PT99500A - Processo de amplificacao de acido nucleico por replicacao sequencial auto-sustida por duas enzimas - Google Patents

Description

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MEMORIA DESCRITIVA

Campo técnico O presente invento refere-se na generalidade a processos e a conj vmtos para a amplificação de segmentos alvo de ácido nucleico em amostras de ácidos nucleicos. 0 invento refere-se também a aplicações dos processos e dos conjuntos em Biologia Molecular, Genética Molecular e em ensaios de hibridação com sonda de ácido nucleico, incluindo ensaios empregues no diagnóstico de doenças.

Antecedentes do invento

Grande parte do trabalho em Biologia Molecular, Genética Molecular e suas aplicações, tais como a utilização de ensaios de hibridação com sonda de ácido nucleico no diagnóstico de doenças, pela detecção de patogénios transportados pelo sangue ou genes defeituosos, envolve a detecção ou o isolamento de uma sequência particular de ácido nucleico (i.e., um segmento de ácido nucleico com uma sequência particular), a partir de um conjunto de um elevado número de sequências diferentes, mas por vezes semelhantes, com o mesmo ou aproximadamente o mesmo comprimento. Um problema fundamental num tal trabalho consiste em detectar ou isolar e, se possível, quantificar uma sequência particular de ácido nucleico de interesse num tal conjunto. O problema tem sido difícil porque os materiais biológicos, tais como culturas de células, amostras de tecido e amostras de sangue, que proporcionam as misturas de ácidos nucleicos, nas quais um segmento particular tem de ser detectado, ou a partir das quais um segmento particular tem de ser isolado, são constituídas tipicamente por uma mistura complexa de ARN e ADN, dos quais apenas uma pequeníssima fracção possui um segmento de interesse. Têm sido utilizadas duas abordagens fundamentalmente distintas ao problema da detecção ou do isolamento, após clonagem de um segmento com interesse de ácido nucleico ("segmento alvo"), que se encontra presente em níveis baixos numa mistura complexa de ácidos nucleicos.

Na primeira abordagem, a quantidade de ácido nucleico

73 346 50101 -3- -3- (incluindo o segmento alvo) numa amostra de ácidos nuclereos, sujeita a análise, não é alterada; em vez disso um sistema gerador de sinal é associado ao segmento alvo e produz um sinal detectável representativo da presença ou do número de cópias do segmento alvo na amostra. Por exemplo, uma sonda de ácido nucleico com uma sequência complementar à de pelo menos um subsegmento do segmento alvo e ligada com uma enzima, como por exemplo a fosfatase alcalina, é misturada com a amostra em condições de hibridação, que permitem a hibridação entre a sonda e o segmento alvo, mas não, de um modo apreciável, entre a sonda e outros segmentos de ácido nucleico na amostra. Após a remoção da sonda que não hibridou é adicionado o substrato da enzima (por exemplo, um substrato cromogénico da fosfatase alcalina) sob condições que permitem que a catálise pela enzima decorra e, em princípio, é rapidamente produzido um grande número de moléculas detectáveis na reacção catalizada pela enzima (coloração visível no caso de um substrato cromogénico com a fosfatase alcalina) para cada molécula de sonda hibridada com o segmento alvo. São conhecidos na arte numerosos outros sistemas para a detecção de segmentos de ácido nucleico sem alterar a quantidade de ácido nucleico alvo. Por exemplo, têm sido detectados segmentos alvo de ácido nucleico com base na hibridação com uma sonda marcada com um isótopo radioactivo (por exemplo, 32P) ou uma porção fluorescente. Alternativamente, é conhecida a utilização de uma sonda que compreende ou está ligada a uma molécula de ARN autocataliticamente replicável (exemplo, um ARN que é um substrato da ARN-polimerase ARN-dependente do fago §β ou do vírus do mosaico do bromo (BMV, ver Miele et al.. J. Mol. Biol. 171. 281 (1983)) e, após hibridação da sonda com o ácido nucleico de uma amostra e posterior lavagem da sonda não hibridada da amostra, induz a replicação de ARN replicável com a correspondente ARN-polimerase e, finalmente, detecta as moléculas de ARN replicado. Um sistema no qual a sonda para um segmento alvo está ligada a ARN capaz de ser replicado pela replicase de Q/J encontra-se descrito por Chu et al. . Nucl. Acids Res. 14. 5591 (1986) e Patente U.S. No. 4 957 858 e pela replicase de BMV por Marsh et al.. Positive Strand RNV Viruses (Proceedings of 1986 73 346 50101 -4- UCLA Symposium),

Alan R.

Liss Publ

Co.

Esta primeira abordagem de amplificação de sinais associado a um alvo apresenta duas sérias desvantagens. Em primeiro lugar, em muitas situações, o número de cópias do segmento alvo, numa amostra de dimensão praticável é tão baixo que mesmo no caso de sistemas geradores de sinal razoávelmente rápidos, o tempo necessário para gerar um sinal detectável que seja significantemente superior ao do fundo é impraticavelmente longo. Em segundo lugar, em qualquer ensaio para um segmento alvo, o sinal devido ao "fundo" é inevitável. Num sistema onde o sinal é amplificado, a geração do sinal e a amplificação ocorrem essencialmente à mesma taxa nas moléculas geradoras do sinal de "fundo" (por exemplo, moléculas de sonda hibridadas a segmentos com sequências aproximadamente semelhante mas não idênticas à da sequência do segmento alvo, moléculas de sonda aderentes ao vidro, plástico ou outros componentes de um sistema, etc.) e nas moléculas geradoras de sinal efectivamente associadas ao alvo. Assim, a sensibilidade dos ensaios que utilizam a primeira abordagem é fundamentalmente limitada por moléculas geradoras de sinal de "fundo" inevitáveis. A segunda abordagem é fundamentalmente diferente, ela envolve o aumento de número de cópias do própio segmento alvo, preferencialmente numa extensão maior que a de outros segmentos numa amostra, particularmente daqueles que poderão ser erradamente detectados como segmentos alvo, devido a semelhanças nas sequências.

Exemplos desta segunda abordagem incluem várias técnicas de cultura, nas quais as células que albergam o segmento alvo são forçadas a aumentar em número, por vezes mais rapidamente do que outras células, ou nas quais ácidos nucleicos particulares (por exemplo, plasmídeos, ARN) que compreendem o segmento alvo são forçados a aumentar em número.

Outro exemplo desta segunda abordagem é a amplificação do segmento alvo de ADN na designada "reacção de polimerase em

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cadeia" ("PCR"). Esta técnica é uma adaptação de processos desde à muito conhecidos que ocorrem naturalmente na replicação de, por exemplo, genomas de certos vírus de ADN de cadeia simples e, em todos os casos, é semelhante à preparação de ADN segundo Hong, Bioscience Reports 1. 243 (1981); Cooke et al. . J. Biol. chem. 255. 6502 (1980); e Zoller et al.. Methods in Enzvmoloqy 100, 468-500 (1983). Através da técnica de PCR, um segmento particular aumenta exponencialmente em número de cópias com o número de ciclos, cada um dos quais inclui (1) submeter o subsegmento terminal 3' de cada um dos segmentos alvo e o seu complementar (i.e., o segmento da sequência complementar à do segmento alvo), a tempera ("annealing") com um iniciador de ADN, (2) extensão de cada um dos iniciadores com uma ADN-polimerase, e (3) transformar os dúplices resultantes do passo (2) em cadeias simples por desnaturação térmica. A técnica de PCR é descrita em Saiki et al.. Science 230. 135 (1985) e Mullis et al. , Publicação dos Pedidos de Patente Europeia Nos. 0 200 362 e 0 201 184 e Patentes US Nos. 4 683 195 e 4 683 202.

Outra técnica para efectuar a segunda abordagem para detectar um segmento alvo presente a nível baixo numa mistura complexa de ácidos nucleicos consiste em empregar o chamado sistema de amplificação baseado na transcrição ("TAS"). 0 TAS utiliza um passo de produção de transcritos de ARN a partir de um ADN sintetizado, para incorporar um segmento com a sequência do alvo e um promotor posicionado relativamente ao segmento que contém a sequência alvo, de modo a permitir a transcrição a partir do segmento de ARN com a sequência complementar à do alvo. Podem ser executados ciclos múltiplos na medida em que o ARN produzido no passo de transcrição serve de molde para a produção de ADN que pode ser transcrito de modo semelhante, o qual por sua vez pode ser transcrito para produzir ARN adicional. A amplificação continua muito rapidamente com cada ciclo, sendo rapidamente produzidas entre cerca de 10 e cerca de 1 000 cópias de ARN compreendendo a sequência do segmento alvo ou da sequência complementar deste, a partir de cada ADN de cadeia dupla, que incorpora um promotor que possibilita a transcrição de um segmento que compreende o segmento alvo. 0 método TAS é descrito 73 346

50101 -6- nos Pedidos de Patentes US Nos. 064 141, deposite

Junho de 1987 e 202 978, depositado em 6 de Junho de 1988 (publicado na Publicação Internacional do Pedido de Patentes No. W088/10315), cujas descrições são aqui incorporadas para referência. 0 método TAS de amplificação de ácido nucleico proporciona um rápido aumento do número de cópias de um segmento alvo seleccionado fazendo uso de duas propriedades de ARN-polimerases ADN-dependentes: (1) iniciação apreciável da transcrição a partir de apenas um pequeno número de sequências específicas para cada polimerase, ver exemplo, Brom et al. . Nucleic Acids Res. 14. 3521 (1986); e (2) produção rápida de um grande número de transcritos (tipicamente 102-104 por hora) a partir de cada cópia de um promotor reconhecido por uma ARN-polimerase. Ver Milligan et al. . Nucleic Acids Res. 15. 8783 (1987). Adicionalmente, pelo emprego de uma técnica padronizada, o uso do sistema TAS torna possível uma medição, sem ambiguidades, da quantidade de segmento alvo de ácido nucleico presente numa amostra. 0 método TAS utiliza a actividade de ADN-polimerase ARN-dependente e a actividade da ADN-polimerase ADN-dependente, ambas as quais podem ser proporcionadas por uma transcriptase inversa, assim como a actividade de ARN-polimerase ADN-dependente e iniciadores. Os iniciadores definem as extremidades do segmento alvo a ser amplificado. Pelo menos um dos iniciadores, tipicamente aquele que hibrida com a extremidade 37 do segmento alvo, inclui um segmento que tem a sequência da cadeia com sentido de um promotor e está operativamente ligado para transcrição ao segmento do iniciador com a sequência complementar àquela da extremidade 37 do segmento alvo, de modo a iniciar a transcrição do ADN de dupla cadeia que compreende o promotor e o segmento alvo. Exemplos de promotores empregues no método TAS são aqueles reconhecidos pelas ARN-polimerases do fago T7, do fago T3 e do fago SP6. O método TAS pode ser empregue para amplificar um segmento alvo de ARN. Em tais amplificações, os iniciadores são empregues para sintetizar, a partir do ARN compreendendo o segmento alvo, 73 346 50101 -7-

um ADN de dupla cadeia, o qual incorpora um promotor que dirige a transcrição de um ADN que contém um segmento com a sequência do segmento alvo, para resultar num ARN contendo um segmento com a sequência complementar ao segmento alvo. o método TAS pode também ser empregue para amplificar um segmento alvo de um ácido nucleico de dupla cadeia. Resumidamente, o ácido nucleico de dupla cadeia de uma amostra é desnaturado e permite-se que os iniciadores hibridem com as suas respectivas cadeias, um iniciador (o iniciador "anti-sentido") híbrida com a extremidade 3' do segmento alvo e o outro (o iniciador "com sentido") com a extremidade 3' do segmento complementar do segmento alvo. Os iniciadores são então prolongadas com uma polimerase adequada e os dúplices resultantes são desnaturados termicamente e arrefecidos, de modo a permitir que os respectivos iniciadores hibridem novamente, não apenas com as cadeias da amostra de ácido nucleico de dupla cadeia que compreende a sequência alvo, mas também com os produtos de extensão formados na reacção inicial de extensão do iniciador. Os iniciadores hibridados são novamente prolongados numa reacção catalisada por uma polimerase adequada e, com os iniciadores hibridados com os produtos de extensão da extensão inicial do iniciador, dois tipos de ADN de cadeia dupla são formados, pelo menos um dos quais compreende um promotor operativamente ligado para transcrição a um segmento que compreende um segmento alvo. Os ADN de cadeia dupla, que compreendem tais promotores, são transcritos por uma ARN-polimerase ADN-dependente que reconhece o promotor, de modo a resultar num ARN compreendendo um segmento complementar àquele do segmento alvo e, portanto, amplificando o própio segmento alvo. O processo anterior de hibridação, extensão, desnaturação térmica, hibridação, extensão e transcrição podem ser repetidos utilizando ambas as cadeias dos novos ADN de dupla cadeia produzidas e os resultantes transcritos de ARN como moldes. 0 método TAS de amplificação, a menos que seja empregue no processo a replicação autocatalítica dos ARN, resulta, inter alia num primeiro transcrito de ARN de cadeia simples, que

73 346 50101 -8-compreende um segmento com a sequência do segmento alvo ou do seu complementar, o qual está está em largo excesso relativamente a um segundo ARN de sequência complementar àquela do primeiro ARN. Assim, o TAS proporciona uma abundância de ARN de cadeia simples que pode ser detectada sem a necessidade de ciclos térmicos de PCR, repetidos e incómodos ou de separação de cadeias.

Seria desejável proporcionar uma forma de amplificação baseada em transcrição, que eliminasse a necessidade de um passo de desnaturação térmica durante cada ciclo de amplificação, de tal modo que possam ser efectuados ciclos múltiplos de amplificação sem desnaturação térmica. Assim, seria muito desejável fornecer uma forma de amplificação baseada em transcrição, a qual seria auto-sustida e efectuada isotermicamente.

Sumário do Invento 0 presente invento inclui a verificação surpreendente de um processo de amplificação, substancialmente continuo e auto-sustido, de ácido nucleico alvo, que decorre espontaneamente e isotermicamente. Este processo para replicação auto-sustida de sequências (aqui denominado "3SR"), proporciona a amplificação de um segmento alvo de ARN, utilizando actividade de ADN-polimerase ARN-dependente, actividade de ADN-polimerase ADN-dependente, a actividade de RNAse H e actividade de ARN-polimerase ADN-dependente, e iniciadores, os quais são capazes de hibridar com o segmento alvo ou com o seu complementar, iniciando ("priming") uma reacção de extensão dos iniciadores, utilizando como molde o segmento alvo ou o seu complementar. Pelo menos um dos iniciadores proporciona uma sequência com sentido do promotor. A actividade da RNAse H obvia a necessidade de ciclos térmicos através da digestão catalisada enzimáticamente de uma cadeia de ARN de um dúplex ARN-ADN, transformando numa cadeia simples a cadeia de ADN do referido dúplex, a qual foi sintetizada numa reacção de extensão do iniciador utilizando a referida cadeia de ARN como molde. As quatro actividades enzimáticas podem ser proporcionadas por uma combinação de transcriptase inversa e de ARN-polimerase ADN-dependente. 0

presente invento inclui processos de amplificação de 3SR onde a actividade de RNAse H, inerente à transcriptase inversa, proporciona a requerida actividade de RNAse H e processos onde a actividade de RNAse H da transcriptase inversa é suplementada com outra fonte da actividade de RNAse H, tal como a RNAse H de E. coli. permitindo aumentos dos níveis de amplificação de cerca de 10^ a 10® vezes.

0 presente invento também inclui a verificação surpreendente de que, sob certas condições reaccionais, as transcriptases inversas tem actividade de RNAse H suficiente para proporcionarem reacções de amplificação 3SR extremamente sensíveis que são capazes de amplificar um segmento alvo de ARN de cerca de 105 vezes a cerca de 109 vezes, em menos de 4 horas, sem suplementar o meio de reacção com uma outra fonte de actividade de RNAse H diferente da transcriptase inversa. Na ausência das referidas certas condições reaccionais de amplificação 3SR, não são atingidos níveis maiores do que cerca de 103 a 104 vezes, a menos que a actividade de RNAse H da transcriptase inversa seja suplementada com actividade de RNAse H de, por exemplo, RNAse H de E. coli. Assim, em outro dos seus aspectos, o presente invento refere-se a processos 3SR, por 2 enzimas, de amplificação de segmentos de ácido nucleico alvo, que permitem a amplificação do segmento de ácido nucleico alvo de cerca de 10^ a cerca de 109 vezes, em 4 horas, tipicamente em 1/2 hora a 2 horas. 0 presente invento refere-se ainda a novos melhoramentos nos processos de amplificação 3SR. Estes melhoramentos incluem meios de reacção e outras condições de reacção melhorados, que permitem que a amplificação do segmento alvo por 3SR seja efectuada com apenas duas enzimas, e proporciona níveis aumentados de amplificação em ambas reacções 3SR por duas enzimas e reacções 3SR por três enzimas. 0 presente invento também proporciona processos para amplificação 3SR por duas enzimas, onde segmentos alvo relativamente grandes, com mais do que cerca de 700 bases, podem ser amplificados a níveis que de outro modo seriam apenas

73 346 50101 -10- alcançados com segmentos alvo menores. 0 presente invento proporciona conjuntos para amplificação por 3SR de segmentos de ácido nucleico alvo e para ensaios de amostras quanto à presença de ácidos nucleicos alvo, por processos que compreendem a amplificação por 3SR, compreendendo os referidos conjuntos meios de reacção optimizados para amplificação 3SR por três enzimas ou componentes para amplificação 3SR por duas enzimas.

Breve Descrição das Fiouras A Figura 1 é uma representação esquemática de uma concretização do presente invento. A Figura 1 representa o processo de replicação de sequências auto-sustida (3SR) como um processo passo-a-passo, apesar de dever ser entendido que na prática todos os passos ocorrem simultaneamente de um modo altamente interactivo. As actividades enzimáticas necessárias para a reacção de amplificação 3SR são a actividade de ADN-polimerase ARN-dependente (actividade 1 de RT), a actividade de ADN-polimerase ADN-dependente (actividade 2 de RT), a actividade de RNAse H (actividade 3 de RT) e a actividade de ARN-polimerase ADN-dependente. Os blocos rectangulares escuros representam os segmentos que proporcionam o promotor do primeiro iniciador (designado "A") e do segundo iniciador (designado "B").

As Figuras 2a e 2b apresentam uma representação esquemática detalhada dos vários passos de uma concretização do presente invento, a qual mostra os vários subsegmentos que compreendem as espécies de ácido nucleico estáveis ou temporáriamente presentes durante a reacção de amplificação 3SR, tal como será aqui descrito.

Descrição Detalhada do Invento 0 pedido de patente u.S. Na 285 467, depositado em 16 de Dezembro de 1988, o qual é aqui na sua totalidade incorporado para referência, apresenta um processo de amplificação de ácido nucleico alvo, substancialmente contínuo e auto-sustida, que decorre espontânea e isotermicamente. Este processo evita

73 346 50101 -11-vatajosamente a necessidade de desnaturação térmica de ácidos nucleicos hibridados. Como este processo de amplificação decorre espontaneamente e isotermicamente na presença do segmento alvo de ARN, dos iniciadores requeridos, das enzimas que proporcionam as actividades enzimáticas necessárias e dos substratos de nucleósido-trifosfatos, o processo é denominado "replicação de sequências auto-sustida", aqui abreviada como "3SR". A replicação de sequências auto-sustida pode ser efectuada de modo a decorrer até à exaustão porque, tal como foi surpreendentemente verificado, é possível manter uma mistura de reacção, incluindo as enzimas que proporcionam as quatro actividades enzimáticas necessárias, iniciadores, ribonucleósi-do-trifosfatos e 2/-desoxirribonucleósido-trifosfatos e ARN, em condições de reacção adequadas para ambas hibridações de iniciadores e, a níveis adequados, as quatro actividades enzimáticas necessárias. O processo 3SR emprega dois iniciadores de ADN, os quais iniciam reacções de extensão de cadeia utilizando o segmento alvo ou o seu complementar, respectivamente, como molde. Pelo menos um dos iniciadores inclui a cadeia com sentido de um promotor. A amplificação pelo processo 3SR, o qual é contínuo e substancialmente isotérmico, requer quatro actividades enzimáticas proporcionadas pelo menos por duas enzimas - a transcriptase inversa (para fornecer actividade de ADN-polimerase ARN-dependente, actividade de ADN-polimerase ADN-dependente e actividade de RNAse H) e uma ARN-polimerase ADN-dependente. A actividade de RNAse H empregue em 3SR é utilizada para transformar em cadeia simples um produto de extensão de ADN quando um segmento de ARN actua como molde para sintetizar o produto de extensão, ao contrário de TAS, que requer um passo de desnaturação. A actividade de RNAse H de uma transcriptase inversa, utilizada nas reacções de 3SR do invento, pode ser opcionalmente suplementada com uma fonte de actividade de RNAse H que não a transcriptase inversa, tal como a RNAse H de E. coli. No entanto, como a RNAse H de E. coli possui as suas próprias condições de reacção óptimas, que diferem das condições de 73 346 50101

-12- reacção óptimas das outras duas enzimas, e como a RNAse H de E. coli não é fácilmente isolada numa forma aceitavelmente pura e é consideravelmente mais dispendiosa que as outras duas enzimas requeridas para a amplificação 3SR, é altamente desejável eliminar o requisito para uma enzima em separado da transcriptase inversa, de modo a proporcionar uma quantidade de actividade de RNAse Ή eficaz para uma amplificação altamente sensível, a qual é necessária para detectar a presença de segmentos alvo de ácido nucleico, antes da amplificação, a muito baixas concentrações.

Faz-se referência aos livros de texto usuais de Biologia Molecular que contêm definições, métodos e meios de efectuar as técnicas básicas do presente invento, tais como: preparação de sondas ou iniciadores de ADN, incluindo a síntese de ADN? metodologia de hibridação, incluindo variações nas condições de rigor para produzir maior ou menor especificidade de hibridação dependendo do grau de homologia de um iniciador com um segmento alvo de ADN; reacções de polimerização de ADN, ADN-dependente e ARN-dependente, e síntese de ADNc; identificação, isolamento, sequenciação ou preparação de promotores, ou mais especificamente, de promotores ou locais reconhecidos por ARN-polimerases ADN-dependentes de bacteriófagos, para ligação preparativa da catálise da transcrição, ou, quando são empregues sistemas eucariotas, esses promotores ou locais reconhecidos por ARN-polimerases virais ARN-dependentes e ADN-dependentes, por exemplo, ARN-polimerase codificada por adenovírus e ARN-polimerase de vírus de mosaico do bromo; condições conducentes à produção de transcritos de ARN, incluindo as denominadas sequências intensificadoras de transcrição; métodos de reacção de polimerase em cadeia, incluindo os reagentes nela utilizados; e assim por diante. Ver, por exemplo, Maniatis et al. . Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982), e as várias referências nele citadas; Patente U.S. 4683195; Patente U.S. 4683202; Beaucage et al.. Tetrahedron Letters 22. 1859 (1981); Caruthers et al.. Meth. Enzvm. 154 287 (1985); Lee et al.. Science 239. 1288 (1988); Milligan et al.. Nucleic Acids Res. 15. 8783 (1987); Miller et al.. Viroloav 125. 236 (1983),

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Ahlquist et al. . J. Mol. Biol. 153 . 23 (1981)? Miller et al. . Nature 313. 68 (1985); Ahlquist et al.. J. Mol. Biol. 172, 369 (1984); Ahlquist et al.. Plant Mol. Biol. 3. 37 (1984); Ou et al.. PNAS 79. 5235 (1982); Chu et al.. Nucleic Acids Res. 14. 5591 (1986); Publicação de Pedido de Patente Europeia N2. (EPA) 194809? Marsh et al.. Positive Strand RNA Viruses. p. 327-336, Alan R. Liss (Publ.; New York) (1987; Proceedings of UCLA Symposium, 1986); Miller et al.. J. Mol. Biol. 187. 537 (1986); Stoflet et al.. Science 239. 491 (1988); e Murakawa et al. DNA 7. 287 (1988).

Todas as publicações acima citadas são aqui incorporadas para referência.

O termo "iniciador", no presente contexto, significa um ácido nucleico de cadeia simples, que tem um segmento na sua extremidade 3' com homologia suficiente com um segmento do segmento alvo ou complementar dele, de tal modo que, em condições de hibridação adequadas, é capaz de hibridar com o segmento alvo (ou complemento dele) e iniciar uma reacção de extensão do iniciador, na qual um ácido nucleico contendo a sequência do segmento alvo (ou complementar dele) é o molde. Um segmento hibridante de um iniciador típico tem pelo menos cerca de 10 nucleótidos de comprimento, mais preferivelmente 15-50 nucleótidos e muito preferivelmente aproximadamente 15-25 bases nucleotídicas de comprimento. Um "iniciador" é preferencialmente um ADN.

Tal como é aqui utilizado, um "iniciador anti-sentido" significa um iniciador que possui uma sequência suficientemente complementar à sequência da extremidade 3· do segmento alvo a ser prolongado, numa reacção de extensão em cadeia, utilizando o segmento alvo como molde; um "iniciador com sentido" significa um iniciador que possui uma sequência semelhante suficientemente homóloga à sequência da extremidade 5' do tal segmento alvo. Os iniciadores definem as extremidades do segmento alvo a ser amplificado. Nas concretizações mais preferíveis, os iniciadores com sentido e anti-sentido, respectivamente, contêm segmentos, 73 346 50101 -14-

que incluem pelo menos as suas extremidades 37, que compartilham identidade ou homologia muito elevada com a extremidade 5' do segmento alvo e do complementar da extremidade 3' do segmento alvo, respectivamente. Ver, por exemplo, EPA 128042 (publ. 12 Dezembro 84).

Pelo menos um, opcionalmente ambos, dos iniciadores compreende um segmento com uma sequência com sentido do promotor. 0 termo "cadeia com sentido do promotor" significa um ácido nucleico de cadeia simples que, quando hibridado com o seu complementar de modo a se encontrar na forma de cadeia dupla (i.e., como um promotor de cadeia dupla), é especificamente reconhecido por uma ARN-polimerase, a qual se liga à sequência ligadora de polimerase do promotor e inicia o processo de transcrição, pelo que se produz um transcrito de ARN. Em principio, pode ser empregue qualquer sequência de promotor com sentido para a qual exista uma polimerase conhecida e disponível que seja capaz de reconhecer a sequência. Tipicamente, promotores conhecidos e úteis são aqueles que são reconhecidos por certas ARN-polimerases de bacteriófagos, tais como aquelas dos bacteriófagos T3, T7 ou SP6. Ver Siebenlist et al. , Cell 20. 269 (1980). Estes são apenas exemplos de ARN-polimerases que podem ser empregues na prática do presente invento em conjunção com as suas sequências de promotor associadas. Adicionalmente, uma "cadeia com sentido do promotor", tal como é aqui utilizada, preferencialmente compreende um ou mais nucleótidos, mais preferencialmente cerca de 4 a cerca de 10 ou mais nucleótidos, contíguos ao nucleótido mais a 5' da sequência consensual do promotor (cadeia com sentido) (i.e., a sequência com sentido do local de ligação consensual da polimerase). Tal como é aqui utilizado, uma "sequência com sentido do promotor" deve ter um comprimento suficiente de tal modo que, após estar completo um ADNc incorporando a referida sequência, a sequência consensual do promotor é completamente de cadeia dupla. Nestes ADNc, a transcrição ocorre a partir do promotor quando uma ARN-polimerase, que reconhece o promotor, está presente nas condições adequadas para a transcrição a partir do promotor.

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Os promotores de bacteriófagos são preferidos devido à sua elevada especificidade para as ARN-polimerases com elas relacionadas. Outros promotores e suas correspondentes ARN-polimerases ADN-dependentes, que possuem igualmente elevada especificidade, podem ser empregues de acordo com o invento em vez das polimerases e promotores de bacteriófagos, e o invento tenciona cobrir esses outros promotores assim como as ARN-polimerases, desde que o referido promotor mostre um elevado grau de especificidade para a referida polimerase.

As sequências com sentido do promotor de bacteriófago preferidas são as cadeias (+) dos promotores de T7, T3 e SP6, que incluem o segmento ao qual a correspondente ARN-polimerase se liga e pelo menos um, e preferencialmente cerca de 4 a cerca de 10, nucleótidos 5' da extremidade 5' deste segmento de ligação de polimerase. Os promotores preferidos e as suas correspondentes ARN-polimerases são descritos nos exemplos e reivindicações, mas são conhecidos na arte numerosos outros promotores e ARN-polimerases e podem também ser empregues.

Os "subsegmentos variáveis" que são opcionalmente incluídos nos iniciadores de ADN possuem uma ou mais funções. Primeiro, para o(s) iniciador(es) que inclui (incluem) uma sequência do promotor, os subsegmentos variáveis incluem preferencialmente sequências de iniciação de transcrição que são preferidas pela ARN-polimerase correspondente ao promotor. Apesar de se acreditar que a sequência de iniciação de transcrição do bacteriófago T7, 5/-GGGA-3/, que se encontra adjacente à extremidade 3' da sequência consensual de 17 nucleótidos do promotor T7, é importante para a transcrição in vivo, ela não parece ser crucial para a transcrição durante a amplificação 3SR. O Exemplo IX, que se segue mostra o efeito nos níveis de amplificação causados por mutações (substituições de nucleótidos ou delecções) na sequência de iniciação de transcrição, imediatamente a jusante da sequência consensual de 17 nucleótidos do promotor T7. A sequência de iniciação de transcrição é opcional para iniciadores contendo um segmento que proporciona o promotor. Tais iniciadores, contendo o nucleótido mais a 3' da sequência consensual do promotor contíguo -16- 73 346 50101 a um segmento de hibridação alvo, podem proporcionar elevados níveis de amplificação comparáveis àqueles alcançados quando a sequência de iniciação de transcrição, 5'-6GGA-3', está presente. No entanto, é preferível incluir um segmento de pelo menos um a cerca de quatro, preferencialmente quatro, nucleótidos contíguos ao nucleótido mais a 3' da sequência consensual do promotor. Um exemplo de uma sequência preferida, para inclusão no local da sequência de iniciação de transcrição contígua ao nucleótido mais a 37 da sequência consensual de T7, é a sequência 5'-GAAA-3'.

Segundo, para todos os iniciadores, um subsegmento variável pode opcionalmente conter um segmento não-alvo particular, segmento pelo qual produto de ARN da amplificação possa ser detectado num ensaio de hibridação com sondas de ácido nucleico. Com efeito, a amplificação (e o ensaio) pode ocorrer simultaneamente para vários segmento alvo diferentes, através da utilização de conjuntos de iniciadores que diferem nos seus segmentos de reconhecimento ("anti-alvo" ou "complementar de anti-alvo") nas suas extremidades 3', mas que incluem um subsegmento variável comum. O subsegmento variável pode também conter uma sequência poliligadora que, convenientemente, possui uma pluraridade de locais de restrição de modo a facilitar a clonagem subsequente. Além disso, o subsegmento variável pode conter a sequência de um ARN auto-replicável, tal como o vírus QjS, o qual na presença da sua correspondente replicase (exemplo, replicase de Qj0) pode multiplicar e auto-replicar um transcrito de ARN contendo o tal subsegmento variável. 0 termo "operativamente ligado", relacionado em particular com a ligação de uma sequência do promotor de um iniciador com uma sequência hibridante (anti-alvo ou complementar de anti-alvo) do referido iniciador, refere-se à funcionalidade do "molde de ácido nucleico de cadeia dupla" ou "ADNc" final sintetizado nos processos de amplificação do presente invento e incorporando o iniciador. Os ADNc assim produzidos são capazes de produzir transcritos de ARN, na presença de uma ARN-polimerase ADN-dependente que reconheça o promotor, quando o segmento de

73 346 50101 -17- cadeia com sentido do promotor de um iniciador está "operativamente ligado por transcrição" ao segmento 3' do iniciador, o qual híbrida com o alvo para complementar o alvo. A reacção de extensão do iniciador para produzir um duplex de ADN-ARN ou ADN-ADN é bem conhecida. Transcritases inversas, particularmente aquelas de retrovírus, são conhecidas por serem úteis no fornecimento de actividade de ADN-polimerase ADN-dependente e de ADN-polimerase ARN-dependente. "Quantidade de actividade de RNAse H eficaz para amplificação altamente sensível" significa uma quantidade de actividade de RNAse H que, na mistura de reacção contendo os iniciadores apropriados (para a amplificação 3SR de um segmento alvo de ARN), actividade de ADN-polimerase ARN-dependente, actividade de ADN-polimerase ADN-dependente e ARN-polimerase ADN-dependente (e seus substratos), a qual é incubada numa gama de temperaturas na qual as últimas três actividades enzimáticas são activas, seja capaz de amplificar o referido segmento alvo de ARN pelo menos 105 vezes, em 2-4 horas. 0 termo "quantidade de RNAse H eficaz para amplificação altamente sensível", tal como é aqui utilizado, pretende significar o nível de amplificação necessária numa reacção 3SR para detectar, utilizando as técnicas de ensaio de hibridação de ácido nucleico conhecidas, um segmento alvo de ácido nucleico, o qual está presente, antes da amplificação, num meio de reacção a um nível de 1 a 10 000 moléculas (por exemplo, num volume de reacção de cerca de 0,05 a cerca de 1 ml). Uma quantidade de actividade de RNAse H que é eficaz para a reacção de amplificação 3SR pode ser menor do que a "quantidade de actividade de RNAse H eficaz para amplificação altamente sensível", e nestes casos pode ser suficiente para amplificar, numa reacção de amplificação 3SR, um segmento de ácido nucleico alvo, o qual está presente numa concentração tal que o nível de amplificação necessário para detecção seja menor do que cerca de 102 vezes a cerca de 104 vezes. A actividade de RNAse H que se sabe que as transcritases inversas de retrovírus possuem, é conhecida por em certas

50101 -18- condições, digerir a cadeia de ARN de um duplex ARN-ADN em pequenos oligonucleótidos (por exemplo, oligo-ribonucleótidos com menos do que cerca de 5-10 bases de comprimento), deixando intacta a cadeia de ADN. No entanto, nas condições de reacção que são descritas na Patente U.S. No. 285 467, acima mencionada e aqui incorporada, a actividade de RNAse H inerente nas transcritases inversas é insuficiente para proporcionar uma amplificação 3SR altamente sensível. Nas condições de reacção descritas na Patente No. 285,467, a adição de RNAse H de E. coli suplementa a inerente actividade de RNAse H de uma transcriptase inversa e permite níveis de amplificação 3SR necessários para detecção, por hibridação de ácido nucleico, de um segmento de ácido nucleico alvo, presente a uma concentração de cerca de 10 attomole/ml antes da amplificação.

Os quatro ribonucleósido-trifosfatos, rATP, rUTP, rCTP e rGTP, são aqui referidos colectivamentente como "rNTP" ou "rXTP".

As técnicas para formar um sinal detectável, tal como através de marcação radioactiva ou por meios cromogénicos utilizando uma enzima que catalisa uma reacção cromogénica, são bem conhecidos e documentados na arte.

Num dos seus aspectos, o invento inclui um processo de amplificação 3SR de um segmento alvo de ARN de uma molécula alvo de ARN cuj o segmento compreende um subsegmento 57, que inclui um nucleótido 57-terminal e se prolonga por pelo menos 9 nucleótidos na direcção 37 a partir do nucleótido 57-terminal do segmento alvo, e um subsegmento 37, que não se sobrepõe ao subsegmento 57 e que inclui um nucleótido 37-terminal e se prolonga por pelo menos 9 nucleótidos na direcção 57 a partir do nucleótido 37 do segmento alvo (ver, por exemplo, a Figura 2a, passo 1), método que compreende incubar num meio de reacção: f (a) (1) um primeiro iniciador de ADN, que é um ADN de cadeia simples, que compreende, na sua extremidade 37, um primeiro subsegmento contendo um nucleótido 37-terminal e se prolonga por pelo menos 9 nucleótidos na direcção 57, tendo o referido

73 346 50101 -19-primeiro subsegmento do referido primeiro iniciador o mesmo comprimento que o subsegmento 3' do segmento alvo e tendo uma sequência suficientemente complementar àquela do subsegmento 3' do segmento alvo, para iniciar, no meio de reacção, uma reacção de extensão do iniciador, na qual um ácido nucleico com a sequência do segmento alvo é o molde, e (2) um segundo iniciador de ADN, que é um ADN de cadeia simples, que compreende, na sua extremidade 3', um primeiro subsegmento contendo um nucleótido 3'-terminal e se prolonga por pelo menos 9 nucleótidos na direcção 5', tendo o referido primeiro subsegmento do referido segundo iniciador o mesmo comprimento que o subsegmento 5' do segmento alvo e tendo uma sequência suficientemente homóloga àquela do subsegmento 5' do segmento alvo a ser iniciado, para iniciar, no meio de reacção, uma reacção de extensão do iniciador, na qual um ácido nucleico com a sequência complementar àquela do segmento alvo é o molde, desde que pelo menos um dos referidos iniciadores compreenda ainda um subsegmento contendo um promotor, que compreende a cadeia com sentido de um primeiro promotor, sendo a referida cadeia com sentido Tinida ao primeiro subsegmento do iniciador, que compreende o referido segmento contendo um promotor, de um modo operacional, para transcrição a partir do referido primeiro promotor de um ADNc contendo os produtos de extensão dos dois referidos iniciadores e, desde ainda que, não possuindo o referido primeiro iniciador um segmento que proporciona um promotor, então que o nucleótido terminal 5', do referido subsegmento 5', do referido segmento ARN alvo, seja o nucleótido terminal 5' da molécula alvo de ARN; (b) pelo menos duas enzimas que exibem, no referido meio de reacção, actividade de ADN-polimerase ADN-dependente, actividade de ADN-polimerase ARN-dependente, actividade de RNAse H e uma ARN-polimerase ADN-dependente, sendo a referida ARN-polimerase ADN-dependente, no referido meio de reacção, capaz de catalisar a transcrição do referido primeiro promotor; e (c) nucleósido-trifosfatos requeridos como substratos para a actividade da ADN-polimerase ADN-dependente, ADN-polimerase ARN-dependente e ARN-polimerase ADN-dependente;

73 346 50101 -20- onde a referida incubação ocorre numa gama de temperaturas, nas quais as referidas enzimas, no referido meio de reacção, são activas para proporcionarem as referidas actividades de ADN-polimerase ADN-dependente, ADN-polimerase ARN-dependente, RNAse H e ARN-polimerase ADN-dependente.

Em outro dos seus aspectos, o invento inclui um processo para amplificação 3SR, por duas enzimas, altamente sensível e altamente produtivo, de um segmento alvo de ARN, de uma molécula ARN alvo, segmento esse que compreende um subsegmento 5', que inclui um nucleótido 5'-terminal e se prolonga por pelo menos 9 nucleótidos na direcção 3', a partir do nucleótido 5'-terminal do segmento alvo, e um subsegmento 3', que não se sobrepõe ao subsegmento 5' e que inclui um nucleótido 3'-terminal e se prolonga por pelo menos 9 nucleótidos na direcção 5' a partir do nucleótido 3' do segmento alvo (ver, por exemplo, a Figura 2a, passo 1), processo esse que compreende incubar num meio de reacção: (a) (1) um primeiro iniciador de ADN, que é um ADN de cadeia simples, que compreende, na sua extremidade 3', um primeiro subsegmento contendo um nucleótido 3'-terminal e se prolonga por pelo menos 9 nucleótidos na direcção 5', tendo o referido primeiro subsegmento do referido primeiro iniciador o mesmo comprimento que o subsegmento 3' do segmento alvo e tendo uma sequência suficientemente complementar àquela do subsegmento 3' do segmento alvo a iniciar, para iniciar, no meio de reacção, uma reacção de extensão do iniciador, na qual um ácido nucleico com a sequência do segmento alvo é o molde, e (2) um segundo iniciador de ADN, que é um ADN de cadeia simples, que compreende, na sua extremidade 3', um primeiro subsegmento contendo um nucleótido 3'-terminal e se prolonga por pelo menos 9 nucleótidos na direcção 5', tendo o referido primeiro subsegmento do referido segundo iniciador o mesmo comprimento que o subsegmento 5' do segmento alvo e tendo uma sequência suficientemente homóloga àquela do subsegmento 5' do segmento alvo a iniciar, para iniciar, no meio de reacção, uma reacção de extensão do iniciador, na qual um ácido nucleico com a sequência complementar -21- 73 346 50101 àquela do segmento alvo é o molde, desde que pelo menos um dos referidos iniciadores compreenda ainda um subsegmento que proporciona um promotor, que compreende a cadeia com sentido de um primeiro promotor, sendo a referida cadeia com sentido unida ao primeiro subsegmento do iniciador, que compreende o referido segmento que proporciona um promotor, de um modo operacional, para transcrição a partir do referido primeiro promotor de um ADNc contendo os produtos de extensão dos dois referidos iniciadores e, desde ainda que, quando o referido primeiro iniciador não possui um segmento contendo um promotor, então que o nucleótido 5'-terminal, do referido subsegmento 5', do referido segmento ARN alvo, seja o nucleótido terminal 5' da molécula alvo de ARN; (b) (1) uma transcriptase inversa que exibe, no referido meio de reacção, actividade de ADN-polimerase ADN-dependente, actividade de ADN-polimerase ARN-dependente e uma quantidade de actividade de RNAse H eficaz para amplificação altamente sensível, e (2) uma ARN-polimerase ADN-dependente que, no referido meio de reacção, catalise a transcrição a partir do referido primeiro promotor; e (c) nucleósido-trifosfatos requeridos como substratos para as actividades de ADN-polimerase ADN-dependente, ADN-polimerase ARN-dependente e ARN-polimerase ADN-dependente; onde a referida incubação ocorre numa gama de temperaturas, na qual as referidas enzimas, no referido meio de reacção, são activas, proporcionando as referidas actividades de ADN-polimerase ADN-dependente, ADN-polimerase ARN-dependente, RNAse H e de ARN-polimerase ADN-dependente.

Os processos de amplificação 3SR requerem pelo menos um iniciador que proporciona um promotor, o qual é um iniciador que compreende um segmento com a sequência com sentido de um promotor, segmento esse que está ligado operativamente para transcrição ao segmento 3' do iniciador, através do qual o iniciador híbrida com o segmento alvo ou complementar do segmento alvo. 0 primeiro iniciador e o segundo iniciador são também aqui

50101 -22- referidos como "iniciador anti-sentido" e "iniciador com sentido", respectivamente. O iniciador anti-sentido é o iniciador preferido para incluir uma sequência de promotor, apesar de, tal como se tomará claro a partir da descrição do presente invento, os iniciadores anti-sentido e com sentido poderem cada um incluir uma sequência de promotor, e em certos casos, a amplificação pode ocorrer apenas onde o iniciador com sentido inclui uma tal sequência de promotor. As concretizações posteriores, nas quais apenas o iniciador com sentido compreende uma cadeia com sentido de um promotor, requerem um segmento alvo de ARN, em que o nucleótido 5'-terminal do subsegmento 57 é também a extremidade 5' de toda a molécula alvo de ARN.

Certos subscriptos são empregues para definir os vários ácidos nucleicos, estáveis ou temporariamente presentes, durante a amplificação 3SR. Estes subscriptos têm os seguintes significados: "1" — uma sequência associada com um primeiro iniciador; "2" -- uma sequência associada com um segundo iniciador; "t" — uma porção de um segmento alvo? "c" — uma sequência complementar a uma porção de um segmento alvo; "r" — ARN; e "d" — ADN. Por exemplo, o segmento aqui designado como (subsegmentotcd-3' ) é uma sequência de ADN (d), que é complementar (c) ao subsegmento 37 (i.e., o segmento hibridante com o iniciador) do segmento alvo de ARN (t), cujo segmento hibridante é designado (subsegmentOj-r-37).

Os processos de amplificação 3SR por duas enzimas, do presente invento, em que o iniciador anti-sentido inclui uma sequência com sentido do promotor, serão agora descritos. A descrição seguinte assume a presença de um segmento alvo de ARN no meio de reacção. Será também descrito a produção de um segmento alvo de ARN a partir de uma cadeia dupla de ADN, que inclui um segmento com a mesma sequência do segmento alvo de ARN (substituindo os ribonucleótidos por 27-desoxirribonucleótidos e U por T), para situações onde um segmento alvo de ARN pode não estar inicialmente presente numa amostra biológica ou noutra amostra de ácido nucleico, à qual o método do invento é aplicado. 73 346 50101 -23-

Com referência à Figura 1, a amplificação 3SR por duas enzimas, de acordo com o presente invento, é iniciada com um segmento alvo de ARN com a Fórmula I: 57 - (subsegmento^-r-57) - (subsegmento^-r intermédio) - (subsegmento£r-37) -37 0 subsegmento designado (subsegmento^r-57) é um segmento de ARN de sequência conhecida, tendo pelo menos 10 nucleótidos, incluindo o nucleótido mais a 5' do segmento alvo de ARN e que se prolonga na direcção 37, por pelo menos 9 nucleótidos. o (subsegmento^.r-37) é um segmento de ARN de sequência conhecida de pelo menos 10 nucleótidos, incluindo o nucleótido mais a 37 do segmento alvo de ARN e que se prolonga, na direcção 57, de pelo menos 9 nucleótidos. O (subsegmento.^ intermédio) é um segmento de ARN de 0 ou mais nucleótidos que unem o (subsegmentotr-37) e o (subsegmentOtr-57). se o (subsegmento^.r intermédio) não possui nucleótidos, então a extremidade 37 do (subsegmentotr-57) une-se à extremidade 57 do (subsegmentotr-37). 0 primeiro passo no processo de amplificação 3SR envolve a hibridação do primeiro iniciador (anti-sentido) ao subsegmento-37 do segmento alvo de ARN (subsegmentotr-37) e a sua extensão através da actividade da ADN-polimerase ARN-dependente de uma transcriptase inversa, utilizando o alvo de ARN como molde para formar um duplex ADN-ARN. 0 duplex de ADN-ARN, então formado, prolonga-se pelo menos até ao nucleótido 57-terminal do (subsegmentotr-57). Ver Figura 2a, passo 3. 0 primeiro iniciador é um ADN de cadeia simples, o qual compreende o segmento de ácido nucleico com a Fórmula II: 57- (promotorld) - (subsegmentold variável) -(subsegmento^-C(j-37) -37

II 0 segmento designado (promotorld) é um segmento de ADN de cadeia simples com a sequência da cadeia com sentido de um primeiro

73 346 50101 -24- promotor, preferencialmente um reconhecido por uma ARN— ADN-dependente, de bacterióf ago; o (subsegmento^.C(j-3 7) é um segmento de ADN de cadeia simples, contendo o mesmo número de nucleótidos e uma sequência que é suficientemente complementar a (subsegmentotr-37), para hibridar e iniciar uma reacção de extensão, utilizando o ARN alvo como molde; o (subsegmentold variável) é um ADN de cadeia simples, de 0 a 50 nucleótidos, contíguo ao nucleótido terminal 3' do (promotor 1(j). Se o referido (subsegmento·^ variável) não possui nucleótidos, a extremidade 37 da cadeia com sentido do promotor, (promotor), une-se ao terminal 57 do referido (subsegmento^-c<j-37). O (segmento1(j variável) pode compreender, por exemplo, um segmento de iniciação de transcrição nativo reconhecido por uma ARN-polimerase, que reconhece o promotor; no caso da polimerase do bacteriófago T7, este segmento de iniciação de transcrição nativo poderia conter a sequência 57-GGGA-37. Um segmento de iniciação de transcrição, presentemente preferido, compreende a sequência 57-GAAA-37.

Os meios de reacção melhorados do presente invento permitem os métodos de amplificação 3SR por duas enzimas do presente invento porque tal meio de reacção permite a expressão da inerente actividade de RNAse H da transcriptase inversa. Esta actividade de RNAse H da transcriptase inversa degrada a cadeia de ARN de um duplex de ADN-ARN, resultando uma primeira cadeia de ADN complementar, contendo o segmento de ADN com a Fórmula III: 57- (promotorld) - (subsegmentold variável)- (subsegmentotc(j-37) - (sxabsegmento^câ intermédio) - (subsegmento^-C(j-57) -37

III

Os segmentos (subsegmentotcd intermédio) e (subsegmentotcd-57) são segmentos de ADN complementares a (subsegmentotr intermédio) e (subsegmentotr-57), respectivamente. Os segmentos (promotorld), (subsegmentold variável) e (subsegmentotc(j-37) são definidos na Fórmula II.

Quando a molécula alvo de ARN não é idêntica em comprimento

73 346 50101

ao segmento alvo de ARN, o duplex ADN-ARN pode incluir um segmento de duplex ADN-ARN que se prolonga (relativamente à cadeia de ARN) na direcção 57, para além do subsegmento 5' do alvo e/ou de uma sequência de ARN de cadeia simples que se prolonga na direcção 37 a partir do subsegmento 37.

Um segundo iniciador de ADN ("iniciador com sentido") híbrida com o primeiro ADN complementar de cadeia simples e inicia uma reacção de extensão do iniciador, neste primeiro ADN complementar. 0 segundo iniciador de ADN é um ADN de cadeia simples, contendo uma sequência de pelo menos 10 nucleótidos, e corresponde à Fórmula IV (iniciador sem promotor) ou à Fórmula IV(a), um iniciador contendo um promotor: 57- (subsegmento2£ variável) - (subsegmento^-57) -37

IV 57- (promotor2(}) - (subsegmento2(j variável) -(57 -subsegmento^) -37 IV(a) 0 segmento designado (subsegmentot<a-57 ) é um ADN com uma sequência que é suficientemente homóloga à sequência de (subsegmentotr-57) para hibridar com um primeiro ADN complementar (em (subsegmento^.c^-57)) e iniciar uma reacção de extensão de iniciador, utilizando vim primeiro ADN complementar, com a Fórmula III, como molde. 0 segmento designado (subsegmento2(j variável) é um segmento de 0 a 100 nucleótidos, que se une ao terminal 57 do (subsegmentotd-57). A segunda sequência com sentido do promotor é designada (promotor2(j) · Tal como com o segmento designado (subsegmento1(j variável), o (subsegmento2(j variável) pode consistir numa. A segunda sequência com sentido do promotor, se presente, pode ser a mesma ou diferente da primeira sequência do promotor. Quando o primeiro promotor e o segundo promotor são diferentes (i.e., quando o primeiro e o segundo promotores não são reconhecidos pela mesma ARN-polimerase ADN-dependente), o meio de reacção pode incluir opcionalmente uma segunda ARN-polimerase ADN-dependente que reconheça o segundo promotor. 50101

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Visto que o segmento designado (subsegmento2d variável*^ é um segmento opcional de um iniciador sem promotor com sentido, com a Fórmula IV (apesar de que deve ser compreendido que a inclusão do tal subsegmento pode ser desejável, por exemplo, para proporcionar uma sequência não-alvo para fins de ensaio de hibridação), este segmento opcional poderá ser omitido da descrição que se segue, a qual se refere às concretizações do presente invento utilizando um iniciador sem promotor com sentido. A actividade da ADN-polimerase ADN-dependente da transcriptase inversa prolonga o segundo iniciador, utilizando o primeiro ADN complementar como um molde, para formar um primeiro ADNc de dupla cadeia (aqui denominado ADNc I), que compreende um promotor operativamente ligado para transcrição a tua segmento de ADNc, que é complementar ao segmento alvo de ARN (i.e. tem a sequência exactamente complementar àquela do segmento alvo). Ver a Figura 2a, passo 6. O ADNc compreende a primeira cadeia de ADN complementar, tal como acima foi definida na Fórmula III, e uma segunda cadeia de ADN complementar, compreendendo o ADN da Fórmula V ou V(a): 5·- (subsegmentotd-5') - (subsegmentotd intermédio) -(subsegmento^-3') - (subsegmentolcd variável) -(promotorlcd) -3'

V 5'- (promotor2d) - (subsegmento2d variável)-(subsegmento^-5') - (subsegmento^ intermédio) -(subsegmentotd-3') - (subsegmentolcd variável) -(promotorlcd) -3' V(a)

Os segmentos (subsegmento.^ variável), (subsegmento^-3 '), (subsegmentolcd variável) e (promotorlcd) são segmentos que são complementares aos (subsegmento-j.cd intermédio), (subsegmento^jj-S'), (subsegmentold variável) e (promotorld), respectivamente. Os segmentos (promotor2d), (subsegmento2d

73 346 50101 -27-variável) e (subsegmento^-5') são definidos como nas Fórmulas IV e IV (a); O ADNc If consistindo na primeira e segunda cadeias complementares de ADN, é transcrito a partir do primeiro promotor, na presença da correspondente ARN-polimerase ADN-dependente, para produzir cópias múltiplas de um transcrito de ARN, com a Fórmula VI ou Fórmula VI(a) (Ver Figura 2b, passo 7): 5'- (subsegmento*Lr variável) - (subsegmento^.cr~3') -(subsegmento^cr intermédio) - (subsegmentotcr-5') -3'

VI 5'— (subsegmentolr variável) - (subsegmentotcr-3') -(subsegmento^.cr intermédio) - (subsegmento^-cr-5 ·) -(subsegmento2cr variável) - (promotor2cr) -37 VI (a) o segmento (subsegmentolr variável) é um segmento de arn correspondente ao (subsegmentold variável); os segmentos (subsegmentotcr-3' ) , (subsegmentotcr intermédio), (subsegmentotcr-5#), (subsegmento2cr variável) e (promotor2cr) são complementares a (subsegmentotr-3'), (subsegmentotr intermédio), (subsegmento^.r-5 ’), (subsegmento2(j variável) e (promotor 2(^), respectivamente.

Cada uma das múltiplas cópias do transcripto de ARN com a Fórmula VI ou VI(a) é capaz de hibridar com um segundo iniciador com a Fórmula IV ou IV(a), respectivamente, e funcionar como molde para uma reacção de extensão de iniciador, para formar um duplex de ADN-ARN. Ver Figura 2b, passos 8 e 9. A actividade inerente de RNAse H da transcriptase inversa digere a cadeia do transcrito de ARN do duplex ADN-ARN, tornando assim em cadeia simples o terceiro ADN complementar, com a Fórmula VII ou Fórmula VII(a): -28- 50101 5'— (subsegmentotd-5') - (subsegmentotd intermédio) -(subsegmentotd-3') - (subsegmentolcd variável) -3'

VII 5#- (promotor2(j) - (subsegmento2(j variável) -(subsegmentotd-5') - (subsegmentotd intermédio) -(subsegmento^-3') - (subsegmento1C(j variável) -3' VII(a)

Cada um dos segmentos é definido como nas Fórmulas V ou V(a) acima. A seguir, um primeiro iniciador com a Fórmula II hibrida com a esta terceira cadeia de ADN complementar e é prolongado, para formar um quarto ADN complementar. Ver Figura 2b, passo 12. O quarto ADN complementar é um segmento com a Fórmula VIII: 3' - (subsegmentotc<a-5 ') - (subsegmentotc<a intermédio) -(subsegmento£C<j-3') - (subsegmento1(j variável) -(promotorld) -5'

VIII ou com a Fórmula VIII(a): 3'- (promotor2cd) “ (subsegmento2c(j variável) - (subsegmentOj-C(j-5') - (sttbsegmento^C(j intermédio) -(subsegmentotcd-3 ’) - (subsegmento1(j variável) -(promotor^) -5' VIII(a)

Cada um dos segmentos é definido como na Fórmula III acima. A extremidade saliente do quarto ADN complementar, a sequência codificadora do promotor, actua como um molde para o prolongamento do terceiro ADN complementar, para completar um ADNc II, Fórmula X, que consiste numa terceira cadeia de ADN complementar com a Fórmula VII e uma quarta cadeia complementar com a Fórmula VIII (ou Fórmula VII(a) e VIII(a)).

73 346 50101 -29

Nesta concretização descrita do presente invento, a transcrição produz transcritos anti-sentido (onde apenas o iniciador anti-sentido contém uma cadeia com sentido do promotor) como ambos transcritos com e anti-sentido (onde cada iniciador contém uma cadeia com sentido do promotor).

Os transcriptos com sentido possuem a Fórmula IX: 5'- (subsegmento2r variável) - (subsegmento^r-5') - (subsegmentotr intermédio) - (subsegmento^-r-3') - (subsegmentolcr variável) - (promotorlcr) -3'

IX

Os segmentos designados como (subsegmento^-r-5' ), (subsegmento^-r intermédio) e (subsegmentotr-3') são idênticos, ou substancialmente hómologos, ao segmento alvo de ARN com a Fórmula I. Os segmentos (subsegmentolcr variável) e (promotorlcr), respectivamente, são as sequências de ARN complementares a (subsegmentold variável) e (promotorld).

Os transcritos anti-sentido entram novamente num ciclo de amplificação anti-sentido como molde, para produzir cópias adicionais de ADNc II. Figura 2b, passos 7-12.

Os transcritos com sentido, com a Fórmula IX, entram num ciclo de amplificação com sentido, discreto, análogo ao ciclo anti-sentido acabado de ser descrito. Resumidamente, cada uma das múltiplas cópias do transcrito com sentido é capaz de hibridar com o primeiro iniciador, com a Fórmula II, e funcionar como molde para um produto de extensão, de modo a formar um duplex de ADN-ARN compreendendo um quinto ADN complementar, o qual é transformado numa cadeia simples pela actividade inerente de RNAse H da transcriptase inversa. Ver Figura 2b, passos 7a-10a. Um segundo iniciador, com a Fórmula lV(a) hibrida com essa cadeia e é prolongado, para formar um ADNc II de cadeia dupla, o qual é idêntico ao ADNc II que consiste nas cadeias de ADN das Fórmulas VII(a) e VIII(a). 0 ADNc II possui um promotor completamente de dupla cadeia em cada uma das suas extremidades. (Figura 2b, 73 346 50101 -30-

passos lla-12). A transcrição pode ocorrer a partir de cada uma das duas cadeias de ADN, para produzir cópias múltiplas de transcriptos com sentido (i.e., transcriptos compreendendo um segmento com a sequência dos segmentos alvo) e transcriptos anti-sentido (i.e., transcritos compreendendo um segmento com a sequência complementar àquela do segmento alvo), para alimentar os dois ciclos complementares de amplificação.

Através do ciclo de reacção, acima descrito, pode ser amplificada uma ou mais moléculas de ARN contendo um segmento alvo, em duas horas, para 106 cópias ou mais de um transcrito de ARN contendo um segmento com a sequência do segmento alvo, ou do seu complementar, sem a necessidade de ciclos térmicos ou da adição repetida de enzimas. A reacção 3SR do presente invento, efectuada no meio de reacção optimizado do presente invento, requer apenas duas enzimas, a transcriptase inversa e a ARN-polimerase ADN-dependente, para proporcionar a necessária actividade de quatro enzimas.

Apesar do processo ter sido acima descrito passo a passo, deve ser entendido que na práctica todos os vários passos ocorrem simultaneamente, de uma maneira muito complexa e altamente interactiva.

Embora o mecanismo de amplificação acima descrito empregue um iniciador anti-sentido contendo um segmento que proporciona um promotor (i.e., inclui uma sequência com sentido do promotor), a amplificação 3SR pode também ser efectuada quando o iniciador com sentido compreende um segmento que proporciona o promotor e o iniciador anti-sentido não. Nesta concretização a molécula alvo de ARN não se deve prolongar na direcção 5', para além do nucleótido 5' do segmento alvo de ARN (i.e., o nucleótido 5' do subsegmento designado por (subsegmento^-S' ) deve ser o nucleótido 5' da molécula alvo). Quando o nucleótido terminal 5' do segmento alvo é o nucleótido terminal 5' da molécula alvo de ARN inteira, a amplificação irá proceder por passos análogos àqueles apresentados nas Figuras 2a e 2b, mas os transcritos produzidos serão transcritos com sentido, que entrarão

73 346 50101 -31- directamente no ciclo de amplificação representado pelos passos 7a-12. Transcritos anti-sentido não serão produzidos.

Uma maneira de assegurar que o nucleótido 5'-terminal da molécula alvo de ARN é o nucleótido 5'-terminal do segmento alvo de ARN é amplificar um segmento alvo de ARN da sequência de ácido nucleico predeterminada, cujo segmento está na extremidade 5' da molécula alvo de ARN. Deste modo, pode ser fornecida uma sequência adequada para o iniciador com sentido, que proporciona o promotor, pode ser fornecida. Por exemplo, um iniciador com sentido adequado pode compreender um segmento de ADN, que inclui uma cadeia com sentido do promotor operativamente ligada para transcrição a um segmento contendo uma sequência homóloga, por exemplo, ao segmento de 20 nucleótidos da extremidade 5' da molécula alvo de ARN, incluindo o nucleótido 5'-terminal da molécula alvo prolongando-se por 19 nucleótidos na direcção 3'. O iniciador anti-sentido pode consistir num segmento de ADN contendo uma sequência que é complementar ao segmento da extremidade 3' do segmento alvo.

Uma segunda maneira de fornecer um segmento de ARN, tendo em conta a limitação de que o nucleótido 5'-terminal da molécula alvo de ARN seja o nucleótido 5'-terminal do segmento alvo, é produzir uma tal molécula alvo de ARN, a partir de um segmento de ADN que codifica a sequência alvo, através da condução de um ciclo de amplificação TAS. Um segmento alvo de ARN apropriado pode ser assim gerado a partir de um ADN de cadeia dupla (ou ADN ou ARN de cadeia simples) conhecido por codificar a sequência alvo. Por exemplo, quando um ADN de cadeia dupla codifica um segmento alvo de interesse, o primeiro e segundo iniciadores de ADN são adicionados à solução de reacção e a solução é aquecida a cerca de 94°C - 100"C, durante 1 minuto, e depois é arrefecida a 42°C, durante 1 minuto. Este aquecimento e depois permanência a 42°C, em combinação com a composição da solução, proporciona as condições de rigor suficientes para proporcionar a hibridação, do primeiro iniciador e do segundo iniciador às duas cadeias complementares do referido ADN de cadeia dupla, com estabilidade suficiente para iniciar uma reacção de extensão do iniciador. A

73 346 50101 -32-transcriptase inversa ou a ADN-polimerase ADN-dependente**( e os necessários nucleósido-trifosfatos se não tiverem sido previamen-te adicionados) é adicionada para polimerizar a reacção de extensão. Podem ser utilizados ADN-polimerase estável ao calor de Thermus aquaticus (ver Chien et al.. J. Bacteriol. 127. 1550 (1976)), a ADN-polimerase recombinante de T7 da marca Sequenase™ fornecida por U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, U.S.A., o bem conhecido fragmento de Klenow de ADN-polimerase I de E. coli. e a alfa ADN-polimerase de timo de vitelo. A solução contendo ácido nucleico é novamente aquecida a 100eC, durante 1 minuto, e arrefecida a 42°C por 1 minuto, durante o qual o primeiro e o segundo iniciadores hibridam com os produtos de extensão da anterior reacção de extensão do iniciador. No caso de 3SR por duas enzimas, a transcriptase inversa e a ARN-polimerase ADN-dependente são então adicionadas, de tal modo que os iniciadores hibridados são prolongados, para completar a síntese de ADNc, e o ADNc é transcrito para produzir os transcritos alvo de ARN. A amplificação 3SR é assim iniciada. 0 segmento alvo de ARN proporcionado por um tal ciclo de amplificação TAS tem as suas extremidades 57 e 3' definidas pelos dois iniciadores utilizados. Tal ARN satisfaz então o requisito de o nucleótido 57-terminal da molécula alvo de ARN ser o nucleótido 57-terminal do subsegmento 57 do ARN alvo. No entanto, também deve ser claro que um tal ciclo de amplificação TAS pode virtualmente ser sempre utilizado para produzir um segmento alvo de ARN adequado para amplificação 3SR, sem observar qual do(s) iniciador(es) inclui uma sequência do promotor. Ver o Exemplo II.

Em concretizações preferidas do presente invento, o segmento alvo amplificável de um ácido nucleico de interesse possui um (subsegmento£r intermédio) incluindo pelo menos 20 nucleótidos, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 50 nucleótidos, para permitir opcionalmente o uso de um segundo ciclo de amplificação de 3SR, utilizando o terceiro e o quarto iniciadores de ADN, para amplificar o (subsegmento^-r intermédio), num refinamento adicional do processo de amplificação. De igual modo, o

73 346 50101 -33- (subsegmentotr intermédio) pode ser utilizado para aetectar transcriptos produzidos em 3SR, por um ensaio de hibridação de ácidos nucleicos, onde o (subsegmento variável) não possui um segmento não-alvo, o qual pode ser utilizado para este fim.

Em vários dos seus aspectos, o presente invento envolve a verificação de que duas enzimas, uma transcriptase inversa de retrovírus e uma ARN-polimerase ADN-dependente, por elas própias e na ausência de qualquer fonte exógena de actividade de RNAse H, que não a da transcriptase inversa, podem proporcionar as quatro actividades enzimáticas necessárias para uma amplificação 3SR altamente sensível, a qual requer uma quantidade de actividade de RNAse eficaz para uma amplificação 3SR altamente sensível. Um processo para aumentar a actividade endógena de RNAse H da transcriptase inversa inclui efectuar a reacção num meio de reacção contendo cerca de 20 a 40 mM de um sal contendo magnésio, tal como, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio e outros semelhantes; cerca de 1 a 25 mM de um cloreto de um metal alcalino, tal como o KC1 ou o NaCl e outros semelhantes? cerca de 0 a 20 mM de um agente redutor de sulfidrilo, tal como o ditiotreitol (DTT), beta mercaptoetanol e outros semelhantes; cerca de 0 a 10 mM de espermidina; cerca de 1 a 8 mM de ribonucleósido-trif osf atos; cerca de 1 μΜ a 8 mM de 2,-desoxirribonucleósido-trifosfatos e cerca de 0 a 25 por cento em volume de um composto sulfóxido, tal como o dimetilsulfóxido. 0 meio de reacção preferível compreende:

MgCl2 20 - 40 mM

KC1 1 - 25 mM

Espermidina 1 - 10 mM DTT 1 - 20 mM

rNTP 1 - 7 mM

dNTP 0,01 - 2 mM dimetilsulfóxido 0-15% (em volume) e um tampão apropiado (Tris, HEPES, etc.) tal que o referido meio de reacção possua um pH entre cerca de 7,5 e 8,5,

73 346 50101 preferencialmente pH 8,1. O DMSO é requerido quando uma transcriptase inversa de AMV é a fonte de actividade de RNAse H.

Antes do presente invento, acreditava-se que as reacções 3SR não eram suportáveis utilizando como fonte das quatro actividades enzimáticas requeridas apenas uma transcriptase inversa de retrovírus, tal como a transcriptase inversa de AMV, e uma ARN-polimerase ADN-dependente, onde níveis de amplificação maiores que cerca de 103 eram desejados. Os inventores verificaram surpreendentemente que um meio de reacção optimizado, permite que a actividade de RNAse H, inerente às transcriptases inversas de retrovírus, actue de modo a permitir tais níveis de amplificação 3SR, mesmo na ausência de outras fontes de actividade de RNAse H, tal como RNAse de E. coli.

Os inventores verificaram, também, que suplementando esses meios de reacção com cerca de 1 a cerca de 25 percento por peso de um composto contendo hidroxilo, aumenta surpreendentemente o nível de amplificação que é alcançado. Os compostos que contêm hidroxilo incluem, mas não estão limitados a alcoóis Cj^-C-lq, tal como o metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol e semelhantes; glicóis tal como o etilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol e polietilenoglicóis com uma massa molecular média superior a cerca de 20 000 Dalton, os quais são solúveis em água; mono-, di- e trissacáridos, tal como a glucose, galactose, manose, frutose, sacarose, maltose, rafinose e semelhantes; e alcoóis-açúcares, tal como sorbitol, glicerol, glucitol, manitol, inositol e semelhantes.

Assim, os meios de reacção melhorados do presente invento incluem preferivelmente um ou mais dos seguintes compostos: (i) um alcóol C1-C10; (ii) um composto com a fórmula HOCH2(CHOH)xCH2OH, onde x é 0-20; (iii) um composto de polietilenoglicol com a fórmula H(0CH2-CH2)n0H, onde n é 2-600, ou uma mistura de tais compostos com uma massa molecular média de cerca de 1 000 a cerca de 20 000, preferencialmente de cerca de 6 000 a cerca de 10 000, e (iv) um açúcar do grupo dos mono-, di-e trissacáridos e derivados deles. Compostos preferidos com a 73 346 50101 -35-

sacarose e PEG-8000. Vários dos exemplos abaixo mostram o efeito de compostos contendo sulfóxido e hidroxilo nos níveis de amplificação atingidos com 3SR por duas enzimas e 3SR por três enzimas.

As transcriptases inversas (RT) mais preferíveis são a transcriptase inversa de AMV, a transcriptase inversa recombinante de MMLV e transcriptase inversa de HIV-1, que não possuem actividade de exonuclease 5' para 3'.

Os meios de reacção melhorados devem ser suplementados com um composto de sulfóxido com a fórmula R1-(S0)-R2, onde R-j^ e R2 são independentemente alquilo C-l-C^ e onde R-l e R2 podem estar ligados como parte de uma porção cíclica saturada (preferencialmente 10% em volume de dimetilsulfóxido (DMSO)), onde a transcriptase inversa de AMV é empregue para 3SR por duas enzimas, mas um tal composto de sulfóxido pode ser omitido quando é utilizada a transcriptase inversa derivada MMLV, HIV-1 ou de outros retrovírus.

Os meios de reacção melhorados ainda melhoram os níveis de amplificação nas reacções 3SR efectuadas na presença de RNAse H de E. coli. Novamente, DMSO ou outro composto contendo sulfóxido pode ser utilizado para aumentar os níveis de amplificação em reacções 3SR por três enzimas utilizando transcriptase inversa de AMV.

Os meios de reacção devem ser suplementados com 0,1 - 10 mM de MnCl2 ou um sal de manganês semelhante quando é empregue a transcriptase inversa de MMLV nas reacções 3SR por duas enzimas do presente invento.

Para 3SR por duas enzimas, a concentração de rNTP, nos meios de reacção melhorados do presente invento, deve ser muito preferivelmente cerca de 6 mM, apesar de poderem ser empregues concentrações menores de rNTP nos meios de reacção melhorados para 3SR por três enzimas. Aumentos inesperados nos níveis de

73 346 50101 -36-amplificação acima de 10 vezes ou mais são obtidos nas reacções 3SR por duas enzimas, onde a concentração de rNTP é aumentada de 4 mM para 6 mM nos meios de reacção melhorados, mesmo apesar de concentrações menores de rNTP representarem um grande excesso molar de substrato. Concentrações de rNTP maiores do que cerca de 8 mM ou 9 mM tendem a reduzir os níveis de amplificação que podem ser obtidos nas reacções 3SR por duas enzimas. 0 Exemplo III, abaixo, põe em evidência a capacidade dum meio de reacção melhorado do invento para suportar uma reacção de 3SR por duas enzimas, mas não a de um meio de reacção descrito na arte para suportar uma reacção de 3SR por três enzimas.

Presentemente, é preferível utilizar aproximadamente 10 unidades de transcriptase inversa de AMV e 20 unidades de ARN-polimerase de T7 por reacção de amplificação (100 μΐ), em reacções 3SR por duas enzimas. Um facto interessante consiste em a amplificação 3SR por três enzimas requerer não apenas RNAse H de E. coli. mas também concentrações significativamente elevadas de transcriptase inversa (30 unidades) e ARN-polimerase (60-100 unidades).

Com respeito ao comprimento de um segmento alvo, são favorecidas as distâncias entre iniciadores menores que 1500 nucleótidos, presumivelmente devido à falta de rigor nas quais as reacções 3SR são efectuadas. Geralmente, segmentos alvo com comprimentos maiores do que cerca de 200 nucleótidos podem ser amplificados mais eficazmente quando o meio de reacção é suplementado com cerca de 1 a cerca de 25 por cento em peso de um alcóol ou de um composto de poli-hidroxilo, utilizando os métodos por duas enzimas ou por três enzimas. É especialmente preferido suplementar os meios de reacção melhorados com entre cerca de 5 e cerca de 15 por cento em peso de um alcóol-açúcar com a fórmula HOCH2(CHOH)xCH2OH, onde x é 0-20, mais preferivelmente onde x é 0-5, e ainda mais preferivelmente quando o composto é sorbitol ou glicerol.

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Um meio de reacção preferido do presente invento para efectuar uma amplificação 3SR por duas enzimas é uma solução aquosa compreendendo:

TAMPÃO: Tris pH 8flf 40 mM

MgCl2, 30 mM KC1, 20 mM DTT, 10 mM Espermidina, 4 mM.

NUCLEÓTIDOS: rNTP, 6 mM

dNTP, 1 mM INICIADORES: 0,25 μg de iniciador com sentido compreendendo uma região de ligação alvo com 15 bases; e 0,25 μg de iniciador anti-sentido compreendendo uma região de ligação alvo com 15 bases operativamente ligada a uma sequência de promotor (de cerca de 20 bases) ENZIMAS: Transcriptase Inversa de AMV, 10 unida- des/100 μΐ de solução de reacção (solução de reacção compreendendo 10% de dimetilsul-fóxido (DMSO) e 15% de sorbitol) ou

Transcriptase Inversa de MMLV, 1000 unida-des/100 μΐ de solução de reacção (solução de reacção compreendendo MnCl2 1 mM e 15% de sorbitol) e ARN-polimerase de T7, 20 unidades/100 μΐ de solução de reacção. A temperatura da mistura de reacção durante a amplificação 73 346 50101 -38-

3SR por duas enzimas ou por três enzimas tem também um efeito marcante no nível de amplificação alcançado. Embora a amplificação possa ser efectuada a temperaturas entre cerca de 5QC e cerca de 50 °C, mais preferivelmente a amplificação é efectuada entre cerca de 37°C e cerca de 47°C, e mais preferivelmente ainda a cerca de 42°C. A temperatura de reacção é particularmente importante nos processos de 3SR por duas enzimas do presente invento, sendo a amplificação a 42“C aproximadamente 100 vezes mais eficaz do que a 37°C. De igual modo, as taxas de amplificação são 2 a 3 vezes maiores numa gama de temperaturas de 42eC-45°C, na presença de um alcóol ou de um aditivo contendo poli-hidroxilo, tal como o sorbitol, glicerol, etanol e outros semelhantes, e adicionalmente de DMSO, ou outro composto sulfóxido semelhante, quando a transcriptase inversa de AMV é utilizada. A reacção 3SR pode ser mais eficiente num ciclo de amplificação do que noutro. Assim, quando ambos os iniciadores com sentido e anti-sentido incluem um segmento codificador de um promotor, pode predominar o produto com sentido ou o produto anti-sentido, presumivelmente devido às sequências a jusante do segmento de dupla cadeia do promotor do ADNc poderem ter um efeito significtivo nas taxas de transcrição.

Em outro dos seus aspectos, o presente invento refere-se a iniciadores de ADN capazes de iniciarem uma reacção de alongamento de cadeia, iniciadores esses que compreendem uma cadeia com sentido do promotor contendo pelo menos um a dez nucleótidos prolongando-se na direcção 5' e ligando-se ao nucleótido mais a 5' do segmento com a cadeia com sentido do local de ligação da polimerase do promotor (preferencialmente com a sequência consensual do promotor). Os inventores verificaram surpreendentemente, que o comprimento e sequência do segmento que proporciona o promotor, de um iniciador contendo uma cadeia com sentido do promotor, tem um efeito marcante no nível de amplificação em 3SR. Verificou-se que iniciadores truncados na sua extremidade 5' com o nucleótido 5' da sequência consensual do promotor (i.e., a extremidade 5' do iniciador é o nucleótido 73 346 50101 -39-

mais a 5' da sequência consensual) exibem uma amplificação de menos do que 105 vezes, em uma hora e a 42°c, nos meios de reacção melhorados do presente invento. Tal como é compreendido na arte, um promotor possui um certo número de partes. Primeiro, tem um segmento de ligação da polimerase, que é o segmento de ADN de cadeia dupla ao qual a polimerase se liga na iniciação da transcrição. Um promotor deve ter pelo menos um segmento de ligação da polimerase para actuar na transcrição. Pensa-se que a sequência consensual é a sequência mínima necessária, completamente na forma de cadeia dupla, que é necessária para a ligação da ARN-polimerase no processo de iniciação de transcrição. Opcionalmente, pode ser desejável incluir um segmento, aqui referido como sequência de iniciação de transcrição, imediatamente adjacente (a jusante) da sequência consensual. A sequência consensual para o promotor T7 é aqui apresentada. Outras sequências consensuais de promotores são bem conhecidas na arte. Por exemplo, a cadeia com sentido da sequência consensual de T3 é 5'-ATTAACCCTCACTAAA-3' e a sequência de iniciação de transcrição de T3 é 5'-GGGA-3'. De igual modo, duas versões do promotor de SP6 são bem conhecidas. A sequência consensual da cadeia com sentido do promotor de SP6 (versão 1) é 5·-ATTTAGGTGACACTATA-37 e a sequência consensual da cadeia com sentido do promotor SP6 (versão 2) é S^AATTAGGGGACACTATA-S'; a sequência de iniciação de transcrição para ambas as versões 1 e 2 do promotor de SP6 é 5'-GAAG-3#. Quando a concentração inicial do segmento alvo está na gama de concentrações de cerca de 0,01 - 1 atomole numa alíquota de 100 μΐ - uma concentração que não é fora do comum para a detecção da presença de, por exemplo, vírus HIV-1 ou dum gene defeituoso característico de um estado de doença - um tal nível de amplificação não é detectável por ensaios de hibridação de ácidos nucleicos comuns. No entanto, iniciadores que proporcionaram o promotor que possuem tão poucos como 1 nucleótido unido à extremidade 5· da sequência consensual do promotor, mostram surpreendentemente um aumento de amplificação de cerca de 10 vezes; e para cada nucleótido adicional, até uma sequência de quatro nucleótidos adicionados à extremidade 5' da sequência consensual, é atingido um aumento adicional de 7- a 10-vezes. Prolongando um oligonucleótido a partir da sua

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partir da sua extremidade 5' mais do que quatro nucleótidos e até cerca de 10 nucleótidos, relativamente a uma sequência consensual do promotor pode melhorar a amplificação acima do nível alcançado com 1 a 4 nucleótidos, tal como é mostrado na Tabela seguinte. A seguinte Tabela mostra os resultados inesperados relacionados com os níveis de amplificação 3SR obtidos após modificação do comprimento e da sequência nucleotídica a montante da sequência (a partir de 5') com sentido do promotor de um iniciador de ADN.

(Segue Tabela) t 73 346 50101 -41-

Efeito nas amplificações 3SR da sequência nucleotídica da extremidade 5' de iniciadores oliqonucleotídicos contendo sequências do promotor T7

Oligonu cleótido SEQ ID Canprim. NO: (nt) - 1 Sequencia1 2 nQ amp. 90-425 1 59 5' -17 *1 3' 5'AGTAATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 3.1x10® 88-347 2 56 5' AATTTAATACGAC1CACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 1.9x10® 90-578 3 56 GATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 6.5x1O7 90-575 4 56 GCTTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 2.8x107 90-577 5 56 GCGTTAATACGACTCACTATAGGGATGTAC7ATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 5.5x107 90-574 6 56 GCGC7AA7ACGAC7CAC7A7AGGGA7G7AC7A77A7GG7777AGCA77G7C7G7GA 1.1X108 90-427 7 55 ATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 1.2x10® 90-428 8 54 TTTAATACCACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 5.5x107 90-576 9 54 GTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 2.5x107 90-579 10 54 GCTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 2.1x107 90-429 11 53 TTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 1.1x107 90-205 12 52 TAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTG1GA <105 90-206 13 51 AA7ACGAC7CAC7A7AGGGA7G7AC7A77A7GG7777AGCA77G7C7G7GA <105 -1) A sequência da cadeia codificadora é apresentada. A sequência sublinhada corresponde à sequência canónica de 17 nt do promotor T7 e o início da transcrição de ARN é denotada por +1. A sequência GGGA provém da sequência T7; os nucleótidos após +5 provêm da sequência de HIV-1? as sequências subsequentes são idênticas para cada oligonucleótido. Os oligonucleótidos estão alinhados de modo a evidenciar as diferenças entre os iniciadores. 73 346 50101 -42-

2) As reacções 3SR foram efectuadas em 50 μΐ contendo 0,05 atomoles (-1 000 moleculares) de ARN alvo de HIV-1, 30 U de ARN-polimerase de T7, 2U de RNAse H de E. coli. 15 U de RT de AMV, Tris 40 mM, pH 8,1/ MgCl2 30 mM, KC1 20 mM, DTT 10 mM, espermidina 4 mM, dXTP 1 mM, rXTP 7 mM e 0,125 μg de iniciadores oligonucleotídicos, durante 1-2 horas a 42eC. 0 mesmo par de iniciador, 89-225 (SEQ ID NO: 14) (5/TTATTGTGCCCCGGCTGGTTTTGCGATTCTA37) (Ratner et al.. 1985) foi utilizado para cada iniciador apresentado nesta Tabela. O produto de ARN sintetizado possui um comprimento de 214 nucleótidos. Os alvos amplificados foram quantificados utilizando a hibridação tipo sanduíche com esferas (BBSH) empregando 25 mg de esferas contendo oligonucleótidos de captura 86-273 e 100 fmoles de oligonucleótidos de detecção 87-81 marcados com 32P (Guatelli et al.. 1990). Todos os valores de amplificação, excepto para 88-347, são uma média de duas reacções 3SR e cada uma destas reacções de amplificação foi analisada por reacções BBSH em duplicado. As amplificações 3SR efectuadas com 88-347 representam uma média de seis reacções 3SR. A amplificação realizada a cabo nas condições acima descritas mostrou que, quando a sequência consensual de T7 não está flanqueada na extremidade 57 por, pelo menos um nucleótido contíguo ao nucleótido da extremidade 57 da sequência consensual, a amplificação não era detectada a um nível superior a 105 vezes. Os iniciadores que proporcionaram o promotor do presente invento, que possuem 1-10 nucleótidos e, preferivelmente 1-4 nucleótidos contíguos ao nucleótido da extremidade 57 da sequência consensual, aumentam significativamente os níveis de amplificação relativamente aos iniciadores contendo o promotor, descritos anteriormente.

Embora não se pretenda ficar limitado pela teoria, acredita-se que a sequência de 1 a 10 nucleótidos, contígua à extremidade 57 da sequência consensual garante que a transcriptase inversa permanece associada à cadeia de ADN molde pelo menos até um ADNc, contendo um segmento de promotor de cadeia completamente dupla, ser completado.

73 346 50101 -43- O completo estabelecimento da cadeia dupla do segmento do promotor que compreende a sequência consensual (presumivelmente o segmento que liga a polimerase) é presumivelmente importante para a transcrição eficiente do promotor.

Os iniciadores oligonucleotidicos usados nos Exemplos que se seguem, excepto quando referido em contrário, possuem a sequência de nucleotídica correspondente à região indicada do genoma do HIV-1 descrita em Rantner et al.. Nature (London) 313. 277-284 (1985), a qual é aqui incorporada para referência. Excepto quando referido em contrário, um asterisco (*) denota um iniciador oligonucleotídico que proporciona o promotor, compreendendo o segmento 5'-AATTTAATAC GACTCACTATAGGGA-3' (SEQ ID NO: 15), onde a sequência sublinhada corresponde à sequência consensual de 17 nucleótidos do promotor, reconhecida pela ARN-polimerase ADN-dependente, do bacteriófago T7. A sequência de 4 nt (5/-AATTT-3/) na extremidade 5' da sequência consensual é aqui definida como incluída no termo "cadeia com sentido do promotor" e o segmento de 4 nt (exemplo , 5'-GGGA-3'-ou 5/-GAAA-3/, etc.) na extremidade 3' da sequência consensual é o segmento de iniciação da transcrição de T7, o qual na linguagem adoptada acima, é o "subsegmento variável" do iniciador. A sequência correspondente a este subsegmento variável ocorrerá em transcriptos feitos a partir do promotor correspondendo ã cadeia com sentido do promotor. Por exemplo, a sonda oligonucleotídica contendo o promotor designada 88-347* consiste num segmento que é o complemento do segmento do genoma do HIV-1, correspondendo aos nucleótidos 6661-6631 (inclusive), o subsegmento variável de 4 nt correspondendo à sequência, de iniciação da transcrição 5'-GGGA-3' e a cadeia com sentido de 21 nt do promotor com a sequência dada acima, possui a seguinte sequência completa: 5/-AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT CTGTGA-3' (SEQ ID NO: 2).

As sequências de nucleótidos dos seguintes iniciadores de oligonucleotídicas (designados por iniciador #) são apresentados de acordo com a convensão anterior. Vários destes

J 73 346 50101 -44-

oligonucleótidos são referidos na descrição e nos exemplos aqui dados. Uma designação "com sentido" significa que o iniciador compreende um segmento com a mesma sequência que o segmento indicado a partir do genoma do HIV-1. Uma designação "anti-sentido" significa que o iniciador compreende um segmento que é complementar em sequência ao segmentos indicado a partir do genoma do HIV-1.

Iniciador Com sentido Posições nucleotídicas aonucleotídico i ou anti-sentido da reaião env de HIV-1 88-211* !) (com sentido) 6450 6479 255 (SEQ ID NO: 14) (com sentido) 6450 - 6479 88-299 (com sentido) 6486 - 6515 89-332 (com sentido) 6494 - 6508 88-33 (com sentido) 6419 - 6440 90-106* (com sentido) 6419 - 6446 88-348* (com sentido) 6419 - 6446 347*(SEQ ID NO: 2) (anti-sentido) 6661 - 6631 89-263* (anti-sentido) 6830 - 6801 86-274 (anti-sentido) 6691 - 6661 88-346 (anti-sentido) 6830 - 6801 90-66 (anti-sentido) 6918 - 6891 90-69 (anti-sentido) 7101 - 7070 85-237 (anti-sentido) 7255 - 7226 85-235 (anti-sentido) 7335 - 7306 90-72* (anti-sentido) 7255 - 7226 90-71* (anti-sentido) 7335 - 7306 90-187* (anti-sentido) 7899 - 7870 86-273 (com sentido) 6591 - 6620 87-81 (com sentido) 6551 - 6577 87-79 (com sentido) 6419 - 64431) 1) No iniciador # 88-211, o subsegmento variável correspondente ao local de iniciação de transcrição possui a sequência 5' -GGGATC-3', em vez de 5'-GGGA-3'.

Em outro dos seus aspectos o invento refere-se a processos

73 346 50101 -45-úteis para a detecção de pelo menos um segmento alvo específico de ARN, numa amostra contendo ácido nucleico, compreendendo a amplificação do referido segmento alvo de ARN, de acordo com os processos acima citados, e a detecção da presença de transcritos de ARN que compreendem um sequência que é a mesma ou a complementar daquela do referido segmento alvo. A detecção dos produtos amplificados de ácido nucleico pode ser conseguida por técnicas de hibridação de ácido nucleico bem conhecidas. O Exemplo II descreve a técnica de hibridação tipo sanduíche, com esferas, a qual é o processo preferido para a detecção dos produtos amplificados. De entre outros processos de detecção são efectuadas amplificações utilizando ribonucleósido-trifosfatos que tinham sido marcados com um radio-isótopo ou um substrato cromogénico ou fluorescente, ou um grupo, tal como o biotinilo, capaz de se ligar a um complexo compreendendo uma enzima capaz de catalisar uma reacção cromogénica, tal como é bem conhecido na arte e detecção num ensaio de hibridação da presença de transcritos de ARN que tinham incorporado os rNTP marcados.

Tal como acima notado, o invento também inclui conjuntos para efectuar os processos de amplificação do invento. Um conjunto do invento pode compreender um iniciador com sentido e um iniciador anti-sentido (um ou ambos incluindo uma cadeia com sentido do promotor), componentes de um meio de reacção permitindo a amplificação 3SR por duas enzimas e apenas a(s) ARN-polimerase(s) ADN-dependente ( s) , de bacteriófago, correspondentes aos promotores dos iniciadores, e a uma transcriptase inversa. Alternativamente, um conjunto do invento pode incluir componentes para 3SR por três enzimas, incluindo uma enzima que proporciona actividade de RNAse H, mas que não é a transcriptase inversa, e uma solução aquosa para proporcionar um meio de reacção melhorado do invento ou composto (exemplo sais, tampões compostos hidroxilo, DMSO, nucleósido-trifosfatos) para preparar um tal meio de reacção melhorado. 0 invento também inclui o meio de reacção melhorado.

Os processos e conjuntos para a execução de ensaios de

73 346 50101 hibridação com sondas de ácidos nucleicos (por amplificação de um segmento alvo, de acordo com o invento) podem incluir, em adição, passos e componentes necessários para a detecção de produto de ARN resultante da amplificação, de acordo com o invento. Os peritos na arte compreenderão que os vários passos e componentes adicionais, que são respectivamente, necessários para detectar ARN de um processo de amplificação por um dos numerosos métodos de ensaios de hibridação com sondas, conhecidos na arte. Um processo de ensaio preferido de hibridação com sondas de ácidos nucleicos, envolvendo a captura por esferas de ARN marcado, amplificado, é ilustrado no Exemplo II, abaixo. 0 invento irá ser, seguidamente, descrito com grande pormenor, através de exemplos.

EXEMPLO I

Preparação de sondas oliqonucleotídicas ligadas a esferas de Trisacrvl

Foi preparado um derivado 5/-amino-hexilfosforamidato de oligonucleótido fazendo reagir o 88-297 fosforilado em 5' (5 '-TGGCCTAATTCCATGTGTACATTGTACTGT—3') (SEQ ID No: 16) com I, 6-diamino-hexano na presença de l-etil-3-(3-dimetilami-nopropil)carbodiimida 0,25 M em metilimidazolo 0,1M, pH 6,0, como descrito anteriormente por Chu et al.. Nucleic Acids Res. II, 6513-6529 (1983). É essencial executar esta reacção em tubos Eppendorf recentemente silanizados, de forma a evitar a adsorção não específica dos ácidos nucleicos às paredes dos tubos. 0 derivado amina foi isolado precipitando duas vezes com EtOH/LiCl. Tipicamente, uma alíquota de 150 μΐ de uma solução a 10 mg/ml de bromoacetato de N-succinimidilo (ver Bernatowicz, et al. Anal. Biochem. 155. 95-102 (1986)) em Ν,Ν-dimetilformamida foi adicionada a 2,5 nmol do derivado 5'-amino-hexilfosforamidato do oligonucleótido em 1,1 ml de HEPES 0,2 M, pH 7,7. Após um tempo de reacção de 1 h, o oligonucleótido foi precipitado duas vezes com etanol/LiCl. A derivação do Trisacryl GF2000 (Réactifs IBF, Pointet

73 346 50101 -47-

Girard, França) com grupos amino foi realizada usando 20 ml de suspensão da resina, que foi pipetada para um funil de vidro sinterizado, lavada com 200 ml de H20f e seca por vácuo, durante 10 min. A amostra seca (-11 g) foi adicionada lentamente a 20 ml de etilenodiamina destilada, a qual tinha sido previamente aquecida a 90"C, num banho de óleo. Após uma hora a 90°C, a mistura de reacção foi arrefecida pela adição de 30 ml de gelo moído. 0 excesso de etilenodiamina foi removido por lavagens sucessivas da resina num funil com 400 ml de NaCl 0,2 M, de HC1 0,001 M e, finalmente com 500 ml de NaCl 0,1 M. As lavagens foram continuadas até o filtrado dar teste negativo com o reagente ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico. A conversão dos suportes Trisacryl-amina para Trisacryl-sulfidrilo foi realizada por prévio equilíbrio das esferas (10 g de peso húmido) com NaHCO-j 0,5 M, pH 9,7. O volume foi ajustado a 40 ml num tubo cónico Sarstedt de 50 ml, foi adicionado a tiolactona de N-acetil-homocisteína sólida (2,5 g) e o tubo foi agitado à temperatura ambiente durante uma hora. Subsequentemente, outra grama de reagente foi adicionada e a amostra foi agitada durante a noite. As esfera foram lavadas com 250 ml de NaCl 0,1 M e posteriormente filtradas usando um funil de vidro sinterizado. Uma amostra de 10 g de Trisacryl-sulfidrilo foi depois equilibrada em 30 ml de NaOAc 0,1 M, pH 6,0 e depois tratada com 200 mg de anidrido succínico sólido. Após agitação durante 30 min, foram adicionadas mais 200 mg de anidrido foram adicionadas à suspensão e a reacção de revestimento foi deixada decorrer durante mais 30 minutos. As esferas foram então equilibradas em 50 ml de Tris 0,1 M, pH 8,5, para hidrolisar as ligações tioéster. Após 1 h, o suporte foi lavado com TE, pH 8,0, e guardado a 4°C. A concentração do grupo sulfidrilo no suporte foi estimada por titulação com 5,5'-ditio-bis-(ácido 2- nitrobenzóico) e monitorizada pela libertação de 3- carboxilato-4-nitrotiofenolato a 412 nm.

Finalmente, a ligação covalente do derivado 5'-bromoacetilo de oligonucleótidos ao suporte Trisacryl-sulfidrilo foi realizada do seguinte modo. O suporte Trisacryl-sulfidrilo (1 g) obtido fekí. 73 346 50101 -48-pela reacção anterior foi reduzido com 30 ml de DTT 20 mM em de KH2P04 0,05 M, pH 8,0 e de EDTA 1 mM durante 1 h. O suporte foi depois lavado quatro vezes com 25 ml de KH2P04 0,05 M, pH 8,0 e EDTA 1 mM seguidas de duas lavagens com 25 ml de fosfato de trietilamónio (TEAP) 0,1 M, EDTA 1 mM, pH 9,0. Cinco nanomoles de oligonucleótido derivado com bromoacetilo dissolvido em 7 ml de TEAP 0,1 M, EDTA 1 mM, pH 9,0 foram adicionadas ao suporte e o tubo foi purgado com N2 e selado. Após agitação durante a noite num misturador rotativo, foram adicionadas 200 mg de ácido iodoacético e a mistura foi deixada à temperatura ambiente durante 1 h. As esferas foram lavadas duas vezes com 35 ml de Tris 0,1 M, pH 8,0, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM e 0,1% de SDS, quatro vezes com 45 ml de Na2P2°7 0,1 M, pH 7*5, seguida por duas lavagens com 45 ml de TE, pH 8,0 e guardadas a 4°C.

EXEMPLO II Níveis detectáveis de amplificação observados com amplificação 3SR por 3 enzimas de um ADN alvo.

Este exemplo mostra que são observados níveis detectáveis de amplificação com uma amplificação 3SR por 3 enzimas, de um ADN alvo.

Os ácidos nucleicos de 2,5 x 10^ PBMC provenientes tanto de pacientes normais como de pacientes com fibrose quística foram extractados como no Exemplo I. Os ácidos nucleicos precipitados foram sedimentados por centrifugação. O sedimento foi drenado, lavado com etanol a 70%, uma vez) seco e depois ressuspenso em 100μ1 contendo:

Tris-HCl 40 mM, pH 8,1 DMS0 10%

Glicerol 10%

MgCl2 30 mM

KC1 20 mM

Espermidina 4 mM

Ditiotreitol 10 mM

dATP, dGTP, dCTP e dTTP l mM

J 73 346 50101 -49- rATP,

rCTP, dGTP e dUTP 7 mM

250 ng de cada um dos iniciadores de oligonucleotidicos 90-159 (5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAAATGCTTTGATGACGCTTC TGTA-31) (SEQ ID No: 17) 90-161 (5'-TTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGAA-3') (SEQ ID No:18)

As amostras foram agitadas em vórtex até que o sedimento ficasse completamente ressuspendido. Como controlo usou-se água em substituição do sedimento de ácido nucleico, no tampão acima referido.

As amostras foram aquecidas a 100eC durante 1 minuto, arrefecidas a 42°C durante 1 minuto e foram adicionadas 10 unidades de transcriptase inversa (RT) de AMV (Life Science, Inc.)· As amostras foram incubadas a 42°C durante 15 minutos e depois aquecidas a 100°C durante 1 minuto. Foram adicionadas trinta unidades de RT de AMV, 100 unidades de ARN-polimerase de T7 (Stratagene) e 4 unidades de RNAse H de E. coli (Bethesda Research Labs). As amostras foram incubadas a 42"C durante 1 hora. As amostras foram depois congeladas a -20°C. As amostras foram depois analisadas por hibridação tipo sanduíche, com esferas usando-se Oligobeads™ 90-294 φ (5 '-GTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGC-3' ) (SEQ ID No:19) e OS oligonucleótidos de detecção marcados com ^^P, 90-165 (5 '-AAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCT-3 ' ) (SEQ ID No:20), O qual detecta o gene selvagem da fibrose quística ou 90-166 (5_-AAAGAAAATATCATTGGTGTTTCCTA-3') (SEQ ID No:21) o qual detecta uma mutação por delecção de 3 bases no gene da fibrose quística.

Num procedimento de hibridação tipo sanduíche, com esferas (BBSH) típica uma alíquota de 25 mg de suspensão de esferas é adicionada a uma micro-coluna de 2 ml (2S-GS, Isolab) e a solução TE é removida forçando-a através da coluna com uma seringa. 0 alvo, em 20μ1 de TE, é adicionado à coluna em simultâneo com 10μ1 da solução de hibridação 2x (20% de sulfato de dextrano, SSPE

73 346 50101 -50-20Χ, 0/2% de SDS), que foi aquecida a 42°C. As micro-colunas foram agitadas em vortex e incubadas com agitação ocasional a 42°C durante duas horas. As esferas foram lavadas seis vezes com 1 ml de SSC 2x de cada vez, o qual tinha sido equilibrado a 42 °C. A contagem de Cerenkov das colunas e das lavagens foi usada para determinar a quantidade de alvo detectado. A contagem do fundo é subtraída de todas as amostras e o fm do alvo detectado é calculado como a seguir se descreve: cpm nas esferas x fm da sonda adicionada (cpm nas esferas + cpm das lavagens)

Oliao. de deteccão sem alvo 2/5xl05 tipo selvagem pBMC p/p 90-165 90-165 SEQ ID NO: fm/ul 3SR rxn 20 0,016 20 0,113

sem alvo 2/5x1O5 mutante pBMC 90-166 90-166 21 0,018 21 2,243 Δ/Δ

EXEMPLO III

Comparação dos níveis de amplificação observados com a reacção 3SRr oor duas enzimas a 37°C com um meio de reaccão preferido do presente invento e com um meio tradicionalmente utilizado, adequado para reacções 3SR, por três enzimas

Este exemplo mostra que níveis detectáveis de amplificação são observados com uma reacção 3SR, por duas enzimas, a 37°C com um meio de reacção preferido do presente invento mas não com um meio de reacção da arte anterior utilizado, adequado para reacções 3SR por três enzimas.

Aplicaram-se 0,1 atomoles de ARN de HIV-1 em reacções 3SR por dois ou por três enzimas, a 37°C, em condições da arte anterior escolhidas ou em condições de reacção optimizadas do invento. Sob condições melhoradas, mas não nas condições da arte

73 346 50101 -51- anterior escolhidas, a amplificação 3SR por duas enzimas produziu uma quantidade detectável de produto de amplificação. Níveis mais elevados de amplificação na reacção por três enzimas foram observadas com os meios de reacção melhorados tal como o meio preferido descrito a seguir neste Exemplo.

Cada solução de reacção continha 0,25 μg de cada um dos iniciadores oligonucleotídicos 88-221* e 88-347* , 10 unidades de transcriptase inversa de AMV e 20 unidades de ARN-polimerase de T7. O volume total de reacção era de 100μ1. Um ,,+" na coluna •'RNAse H adicionada exogenamente" denota a presença de 4 U de RNAse de E. coli no meio de reacção, enquanto que um "+" na coluna "DMSO/PEG-8000" denota que o meio de recção foi suplementado com 10% de dimetilsulfóxido e 5% de PEG-8000.

Meio de reacção 3SR da arte anterior Tris 40 mM, pH 8.1 MgCl2 20 mM DTT 5 mM Espermidina 2 mM BSA 80jug/ml dNTP 1 mM rNTP 4 mM

Meio de reacção 3SR preferido Tris 40 mM, pH 8.1 MgCl2 30 mM DTT 10 MM Espermidina 4 mM BSA 0 μg/ml dNTPs 1 mM rNTP 7 mM

Os produtos de reacção foram detectados por hibridação tipo sanduíche, com esferas (Exemplo II) usando Oligobeads™ derivada com oligonucleótido #86-273 e oligonucleótido #87-81 como sonda. (Segue Quadro)

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Reacções 3SR na região env. a 37°C

Tampão/ nucleótidos RNAse H adicionada exoaenamente DMSO/ Pecr-8000 Na de vezes de amolificacão arte anterior + _ 3.5 x 107 arte anterior - - < 104 arte anterior - + Λ H O preferido + - 1.7 x 108 preferido - - <104 preferido + 1.1 X 105

EXEMPLO IV

Efeito da sunlementacão do presente meio de reacção preferido do invento com 10% de DMSO. 10% de Glicerol. e/ou 5% de polietilenoqlicol fPEG-8000) em reacções 3SR por dois ou por três enzimas

Este exemplo põe em evidência o efeito da suplementação do presente meio de reacção preferido do invento (Ver Exemplo III) com 10% de DMSO, 10% de Glicerol, e/ou 5% de polietilenoglicol (PEG-8000) no nível da amplificação obtido em reacções 3SR por dois ou três enzimas.

As condições de reacção usadas em reacções 3SR foram as mesmas de "Meio de reacção 3SR preferido", referido no Exemplo III com excepção das reacções terem sido realizadas a 42 °C -53- 73 346 50101 durante uma hora.

As reacções 3SR foram realizadas usando 0,1 atomoles de ARN de HIV-1 como alvo e o par de iniciadores 88-299/89-263* (distanciados aproximadamente de 400 bases). Os produtos de amplificação foram detectados por hibridação tipo sanduíche, com esferas (Exemplo II) usando 01igobeadsTIÍ derivadas com oligonucleótido 86-273 e oligonucleótido 87-81 como sonda. Como se mostra seguidamente, níveis melhorados de amplificação são obtidos na presença de 10% de DMSO e 10% de glicerol.

Efeito de aditivos na amplificação 3SR da região env do HIV-1

Iniciador RNAse H DMSO Glicerol PEG na de vezes de amplif icação 88-299/89-263* - 10% - 5% 1 x 105 88-299/89-263* - 10% 10% fp* 2 x 107 88-211*/88-347* 4U - - - 2,8 x 108 88-211*/88-347* 4U - 10% - 2,0 X 108 88-211*/88-347* 4U 10% 10% - 3,9 x 108 88-211*/88-347* - - - - n.d. 88-211*/88-347* - - 10% - n.d. 88-211*/88-347* - 10% 10% - 1,3 x 107 n.d.: nenhum produto detectado reacções por duas enzimas: 10 U RT de AMV, 20 U de polimerase de ARN de T7 reacções por três enzimas: 30 U RT de AMV, 4 U de RNAse de E. coli

EXEMPLO V Níveis de amplificação 3SR por duas enzimas e amplificação 3SR nor três enzimas na presença e ausência de 10% de DMSO e 5% de PEG-8000 no meio de reaccão 3SR preferido

Este exemplo compara os níveis de amplificação 3SR por duas enzimas e de amplificação 3SR por três enzimas ( 0,1 atomoles de

ARN alvo de HIV-1 e par de iniciadores 88-211* /88-347* em cada caso) na presença e ausência de 10% de DMSO e 5% de PEG-8000 no meio de reacção 3SR preferido. Os produtos foram detectados por hibridação tipo sanduíche, com esferas, como no Exemplo IX, usando Oligobeads™ derivada com oligonucleótido 86-273 e oligonucleótido 87-81 como sonda.

Efeito de aditivos na reaccão 3SR. oor duas enzimas Temo. Enzimas DMSO PEG-8000 ns de vezes de amolificacão 42 °C Todas as 3 - - 8,0 x 107 42eC RT/T7 - - Λ H O 42 °C RT/T7 + - 1,1 X 107 ·> to o o RT/T7 + + 5,0 x 107 45 eC RT/T7 + + 1,7 X 107

Usaram-se nos meios de reacção 30 u de RT de AMV, 100 U de ARN-polimerase de T7 e, quando presente (isto é, "todas as 3"), 4 U de RNAse H de E. coli.

EXEMPLO VI

Reaccões 3SR. por duas enzimas, com transcriotases inversas de vírus da leucemia murina de Molonev, HIV-1 e vírus da mieloblastose de aves

Este exemplo mostra reacções 3SR, por duas enzimas, com transcriptases inversas (RT) de vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV), HIV-1 e vírus da mieloblastose de aves (AMV). A transcriptase inversa do MMLV requer iões manganês para produzir uma quantidade eficaz de actividade inerente da RNAse H.

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Sistema 3SR; comparação da região env 88-221* e 88-347* de transcriptases inversas de diferentes fontes

Pol. ng vezes de RT de T7 RNAse H DMSO Glicerol MnClo amplificação M-MLV 1000U 60U 4U 5% - - 3 X 106 M-MLV 1000U 60U - 5% - ímM 3 X 107 M-MLV 1000U 60U - - - lmM 2 X 107 HIV 5/il1) 60U - - - - 1 X 106 HIV 10μΐ 60U 4U - - - 9 X 105 AMV 30U 10 OU 4U 10% 10% - 4 X co o H AMV 10U 20U — 10% 10% - 1 X 108

Tempo de reacção: 1 hora. Temperatura: 42°C.

Molde: 0.1 atomoles de ARN de HIV-1 1) A actividade específica da preparação de transcriptase inversa de HIV-1 era desconhecida

EXEMPLO VII

Níveis de amplificação aumentados, obtidos em reaccões 3SR. por três enzimas, na presença e ausência de 5% de PEG-8000/ 10% de DMSO. com incubação a 420C ou 45°C

Este exemplo põe em evidência os níveis de amplificação aumentados, obtidos em reacções 3SR, por três enzimas, na presença e ausência de 5% de PEG-8000/ 10% de DMSO, com incubação a 42°C ou 45°C.

Amplificaram-se 0,1 atomoles de ARN de HIV-1 em reacções 3SR, por três enzimas, com 30 Unidades de transcriptase inversa de AMV, 100 Unidades de ARN-polimerase ADN-dependente, 4 Unidades de RNAse H, a 42°C durante 1 hora, no meio de reacção preferido, descrito no Exemplo III, usando um dos seguintes conjuntos de pares de iniciadores env: 88-221*/ 88-347* ou 87-79*/88-347*.

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Influência da temperatura de reaccão na amplificação da região env do HIV-1

Par de iniciadores PEG-8000/DMSQ

na de vezes de amplificação 42 °C 45 °C

4,4 X 107 8,4 X 106 + 2,3 X H O 00 1,5 X 00 o H 4,5 X 107 1,5 X 107 + 1,7 X 108 5,6 X 00 o H 88-211*/ 88-347* 87-79*/ 88-347*

EXEMPLO VIII

Efeito da temperatura na amplificação 3SR. por três enzimas, no meio de reaccão preferido na presença e ausência de 10% de DMSO

Este Exemplo põe em evidência o efeito da temperatura na amplificação 3SR por três enzimas, no meio de reacção preferido (Ver Exemplo III) na presença e ausência de 10% de DMSO. 0 alvo foi 0,1 atomoles de ARN de HIV-1. Cada 100 μΐ de mistura de reacção continham 30 U de RT de AMV, 100 U de ARN-polimerase de T7 e 4 U de RNAse H de E. coli. •

Dependência da temperatura da reaccão 3SR na presença ou ausência de DMSO

Iniciadores 88-211* e 88-347* (região env) Temperatura de reaccão - DMSO + DMSO 42 °C 9,1 x 107 2,7 X 10 45 °C 8,7 X 107 1,6 X 10 47 °C 7,4 x 104 <104 50 °C <104 <104 73 346 50101 -57

EXEMPLO IX

Efeito de alterações de nucleótidos nas extremidades 5' e 37 dos iniciadores oliqonucleotidicos contendo a sequência consensual do promotor T7

Este Exemplo mostra o efeito de alterações de nucleótidos nas extremidades 5' e 3' dos iniciadores oligonucleotídicos contendo a sequência consensual do promotor T7.

As reacções 3SR foram realizadas em 50μ1 contendo 0,05 atomoles (-1.000 moléculas) de ARN alvo de HIV-1, 30 U de ARN-polimerase de T7, 2 U de RNAse H de E. colif 15 U de RT de AMV, Tris 40 mM, pH 8,1, MgCl2 30 mM, KCl 20 mM, DTT 10 mM, espermidina 4 mM, dXTP 1 mM, rXTP 7 mM e 0,125 μg de iniciadores oligonucleotídicos durante 1-2 horas, a 42°C. 0 mesmo iniciador companheiro, 89-255 (5'TTATTGTGCCCCGGCTGGTTTTGCGATTCTA3') (SEQ ID NO:14) (Ratner et al. 1985) foi usado para cada iniciador listado nesta tabela. Os inciadores listados codificam a sequência canónica de 17 nt do promotor T7 (excepto #90-206, que contém a delecção do nucleótido 5' respectivo) e possuem comprimentos e composições variáveis, no que respeita às sequências flanqueadoras em 5' e 3' relativamente à sequência consensual de 17 nt do promotor T7. 0 produto ARN produzido apresenta um comprimento de 214 nucleótidos. Os alvos amplificados foram quantificados por hibridação tipo sanduíche, com esferas (BBSH) utilizando 25 mg de esferas contendo o oligonucleótido de captura 86-273 e 100 fmoles de oligonucleótidos 87-81 marcados com 32P (Guatelli et al. 1990). Todos os valores de amplificação exceptuando os de 88-347* são as médias das duas reacções 3SR, e cada uma destas reacções foi analisada por reacções BBSH em duplicado. As amplificações 3SR realizadas com 88-347* representam a média de seis reacções 3SR.

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Efeito na amplificação 3SR do nucleótido da sequência de iniciação de transcrição de iniciadores olicronucleotídicos contendo as sequências do promotor T7 SEQ ID Oligonu- Comprim. NO: cleõtido (nt) 1 Sequencia ns amp 2 88-347 56 5' -17 *1 3' AATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 2x1 o8 22 90-426 56 AATTTAATACGACTCACTATAGAAATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 2.4x109 23 90-199 56 AATTT AAT ACGACTCACT AI AGGT AT GT ACT ATT AT GGTTTT AGCATT GTCT GT GA 1.1x109 24 90-200 56 AATT T AAT ACGACTCACT AT AGGAATGT ACTATTAT GGTTTT AGCATTGTCTGTGA 2.2x109 25 90-201 56 AATTTAAT ACGACT CACT AT AGGCAT GT ACTATT AT GGTTTT AGCATT GT CT GT GA 1.8x1O9 26 90-202 55 AATTTAATACGACTCACTATAGG ATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 2.0x109 27 90-203 54 AATTTAAT ACGACT CA CT AT AG AT GT ACT ATT AT GGTTTT AGCATT GT CT GT GA 2.5x109 28 90-204 53 AATTT AAT ACGACT CACT AT AG TGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA 1.9x109 29 90-430 52 AATTTAAT ACGACT CACT ATA TGT ACTATTATGGTTTT AGCATTGTCTGTGA 2.8x1O9

^ A sequência da cadeia codificadora é apresentada. A sequência sublinhada corresponde à sequência canónica de 17 nt da sequência do promotor T7 e o início da transcrição de ARN é denotada por +1. A sequência GGGA provém da sequência T7; os nucleótidos após 5+ provém da sequência de HIV-1. Apenas a porção da extremidade 5' de cada oligonucleótido é apresentada; as sequências subsequentes são idênticas para cada oligonucleótido. Os oligonucleótidos estão alinhados de modo a evidenciar as diferenças entre os iniciadores.

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EXEMPLO X

Efeito de várias combinações de aditivos na amplificação de uma região do gen pol do HIV-1

Este Exemplo demonstra o efeito de várias combinações de aditivos na amplificação de uma região de 707 bases do gene pol do HIV-1. As reacções foram realizadas a 42°C durante duas horas com 0,1 atomoles de ARN de HIV-1 como alvo e 90-249 (com sentido) (5 7-GAAAAAATAAAAGCATTAGTAGA-37) (SEQ ID N0:30) e 89-391* (sem sentido) (5 7 -AATTTAATACGACTCACTATAGGGATTTCCCCACTAACTTCTGTATGTCA- TTGACA-37) (SEQ ID NO:31) como oligonucleótidos iniciadores. As reacções por três enzimas continham 30 U de RT de AMV, 100 U de ARN-polimerase de T7 e 2 U de RNAse H de E. coli . As reacções por duas enzimas continham 10 U de RT de AMV e 20 U de ARN-polimerase de T7. As sequências da sonda e de Oligobead™ eram, respectivamente 89-534, 5'- AGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCA-37 (SEQ ID NO:32) e 89- 419, 57- AGAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTC-37 (SEQ ID NO: 33).

Efeito da combinação de aditivos na amplificação por dois e por três enzimas, de uma região do gene pol do HIV-1

Aditivos na de vezes de amplificação três enzimas duas enzimas nenhum 10% de DMSO/10% de glicerol 10% de DMSO/5% de PEG-8000 10% de DMS0/15% de Sorbitol 7,9 X 104 n.d. -a· co X 106 1,2 X105 vo •tf X tf o H n.d. 7,0 X 106 1,3 X 10 n.d. = não foi detectado produto, por hibridação tipo sanduíche, com esferas.

Embora o invento tenha sido descrito com alguma especificidade, poderão ser feitas modificações evidentes para os peritos na arte, sem alterar grandemente o espírito do invento.

73 346 50101 -60- Vários aspectos do invento são referidos nas reivindicações seguintes.

Claims (65)

1. 73 346 50101 -61- REIVINDICACÕES 1 - Processo para a amplificação 3SR de um segmento de ARN alvo de uma molécula de ARN alvo, segmento esse que compreende um subsegmento 5' que inclui um nucleótido 5'-terminal e se prolonga na direcção 3', a partir do nucleótido 5'-terminal do segmento alvo, por pelo menos 9 nucleótidos, e um subsegmento 3', que não se sobrepõe ao subsegmento 5' e que inclui um nucleótido 3'-terminal e se prolonga na direcção 5', a partir do nucleótido 3'-terminal do segmento alvo, por pelo menos 9 nucleótidos, caracterizado por compreender a incubação num meio de reacção de: (a) (1) um primeiro iniciador de ADN, que é um ADN de cadeia simples, o qual compreende na sua extremidade 3' um primeiro subsegmento com um nucleótido 3'-terminal e que se prolonga na direcção 57, por pelo menos 9 nucleótidos, tendo o referido primeiro subsegmento do referido primeiro iniciador o mesmo comprimento que o subsegmento 37 do segmento alvo e tendo uma sequência suficientemente complementar à do subsegmento 3' do segmento alvo para iniciar ("prime"), no meio de reacção, uma reacção de extensão de iniciador, na qual um ácido nucleico com a sequência do segmento alvo é o molde, e (2) um segundo iniciador de ADN, que é um ADN de cadeia simples, o qual compreende, na sua extremidade 3', um primeiro subsegmento com um nucleótido 37-terminal e que se prolonga na direcção 57, por pelo menos 9 nucleótidos, tendo o referido primeiro subsegmento do referido segundo iniciador o mesmo comprimento que o subsegmento 57 do segmento alvo e tendo uma sequência suficientemente homóloga à do subsegmento 5' do segmento alvo para iniciar ("prime"), no meio de reacção, uma reacção de extensão de iniciador na qual um ácido nucleico com a sequência complementar à do segmento alvo é o molde, desde que pelo menos um dos referidos iniciadores compreenda, ainda, um subsegmento que proporciona o promotor, que compreende a cadeia com sentido de um primeiro promotor, estando a referida cadeia com sentido ligada ao primeiro subsegmento do iniciador, o qual compreende o referido segmento que proporciona o promotor, operavelmente para transcrição a partir do referido primeiro promotor de um ADNc compreendendo os produtos de

   extensão dos dois iniciadores referidos, e desde que, para além disto, quando o referido primeiro iniciador não tem esse subsegmento que proporciona o promotor, o nucleótido 5'-terminal do referido subsegmento 5', do referido segmento de ARN alvo, seja o nucleótido 5'-terminal da molécula de ARN alvo;

   (b) pelo menos duas enzimas, que exibam no referido meio de reacção actividade de ADN-polimerase ADN-dependente, actividade de ADN-polimerase ARN-dependente, actividade de RNAse H, e uma ARN-polimerase ADN-dependente, sendo a referida ARN-polimerase ADN-dependente capaz de catalisar a transcrição do primeiro promotor no referido meio de reacção; e (c) nucleósido-trifosfatos, necessários como substratos para as actividades de ADN-polimerase ADN-dependente, de ADN--polimerase ARN-dependente e de ARN-polimerase ADN-dependente; ocorrendo a referida incubação numa gama de temperaturas na qual as referidas enzimas, no referido meio de reacção, são activas para proporcionar as referidas actividades de ADN --polimerase ADN-dependente, de ADN-polimerase ARN-dependente, de RNAse H e de ARN-polimerase ADN-dependente.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o segmento alvo ter menos do que cerca de 1500 nucleótidos de comprimento, por o subsegmento 5' e o subsegmento 3' do segmento Φ alvo terem cerca de 15-50 nucleótidos e por a referida incubação ocorrer a cerca de 40°C.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a transcriptase inversa ser uma transcriptase inversa retroviral.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a meio de reacção compreender uma enzima transcriptase inversa, uma enzima RNAse H e uma ARN-polimerase ADN-dependente.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a enzima RNAse H ser RNAse H de E. coli. 73 346 50101 63-
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a actividade da ARN-polimerase ADN-dependente ser proporcionada pela ARN-polimerase de um bacteriófago seleccionado de entre o grupo que consiste em T7, T3 e SP6.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o segmento de ARN alvo ter menos do que cerca de 200 nucleótidos de comprimento.
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por, após a incubação para amplificação do segmento de ARN alvo, o referido segmento de ARN alvo ou o segmento de ARN com a "'sequência complementar à do referido segmento de ARN alvo ser detectado num ensaio de hibridação com sonda de ácido nucleico, .
9. 9 - Processo para a amplificação de um segmento de ARN alvo que compreende um subsegmento 57 que inclui e se prolonga na direcção 37, a partir do nucleótido 57-terminal do segmento alvo, por pelo menos 9 nucleótidos, e um subsegmento 37, que não se sobrepõe ao subsegmento 57 e que inclui e se prolonga na direcção 57 a partir do nucleótido 37-terminal do segmento alvo, por pelo menos 9 nucleótidos, caracterizado por compreender a incubação, numa solução aquosa que compreende o segmento de ARN alvo, de: (a) (1) um primeiro iniciador de ADN, que é um ADN de cadeia simples, o qual compreende na sua extremidade 37 um primeiro subsegmento com um nucleótido 37-terminal e que se prolonga na direcção 57, por pelo menos 9 nucleótidos, tendo o referido primeiro subsegmento do referido primeiro iniciador o mesmo comprimento que o subsegmento 37 do segmento alvo, e tendo uma sequência suficientemente complementar à do subsegmento 37 do segmento alvo para iniciar ("prime11), no meio de reacção uma reacção de extensão do iniciador na qual um ácido nucleico com a sequência do segmento alvo é o molde e (2) um segundo iniciador de ADN, que é um ADN de cadeia simples, que compreende na sua extremidade 37 um primeiro subsegmento com um nucleótido 37--terminal e que se prolonga na direcção 57, por pelo menos 9 nucleótidos, tendo o referido primeiro subsegmento do referido

   73 346 50101

   -64- segundo iniciador o mesmo comprimento que o subsegmento 5' do segmento alvo e tendo uma sequência suficientemente homóloga à do subsegmento 5' do segmento alvo, para iniciar ("prime"), no meio de reacção, uma reacção de extensão do iniciador, na qual um ácido nucleico com a sequência complementar à do segmento alvo é o molde, desde que pelo menos um dos referidos iniciadores compreenda, ainda, um subsegmento que proporcione o promotor que compreende a cadeia com sentido de um primeiro promotor, estando a referida cadeia com sentido ligada ao primeiro subsegmento do iniciador que compreende o referido segmento que proporciona o promotor, operavelmente para a transcrição, a partir do referido primeiro promotor, de um ADNc que compreende os produtos da extensão dos dois iniciadores referidos, e ainda desde que, quando o referido primeiro promotor não tem esse subsegmento que proporciona o promotor, o nucleótido 5'-terminal do referido subsegmento 5' do referido segmento de ARN alvo seja o nucleótido 5'-terminal da molécula de ARN alvo; (b) (1) uma transcriptase inversa que exibe, no referido meio de reacção, actividade de ADN-polimerase ADN-dependente, actividade de ADN-polimerase ARN-dependente e uma quantidade de actividade de RNAse H eficaz na amplificação de alta sensibilidade e (2) uma ARN-polimerase ADN-dependente que, no referido meio de reacção, catalisa a transcrição a partir do referido primeiro promotor; e (c) nucleósido-trifosfatos, necessários como substratos para as actividades de ADN-polimerase ADN-dependente, de ADN-polimerase ARN-dependente e de ARN-polimerase ADN-dependente; ocorrendo a referida incubação numa gama de temperaturas à qual as referidas enzimas, na referida solução, são activas para proporcionar as referidas actividades de ADN-polimerase ADN-dependente, de ADN-polimerase ARN-dependente, de RNAse H e de ARN-polimerase ADN-dependente.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o meio de reacção compreender MgCl2 20-40 mM, KC1 1-25 mM, ditiotreitol 1-20 mM, espermidina 1-10 mM, NTPr 1-7 mM, NTPd 0,1- -65- 73 346 50101 -2 mM e uma quantidade eficaz de tampão para manter o meio de reacção a pH próximo de 8.
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, carácter izado por o segmento alvo ter menos do que cerca de 1500 nucleótidos de comprimento, por o subsegmento 5' e o subsegmento 3' do segmento alvo terem cerca de 15-50 nucleótidos e por a referida incubação ocorrer entre cerca de 37°C e cerca de 47°C.
12. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, carac-terizado por a transcriptase inversa ser uma transcriptase inversa retroviral.
13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, carácter izado por a concentração dos NTPr ser de cerca de 6 mM e por o meio de reacção compreender ainda entre cerca de 1 e cerca de 25 por cento em peso de pelo menos um composto escolhido do grupo que consiste em (i) um álcool (ii) um álcool-açúcar de fórmula HOCH2(CHOH)xCH2OH, em que x é 0-20? (iii) um composto polietilenoglicol de fórmula H(OCH2-CH2)nOH, em que n é 2-600; (iv) um açúcar do grupo dos mono, di e trissacáridos; e (v) um composto sulfóxido de fórmula R1-(S0)-R2, em que e R2 são, independentemente um do outro, alquilo em que R^ e R2 podem estar ligados como parte de um composto cíclico saturado.
14. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, carácter izado por o referido pelo menos um composto ser seleccionado de entre o grupo consistindo em sorbitol, glicerol, etanol, sacarose, polietilenoglicol e dimetilsulfóxido.
15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, carac-terizado por a actividade de ARN-polimerase ADN-dependente ser proporcionada pela ARN-polimerase de um bacteriófago seleccionado de entre o grupo que consiste em T7, T3 e SP6.
16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac-terizado por o meio de reacção compreender MgCl2 30 mM, KC1 20 mM, ditiotreitol 10 mM, espermidina 4 mM, NTPr 6 mM, NTPd 1 mM. 73 346 50101 -66-
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação

    terizado por a sequência do primeiro subsegmento do primeiro iniciador ser exactamente complementar à sequência do subsegmento 3' do segmento alvo e por a sequência do primeiro subsegmento do segundo iniciador ser igual à sequência do subsegmento 5' do segmento alvo.
18. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, carac-terizado por# após a incubação para amplificar o segmento de ARN alvo, o referido segmento de ARN alvo ou o segmento de ARN com a sequência complementar à do referido segmento de ARN alvo ser detectado num ensaio de hibridação com sonda de ácido nucleico.
19. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 12, carac-terizado por a transcriptase inversa ser transcriptase inversa de AMV e os meios de reacção compreenderem, ainda, entre cerca de 1 e cerca de 25 por cento em peso de um composto sulfóxido de fórmula R1-(SO)-R2, em que e R2 s^o, independentemente um do outro, alquilo em que e R2 podem estar ligados como parte de um composto cíclico saturado.
20. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, carac-terizado por o meio de reacção compreender dimetilsulfóxido.
21. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 20, carácter izado por a concentração dos NTPr ser de cerca de 6 mM e por o meio de reacção compreender, ainda, entre cerca de 1 e cerca de 25 por cento em peso de pelo menos um composto seleccionado do grupo que consiste em (i) um álcool ; (ii) um açúcar-álcool de fórmula HOCH2(CHOH)xCH2OH, em que x é 0-20; (iii) um composto polietilenoglicol de fórmula H(OCH2-CH2)nOH, em que n é 2-600; (iv) um açúcar do grupo dos mono, di e trissacáridos.
22. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 21, carac-terizado por o referido composto ser seleccionado de entre o grupo de sorbitol, glicerol, etanol, sacarose e polietilenoglicol .

    73 346 50101 -67
23. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 22, carac-terizado por a actividade da ARN-polimerase ADN-dependente ser proporcionada pela ARN-polimerase de um bacteriófago seleccionado de entre o grupo que consiste em T7, T3 e SP6.
24. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 23, carac-terizado por a solução aquosa compreender MgCl2 30 mM, KC1 20 mM, ditiotreitol 10 mM, espermidina 4 mM, NTPr 6 mM, NTPd 1 mM.
25. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado por a sequência do primeiro subsegmento do primeiro iniciador ser exactamente complementar à sequência do subsegmento 37 do segmento alvo e por a sequência do primeiro subsegmento do segundo iniciador ser igual à sequência do subsegmento 57 do segmento alvo.
26. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 25, carácter izado por o segmento alvo de ARN ter um comprimento de pelo menos 50 nucleótidos e os segmentos alvo de hibridação dos dois iniciadores de ADN terem, cada um, cerca de 15 nucleótidos de comprimento.
27. 27 - Processo de acordo com a reivindicação 26, carac-terizado por, após a incubação para amplificar o segmento de ARN alvo, o referido segmento de ARN alvo ou o segmento de ARN com a sequência complementar à do referido segmento de ARN alvo ser detectado num ensaio de hibridação com sonda de ácido nucleico.
28. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 12, carac-terizado por a transcriptase inversa ser transcriptase inversa do vírus da leucemia murina de Moloney e por a solução aquosa compreender entre cerca de 0,1 mM e cerca de 10 mM de iões manganês.
29. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, carácter izado por a concentração dos NTPr ser de cerca de 6 mM e por o meio de reacção compreender ainda entre cerca de 1 e cerca de 25 por cento em peso de pelo menos um composto seleccionado do grupo 73 346 50101

    -68-

    fórmula HOCH2(CHOH)xCH2OH, em que x é 0-20? (iii) um composto polietilenoglicol de fórmula H(OCH2-CH2)nOH, em que n é 2-600; (iv) um açúcar do grupo dos mono, di e trissacáridos; e (v) um composto sulfóxido de fórmula R-l-íSO)-^, em que R-l e R2 são, independentemente um do outro, alquilo em que R-l e R2 podem estar ligados como parte de um composto cíclico saturado.
30. 30 - Processo de acordo com a reivindicação 29, carac-terizado por o referido composto ser seleccionado de entre o grupo consisitindo em sorbitol, glicerol, etanol, sacarose, polietilenoglicol e dimetilsulfóxido.
31. 31 - Processo de acordo com a reivindicação 30 , carac-terizado por a actividade de ARN-polimerase ADN-dependente ser proporcionada pela ARN-polimerase de um bacteriófago seleccionado de entre o grupo que consiste em T7, T3 e SP6.
32. 32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, carac-terizado por a solução aquosa compreender MgCl2 30 mM, KC1 20 mM, ditiotreitol 10 mM, espermidina 4 mM, NTPr 6 mM, NTPd 1 mM.
33. 33 - Processo de acordo com a reivindicação 32, carácter izado por o segmento de ARN alvo ter um comprimento de pelo menos 50 nucleótidos e os segmentos alvo de hibridação dos dois iniciadores de ADN terem, cada um, cerca de 15 nucleótidos de comprimento.
34. 34 - Processo de acordo com a reivindicação 33, carac-terizado por a sequência do primeiro subsegmento do primeiro iniciador ser exactamente complementar à sequência do subsegmento 3' do segmento alvo e por a sequência do primeiro subsegmento do segundo iniciador ser igual à sequência do subsegmento 5' do segmento alvo.
35. 35 - Processo de acordo com a reivindicação 34, carac-terizado por, após a incubação para amplificar o segmento de ARN alvo, o referido segmento de ARN alvo ou o segmento de ARN com a 73 346 50101 -69-

    sequência complementar à do referido segmento de ARN alvo ser detectado mim ensaio de hibridação com sonda de ácido nucleico.
36. 36 - Processo de acordo com a reivindicação 12, carácter izado por o meio de reacção compreender ainda RNAse H de E. coli.
37. 37 - Processo de acordo com a reivindicação 36, carac-terizado por o meio de reacção compreender ainda um composto sulfóxido de fórmula R1-(S0)-R2, em que R-l e R2 são, independentemente um do outro, alquilo C^-C^, em que R2 e R2 podem estar ligados como parte de um composto cíclico saturado.
38. 38 - Processo de acordo com a reivindicação 37, carac-terizado por o composto sulfóxido ser DMSO.
39. 39 - Processo de acordo com a reivindicação 38, carácter izado por a concentração dos NTPr ser de cerca de 6 mM e por o meio de reacção compreender ainda entre cerca de 1 e cerca de 25 por cento em peso de pelo menos um composto do grupo que consiste em (i) um álcool (i i) um açúcar-álcool de fórmula HOCH2(CH0H)xCH20H, em que x é 0-20; (iii) um composto polietilenoglicol de fórmula H(OCH2-CH2)nOH, em que n é 2-600; (iv) um açúcar do grupo dos mono, di e trissacáridos.
40. 40 - Processo de acordo com a reivindicação 39, carac-terizado por o referido composto ser seleccionado de entre o grupo consistindo em sorbitol, glicerol, etanol, sacarose e polietilenoglicol.
41. 41 - Processo de acordo com a reivindicação 40, carac-terizado por a actividade de ARN-polimerase ADN-dependente ser proporcionada pela ARN-polimerase de um bacteriófago seleccionado de entre o grupo que consiste em T7, T3 e SP6.
42. 42 - Processo de acordo com a reivindicação 41, carac-terizado por a solução aquosa compreender MgCl2 30 mM, KC1 20 mM, ditiotreitol 10 mM, espermidina 4 mM, NTPr 6 mM, NTPd 1 mM.
43. 43 - Processo de acordo com a reivindicação 42, carac-terizado por a transcriptase inversa ser seleccionada de entre o grupo consistindo em transcriptase inversa de AMV, transcriptase inversa de MMLV e transcriptase inversa de HIV-1.
44. 44 - Processo de acordo com a reivindicação de 43, carac-terizado por a transcriptase inversa ser transcriptase inversa de AMV, por o segmento de ARN alvo ter um comprimento superior a cerca de 400 nucleótidos e por o meio de reacção compreender ainda 10% de DMSO e 15% de sorbitol.
45. 45 - Processo de acordo com a reivindicação 44, carac-terizado por a sequência do primeiro subsegmento do primeiro iniciador ser exactamente complementar à sequência do subsegmento 37 do segmento alvo e por a sequência do primeiro subsegmento do segundo iniciador ser igual à sequência do subsegmento 5' do segmento alvo.
46. 46 - Processo de acordo com a reivindicação 45, carácter izado por, após a incubação para amplificar o segmento de ARN alvo, o referido segmento de ARN alvo ou o segmento de ARN com a sequência complementar à do referido segmento de ARN alvo ser detectado num ensaio de hibridação com sonda de ácido nucleico.
47. 47 - Processo de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado por o primeiro iniciador de ADN compreender o referido segmento que proporciona o promotor e o segundo iniciador não ter um segmento que proporciona o promotor.
48. 48 - Processo de acordo com a reivindicação 47, carac-terizado por o meio de reacção ser suplementado com 10% de DMSO e 15% de sorbitol e por o segmento de ARN alvo ter um comprimento inferior a 700 nucleótidos.
49. 49 - Processo de acordo com a reivindicação 48, carac-terizado por o segmento que proporciona o promotor ser derivado do promotor de T7.
50. 50 - Processo de acordo com a reivindicação 49, carac-terizado por a sequência do primeiro subsegmento do primeiro iniciador ser exactamente complementar à sequência do subsegmento 3' do segmento alvo e por a sequência do primeiro subsegmento do segundo iniciador ser igual à sequência do subsegmento 5' do segmento alvo.
51. 51 - Processo de acordo com a reivindicação 50, carac-terizado por o segmento de ARN alvo ter um comprimento de pelo menos 50 nucleótidos e os segmentos alvo de hibridação dos dois iniciadores de ADN terem, cada um, 15 nucleótidos de comprimento.
52. 52 - Processo de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado por o primeiro iniciador compreender um primeiro subsegmento que proporciona o promotor, para proporcionar um primeiro promotor para iniciar a transcrição de um ADNc que compreende os produtos de extensão dos dois iniciadores e por o segundo iniciador compreender um segundo subsegmento que proporciona o promotor, para proporcionar um segundo promotor para iniciar a transcrição de um ADNc que compreende os produtos de extensão dois iniciadores, sendo o referido primeiro promotor reconhecido, no meio de reacção, por uma primeira ARN-polimerase ADN-dependente para catálise da transcrição e sendo o referido segundo promotor reconhecido, no meio de reacção, por uma segunda ARN-polimerase ADN-dependente para catálise da transcrição, sendo as referidas primeira e segunda ARN-polimerases ADN-dependentes iguais ou diferentes; e por o meio de reacção compreender a referida segunda ARN-polimerase ADN-dependente.
53. 53 - Processo de acordo com a reivindicação 52, carac-terizado por a referida primeira ARN-polimerase ADN-dependente ser diferente da referida segunda ARN-polimerase ADN-dependente, por no meio de reacção a referida segunda ARN-polimerase ADN-dependente, mas não a referida primeira ARN-polimerase ADN-dependente, reconhecer o referido segundo promotor; e por o referido meio de reacção compreender a referida segunda ARN--polimerase ADN-dependente.

    73 346 50101 -72-
54. 54 - Processo de acordo com a reivindicação 53, carac-terizado por a sequência do primeiro subsegmento do primeiro iniciador ser exactamente complementar à sequência do subsegmento 37 do segmento alvo e por a sequência do primeiro subsegmento do segundo iniciador ser igual à sequência do subsegmento 57 do segmento alvo.
55. 55 - Processo de acordo com a reivindicação 54, carac-terizado por o segmento alvo de ARN ter um comprimento de pelo menos 50 nucleótidos e por os segmentos alvo de hibridação dos dois iniciadores de ADN terem, cada um, 15 nucleótidos de comprimento.
56. 56 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido subsegmento que proporciona o promotor do referido pelo menos um iniciador compreender, na sua extremidade 5', um segmento de ADN tendo entre um e dez nucleótidos, sendo o referido segmento de um a dez nucleótidos ligado, através de uma ligação fosfodiéster única, ao nucleótido 57 de um local de ligação de polimerase com o mesmo comprimento da sequência de consenso da referida cadeia com sentido do referido primeiro promotor.
57. 57 - Processo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado por o segmento alvo ter menos do que cerca de 1500 nucleótidos de comprimento, por os subsegmento 5' e o subsegmento 37 do segmento alvo terem cerca de 15-50 nucleótidos e por a referida incubação ocorrer a cerca de 40°C.
58. 58 - Processo de acordo com a reivindicação 57, caracterizado por a transcriptase inversa ser uma transcriptase inversa retroviral.
59. 59 - Processo de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por o meio de reacção compreender uma enzima transcriptase inversa, uma enzima RNAse H e uma ARN-polimerase ADN-dependente.

    73 346 50101
60. 60 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido segmento que proporciona o promotor do referido pelo menos um iniciador compreender ainda, na sua extremidade 5', um segmento de ADN tendo entre um e dez nucleótidos, sendo o referido segmento de um a dez nucleótidos ligado, através de uma ligação fosfodiéster única, ao nucleótido 5' de um local de ligação de polimerase com o mesmo comprimento da sequência de consenso da referida cadeia com sentido do referido primeiro promotor.
61. 61 - Processo de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por o meio de reacção compreender MgCl2 20-40 mM, KC1 1-25 mM, ditiotreitol 1-20 mM, espermidina 1-10 mM, NTPr 1-7 mM, NTPd 0,1-2 mM e uma quantidade eficaz de tampão para manter o meio de reacção a pH próximo de 8.
62. 62 - Processo de acordo com a reivindicação 61, caracterizado por o segmento alvo ter menos do que cerca de 1500 nucleótidos de comprimento, por o subsegmento 5' e o subsegmento 3· do segmento alvo terem cerca de 15-50 nucleótidos e por a referida incubação ocorrer entre cerca de 37°C e cerca de 47°C.
63. 63 - Processo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por a transcriptase inversa ser uma transcriptase ^ inversa retroviral.
64. 64 - Processo de acordo com a reivindicação 63, carac terizado por a concentração dos NTPr ser de cerca de 6 mM e por o meio de reacção compreender, ainda, entre cerca de 1 e cerca de 25 por cento em peso de pelo menos um composto seleccionado do grupo que consiste em (i) um álcool (ϋ) um açúcar-álcool de fórmula HOCH2(CHOH)xCH2OH, em que x é 0-20; (iii) um composto polietilenoglicol de fórmula H(0CH2-CH2)n0H, em que n é 2-600; (iv) um açúcar do grupo dos mono, di e trissacáridos; e (v) um composto sulfóxido de fórmula R1-(SO)-R2, em que e R2 são, independentemente um do outro, alquilo C^-C^, em que R*l e R2 podem estar ligados como parte de um composto cíclico saturado. -74- 73 346 50101
65. 65 - Processo de acordo com a reivindicação 64, carac-terizado por o referido pelo menos um composto ser seleccionado de entre o grupo consistindo em sorbitol, glicerol, etanol, sacarose, polietilenoglicol e dimetilsulfóxido. Lisboa, Por SISKA DIAGNOSTICS, INC. =0 AGENTE 0FICIAL=