JP7258361B2 - 二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 - Google Patents
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Description
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2017年6月16日に作製された前記ASCIIコピーの名称は、316478-1_SL.txtであり、サイズは5,663バイトである。
RCA産物DNAの生成
RCA産物DNAは、RCA反応により、環状DNA鋳型(プラスミド陽性対照、例えば、pCFE-GFP、又は最小限の発現配列を有するDNAミニサークルのいずれか)から生成した。プラスミド陽性対照であるpCFE-GFPは、1-Step Human Coupled IVTキットの一部として購入した。この精製されたプラスミドは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の内部リボソーム進入部位(IRES)を含み、TurboGFPタンパク質をコードする。
EGFPの最小限の発現配列は、インシリコで設計し、インビトロで合成した。最小限の発現配列は、主にT7プロモーター及び+1配列(結果として生じるmRNAの5'非翻訳領域の最初のリボース位置)に続いて、EGFPコード領域に融合したIRES配列を含有した。T7プレプロモーター配列、T7 phi10プロモーターステムループ、翻訳増強エレメント(TEE)、リボソーム結合配列、リボソーム結合を増強するためのインスレーター配列、リボソーム開始を増強するためのインスレーター配列、T7転写終結配列、ポリアデニル化配列、ペプチドリーダー配列、又はプロテアーゼ切断部位を含む、様々な追加の非コーディングパラメーター及びコーディングパラメーターが最小限の発現配列の設計中に含まれた。最小限の発現配列は、コドン使用のために更に最適化され得る。代表的な最小限の発現配列は、配列番号5(Table 3(表3))として表にされている。配列番号5の最小限の発現配列は、T7プロモーター、EMVC IRES、翻訳開始コドン、EMVCポリタンパク質ORFの翻訳されたN末端(コドン最適化されたEGFPに融合している)、翻訳終止コドン、ポリA束及びT7転写ターミネーター配列を逐次的に含む。
環状DNA鋳型(例えば、プラスミド又はDNAミニサークル)のRCAは、インプットDNA配列のタンデム反復を有する高分子量の超分岐状コンカテマーを生じる。水、反応緩衝液、プライマー、及びDNAポリメラーゼ酵素を含むRCA試薬は、環状DNA鋳型(プラスミド又はミニサークル)又はdNTPを添加する前に30℃で60分間、予め清澄化して、オフターゲット増幅を最小限にした。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性プライマー及びヌクレオチドを含むプライマー-ヌクレオチドミックスを、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、及び一本鎖DNA結合タンパク質(SSBタンパク質)の組合せとともに、プライマー-ヌクレオチドミックスをインキュベートすることにより混入物除去した。一部の実施形態では、鎖置換型DNAポリメラーゼを含有する酵素ミックスを、場合によりエキソヌクレアーゼの存在下で二価カチオン(例えば、Mg2+)とともにインキュベートすることにより混入物除去した(使用されるDNAポリメラーゼが非プルーフリーディングDNAポリメラーゼを含む場合)。続いて、混入物除去した酵素及びプライマー-ヌクレオチドのミックスを使用して、環状DNA鋳型の増幅を実施した。例えば、200ngのPhi29 DNAポリメラーゼを含有するポリメラーゼ溶液を、15mM KCl、20mM MgCl2、0.01%Tween-20及び1mM TCEPを含有する5μLの50mM HEPES緩衝液(pH=8.0)中で0.1単位のエキソヌクレアーゼIIIとともにインキュベートした。インキュベーションを、30℃で約60分間又は4℃で12時間実施した。混入物除去したPhi29 DNAポリメラーゼ溶液を氷浴に移し、次に、エキソヌクレアーゼIIIを事前に不活性化することなく、標的RCAアッセイに使用した。
真核生物セルフリー抽出物中のプラスミドDNAから生成されたRCA産物DNAの発現
1-Step Human Coupled IVTキットは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の内部リボソーム進入部位(IRES)を含有し、TurboGFPタンパク質をコードする陽性対照ベクターとしてpCFE-GFPを含む。IRES配列のRNAフォールディングは、翻訳効率の調節に著しく影響を与えることが公知であるため、1-Stepインビトロでの転写翻訳(IVTT)キット内の成分は、EMCV IRES活性に最適化されている。
DNAミニサークルから生成されたRCA産物DNAを使用したセルフリータンパク質発現
実施例2からのデータ(図1)は、HeLa細胞溶解物を使用するIVTTアッセイの鋳型としてRCA産物DNAを使用した場合、最適なタンパク質発現のために、プラスミドDNAと比較して、4~8倍低い濃度のRCA産物DNAが必要であることを示した。この観察は、IVTT反応用のDNAミニサークルから生成されたRCA産物DNAを使用することにより更に確立された。DNAミニサークル鋳型から生成されたRCA産物DNAを調製し、IVTTによるタンパク質発現の比較に利用した。実施例1に記載されるように、EGFPタンパク質をコードするDNA配列(配列番号5)をライゲーションしてミニサークルを形成し、チオ化dATPの存在下でATプライマーを使用してRCAにより増幅した。RCA産物DNAを逐次希釈して、様々な濃度のRCA産物DNAの試料を生成した。様々な濃度のRCA産物DNAを25μLの1-Step Human Coupled IVT反応混合物に添加し、300rpmで穏やかに振とうしながらEppendorf ThermoMixerにおいて30℃で6時間インキュベートした。セルフリーEGFPタンパク質である生成されたIVTT産物を、蛍光分析前に4℃で一晩、フォールディングした。約4μLのIVTT産物をSDS-PAGEで分離し(図3)、488nmのTyphoon variable-mode Imager (GE Healthcare社)を使用して、天然蛍光タンパク質をゲルで検出した。図4は、約125ngのRCA産物DNAがHeLa細胞溶解物中のEGFPの最大のセルフリー発現をもたらしたことを示し、これは、プラスミドDNA鋳型から生成されたRCA産物DNAを使用する実施例2の結果と一致する。図4に示されるように、RCA産物DNA発現収量のうちでガウス分布が観察された。結果として、図4は、ほぼ同等の量のタンパク質が、0.5~1マイクログラムのインプットRCA DNAから、及び8~16ナノグラムのインプットRCA DNAから生成されたことを示す。更に、図4は、インプットRCA DNAの量(0.5マイクログラム及び16ナノグラムのインプット等)間の差が96%を超える場合でさえ、セルフリータンパク質発現がほぼ同じであることを示す。対照の目的で、TurboGFPタンパク質を1マイクログラムのpCFE-GFPプラスミドから合成し(キットの製造業者の指示による)、相対的な蛍光出力を比較した。要約すると、図3及び図4は、環状鋳型(図2のDNAミニサークル構築物)から生成されたRCA産物DNAの必要量が、真核生物セルフリー溶解物における所望のタンパク質発現のためのプラスミドDNAの必要量よりも4~8倍低いことを示す。
DNAミニサークルから生成された磁気ビーズコンジュゲートRCA産物DNAからのセルフリー発現
実施例3からのDNAミニサークル配列(配列番号5)から生成されたビオチン化RCA産物DNAを、ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートし、HeLa細胞抽出物におけるインビトロでの転写及び翻訳に使用した。DNAミニサークル(配列番号5)を、ビオチン化ヘキサマープライマー(配列番号7)又は非ビオチン化ATヘキサマー(配列番号6)プライマーを使用してRCAによって増幅し、結果として生じる増幅産物をPicoGreenアッセイによって定量化した。一部の実施形態では、結果として生じる粗製RCA産物を、MICROCON遠心フィルターを使用して予め精製して、ビーズコンジュゲーションの前に過剰なビオチン化ヘキサマープライマーを除去した。粗製又は精製RCA産物DNAをストレプトアビジンビーズと混合して、ビーズのマイクロリットルあたり約24ng又は50ngのRCA産物DNAを捕捉できるようにした。ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートしたRCA産物DNAの相対量を、ストレプトアビジンビーズをPstIで消化し、PicoGreenアッセイにより放出されたDNA量を定量化することにより確認した。代表的なビーズ調製プロトコールの定量結果をTable 3(表4)に提示する。収集するために磁石を使用してPBS中でビーズを徹底的に洗浄した後、一定量(2.8μL)のビーズを1-Step Human Coupled IVT反応(25μL)に移し、セルフリーEGFP翻訳を、SDS-PAGEゲルにおける天然蛍光により比較した(図5)。EGFP蛍光を、488nm Typhoon variable-mode Imagerを使用して(ゲル内で)画像化した。図5は、IVTT反応混合物の1マイクロリットルあたり5ngの推定される鋳型濃度でビオチン-ストレプトアビジンカップリングによりストレプトアビジンビーズに捕捉した場合、DNAミニサークルから生成されたRCA産物DNAから蛍光EGFPが効果的に産生されたことを示す。ビオチン化RCA産物DNAは、いかなる中間体精製も必要とせずに、ストレプトアビジンビーズに効果的にカップリングした。予期した通り、非ビオチン化ATプライマーとともにインキュベートしたビーズを使用しても、セルフリーEGFP発現はほとんど観察されないか又は全く観察されなかった。過剰なヘキサマープライマーを除去するためのMICROCONフィルターの使用は、粗製調製プロセス(図5、レーン2を参照されたい)と比較して、より高い非特異的発現に寄与した(図5、レーン3を参照されたい)。対照の目的で、TurboGFPを1マイクログラムのpCFE-GFPプラスミドDNAから合成し(キットの製造業者の指示による)、相対的な蛍光出力を比較した。
Claims (25)
- インビトロでの転写及び翻訳のための方法であって、
精製された二本鎖コンカテマーDNAを真核生物セルフリー発現系と接触させる工程であって、二本鎖コンカテマーDNAが複数のタンデム反復配列を含み、複数のタンデム反復配列の各々が、プロモーターを含む発現配列、キャップ非依存性翻訳エレメント(CITE)、及びオープンリーディングフレームを含む、工程;並びに
真核生物セルフリー発現系において二本鎖コンカテマーDNAからインビトロでタンパク質を発現させる工程
を含み、真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が5ng/μL~20ng/μLの範囲である、方法。 - 真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が、5ng/μL~10ng/μLの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が、5ng/μL~7ng/μLの範囲である、請求項1又は2に記載の方法。
- キャップ非依存性翻訳エレメント(CITE)が、内部リボソーム進入部位(IRES)、翻訳増強エレメント(TEE)、又はそれらの組合せを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- オープンリーディングフレームが、翻訳を増強するためのコドン最適化配列を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- オープンリーディングフレームが、発現タンパク質の精製のためのタグ配列、増強したリボソーム認識のためのIRESに由来するアミノ末端ペプチド融合配列、又はそれらの組合せを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 発現配列が、ポリA配列、転写終結配列、インスレーター配列、又はそれらの組合せを更に含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAを真核生物セルフリー発現系と接触させる前に、二本鎖コンカテマーDNAを基材に固定する工程を更に含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- インビトロでタンパク質を発現させた後、真核生物セルフリー発現系から基材固定化二本鎖コンカテマーDNAを回収し、回収された基材固定化二本鎖コンカテマーDNAを、続くインビトロでの転写及び翻訳反応に再使用する工程を更に含む、請求項8に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAが、ローリングサークル増幅(RCA)産物DNAである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAが、ビオチン化ヌクレオチド、ホスホロチオエート化ヌクレオチド、イノシン含有ヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)ヌクレオチド、2-アミノ-デオキシアデノシン、2-チオ-デオキシチミジン、ポリカチオンヌクレオチド又はそれらの組合せを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- インビトロでの転写及び翻訳のための方法であって、
DNAミニサークルを用意する工程、
DNAミニサークルのローリングサークル増幅を介して二本鎖コンカテマーDNAを生成する工程;
生成された二本鎖コンカテマーDNAを精製する工程;及び
精製された二本鎖コンカテマーDNAをインビトロで真核生物セルフリー発現系と接触させて、転写及び翻訳を介して二本鎖コンカテマーDNAからタンパク質を発現させる工程
を含み、真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が5ng/μL~20ng/μLの範囲である、方法。 - DNAミニサークルが、プロモーター、キャップ非依存性翻訳エレメント、及びオープンリーディングフレームを含む最小限の発現配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 最小限の発現配列が、宿主細胞内におけるプラスミドの増幅に必要とされる任意外来配列を欠いている、請求項13に記載の方法。
- キャップ非依存性翻訳エレメント(CITE)が、内部リボソーム進入部位(IRES)、翻訳増強エレメント(TEE)、又はそれらの組合せを含む、請求項12又は13に記載の方法。
- 最小限の発現配列が、更にインスレーター配列、ポリA配列、転写終結配列、又はそれらの組合せを含む、請求項13、14又は15に記載の方法。
- オープンリーディングフレームが、翻訳を増強するためのコドン最適化配列、発現タンパク質の精製のためのタグ配列、増強したリボソーム認識のためのIRESに由来するアミノ末端ペプチド融合配列又はそれらの組合せを含む、請求項13~16のいずれか一項に記載の方法。
- 真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が、5ng/μL~7ng/μLの範囲である、請求項12~17のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAが、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそれらの組合せを含む、請求項12~18のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAが、ホスホロチオエート化ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、イノシン含有ヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)ヌクレオチド、2-アミノ-デオキシアデノシン、2-チオ-デオキシチミジン、ポリカチオンヌクレオチド又はそれらの組合せを含む、請求項12~19のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAを真核生物セルフリー発現系と接触させる前に、二本鎖コンカテマーDNAを基材に固定する工程を更に含む、請求項12~20のいずれか一項に記載の方法。
- インビトロでタンパク質を発現させた後、真核生物セルフリー発現系から基材固定化二本鎖コンカテマーDNAを回収し、回収された基材固定化二本鎖コンカテマーDNAを、続くインビトロでの転写及び翻訳反応に再使用する工程を更に含む、請求項21に記載の方法。
- ローリングサークル増幅が、10μM~10mMの範囲の最終濃度のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)及び任意のアルファ-チオdNTPを使用して実施される、請求項12~22のいずれか一項に記載の方法。
- ローリングサークル増幅が、ヌクレオチド類似体を含むランダムプライマー混合物を使用して実施される、請求項12~23のいずれか一項に記載の方法。
- ランダムプライマー混合物が、配列+N+N(atN)(atN)(atN)*N(配列番号6)又は5'-ビオチン-NNNN*N*N(配列番号7)を有し、
「N」は、ランダムヌクレオチド(すなわちNは、A、C、G、又はT/Uのいずれであってもよい)を表し、「atN」は、2-アミノdA、2-チオdT、通常のG又は通常のCを表し、文字指定に先行するプラス(+)記号は、その文字で指定されたヌクレオチドがロックド核酸(LNA)ヌクレオチドであることを示し、文字に先行する星印(*)は、その文字で指定されたヌクレオチドがホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを示す、請求項24に記載の方法。
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