnは増幅しようとする
標的配列に相同なヌクレオチドである）。
く塩基を用いた化学反応によって、又はウラシルＮ-グ
リコシラーゼを用いた酵素反応によって再度取り除かれ
３’突出部を形成する、１又は数個のヌクレオチド又は
ヌクレオチド類似体（例えば、ウリジン）をＰＣＲプラ
イマーに取り込むことによって、５’プライマーを相補
鎖の３’末端に結合することができる。この３’突出部
はそれ自身がヘアピン型のループを形成するように本発
明に従って構築され、この３’末端は相補鎖の５’末端
の反対側に正確に位置し、ＤＮＡギャップを、続いて、
例えばＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結によって閉じ、ダ
ンベル形状の内部の閉じた環となる。例えば、以下のオ
リゴヌクレオチドは、この目的で、センスプライマーと
して使用することができる（x1-xnは増幅しようとする
標的配列に相同なヌクレオチドである）。
【００２３】配列番号２ 塩基又はウラシル-Ｎ-グリコシラーゼを切断のために使
用し、二本鎖を加熱して融解する場合は、５’プライマ
ーはヌクレオチドx1-xn（２）までドロップオフし、そ
して、その前にＰＣＲによって形成された３’末端はそ
れ自身とハイブリダイズできる。
用し、二本鎖を加熱して融解する場合は、５’プライマ
ーはヌクレオチドx1-xn（２）までドロップオフし、そ
して、その前にＰＣＲによって形成された３’末端はそ
れ自身とハイブリダイズできる。
【００２４】1. 配列番号３ 配列番号４ 2. 配列番号４ 3. 配列番号４ 手段ｃ）において、双方のＰＣＲプライマーの５’末端
に分子を取り込み、さらにこの分子又はその他の分子で
修飾したヌクレオチドを鋳型の３’末端に取り込み、こ
れら２個の分子を３’末端と５’末端で、タンパク質に
よって非共有結合で結合することによって、５’プライ
マーを相補鎖の３’末端に結合することもできる。例え
ば、２個の分子はビオチンでよく、タンパク質はアビジ
ン又はストレプトアビジンでよい。この場合、ビオチン
は、ビオチン化ヌクレオチドとして化学的に合成された
オリゴヌクレオチドを介して５’末端に取り込まれ、タ
ーミナルトランスフェラーゼを用いてビオチン化ヌクレ
オチド三リン酸として３’末端に導入される。ビオチン
はアビジン又はストレプトアビジンに対して高度の親和
性を有し、アビジン又はストレプトアビジンは最大４分
子のビオチンと結合できるため、アビジン又はストレプ
トアビジンは、２本の鎖における向かい合った２個のビ
オチン残基を結合することができる。二つの分子はジゴ
キシゲニンでもよく、タンパク質はジゴキシゲニンに対
する抗体又は抗体のジゴキシゲニン結合部でもよい。こ
の場合の工程は、アビジン/ストレプトアビジン及びビ
オチンを使用する場合と同様である。
に分子を取り込み、さらにこの分子又はその他の分子で
修飾したヌクレオチドを鋳型の３’末端に取り込み、こ
れら２個の分子を３’末端と５’末端で、タンパク質に
よって非共有結合で結合することによって、５’プライ
マーを相補鎖の３’末端に結合することもできる。例え
ば、２個の分子はビオチンでよく、タンパク質はアビジ
ン又はストレプトアビジンでよい。この場合、ビオチン
は、ビオチン化ヌクレオチドとして化学的に合成された
オリゴヌクレオチドを介して５’末端に取り込まれ、タ
ーミナルトランスフェラーゼを用いてビオチン化ヌクレ
オチド三リン酸として３’末端に導入される。ビオチン
はアビジン又はストレプトアビジンに対して高度の親和
性を有し、アビジン又はストレプトアビジンは最大４分
子のビオチンと結合できるため、アビジン又はストレプ
トアビジンは、２本の鎖における向かい合った２個のビ
オチン残基を結合することができる。二つの分子はジゴ
キシゲニンでもよく、タンパク質はジゴキシゲニンに対
する抗体又は抗体のジゴキシゲニン結合部でもよい。こ
の場合の工程は、アビジン/ストレプトアビジン及びビ
オチンを使用する場合と同様である。
【００２５】手段ｄ）において、線状鋳型の両末端に結
合するＤＮＡ配列特異的結合分子がこのＤＮＡ配列に対
する抗体又は抗体のＤＮＡ結合部であることも考えられ
る。本発明によると、手段ｄ）における、線状鋳型の２
つの末端に結合するＤＮＡ配列特異的結合分子は、最終
鋳型の３’末端及び/又は５’末端にハイブリダイズす
るＰＮＡ分子又は複数のＰＮＡ分子でもよい。
合するＤＮＡ配列特異的結合分子がこのＤＮＡ配列に対
する抗体又は抗体のＤＮＡ結合部であることも考えられ
る。本発明によると、手段ｄ）における、線状鋳型の２
つの末端に結合するＤＮＡ配列特異的結合分子は、最終
鋳型の３’末端及び/又は５’末端にハイブリダイズす
るＰＮＡ分子又は複数のＰＮＡ分子でもよい。
【００２６】手段ｄ）によってもたらされる保護は、基
本的には、大きな分子が線状鋳型の二つの末端に結合す
るものである。従って、例えば、ストレプトアビジン／
アビジンが結合したビオチン化末端も考えられるし、di
g抗体又は抗体のdig結合部が結合したジゴキシゲニン化
末端も考えられる。
本的には、大きな分子が線状鋳型の二つの末端に結合す
るものである。従って、例えば、ストレプトアビジン／
アビジンが結合したビオチン化末端も考えられるし、di
g抗体又は抗体のdig結合部が結合したジゴキシゲニン化
末端も考えられる。
【００２７】手段ｅ）において、エキソヌクレアーゼの
活性を競合的に阻害する非特異的ＤＮＡを添加すること
により、エキソヌクレアーゼを不活性化することができ
る。
活性を競合的に阻害する非特異的ＤＮＡを添加すること
により、エキソヌクレアーゼを不活性化することができ
る。
【００２８】手段ｅ）において、エキソヌクレアーゼの
活性を遮断する不活化抗体を添加することによって、エ
キソヌクレアーゼを不活性化することができる。
活性を遮断する不活化抗体を添加することによって、エ
キソヌクレアーゼを不活性化することができる。
【００２９】本発明はまた、手段ｆ）において、線状鋳
型の両末端を、例えばターミナルトランスフェラーゼを
用いてビオチン化し、ストレプトアビジン又はアビジン
を使用して両末端を結合して環を形成させる本発明の方
法に関する。手段ｆ）により、線状鋳型の両末端をジゴ
キシゲニン化し、ジゴキシゲニンに対する抗体又は抗体
のジゴキシゲニン結合部を結合させて両末端を連結する
ことができる。
型の両末端を、例えばターミナルトランスフェラーゼを
用いてビオチン化し、ストレプトアビジン又はアビジン
を使用して両末端を結合して環を形成させる本発明の方
法に関する。手段ｆ）により、線状鋳型の両末端をジゴ
キシゲニン化し、ジゴキシゲニンに対する抗体又は抗体
のジゴキシゲニン結合部を結合させて両末端を連結する
ことができる。
【００３０】本発明はまた、手段ｆ）において、線状鋳
型の２つの末端をＤＮＡ分子を介して、それに続いて酵
素的、化学的又は非共有結合的な連結によって環化する
本発明の方法に関する。例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いた２つの末端の直接的連結は、熱力学的に望ましく
なく、その進行は全く非効率的であり、従って、その殆
どは連結しないまま残るため、エキソヌクレアーゼの攻
撃を受けやすい。従って、ＤＮＡの末端に非常に長い突
出部を作製する必要がある。このような突出部は、相補
的ＤＮＡ片と対になったときに熱力学的に好ましい状態
に変化するため、効率的な連結が可能となる。
型の２つの末端をＤＮＡ分子を介して、それに続いて酵
素的、化学的又は非共有結合的な連結によって環化する
本発明の方法に関する。例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いた２つの末端の直接的連結は、熱力学的に望ましく
なく、その進行は全く非効率的であり、従って、その殆
どは連結しないまま残るため、エキソヌクレアーゼの攻
撃を受けやすい。従って、ＤＮＡの末端に非常に長い突
出部を作製する必要がある。このような突出部は、相補
的ＤＮＡ片と対になったときに熱力学的に好ましい状態
に変化するため、効率的な連結が可能となる。
【００３１】この目的のため、例えば、ＰＣＲ反応の停
止、及びそれによって５’突出部をもたらすプライマー
を使用するＰＣＲ反応によって鋳型を調製する。この点
に関し好適なプライマーは、特に、プライマー配列中に
ポリメラーゼによる鋳型の伸長を阻止する１又は数個の
修飾モノマー単位が導入されたプライマーである。本発
明の修飾モノマー単位は、例えば、デオキシリボースリ
ン酸、無塩基類似体又は特に、その塩基又はリボースが
修飾されそのためポリメラーゼによる伸長を阻止するヌ
クレオチド類似体である。あるいは、その後、請求項１
０と同様、完全に又は部分的に再度取り除くことができ
るプライマーを、ＰＣＲに使用することもできる。その
末端にすでに５’又は３’突出部を有するこのＰＣＲ産
物は、別のＤＮＡ片が鋳型と相補的な突出部を有する場
合は、これと連結させることによって環化することがで
きる。このようなＤＮＡ片は、化学合成でき、又は同様
のＰＣＲ法によって適当な突出部を提供することもでき
る。後者の方法は、互いに相補的な鋳型及びＤＮＡ分子
に突出した５’末端又は３’末端を作製することによっ
てＤＮＡ分子との連結が生じる場合に、特に好ましい。
突出した３’末端は、ＰＣＲ反応の後に続く化学反応又
は酵素反応によって再度取り除いて３’突出部を形成す
ることができる１又は数個のヌクレオチド又はヌクレオ
チド類似体を取り込むことによって作製する。突出した
５’末端は、ポリメラーゼによる鋳型の伸長を阻止する
修飾モノマー単位を１又は数個取り込むことによって作
製する。続いてＰＣＲ反応を実施する。修飾部位におけ
るポリメラーゼ反応の停止により、鋳型の５’末端に遊
離の一本鎖ＤＮＡ末端が生じる。修飾モノマー単位はま
た、デオキシリボースリン酸又は無塩基類似体でもよ
い。修飾モノマー単位はまた、その塩基又はリボースが
修飾されそのためポリメラーゼによる伸長を阻止するヌ
クレオチド類似体でもよい。
止、及びそれによって５’突出部をもたらすプライマー
を使用するＰＣＲ反応によって鋳型を調製する。この点
に関し好適なプライマーは、特に、プライマー配列中に
ポリメラーゼによる鋳型の伸長を阻止する１又は数個の
修飾モノマー単位が導入されたプライマーである。本発
明の修飾モノマー単位は、例えば、デオキシリボースリ
ン酸、無塩基類似体又は特に、その塩基又はリボースが
修飾されそのためポリメラーゼによる伸長を阻止するヌ
クレオチド類似体である。あるいは、その後、請求項１
０と同様、完全に又は部分的に再度取り除くことができ
るプライマーを、ＰＣＲに使用することもできる。その
末端にすでに５’又は３’突出部を有するこのＰＣＲ産
物は、別のＤＮＡ片が鋳型と相補的な突出部を有する場
合は、これと連結させることによって環化することがで
きる。このようなＤＮＡ片は、化学合成でき、又は同様
のＰＣＲ法によって適当な突出部を提供することもでき
る。後者の方法は、互いに相補的な鋳型及びＤＮＡ分子
に突出した５’末端又は３’末端を作製することによっ
てＤＮＡ分子との連結が生じる場合に、特に好ましい。
突出した３’末端は、ＰＣＲ反応の後に続く化学反応又
は酵素反応によって再度取り除いて３’突出部を形成す
ることができる１又は数個のヌクレオチド又はヌクレオ
チド類似体を取り込むことによって作製する。突出した
５’末端は、ポリメラーゼによる鋳型の伸長を阻止する
修飾モノマー単位を１又は数個取り込むことによって作
製する。続いてＰＣＲ反応を実施する。修飾部位におけ
るポリメラーゼ反応の停止により、鋳型の５’末端に遊
離の一本鎖ＤＮＡ末端が生じる。修飾モノマー単位はま
た、デオキシリボースリン酸又は無塩基類似体でもよ
い。修飾モノマー単位はまた、その塩基又はリボースが
修飾されそのためポリメラーゼによる伸長を阻止するヌ
クレオチド類似体でもよい。
【００３２】in vitroタンパク質合成に前もって必要な
のは、ＤＮＡ鋳型の産生である。この鋳型は以下のエレ
メントを含んでいなければならない：使用するＲＮＡポ
リメラーゼのためのプロモーター、リボソーム結合部位
及び発現させる標的遺伝子である。原則として、線状の
又は環状の閉じた鋳型を使用することができる。線状鋳
型を作製するための様々な方法があり、例えば、制限エ
ンドヌクレアーゼを用いてプラスミドを線状化すること
による方法がある。線状鋳型はまた、ＰＣＲ法によって
非常に簡単に産生することができる。線状鋳型を用いて
精製ＲＮＡポリメラーゼによってin vitro転写を実施す
ることは非常に簡単であるが、線状ＤＮＡ鋳型は、in v
itro転写−翻訳組合せ混合物においてエキソヌクレアー
ゼの攻撃を受けやすい：翻訳に必要とされるリボソー
ム、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ、開始因子、伸長
因子及び停止因子は、エキソヌクレアーゼとの混合物と
して、溶解物からしか調製できないため、線状鋳型をエ
キソヌクレアーゼの攻撃から保護する必要がある。
のは、ＤＮＡ鋳型の産生である。この鋳型は以下のエレ
メントを含んでいなければならない：使用するＲＮＡポ
リメラーゼのためのプロモーター、リボソーム結合部位
及び発現させる標的遺伝子である。原則として、線状の
又は環状の閉じた鋳型を使用することができる。線状鋳
型を作製するための様々な方法があり、例えば、制限エ
ンドヌクレアーゼを用いてプラスミドを線状化すること
による方法がある。線状鋳型はまた、ＰＣＲ法によって
非常に簡単に産生することができる。線状鋳型を用いて
精製ＲＮＡポリメラーゼによってin vitro転写を実施す
ることは非常に簡単であるが、線状ＤＮＡ鋳型は、in v
itro転写−翻訳組合せ混合物においてエキソヌクレアー
ゼの攻撃を受けやすい：翻訳に必要とされるリボソー
ム、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ、開始因子、伸長
因子及び停止因子は、エキソヌクレアーゼとの混合物と
して、溶解物からしか調製できないため、線状鋳型をエ
キソヌクレアーゼの攻撃から保護する必要がある。
【００３３】これは、鋳型の末端を修飾することによ
り、又は１種以上の競合的若しくは非競合的阻害剤を添
加してエキソヌクレアーゼを不活性化することにより、
達成できる。しかし、ここで、転写又は翻訳の各段階の
いずれも阻害されないことが重要である。すなわち、例
えば、EDTAは多くのヌクレアーゼに対して効果的な薬剤
として知られているが、EDTAは同時に転写並びに翻訳を
阻害する。
り、又は１種以上の競合的若しくは非競合的阻害剤を添
加してエキソヌクレアーゼを不活性化することにより、
達成できる。しかし、ここで、転写又は翻訳の各段階の
いずれも阻害されないことが重要である。すなわち、例
えば、EDTAは多くのヌクレアーゼに対して効果的な薬剤
として知られているが、EDTAは同時に転写並びに翻訳を
阻害する。
【００３４】そこで、溶解物中に存在するか又は別に添
加するＲＮＡポリメラーゼによって、このように保護さ
れたＤＮＡ鋳型からｍＲＮＡを転写することが可能であ
る。このｍＲＮＡはすぐにリボソーム上で翻訳される。
請求項に記載された転写を阻害しない手段のためには、
末端の修飾がプロモーター領域中に直接挿入されない
が、プロモーターの前に挿入されるように注意しなけれ
ばならない。アビジン又はストレプトアビジンを使用す
る場合は、ＤＮＡ上のビオチン残基に対してアビジン又
はストレプトアビジンを過剰に使用して、全ＤＮＡが凝
集するのを防止することが重要である。さらに、アビジ
ン又はストレプトアビジン上に残っている遊離の結合部
位は、鋳型を反応に使用する前にビオチンで飽和しなけ
ればならない。そうしなければ、意外にも、タンパク質
合成の完全な阻害が起こってしまう。抗体を使用する場
合は、これらが溶解物に由来するＤＮＡ又はその他の必
須タンパク質と非特異的に反応しないように注意しなけ
ればならない。
加するＲＮＡポリメラーゼによって、このように保護さ
れたＤＮＡ鋳型からｍＲＮＡを転写することが可能であ
る。このｍＲＮＡはすぐにリボソーム上で翻訳される。
請求項に記載された転写を阻害しない手段のためには、
末端の修飾がプロモーター領域中に直接挿入されない
が、プロモーターの前に挿入されるように注意しなけれ
ばならない。アビジン又はストレプトアビジンを使用す
る場合は、ＤＮＡ上のビオチン残基に対してアビジン又
はストレプトアビジンを過剰に使用して、全ＤＮＡが凝
集するのを防止することが重要である。さらに、アビジ
ン又はストレプトアビジン上に残っている遊離の結合部
位は、鋳型を反応に使用する前にビオチンで飽和しなけ
ればならない。そうしなければ、意外にも、タンパク質
合成の完全な阻害が起こってしまう。抗体を使用する場
合は、これらが溶解物に由来するＤＮＡ又はその他の必
須タンパク質と非特異的に反応しないように注意しなけ
ればならない。
【００３５】
【実施例】実施例１ ターミナルトランスフェラーゼを用いて鋳型の３’末端
へ非加水分解性ヌクレオチドを取り込むことによって
３’エキソヌクレアーゼから保護する。このケースで
は、ジデオキシヌクレオチド三リン酸又はホスホチオエ
ート-ＡＴＰを取り込んだ。このような修飾により、鋳
型の分解は大幅に低減し、タンパク質発現量は数倍に増
加した。
へ非加水分解性ヌクレオチドを取り込むことによって
３’エキソヌクレアーゼから保護する。このケースで
は、ジデオキシヌクレオチド三リン酸又はホスホチオエ
ート-ＡＴＰを取り込んだ。このような修飾により、鋳
型の分解は大幅に低減し、タンパク質発現量は数倍に増
加した。
【００３６】ＰＣＲ反応 1115 bp断片をＰＣＲ断片からのin vitro発現のためのE
xpand High FidelityＰＣＲキット(Roche Diagnostics
GmbH)を用いて増幅した。50 ngのpIVEX2.1 GFPを鋳型と
して用いた。プラスミドpIVEX2.1 GFPは、Aequorea vic
toria由来の緑色蛍光タンパク質の配列を変異GFPcycle
3 (Nature Biotechnology (1996) 14,315-319)の形態で
含み、そして以下に示すin vitro発現のために重要な調
節エレメントを含む：Ｔ７プロモーター、リボソーム結
合部位及びＴ７ターミネーターである。ＰＣＲ産物は、
Ｔ７プロモーターの30 bp上流から開始し、Ｔ７ターミ
ネーターの末端までのGFPコード配列を含む。以下のプ
ライマーを増幅のために使用した。
xpand High FidelityＰＣＲキット(Roche Diagnostics
GmbH)を用いて増幅した。50 ngのpIVEX2.1 GFPを鋳型と
して用いた。プラスミドpIVEX2.1 GFPは、Aequorea vic
toria由来の緑色蛍光タンパク質の配列を変異GFPcycle
3 (Nature Biotechnology (1996) 14,315-319)の形態で
含み、そして以下に示すin vitro発現のために重要な調
節エレメントを含む：Ｔ７プロモーター、リボソーム結
合部位及びＴ７ターミネーターである。ＰＣＲ産物は、
Ｔ７プロモーターの30 bp上流から開始し、Ｔ７ターミ
ネーターの末端までのGFPコード配列を含む。以下のプ
ライマーを増幅のために使用した。
【００３７】センスプライマー 配列番号５ 及びアンチセンスプライマー 配列番号６ 94℃で1分、60℃で1分、72℃で1分のＰＣＲサイクルを3
0回繰り返した。産物の濃度はアガロースゲルを用いて
評価した。続いてＰＣＲ産物をエタノールで沈殿させ、
ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水にとった。
0回繰り返した。産物の濃度はアガロースゲルを用いて
評価した。続いてＰＣＲ産物をエタノールで沈殿させ、
ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水にとった。
【００３８】ターミナルトランスフェラーゼを用いたジ
デオキシ-ＡＴＰによる３’末端の修飾 45μgのＰＣＲ産物を、250 Uのターミナルトランスフェ
ラーゼ (Roche Diagnostics GmbH)及び30 nmolのジデオ
キシ-ＡＴＰ (Roche Diagnostics GmbH)とともに、2.5
mM CoCl2を含有するターミナルトランスフェラーゼ用の
5 x 反応バッファー(Roche Diagnostics GmbH)（総量50
0μl） 100μl中で、37℃にて40分間インキュベートし
た。そして、エタノールで沈殿させ、20μlのＤＮＡｓ
ｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水中にとった。
デオキシ-ＡＴＰによる３’末端の修飾 45μgのＰＣＲ産物を、250 Uのターミナルトランスフェ
ラーゼ (Roche Diagnostics GmbH)及び30 nmolのジデオ
キシ-ＡＴＰ (Roche Diagnostics GmbH)とともに、2.5
mM CoCl2を含有するターミナルトランスフェラーゼ用の
5 x 反応バッファー(Roche Diagnostics GmbH)（総量50
0μl） 100μl中で、37℃にて40分間インキュベートし
た。そして、エタノールで沈殿させ、20μlのＤＮＡｓ
ｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水中にとった。
【００３９】ターミナルトランスフェラーゼを用いたホ
スホチオエート-ＡＴＰによる３’末端の修飾 10μgのＰＣＲ産物を、75 Uのターミナルトランスフェ
ラーゼ (Roche Diagnostics GmbH)及び47 nmolのホスホ
チオエート-ＡＴＰ (アデノシン５’-O-(1-チオトリホ
スフェート)， NAPS Company, Gottingen, Germany #39
565 N)とともに、2.5 mM CoCl2を含有するターミナルト
ランスフェラーゼ用の5 x 反応バッファー(Roche Diagn
ostics GmbH)（総量50μl） 10μl中で、37℃にて40分
間インキュベートした。そして、エタノールで沈殿さ
せ、10μlのＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水中
にとった。
スホチオエート-ＡＴＰによる３’末端の修飾 10μgのＰＣＲ産物を、75 Uのターミナルトランスフェ
ラーゼ (Roche Diagnostics GmbH)及び47 nmolのホスホ
チオエート-ＡＴＰ (アデノシン５’-O-(1-チオトリホ
スフェート)， NAPS Company, Gottingen, Germany #39
565 N)とともに、2.5 mM CoCl2を含有するターミナルト
ランスフェラーゼ用の5 x 反応バッファー(Roche Diagn
ostics GmbH)（総量50μl） 10μl中で、37℃にて40分
間インキュベートした。そして、エタノールで沈殿さ
せ、10μlのＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水中
にとった。
【００４０】in vitro転写/翻訳反応の組合せ 転写/翻訳反応は、50μlの体積で、30℃にて２時間にわ
たって実施した。反応溶液は、80.5 mM 酢酸カリウム、
10 mM 酢酸マグネシウム、35 mM 塩化アンモニウム、4
mM 塩化マグネシウム、4 % ポリエチレングリコール200
0、1 mM ＡＴＰ、0.5 mM CTP、1 mM GTP、0.5 mM UTP、
30 mM ホスホエノールピルベート、8μg/ml ピルビン酸
キナーゼ、400μM の各アミノ酸 (20種の天然に存在す
るアミノ酸すべて)、0.1 mM 葉酸、0.1 mM EDTA、50 mM
HEPES-KOH pH 7.6/30℃、20μg/ml リファンピシン、
0.03 % アジ化ナトリウム、2μg/ml アプロチニン、1 m
g/ml ロイペプチン、1μg/ml ペプスタチンA、10 mM ア
セチルホスフェート、100μg/mlの大腸菌MRE600由来ｔ
ＲＮＡ、8 mM ジチオトレイトール、100 U/ml ＲＮＡｓ
ｅ-インヒビター、15μl 大腸菌溶解物、0.5 U/μl Ｔ
７-ＲＮＡポリメラーゼを含むものであった。大腸菌溶
解物は、Zubayの方法 (Annu. Rev. Genet. (1973) 7、2
67)によりA19株から調製した。別に記載しない限り、そ
れぞれの実施例に記載した方法によって調製した鋳型Ｄ
ＮＡの1μgを各混合物に添加した。
たって実施した。反応溶液は、80.5 mM 酢酸カリウム、
10 mM 酢酸マグネシウム、35 mM 塩化アンモニウム、4
mM 塩化マグネシウム、4 % ポリエチレングリコール200
0、1 mM ＡＴＰ、0.5 mM CTP、1 mM GTP、0.5 mM UTP、
30 mM ホスホエノールピルベート、8μg/ml ピルビン酸
キナーゼ、400μM の各アミノ酸 (20種の天然に存在す
るアミノ酸すべて)、0.1 mM 葉酸、0.1 mM EDTA、50 mM
HEPES-KOH pH 7.6/30℃、20μg/ml リファンピシン、
0.03 % アジ化ナトリウム、2μg/ml アプロチニン、1 m
g/ml ロイペプチン、1μg/ml ペプスタチンA、10 mM ア
セチルホスフェート、100μg/mlの大腸菌MRE600由来ｔ
ＲＮＡ、8 mM ジチオトレイトール、100 U/ml ＲＮＡｓ
ｅ-インヒビター、15μl 大腸菌溶解物、0.5 U/μl Ｔ
７-ＲＮＡポリメラーゼを含むものであった。大腸菌溶
解物は、Zubayの方法 (Annu. Rev. Genet. (1973) 7、2
67)によりA19株から調製した。別に記載しない限り、そ
れぞれの実施例に記載した方法によって調製した鋳型Ｄ
ＮＡの1μgを各混合物に添加した。
【００４１】エキソヌクレアーゼアッセイ 13μlのサンプルを、in vitro 転写/翻訳組合せ反応物
(全反応物 200μl)から、記載した時間（分）で採取
し、65℃で15分間加熱した。氷上で15分間冷却した後、
107μlのH2O及び3μlのＲＮＡｓｅ (Roche #119915)を
添加し、37℃で30分間インキュベートした。次に、12μ
lの5 % SDS及び3μlのプロテイナーゼ K (Roche #14137
83)を添加し、37℃で30分間インキュベートした。続い
てこれを13μlの3 M NaAc (pH 4.8)及び 400μlの氷冷E
TOHを用いて30分間、-20℃で沈殿させた。200μlの氷冷
70 % ETOHで洗浄して乾燥させた後、全量を1 % TBEゲル
に流した(図1a、1b及び2を参照されたい)。
(全反応物 200μl)から、記載した時間（分）で採取
し、65℃で15分間加熱した。氷上で15分間冷却した後、
107μlのH2O及び3μlのＲＮＡｓｅ (Roche #119915)を
添加し、37℃で30分間インキュベートした。次に、12μ
lの5 % SDS及び3μlのプロテイナーゼ K (Roche #14137
83)を添加し、37℃で30分間インキュベートした。続い
てこれを13μlの3 M NaAc (pH 4.8)及び 400μlの氷冷E
TOHを用いて30分間、-20℃で沈殿させた。200μlの氷冷
70 % ETOHで洗浄して乾燥させた後、全量を1 % TBEゲル
に流した(図1a、1b及び2を参照されたい)。
【００４２】実施例２ ５’プライマーを相補鎖の３’末端に結合させることに
よる、５’及び３’エキソヌクレアーゼからの保護 その配列中の２個のヌクレオシドモノマー単位が２個の
無塩基リンカー（この場合は単なるデオキシリボース）
と置き換わったＰＣＲプライマーを、ＰＣＲにおいて使
用した。EP 0 416 817に記載されるように、これらの部
位はポリメラーゼ反応の停止をもたらし、その結果、鋳
型の５’末端に一本鎖ＤＮＡ末端をもたらす。この遊離
の５’末端は、それ自身でヘアピン型ループを形成し、
相補鎖の３’末端の反対側に正確に位置するように構築
した。ＤＮＡギャップを続く連結によって閉じ、ダンベ
ル形状の内部の閉じた環を形成する。略図を参照された
い。
よる、５’及び３’エキソヌクレアーゼからの保護 その配列中の２個のヌクレオシドモノマー単位が２個の
無塩基リンカー（この場合は単なるデオキシリボース）
と置き換わったＰＣＲプライマーを、ＰＣＲにおいて使
用した。EP 0 416 817に記載されるように、これらの部
位はポリメラーゼ反応の停止をもたらし、その結果、鋳
型の５’末端に一本鎖ＤＮＡ末端をもたらす。この遊離
の５’末端は、それ自身でヘアピン型ループを形成し、
相補鎖の３’末端の反対側に正確に位置するように構築
した。ＤＮＡギャップを続く連結によって閉じ、ダンベ
ル形状の内部の閉じた環を形成する。略図を参照された
い。
【００４３】略図 オリゴヌクレオチド： 配列番号７ ３’末端に突出部を有するＰＣＲ産物 配列番号８ 突出部の折り返し後 配列番号８ 連結後 配列番号８ このような修飾により鋳型の分解を大幅に低減させるこ
とができ、タンパク質発現量は数倍に増加した（図3a、
3b及び4を参照されたい）。
とができ、タンパク質発現量は数倍に増加した（図3a、
3b及び4を参照されたい）。
【００４４】ＰＣＲ反応 in vitro発現のため、1115 bp断片を、Expand High Fid
elity PCR kit (RocheDiagnostics GmbH)を用い、ＰＣ
Ｒ断片から増幅した。ＰＣＲ産物は、Ｔ７プロモーター
の25 bp上流から開始し、Ｔ７ターミネーターの末端ま
でGFPコード配列を含んでいた。以下のプライマーを増
幅に使用した(リボースは、β-2'-デオキシ -D-リボフ
ラノースを示し、Pはリン酸基を示す)。
elity PCR kit (RocheDiagnostics GmbH)を用い、ＰＣ
Ｒ断片から増幅した。ＰＣＲ産物は、Ｔ７プロモーター
の25 bp上流から開始し、Ｔ７ターミネーターの末端ま
でGFPコード配列を含んでいた。以下のプライマーを増
幅に使用した(リボースは、β-2'-デオキシ -D-リボフ
ラノースを示し、Pはリン酸基を示す)。
【００４５】センスプライマー 配列番号７ アンチセンスプライマー 配列番号９
【００４６】300 ngのpIVEX2.1 GFPを鋳型として使用し
た。プラスミドpIVEX2.1 GFPはAequorea victoria由来
の緑色蛍光タンパク質に対する配列を、変異GFPcycle 3
(Nature Biotechnology (1996) 14, 315-319)の形態で
含み、以下に示すin vitro発現のために重要な調節エレ
メントを含む： Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部
位及びＴ７ターミネーターである。
た。プラスミドpIVEX2.1 GFPはAequorea victoria由来
の緑色蛍光タンパク質に対する配列を、変異GFPcycle 3
(Nature Biotechnology (1996) 14, 315-319)の形態で
含み、以下に示すin vitro発現のために重要な調節エレ
メントを含む： Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部
位及びＴ７ターミネーターである。
【００４７】94℃で１分、60℃で１分、72℃で１分のＰ
ＣＲサイクルを24回繰り返した。産物の濃度は、アガロ
ースゲルを用いて評価した。続いてＰＣＲ産物をエタノ
ールで沈殿させ、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない
水中に取った。
ＣＲサイクルを24回繰り返した。産物の濃度は、アガロ
ースゲルを用いて評価した。続いてＰＣＲ産物をエタノ
ールで沈殿させ、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない
水中に取った。
【００４８】５’末端の相補鎖の３’末端への連結 上記のＰＣＲ反応から得た15μgのＤＮＡを、180μlの
リガーゼバッファー中の30単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて、16℃にて18時間にわたり連結させた。続いて、
エタノールで沈殿させ、20μlのＤＮＡｓｅ及びＲＮＡ
ｓｅを含まない水中に取った。
リガーゼバッファー中の30単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて、16℃にて18時間にわたり連結させた。続いて、
エタノールで沈殿させ、20μlのＤＮＡｓｅ及びＲＮＡ
ｓｅを含まない水中に取った。
【００４９】ＰＣＲ及び連結によって、前記した略図に
示したような線状鋳型のヘアピン型閉鎖末端が得られ
る。
示したような線状鋳型のヘアピン型閉鎖末端が得られ
る。
【００５０】エキソヌクレアーゼアッセイ エキソヌクレアーゼアッセイを実施例１と同様に実施し
た。
た。
【００５１】実施例３ 化学的架橋剤（例えば、ソラレン）を、双方のＰＣＲプ
ライマーの５’末端に取り込み、光による好適な活性化
の後、架橋剤は、相補鎖の塩基を介して相補鎖の３’末
端との間で共有結合を形成させた。これにより、エキソ
ヌクレアーゼに対する高度の耐性がもたらされた。この
ように修飾された鋳型を使用して、実施例１と同様にin
vitroでタンパク質を首尾よく合成した（図６参照）。
ライマーの５’末端に取り込み、光による好適な活性化
の後、架橋剤は、相補鎖の塩基を介して相補鎖の３’末
端との間で共有結合を形成させた。これにより、エキソ
ヌクレアーゼに対する高度の耐性がもたらされた。この
ように修飾された鋳型を使用して、実施例１と同様にin
vitroでタンパク質を首尾よく合成した（図６参照）。
【００５２】ＰＣＲ 反応 ＰＣＲ反応は以下のプライマーを使用して実施例１と同
様に実施した：ソラレン-C-2'ホスホルアミダイトは、G
len Research Ltd., Virginia USAから入手した。
様に実施した：ソラレン-C-2'ホスホルアミダイトは、G
len Research Ltd., Virginia USAから入手した。
【００５３】センスプライマー 配列番号１０ アンチセンスプライマー 配列番号１１ 300 ngのpIVEX2.1 GFPを鋳型として使用した。94℃で１
分、50℃で１分、72℃で１分のＰＣＲサイクルを25回繰
り返した。産物の濃度はアガロースゲルを用いて評価し
た。続いて、ＰＣＲ産物をエタノールで沈殿させ、ＤＮ
Ａｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水中に取った。
分、50℃で１分、72℃で１分のＰＣＲサイクルを25回繰
り返した。産物の濃度はアガロースゲルを用いて評価し
た。続いて、ＰＣＲ産物をエタノールで沈殿させ、ＤＮ
Ａｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水中に取った。
【００５４】５’末端の相補鎖の３’末端への光化学的
連結 その前方にPyrex filterを有する水銀灯で５分間にわた
りＰＣＲ産物を照射することによって、ソラレンを相補
鎖のチミジンに連結させた。
連結 その前方にPyrex filterを有する水銀灯で５分間にわた
りＰＣＲ産物を照射することによって、ソラレンを相補
鎖のチミジンに連結させた。
【００５５】エキソヌクレアーゼアッセイ 光化学的連結の後、400 ngのソラレン修飾ＤＮＡを、総
量20μl中で10 U又は100 U エキソヌクレアーゼIII(Roc
he Diagnostics GmbH)とともに、37℃で１時間インキュ
ベートした（図５参照）実施例４ ５’末端がビオチン化されたＰＣＲプライマー対を用い
て、５’及び３’エキソヌクレアーゼから保護した。続
いてストレプトアビジンを増幅した鋳型の５’末端に結
合させ、その結果、その大きさによって５’及び３’末
端を保護するか、あるいは、ストレプトアビジンを増幅
した鋳型の５’末端に結合させて内部の閉じた環によっ
て鋳型の２つの末端を保護する。
量20μl中で10 U又は100 U エキソヌクレアーゼIII(Roc
he Diagnostics GmbH)とともに、37℃で１時間インキュ
ベートした（図５参照）実施例４ ５’末端がビオチン化されたＰＣＲプライマー対を用い
て、５’及び３’エキソヌクレアーゼから保護した。続
いてストレプトアビジンを増幅した鋳型の５’末端に結
合させ、その結果、その大きさによって５’及び３’末
端を保護するか、あるいは、ストレプトアビジンを増幅
した鋳型の５’末端に結合させて内部の閉じた環によっ
て鋳型の２つの末端を保護する。
【００５６】ビオチン化ヌクレオチドを２個のＰＣＲプ
ライマーの５’末端に取り込んだ。そして、ＰＣＲで増
幅した鋳型をストレプトアビジンとともにインキュベー
トした。ストレプトアビジンの大きさが、エキソヌクレ
アーゼ分解から鋳型の５’及び３’ 末端を保護する。
このように修飾された鋳型から、タンパク質を首尾よく
合成した。
ライマーの５’末端に取り込んだ。そして、ＰＣＲで増
幅した鋳型をストレプトアビジンとともにインキュベー
トした。ストレプトアビジンの大きさが、エキソヌクレ
アーゼ分解から鋳型の５’及び３’ 末端を保護する。
このように修飾された鋳型から、タンパク質を首尾よく
合成した。
【００５７】ＰＣＲ反応 ＰＣＲ反応は、以下のプライマーを使用して実施例１と
同様に実施した。
同様に実施した。
【００５８】センスプライマー 配列番号５ アンチセンスプライマー 配列番号６ ビオチン化プライマーは、Metabion Company, Martinsr
ied, Germanyから入手した。
ied, Germanyから入手した。
【００５９】300 ngのpIVEX2.1 GFP を鋳型として使用
した。94℃で１分、50℃で１分、72℃で１分のＰＣＲサ
イクルを25回繰り返した。産物の濃度は、アガロースゲ
ルを用いて評価した。続いてＰＣＲ産物をエタノールで
沈殿させ、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水中に
取った。
した。94℃で１分、50℃で１分、72℃で１分のＰＣＲサ
イクルを25回繰り返した。産物の濃度は、アガロースゲ
ルを用いて評価した。続いてＰＣＲ産物をエタノールで
沈殿させ、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない水中に
取った。
【００６０】ストレプトアビジンとのインキュベート 10μgのストレプトアビジンを、総容量10μlで、ＰＣＲ
産物1.5μgに加えた。続いて、遊離のビオチン結合部位
を10μgのビオチンを用いて飽和させた。
産物1.5μgに加えた。続いて、遊離のビオチン結合部位
を10μgのビオチンを用いて飽和させた。
【００６１】In vitro発現 1μgのビオチン/ストレプトアビジン修飾ＤＮＡを、in
vitro発現のために、実施例１に記載のように使用した
（図７参照）。
vitro発現のために、実施例１に記載のように使用した
（図７参照）。
【００６２】
【発明の効果】以上記載したように、本発明により、線
状短鎖ＤＮＡの安定性が、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレ
アーゼから保護するための１又は複数の手段によって改
善され、エキソヌクレアーゼ含有溶解物を用いる無細胞
in vitro転写／翻訳系又はエキソヌクレアーゼを含む細
胞系における、安定化された線状短鎖ＤＮＡの転写、及
びそれに続く翻訳を含むタンパク質発現方法が提供され
る。
状短鎖ＤＮＡの安定性が、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレ
アーゼから保護するための１又は複数の手段によって改
善され、エキソヌクレアーゼ含有溶解物を用いる無細胞
in vitro転写／翻訳系又はエキソヌクレアーゼを含む細
胞系における、安定化された線状短鎖ＤＮＡの転写、及
びそれに続く翻訳を含むタンパク質発現方法が提供され
る。
【図１】図１ａは、非修飾鋳型の安定性を示す。５分経
過後にはすでに、この混合物中には線状ＤＮＡは検出さ
れない。レーン１ 標品レーン２〜６ in vitro転写−
翻訳混合物中で５、１５、３０、４５及び６０分間イン
キュベートした後の線状ＤＮＡ。図１ｂは、その３’末
端を、ターミナルトランスフェラーゼを用いてジデオキ
シ−ＡＴＰで修飾した鋳型の安定性を示す。１０分経過
後もなお、線状ＤＮＡはこの混合物中に検出される。
過後にはすでに、この混合物中には線状ＤＮＡは検出さ
れない。レーン１ 標品レーン２〜６ in vitro転写−
翻訳混合物中で５、１５、３０、４５及び６０分間イン
キュベートした後の線状ＤＮＡ。図１ｂは、その３’末
端を、ターミナルトランスフェラーゼを用いてジデオキ
シ−ＡＴＰで修飾した鋳型の安定性を示す。１０分経過
後もなお、線状ＤＮＡはこの混合物中に検出される。
【図２】図２は、線状ＤＮＡ鋳型の３’末端をジデオキ
シ−ＡＴＰ又はホスホチオエート−ＡＴＰで修飾するこ
とにより、非修飾鋳型と比較して、タンパク質合成量が
改善されることを示す。記載のように、1μg及び2μgの
ＤＮＡを使用した。
シ−ＡＴＰ又はホスホチオエート−ＡＴＰで修飾するこ
とにより、非修飾鋳型と比較して、タンパク質合成量が
改善されることを示す。記載のように、1μg及び2μgの
ＤＮＡを使用した。
【図３】図３ａは、実施例２に従って作製された突出し
た５’末端を有する鋳型の、連結前の安定性を示す。図
１ａの非修飾鋳型とは対照的に、このケースにおいて
は、線状ＤＮＡが検出できなくなるのは１０分後であ
る。図３ｂは、実施例２に従って作製された突出した
５’末端を有する鋳型の、連結後の安定性を示す。連結
の後、鋳型は120分の全合成期間にわたって存在する。
線状ＤＮＡの分解は大幅に低減した。
た５’末端を有する鋳型の、連結前の安定性を示す。図
１ａの非修飾鋳型とは対照的に、このケースにおいて
は、線状ＤＮＡが検出できなくなるのは１０分後であ
る。図３ｂは、実施例２に従って作製された突出した
５’末端を有する鋳型の、連結後の安定性を示す。連結
の後、鋳型は120分の全合成期間にわたって存在する。
線状ＤＮＡの分解は大幅に低減した。
【図４】図４は、実施例２に従って、線状ＤＮＡ鋳型の
３’末端を修飾することにより、タンパク質合成量が改
善したことを示す。５’末端の折り返しは、既に、タン
パク質の高度な合成をもたらした。しかし、２つの末端
が連結されてはじめて、鋳型のより高い安定性が達成さ
れ、最大量のタンパク質が生成する。記載のように、1
μg及び2μgのＤＮＡを使用した。
３’末端を修飾することにより、タンパク質合成量が改
善したことを示す。５’末端の折り返しは、既に、タン
パク質の高度な合成をもたらした。しかし、２つの末端
が連結されてはじめて、鋳型のより高い安定性が達成さ
れ、最大量のタンパク質が生成する。記載のように、1
μg及び2μgのＤＮＡを使用した。
【図５】図５は、エキソヌクレアーゼIIIに対する鋳型
の安定性を示す。非修飾ＤＮＡは10 Uエキソヌクレアー
ゼIIIによって既に分解されるのにもかかわらず、ソラ
レンに連結されたＤＮＡは、100 UエキソヌクレアーゼI
IIに対しても安定である。レーン1〜3 ソラレン連結Ｄ
ＮＡ、レーン4〜6 非修飾ＤＮＡ。レーン1、4はエキソ
ヌクレアーゼIIIなし、レーン2、5は10 Uエキソヌクレ
アーゼ IIIを含む、レーン3、6は100 Uエキソヌクレア
ーゼ IIIを含む。
の安定性を示す。非修飾ＤＮＡは10 Uエキソヌクレアー
ゼIIIによって既に分解されるのにもかかわらず、ソラ
レンに連結されたＤＮＡは、100 UエキソヌクレアーゼI
IIに対しても安定である。レーン1〜3 ソラレン連結Ｄ
ＮＡ、レーン4〜6 非修飾ＤＮＡ。レーン1、4はエキソ
ヌクレアーゼIIIなし、レーン2、5は10 Uエキソヌクレ
アーゼ IIIを含む、レーン3、6は100 Uエキソヌクレア
ーゼ IIIを含む。
【図６】図６は、線状ＤＮＡ鋳型の３’末端のソラレン
連結による、タンパク質合成量の改善を示す。
連結による、タンパク質合成量の改善を示す。
【図７】図７は、プライマーをビオチンで修飾し、続い
て、ストレプトアビジンと結合させることによる、タン
パク質合成量の改善を示す。
て、ストレプトアビジンと結合させることによる、タン
パク質合成量の改善を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月１８日（２００２．４．１
８）
８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホフマン，トーマス ドイツ連邦共和国 ディー−68535 ノイ −エディンゲン，アホーンシュトラーセ ４ (72)発明者 ネメツ，コーデュラ ドイツ連邦共和国 ディー−82515 ウォ ルフラッツシャウゼン，イサースピッツ 11 (72)発明者 ヘインドル，ディエター ドイツ連邦共和国 ディー−82327 ツッ ツイング，ワルドシュミッツシュトラーセ １ (72)発明者 メッツラー，トーマス ドイツ連邦共和国 ディー−80337 ミュ ンヘン，マイシュトラーセ 57 (72)発明者 ムッテル，ウォルフガング ドイツ連邦共和国 ディー−82347 バー ンリエド，アム ノイランド １ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 GA30 HA01
Claims (21)
- 【請求項１】 エキソヌクレアーゼ含有溶解物を用いる
無細胞in vitro転写／翻訳系、またはエキソヌクレアー
ゼを含む細胞系における、安定化された線状短鎖ＤＮＡ
の転写及びそれに続く翻訳の段階を含むタンパク質発現
方法であって、線状短鎖ＤＮＡの安定性が、二本鎖ＤＮ
Ａをエキソヌクレアーゼから保護する１または複数の以
下の手段： ａ）鋳型の３’末端へのエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド類似体または他の分子の取り込み、 ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド含有ＰＣＲプ
ライマー対の使用による線状短鎖ＤＮＡの作製、 ｃ）５’末端を相補鎖の３’末端に連結することによ
る、ＰＣＲ反応によって作製される鋳型の保護、 ｄ）線状の鋳型の両末端に結合するＤＮＡ配列特異的結
合分子による鋳型の保護、 ｅ）競合的または非競合的阻害剤の添加によるエキソヌ
クレアーゼの不活性化、 ｆ）鋳型の環状化による環状の閉じた鋳型の形成、によ
って改善される、上記方法。 - 【請求項２】 ジデオキシヌクレオシド三リン酸が手段
ａ）におけるエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドとし
て取り込まれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ５’−ホスホチオエート保護ヌクレオシ
ド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸が手段
ａ）におけるエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドとし
て取り込まれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 ５’−ホスホチオエート保護ヌクレオシ
ド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸が手段
ｂ）におけるエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドとし
て取り込まれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 ２個のヘアピン形成型オリゴヌクレオチ
ドアダプターを鋳型の遊離末端に連結することによって
手段ｃ）における相補鎖の３’末端への５’プライマー
の連結を行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 手段ｃ）において、５’プライマーの相
補鎖の３’末端への連結が、 −ポリメラーゼによる鋳型の伸長を抑制する１または数
個の修飾モノマー単位のプライマー配列中への導入、 −１または数個の修飾モノマー単位を含むＰＣＲプライ
マーを用いたＰＣＲ反応の実施、 −修飾部位におけるポリメラーゼ反応の停止及び鋳型の
５’末端における一本鎖ＤＮＡの遊離末端の形成、 そして更にこの遊離の５’末端のそれ自身でのヘアピン
型ループの形成、及びその５’末端の相補鎖の３’末端
への連結、によって達成される、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項７】 修飾モノマー単位がデオキシリボースリ
ン酸または無塩基（abasic）類似体である、請求項６に
記載の方法。 - 【請求項８】 修飾モノマー単位が、塩基またはリボー
スが修飾され、ポリメラーゼによる伸長を阻止するヌク
レオチド類似体である、請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】 ２個のＰＣＲプライマーの５’末端に化
学的架橋剤を取り込み、ＰＣＲ反応後に化学的架橋を実
施することによって、手段ｃ）における相補鎖の３’末
端への５’プライマーの連結を行う、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１０】 ＰＣＲ反応後の化学的または酵素的反
応によって再度取り除かれる１または数個のヌクレオチ
ドまたはヌクレオチド類似体をＰＣＲプライマー中に導
入することによって３’突出部を形成し、この３’突出
部がそれ自体でヘアピン型ループを形成し、その３’末
端が相補鎖の５’末端の正確な反対側に位置し、そして
ＤＮＡギャップがこれに続く連結反応によって閉じ、結
果としてダンベル形状の内部の閉じた環となることによ
って、手段ｃ）における５’プライマーの相補鎖の３’
末端への連結を行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 双方のＰＣＲプライマーの５’末端に
分子を導入し、鋳型の３’末端にこの分子または別の分
子で修飾されたヌクレオチドを導入し、３’末端及び
５’末端においてこれら2つの分子をタンパク質によっ
て非共有結合によって結合させることによって、手段
ｃ）における５’プライマーの相補鎖の３’末端への連
結を行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 ２個の分子がビオチンであり、タンパ
ク質がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求
項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 ２個の分子がジゴキシゲニンであり、
タンパク質がジゴキシゲニンに対する抗体、または抗体
のジゴキシゲニン結合部である、請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１４】 手段ｄ）において、線状の鋳型の両末
端に結合するＤＮＡ配列特異的結合分子がこのＤＮＡ配
列に対する抗体または抗体のＤＮＡ結合部である、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 線状の鋳型の両末端に結合する手段
ｄ）のＤＮＡ配列特異的結合分子が最終の鋳型の３’及
び／または５’末端にハイブリダイズする１または数個
のＰＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】 手段ｅ）において、エキソヌクレアー
ゼの活性を競合的に阻害する非特異的ＤＮＡの添加によ
ってエキソヌクレアーゼが不活性化される、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項１７】 手段ｅ）において、エキソヌクレアー
ゼの活性を遮断する不活化抗体の添加によってエキソヌ
クレアーゼが不活性化される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】 手段ｆ）において、線状の鋳型の両末
端が、ＤＮＡ分子、及びそれに続く酵素的、化学的また
は非共有的連結によって環化される、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１９】 ＤＮＡ分子を用いた連結が、好ましく
は鋳型内及びＤＮＡ分子内に突出した互いに相補的な
５’末端または３’末端を作製することによって行わ
れ、請求項１０に記載の方法を用いて３’突出末端を作
製し、請求項６、７、または８に記載の方法を用いて
５’突出末端を作製する、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 手段ｆ）において、線状の鋳型の両末
端がビオチン化されており、両末端がストレプトアビジ
ンまたはアビジンによって連結される、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項２１】 手段ｆ）において、線状の鋳型の両末
端がジゴキシゲニン化されており、ジゴキシゲニンに対
する抗体または抗体のジゴキシゲニン結合部が両末端を
連結する、請求項１に記載の方法。
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- 2002-04-18 JP JP2002116814A patent/JP2002320497A/ja active Pending
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