JP5712125B2 - 高温で開始される核酸増幅のための、化学修飾されたヌクレオシド５’−三リン酸 - Google Patents

Description

本明細書では、核酸を複製するための方法および組成物が提供される。特定の具体的な態様および実施形態において、該方法および組成物は、ホットスタートによる核酸増幅を対象とする。

以下の説明は、読者の理解を補助する目的で提供される。提供される情報または引用される参考文献はいずれも、本発明における先行技術であるとは容認されない。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、おそらく、現代の分子生物学およびバイオテクノロジーにおいて最も広く用いられる方法であり、遺伝子検査、診断法、法医学、および生物兵器防衛に急速に応用されつつある（Ｋｏｌｍｏｄｉｎ，Ｌ．Ａ．ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、５６９〜５８０頁（Ｒａｐｌｅｙ，Ｒ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０００年）；Ｂｕｄｏｗｌｅ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１巻、１８５２〜１８５３頁（２００３年）；Ｓａｔｏ，Ｙ．ら、Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５巻（増刊１号）、１９１〜１９３頁（２００３年）；Ｓａｌｄａｎｈａ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌ．、４３巻、７２〜７６頁（１９９４年）；Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、４４巻、４０７〜４１５頁（１９９８年）およびＥｌｎｉｆｒｏ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１３巻、５５９〜５７０頁（２０００年））。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号、および同第４，６８３，２０２号において説明されている。ＰＣＲによる増幅過程の各サイクルでは、複数のステップが行われることが典型的である。まず、２本鎖ＤＮＡの標的配列を、高温（約９５℃）で熱変性させる。本明細書では、熱変性の最初の発生を「初期変性ステップ」と称する。この後、低温（約６０℃）で、各鎖に対する合成オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングが行われる。次いで、高温（約７０℃）で、２’−デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）を組み込み、ピロリン酸（ＰＰｉ）を生成させる、熱的に安定で、マグネシウムイオンに依存するＤＮＡポリメラーゼにより、これらの順方向および逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーの各々を、これらの３’末端から伸長させる。

ＰＣＲの有用性は、約１０^６倍の標的増幅を迅速に提供するその能力のほか、オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションの特異性に部分的に依存する、高度の特異性によっても駆動されている。したがって、オリゴヌクレオチドプライマーの配列および長さは、アニーリングに用いられる温度において、意図される標的配列だけにハイブリダイズするようにデザインされる。しかし、ＰＣＲによる増幅反応は、オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションの特異性を確保するのに必要とされる温度範囲をはるかに下回る雰囲気室温において何分間または何時間もの間にわたり準備されることが典型的である。このような低厳密性の試料調製条件下において、また、プレＰＣＲにおける初期変性ステップの後において、オリゴヌクレオチドプライマーは、他の配列に非特異的に結合する場合があり、潜在的には、望ましくない伸長産物の合成を開始し、これらが標的配列と共に増幅される可能性がある。プライマーに対して部分的な相補性を有する非特異的な標的配列の増幅、いわゆる「ミスプライミング」は、所望の標的配列の増幅と競合する可能性があり、とりわけ、低コピー数の標的の場合、所望の配列の増幅効率を著明に低下させうる（Ｃｈｏｕ，Ｑ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻、１７１７〜１７２３頁（１９９２年））。

「プライマー二量体」の形成が、非特異的なハイブリダイゼーションの別の問題形態であり、これは、Ｃｈｏｕ，Ｑ．らによれば、これといった介在配列なしに、互いの配列間で伸長した２本のオリゴヌクレオチドプライマーの増幅から生じる。これらの研究は、さらに、ＰＣＲ時において、プライマー二量体が増幅されながらオリゴマー化して、オリゴヌクレオチドプライマーのアーチファクトの複雑な混合物をもたらす場合があり、それらの量および質は、低コピー数の増幅における特異的なＰＣＲ産物の収量と反比例して多様化することが多いことにも言及している。

ミスプライミングおよびプライマー二量体の形成に起因する前述の問題には、ＰＣＲのすべての適用において遭遇しうるが、これらの問題は、血液感染性の感染作用物質（Ｓａｌｄａｎｈａ，Ｊ．ら；Ｅｌｎｉｆｒｏ，Ｅ．Ｍ．ら）、生体に有害な微生物（Ｂｕｄｏｗｌｅ，Ｂ．ら）、欠損性遺伝子または癌性遺伝子（Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．ら）の検出、および法医学（Ｂｕｄｏｗｌｅ，Ｂ．ら；Ｙ．Ｓａｔｏら）に用いられる場合など、高感度の分析的ＰＣＲスキームにとって、特に難題でありうる。加えて、多重ＰＣＲでは、偽の増幅産物形成の可能性がますます高くなる（Ｍａｒｋｏｕｌａｔｏｓ，Ｐ．ら、Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ、１６巻、４７〜５１頁（２００２年））。逆転写酵素によるＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）において、標的ＲＮＡ配列を検出するのに最も高感度の手段は、ＲＴステップにおいて、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることである（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３７巻、２３１〜２４１頁（１９９９年）；Ｌｅｋａｎｎｅ Ｄｅｐｒｅｚ，Ｒ．Ｈ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０７巻、６３〜６９頁（２００２年）；Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５巻、１５５〜１６６頁（２００４年））。「偽陰性」および「偽陽性」の重大で有害な帰結を避けるのに高度の特異性を必要とする、これら高感度の適用の場合、ミスプライミングおよびプライマー二量体形成に起因するアーチファクトを機能的に含まないアッセイを提供する試薬およびプロトコールを有することが極めて重要である。

低厳密性条件下における、例えば、試料調製時の室温における、また、プレＰＣＲによる初期変性ステップの後における、ミスプライミングおよびオリゴヌクレオチドプライマー二量体形成に起因する望ましくない増幅を損なうことを目的とする、いわゆる「ホットスタート」過程に基づいて非特異的な増幅を低下させるため、多くの一般的戦略が研究されている。その後、反応混合物が、高厳密性、すなわち、ポリメラーゼを介する、標的配列だけにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を「開始」させる「高」温に達したとき、増幅が開始される。したがって、プライマー／標的のハイブリダイゼーション条件の厳密性が特異性にとって最適である高温だけにおいて、温度により、オリゴヌクレオチドプライマーの酵素的伸長が誘発される。

これらの「ホットスタート」のための一般的な戦略には、（１）試薬の混合を制御する、障壁剤または封鎖剤としての蝋など、温度感受性材料の使用（Ｃｈｏｕ，Ｑ．ら；Ｔａｎｚｅｒ，Ｌ．Ｒ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７３巻、３０７〜３１０頁（１９９９年））；（２）ＤＮＡポリメラーゼの機能を阻害する、オリゴヌクレオチドアプタマー（Ｄａｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６４巻、２６８〜２７８頁（１９９６年））、または抗体（Ｅａｓｔｌｕｎｄ，Ｅ．ら、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ、２巻、２〜５頁（２００１年）；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）、１２６巻、７６２〜７６８頁（１９９９年））の使用；（３）付加されたピロリン酸（ＰＰｉ）による抑制を除去する、ピロホスファターゼなど、第２の熱安定性酵素の使用（Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ｒ．ら、国際特許出願第ＷＯ２００２０８８３８７号）；（４）ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｔ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２５巻、７１６〜７２２頁（１９９８年）；Ｓａｌｄａｎｈａ，Ｊ．ら）における、シトラコン酸修飾されたリシンなど、加水分解において可逆的な試薬により化学修飾されたポリメラーゼ（Ｂｉｒｃｈ，Ｄ．Ｅ．ら、米国特許第５，７７３，２５８号）の使用；（５）競合配列など、低温のミスプライミングに拮抗する、オリゴヌクレオチドプライマー配列による構築物（Ｐｕｓｋａｓ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５巻、３０９〜３１１頁（１９９５年））または「タッチアップ型およびループ組込み型オリゴヌクレオチドプライマー」（ＴＵＬＩＰＳ−ＰＣＲ）（Ａｉｌｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２９巻、５号、１０１８〜１０２３頁（２０００年））の使用；および（６）その３’端近傍において、（１つまたは複数の）ホスホトリエステルによるヌクレオチド間結合を含有する、化学修飾されたプライマー（すなわち、ホスホトリエステルプライマー）（Ｚｏｎ，Ｇ．ら、米国特許出願第２００７０２８１３０８号（２００７年））の使用が含まれる。

本明細書では、核酸を複製するための方法および組成物が提供される。これらの方法は、温度依存的な核酸鋳型に依存する重合化反応における、ヌクレオシド５’−三リン酸（ＮＴＰ）オリゴヌクレオチドプライマー、および酵素の使用を伴う。特定の態様において、方法は、核酸の複製において有用性をもたらす修飾ＮＴＰを用いることにより達成される。特に好ましい実施形態において、修飾ＮＴＰは、３’置換、すなわち、末端の３’位置におけるヒドロキシル基以外の基を有する。方法におけるこのようなＮＴＰの使用は、核酸の増幅、特に、ホットスタートによる増幅を対象としうる。特定の実施形態において、ＮＴＰの３’置換は、ＰＣＲの初期変性ステップなど、高温における核酸複製の初期インキュベーション時間の前において、ポリメラーゼを介するオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を損なう。特定の態様および実施形態では、核酸複製の初期変性ステップ、またはその後において、また、該当する場合は、その後の複製サイクルにおいて、本明細書で開示されるＮＴＰの３’置換基が、開環の３’ヒドロキシル（３’−ＯＨ）基に転換される方法および組成物が提供される。

一部の態様では、本明細書で開示される３’置換を有する複製反応に、少なくとも１つの修飾ＮＴＰが付加されるときに、核酸（例えば、ＤＮＡ）が複製される方法が提供される。核酸複製の初期インキュベーション時間の前、すなわち、ＰＣＲの場合に８０〜１０５℃、またＲＴ−ＰＣＲの場合に４２〜７０℃など、核酸複製の初期変性温度となる前において、少なくとも１つの修飾ＮＴＰの３’置換は、ポリメラーゼを介するオリゴヌクレオチドのプライマー伸長を支援しない（例えば、一部の実施形態では、核酸ポリメラーゼが、非置換ＮＴＰまたは天然ＮＴＰを組み込んでこれを伸長させることは可能であるが、３’置換ＮＴＰを組み込んでこれを伸長させることは可能でないことが好ましい）か、これを損なうか、または防止することが好ましい。特定の好ましい実施形態において、３’置換は、核酸ポリメラーゼを介して、３’置換ＮＴＰがオリゴヌクレオチドプライマーと共に組み込まれることを損ない、これにより、該プライマーの３’伸長を防止する。この種の３’置換ＮＴＰは、「非基質ＮＴＰ」を表す。他の特定の好ましい実施形態において、３’置換ＮＴＰは、オリゴヌクレオチドプライマーの３’端に組み込まれうるが、そこで、３’置換基は、任意のさらなる、核酸ポリメラーゼを介するオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を損なう。この種の３’置換ＮＴＰは、「終結ＮＴＰ」を表す。

本明細書で説明される組成物および方法による修飾基に適する熱不安定性の保護基（例えば、３’置換、およびヌクレオチド間結合）は、オリゴヌクレオチドの合成過程における使用について、文献で説明されている。例えば、Ｇｒａｊｋｏｗｓｋｉら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、３巻、１２８７〜１２９０頁（２００１年）；Ｗｉｌｋ，Ａ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、４２巻、５６３５〜５４３９頁（２００１年）；Ｗｉｌｋ，Ａ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６７巻、６４３０〜６４３８頁（２００２年）；Ｃｉｅｓｌａｋ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６８巻、１０１２３〜１０１２９頁（２００３年）；Ｃｉｅｓｌａｋ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６９巻、２５０９〜２５１５頁（２００４年）；Ｂｅａｕｃａｇｅら、米国特許第７，３５５，０３７号；およびＢｅａｕｃａｇｅら、米国特許第６，７６２，２９８号を参照されたい。

３’置換ＮＴＰおよびヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）の使用に基づく複数の適用が開発されている。Ｊｅｎｇら、Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．、３巻、４４８〜４６８頁（１９７５年）は、３’−アリールアジドＡＴＰ類似体の合成、およびミオシンＡＴＰアーゼの光親和性標識としてのそれらの使用について説明した。他のＡＴＰアーゼ系においても、類似の化合物が調製されて調べられた（Ｓｃｈａｆｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、８７巻、３１８〜３２２頁（１９７８年）；Ｌｕｎａｒｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０巻、４７３〜４８０頁（１９８１年））。Ｈｉａｔｔら、米国特許第６，２３２，４６５号、およびこれにより参照される特許は、オリゴヌクレオチド合成において用いられるホスホジエステル結合を、鋳型に依存せず、酵素触媒により創出するための、３’保護されたヌクレオシド５’−三リン酸について説明している。ホスホジエステル結合の形成後、組み込まれるヌクレオチドの３’保護基を化学的に除去し、該オリゴヌクレオチドの合成を継続することができる。３’置換ＮＴＰの別の使用は、段階的合成による配列決定である。Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ、米国特許第５，３０２，５０９号は、除去可能な蛍光標識を含有する３’修飾ＮＴＰによる、ポリヌクレオチドの配列決定について説明している。Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２巻、４２５９〜４２６７頁（１９９４年）は、新たな配列決定戦略を開発するための重要な構成要素としての、ＵＶにより除去可能な３’保護基を伴う修飾ＮＴＰの合成について説明している。同様の手法には、Ｊｕら、米国特許第６，６６４，０７９号；Ｍｅｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、７８巻、３２４８〜３２５２頁（２００６年）およびＢｉ，Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ−Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２８巻、２５４２〜２５４３頁（２００６年））により開発された、３’−Ｏ−アリルによる保護基および３’−Ｏ−メトキシメチルによる保護基を含有する、色素により標識されたＮＴＰの使用が含まれる。３’−Ｏ−アリルによる保護基は、高温の中性水溶液中において、パラジウム触媒により除去することができる。他の特許もまた、除去可能な３’置換基を伴う３’置換ｄＮＴＰの合成および使用について説明している。例えば、３’遮断基は、ｐＨ２をもたらす塩酸の添加（例えば、Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ、ＷＯ９１／０６６７８）により除去することもでき、メルカプトエタノールなどの還元剤の添加（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．、米国特許第７，２７９，５６３号）により除去することもでき、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィンの添加（例えば、Ｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第７，４１４，１１６号）により除去することもできる。特定の３’置換基は、ＵＶ照射により除去することができる（例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９２／１０５８７）オリゴヌクレオチドについては、除去可能な３’置換基が説明されている（例えば、Ｂｉ，Ｗ．、ＷＯ０８／０１６５６２（Ａ２））。

特定の態様では、本明細書でさらに説明される、式ＩＡおよびＩＢで示される化学式を包含する組成物（すなわち、３’置換ＮＴＰ）が提供される。関連する態様では、本明細書でさらに説明される、式ＩＡおよびＩＢで示される化学式を包含する組成物を用いて、かつ／または式ＩＡおよびＩＢで示される化学式を包含する３’置換ＮＴＰの組込みに由来する、少なくとも１つの単量体ユニットを包含するオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡを複製する方法が提供される。

本明細書で用いられる「非基質ＮＴＰ」という用語は、オリゴヌクレオチドプライマーへの組込みが不可能である３’置換を有する３’置換ＮＴＰを指す（図１Ａ）。本明細書で提供される方法および組成物による非基質ＮＴＰは、２つの状態を有する。非基質ＮＴＰは、３’置換基の存在に起因する不活性状態にあると、核酸ポリメラーゼの基質とならない（図１Ａ）。９５℃であることが多い初期変性温度に到達すると、熱的に誘導される、３’置換基の分子内転換および／または分子間転換により、または非修飾もしくは開環３’−ＯＨ基への３’置換基の転換をもたらす他の化学反応により、不活性の非基質ＮＴＰは、活性状態に転換されうる。非基質ＮＴＰのこの活性状態とは、非置換または開環の３’−ＯＨ基を保有し、核酸ポリメラーゼの基質でありえ、また、核酸複製を支援する、対応する天然ＮＴＰもしくは３’置換されないＮＴＰ、またはその機能的な誘導体である（図１および２）。特に好ましい実施形態において、３’置換基の部分的であるかまたは完全な転換は、約１〜１２０分間にわたる約９５℃のインキュベーション時において生じる。一部の実施形態において、本明細書で開示される３’置換ＮＴＰは、試薬の混合を制御する、障壁剤または封鎖剤としての蝋など、温度感受性の材料の使用；ＤＮＡポリメラーゼの機能を阻害する、オリゴヌクレオチドアプタマーまたは抗体の使用；付加されたピロリン酸（ＰＰｉ）による抑制を除去する、ピロホスファターゼなど、第２の熱安定性酵素の使用；シトラコン酸修飾されたリシンなど、加水分解において可逆的な試薬により化学修飾されたポリメラーゼの使用；競合配列など、低温のミスプライミングに拮抗する、オリゴヌクレオチドプライマー配列による構築物の使用；およびその３’端近傍において、（１つまたは複数の）ホスホトリエステルによるヌクレオチド間結合を含有する、化学修飾されたプライマー（すなわち、ホスホトリエステルプライマー）の使用など、当技術分野で知られる、１つまたは複数の、他のホットスタートによる方法および組成物と共に用いることができる。好ましい実施形態において、３’置換基の転換は温度に関して生じ、標準的なｄＮＴＰによる複製反応において通常用いられるもの以外の酵素、さらなる化学物質、または重合化反応条件の変更を必要としない。本明細書で提供される組成物および方法によるヌクレオシドおよびヌクレオチドのための異なる３’置換基は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．およびＷｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社（１９９９年）において説明されている。

本明細書で用いられる「終結ＮＴＰ」という用語は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’端に組み込まれることが可能な３’置換ＮＴＰを指す（図１Ｂ）。終結ＮＴＰが組み込まれる結果として、終結プライマーが形成され、該プライマーのさらなる伸長が防止される。終結ＮＴＰは２つの状態を有し、いずれの状態においても、核酸ポリメラーゼの基質となる。終結ＮＴＰは、３’置換基の存在に起因する終結状態にある。プライマーの３’端に終結ＮＴＰを組み込む結果、（Ｎ＋１）ヌクレオチドに伸長した終結プライマーが形成され、該プライマーのさらなる伸長が防止される（図１Ｂ）。９５℃などの高温において、熱的に誘導される、３’置換基の分子内除去および／または分子間除去により、または非修飾３’−ＯＨ基もしくは開環３’−ＯＨ基への３’置換基の転換をもたらす他の化学反応により、終結ＮＴＰは、活性状態に変換されうる（図１Ｂ）。この状態において、終結ＮＴＰは、非置換または開環の３’−ＯＨ基を保有し、核酸ポリメラーゼの基質でありうる、対応する天然もしくは非置換のＮＴＰ、またはその機能的な誘導体に転換される。特に好ましい実施形態において、３’置換基の部分的であるかまたは完全な転換は、約１〜１２０分間にわたる約９５℃のインキュベーション時において生じる。好ましい実施形態において、３’置換基の転換は温度に関して生じ、標準的なｄＮＴＰによる複製反応において通常用いられるもの以外の酵素、さらなる化学物質、または重合化反応条件の変更を必要としない。本明細書で提供される組成物および方法によるヌクレオシドおよびヌクレオチドのための異なる３’置換基は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．らにおいて説明されている。

核酸ポリメラーゼにより、終結ＮＴＰがプライマーの３’端に組み込まれる結果、終結ＮＴＰは、（Ｎ＋１）ヌクレオチドに伸長したプライマーの一部となり、これを「終結プライマー」と称する。終結プライマーはさらなる伸長が不可能であり、９５℃であることが多い高温に達するまで、その末端である、終結ＮＴＰの組込みに由来する最後尾の３’ヌクレオチドユニットにおける、３’置換基の存在に起因する「終結状態」にとどまる。終結プライマーのこの終結状態は、非基質ＮＴＰについて本明細書で定義される不活性状態と同等である。好ましい実施形態において、終結プライマーは、３’置換基の含有に加え、さらなる修飾、例えば、修飾された糖、塩基、（５’−３’）ヌクレオチド間結合、またはこれらの任意の組合せを伴う修飾ヌクレオシド残基を包含する。終結プライマーは、熱不安定性の３’置換基を含有することがより好ましい。高温（例えば、ＰＣＲの初期変性温度）に達すると、終結プライマーは、熱的に誘導され、３’置換基を除去する、分子内および／または分子間におけるフラグメント化により、伸長可能プライマーとなりうる（図１Ｂおよび２）。「伸長可能プライマー」は、非置換または開環の３’−ＯＨ基を保有し、核酸ポリメラーゼによる伸長が可能である。特に好ましい実施形態において、３’置換基の部分的であるかまたは完全な転換は、約９５℃で約１〜１２０分間にわたるインキュベーション後において生じる。好ましい実施形態において、終結プライマーの３’置換基の転換は温度に関して生じ、標準的なｄＮＴＰによる複製において通常用いられるもの以外の酵素、さらなる化学物質、または重合化反応条件の変更を必要としない。

好ましい実施形態において、ＮＴＰ重合化反応において存在する、３’置換ＮＴＰ、修飾ＮＴＰ、非修飾ＮＴＰ、またはこれらの組合せなど、該重合化反応混合物の１つまたは複数の成分は、検出可能な標識によって標識化することができる。したがって、複製後において、標的セグメントは、例えば、サイズ、質量、親和性捕捉、または色により同定されうる。検出可能な標識は、蛍光色素であることが好ましく、親和性捕捉標識は、ビオチンであることが好ましい。

別の態様において、本明細書における方法および組成物は、１つまたは複数の修飾基を有するＮＴＰを含めた、核酸複製のための３’置換ＮＴＰを提供する。３’置換ＮＴＰは、本明細書でさらに説明される、式ＩＡおよびＩＢで示される１つまたは複数の化学構造を包含しうる。

さらに別の態様において、本明細書における方法および組成物は、本明細書で開示される３’置換ＮＴＰを合成する方法を提供する。

本明細書で説明される複製を実施するための３’置換ＮＴＰを包含するキットもまた提供される。例えば、キットは、ハウスキーピング遺伝子など、共通の複製標的のためのＰＣＲ試薬を含有しうる。３’置換ＮＴＰを含有するキットは、核酸複製用と明記された容器、核酸複製の実施についての指示書、ならびに／または、修飾プライマー、非修飾プライマー、修飾ＮＴＰ（例えば、３’置換ＮＴＰ）、非修飾ＮＴＰ、核酸ポリメラーゼ、塩化マグネシウムまたは他の２価陽イオン（例えば、マグネシウムイオンおよびマンガンイオン）および反応緩衝液からなる群から選択される１つもしくは複数の試薬を包含しうる。一実施形態において、キットは、３’置換ＮＴＰ、核酸ポリメラーゼ、および少なくとも１つのさらなる酵素（例えば、第２の核酸ポリメラーゼ、逆転写酵素、リガーゼ、または制限酵素）を包含し、少なくとも１つの（１つまたは複数の）さらなる酵素に適するさらなる緩衝液成分を包含しうる。キットは、２つ以上の核酸複製試薬を包含することが好ましく、好ましくは３つ以上、またより好ましくは４つ以上の複製試薬を包含する。３’置換ＮＴＰを含有するキットはまた、オリゴヌクレオチドプライマーも包含しうる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは修飾されており、例えば、ヌクレオチド間結合、ヌクレオシド糖、三リン酸鎖、および／またはヌクレオシド塩基における任意の置換または修飾を有する。キットは、核酸複製用と明記された容器、核酸複製の実施についての指示書、ならびに／またはｄＮＴＰ、核酸ポリメラーゼ、マグネシウム、および反応緩衝液からなる群から選択される１つもしくは複数の試薬を包含しうる。

本明細書で提供される、核酸を複製するための方法および組成物は、合成および／または天然のＮＴＰ、修飾オリゴヌクレオチドプライマー、非修飾オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに核酸を伸長させるためのポリメラーゼを用いる適用において有用である。本明細書で提供される方法および組成物によるＮＴＰは、単一の３’置換を有する可能性もあり、場合によって、さらなる修飾部位を有する可能性もある。

本明細書で提供される方法および組成物による３’置換ＮＴＰは、著明な利点を有する。例えば、末端使用者は、非置換の標準的なＮＴＰと共に既に用いられているものと同じ複製プロトコールおよび複製方法を用いることができる。本明細書で提供される方法および組成物による３’置換ＮＴＰは、既存の複製システムおよび複製試薬（各種のホットスタートによるＰＣＲ法を含めた）と適合的であり、さらなる酵素または試薬は必要とされないが、これらも用いることができる。標準的な化学的および酵素的な合成方法を用いて、本明細書で提供される方法および組成物による３’置換ＮＴＰを合成することができる。忠実度を必要とするポリメラーゼベースの複製適用を、本明細書で提供される方法および組成物による３’置換ＮＴＰと共に用いることができる。

本明細書で用いられる「複製」、「増幅」、または「増幅する」という用語は、標的核酸をコピーし、これにより、選択された核酸配列のコピー数を増大させるための、当技術分野で知られる方法を指す。本明細書で提供される方法および組成物を伴う複製および増幅は、核酸ポリメラーゼによる伸長を伴う、３’置換ＮＴＰおよび／またはプライマーを用いうる。標的核酸の複製または増幅は、指数関数的な場合もあり、非直線的な場合もあり、直線的な場合もある。複製または増幅は、指数関数的または非直線的であることが好ましい。標的核酸は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり、ｃＤＮＡの場合もあり、修飾核酸鋳型の場合もある。以下の本明細書で説明される例示的な方法はＰＣＲ増幅に関するが、当技術分野では、核酸を酵素的に増幅および複製するための、本明細書で提供される方法および組成物に適する他の多くの方法が知られている。例えば、他の酵素的な複製および増幅の方法には、等温法、ローリングサークル法、ホットスタートＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリー（ＰＣＡ）、非対称的ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、急速ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、核酸ライゲーション、ギャップライゲーション連鎖反応（Ｇａｐ ＬＣＲ）、ライゲーション媒介ＰＣＲ、多重ライゲーション依存型プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、ギャップ伸長ライゲーションＰＣＲ（ＧＥＸＬ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）、多重ＰＣＲ、ヘリカーゼ依存型増幅、配列間特異的（ＩＳＳＲ）ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ（Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ−ＰＣＲ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、ネストＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ、ＰＡＮ−ＡＣアッセイ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ端の急速増幅（ＲＡＣＥ ＰＣＲ）、単一分子増幅ＰＣＲ（ＳＭＡ ＰＣＲ）、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ）、タッチダウンＰＣＲ、ロングＰＣＲ、核酸配列決定法（ＤＮＡ配列決定法およびＲＮＡ配列決定法）、転写、逆転写、複製、ＤＮＡまたはＲＮＡのライゲーション、および当技術分野で知られる他の核酸伸長反応が含まれる。当業者は、ＰＣＲ法の代わりに、またこれらと共に、将来において開発される酵素的複製反応を含めた他の方法も用いることができる。例えば、Ｓａｉｋｉ、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ」、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｉｎｎｉｓら編、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、１３〜２０頁（１９９０年）；Ｗｈａｒａｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２９巻、１１号、Ｅ５４〜Ｅ５４頁（２００１年）；Ｈａｆｎｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３０巻、４号、８５２〜６、８５８、８６０頁の各所（２００１年）；Ｒｏｓｓ，Ｐ．ら、国際特許出願第ＷＯ９１／０６６７８号；Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．、米国特許第ＵＳ６，２５５，４７５号、同第ＵＳ６３０９８３６号、および同第ＵＳ６，６３９，０８８号、およびＥＰ１２１８３９１；Ａｎａｚａｗａ，Ｔ．ら、米国特許第６２４２１９３号；Ｊｕら、米国特許第ＵＳ６，６６４，０７９号；Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．ら、国際特許出願第ＷＯ９１／０６６７８号；ならびにＤｏｗｅｒら、国際特許出願第ＷＯ９２／１０５８７号を参照されたい。

本明細書で用いられる「核酸」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらの任意のフラグメント、任意のリボもしくはデオキシリボ誘導体、ならびに天然および／または修飾のヌクレオチド残基およびヌクレオチド間結合を含有する、天然または合成の分子を指す。これらの表現はまた、１本鎖の場合もあり、２本鎖の場合もあり、３本鎖の場合もあり、４本鎖の場合もあり、また、センス鎖を表す場合もあり、アンチセンス鎖を表す場合もある、天然（例えば、ゲノム）由来もしくは合成由来のＤＮＡもしくはＲＮＡ、または任意のＤＮＡ様物質もしくはＲＮＡ様物質も指す。ＤＮＡ配列に関する「ＲＮＡ同等物」は、窒素性塩基であるチミンのすべてまたは大半の発生がウラシルによって置換され、糖骨格が２’−デオキシリボースの代わりにリボースからなることを除き、基準のＤＮＡ配列と同じヌクレオチドの直鎖配列からなる。本明細書で提供される方法および組成物に適する、さらなる代替的な核酸骨格には、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、アルキルホスホトリエステル、アリールホスホトリエステル、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、ロックト核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびにホスホボロン酸が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で説明される方法では、ＲＮＡを用いることができ、かつ／または本明細書で説明される方法において用いられる逆転写により、これをｃＤＮＡに転換することができる。

本明細書で用いられる「３’置換ＮＴＰ」という用語は、３’位置において、開環ヒドロキシル基以外の化学的基を有するヌクレオシド５’−三リン酸を指す。３’置換ＮＴＰには、例えば、修飾糖、修飾塩基、もしくは修飾三リン酸鎖、または、例えば、本明細書でさらに説明される、式ＩＡおよびＩＢにおいて示される修飾糖、修飾塩基、もしくは修飾三リン酸鎖の任意の組合せを含有するＮＴＰが含まれる。このようなＮＴＰの例は、例えば、「Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｖａｇｈｅｆｉ，Ｍ．編、ボカラトン、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ社（２００５年）；Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５巻、１７６７〜１７７６頁（２００５年）（およびこれらの参考文献）において見出すことができる。

本明細書で用いられる「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、通常１本鎖のリボポリヌクレオチドまたはデオキシリボポリヌクレオチドを指し、天然の場合もあり、合成の場合もあり、また通常、約５〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約３０ヌクレオチド、または、より好ましくは約１５〜約２５ヌクレオチドの配列を包含する。オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾基を含有しうる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、および／または他の修飾ヌクレオシドを包含しうる。当業者は、標的配列の複製に適切なプライマーをデザインおよび調製することが可能である。本明細書で提供される方法および組成物において用いられるプライマーのハイブリダイゼーション配列の長さは、ヌクレオチド配列の同一性、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの核酸複製においてこれらの核酸がハイブリダイズされるかまたは用いられる温度を含めた、複数の因子に依存する。特定の配列同一性を有するプライマーのハイブリダイゼーション配列に好ましい長さを決定するのに必要な考慮点は、当業者によく知られている。例えば、短鎖核酸またはオリゴヌクレオチドの長さは、ハイブリダイゼーションの特異性または選択性と関連しうる。

本明細書で用いられる「終結プライマー」という用語は、プライマーの３’端における、核酸ポリメラーゼを介する終結ＮＴＰの組込みにより組み込まれる、３’置換基を含有するプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマーを指す。本明細書で提供される方法および組成物による１つまたは複数のさらなる修飾基を包含しうる終結プライマーを、開環３’−ＯＨ基への３’置換基の転換前に伸長させることはできない。終結プライマーは、天然のヌクレオチド間ホスホジエステル結合、もしくはこれらの修飾、またはこれらの組合せを含有する、天然ＤＮＡヌクレオシドもしくは天然ＲＮＡヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、またはヌクレオシド類似体を包含しうる。３’置換基は熱不安定性であり、複製反応媒体の温度が上昇すると、終結プライマーから解離する速度が上昇することが好ましい。

本明細書で用いられる「伸長可能プライマー」という用語は、プライマーの３’端における、核酸ポリメラーゼを介するＮＴＰの組込みにより伸長しうる、非修飾または開環の３’−ＯＨ基を含有するプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマーを指す。伸長可能プライマーは、オリジナルの開始プライマーの場合もあり、３’置換基が遊離の３’−ＯＨ基に転換された、変換終結プライマーの場合もある。

本明細書で用いられる「３’置換基」という用語は、ＮＴＰまたはプライマーの３’位置における、非修飾または開環のヒドロキシル基（３’−ＯＨ）以外の化学的部分を指す。特定の実施形態において、化学的部分は、エーテル、エステル、またはカーボネートである。特定の好ましい実施形態において、３’置換基は、Ｏ−（ｐ−トルエン）スルホネート；Ｏ−リン酸；Ｏ−硝酸；Ｏ−［４−メトキシ］テトラヒドロピラニル；Ｏ−［４−メトキシ］−テトラヒドロチオピラニル；Ｏ−テトラヒドロチオピラニル；Ｏ−［５−メチル］−テトラヒドロフラニル；Ｏ−［２−メチル，４−メトキシ］−テトラヒドロピラニル；Ｏ−［５−メチル］−テトラヒドロピラニル；Ｏ−テトラヒドロピラニル；Ｏ−テトラヒドロフラニル；Ｏ−フェノキシアセチル；Ｏ−メトキシアセチル；Ｏ−アセチル；Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ_３；Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ；およびＯ−Ｃ（Ｓ）−ＯＣＨ_３からなる群から選択される。一部の特に好ましい実施形態において、３’置換基は、Ｏ−メトキシテトラヒドロピラニル；Ｏ−テトラヒドロピラニル；およびＯ−テトラヒドロフラニルからなる群から選択される。

本明細書で提供される方法および組成物による３’置換ＮＴＰは、オリゴヌクレオチドまたは核酸の伸長に対する有効性を有さないか、またはこれが低下することが好ましい。３’置換ＮＴＰが、その対応する３’置換されないＮＴＰと比較して、複製反応における基質としての有効性が少なくとも５０％低下する、その対応する３’置換されないＮＴＰより、複製反応における基質としての有効性が好ましくは少なくとも６０％低下する、好ましくは少なくとも７０％低下する、より好ましくは少なくとも８０％低下する、より好ましくは少なくとも９０％低下する、より好ましくは少なくとも９５％低下する、より好ましくは少なくとも９９％低下する、また最も好ましくは少なくとも１００％低下する場合に、伸長が損なわれると考えることが好ましい。当業者は、ＮＴＰの基質活性および有効性のレベルを容易に決定することができる。基質の有効性を決定する１つの方法を、実施例４で示す。特定の好ましい実施形態において、３’置換基は熱不安定性であり、複製反応媒体の温度が上昇すると、３’置換ＮＴＰから解離する速度が上昇する。

ＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーとの関連において本明細書で用いられる「３’非置換」、「天然」、または「非修飾」という用語は、修飾基を伴わないＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマー、または修飾基を伴わないＮＴＰもしくはオリゴヌクレオチドプライマーの機能的同等物を指す。

３’置換基に加え、３’置換ＮＴＰまたは３’置換されたプライマーは、１つまたは複数のさらなる修飾基を含有しうる。本明細書で用いられる「修飾基」という用語は、リン酸部分、糖部分、三リン酸鎖部分、またはヌクレオシド塩基部分が含まれるがこれらに限定されない位置において、ＮＴＰまたはプライマーに結合しうる、任意の化学的部分を指す。ＮＴＰまたはプライマーの修飾基は、核酸複製過程に適合する任意の性質の基でありうる。修飾基は、酵素反応媒体の温度が上昇すると、修飾ＮＴＰまたは修飾プライマーから解離する速度が上昇する、不安定性基でありうる。一実施形態において、重合化反応において存在する修飾プライマーの修飾基は、例えば、米国特許出願第２００７０２８１３０８号において説明される結合などのヌクレオチド間結合において存在しうる。別の実施形態において、重合化反応において存在する修飾ＮＴＰまたは修飾プライマーの修飾基は、検出可能な標識でありうる。したがって、複製後において、標的セグメントは、サイズ、質量、親和性捕捉、および／または色により同定されうる。検出可能な標識は、蛍光色素であることが好ましく、親和性捕捉標識は、ビオチンであることが好ましい。

オリゴヌクレオチドに関して本明細書で用いられる「末端」という用語は、オリゴヌクレオチドの３’端または５’端におけるヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドの末端は、末端の６ヌクレオチドを包含することが好ましく、より好ましくは末端の５ヌクレオチド、より好ましくは末端の４ヌクレオチド、より好ましくは末端の３ヌクレオチド、より好ましくは末端の２ヌクレオチド、または、より好ましくは末端ヌクレオチドを包含する。

本明細書で用いられる「転換する」、「解離する」、「解離」、または「フラグメント化」という用語は、ＮＴＰまたはプライマーからの、修飾基の除去または変換（例えば、３’置換基の除去による、または３’−ＯＨ基への３’置換基の変換による）を指す。修飾基の除去または変換は、例えば、３’置換基が、修飾分子部分から解離する場合のように部分的でもありえ、３’置換基が、修飾分子全体から解離する場合のように完全でもありうる。特定の好ましい実施形態において、３’位置における修飾基の除去または変換は、ＮＴＰまたはプライマーの３’位置における開環３’−ＯＨ基の形成をもたらす。修飾基の除去または変換は、分子内反応により生じる場合もあり、別の分子との反応により生じる場合もある。３’置換基の除去または変換は、３’置換ＮＴＰを活性状態に転換し、終結プライマーを伸長可能プライマーに転換することが好ましい。

本明細書で用いられる「ヌクレオチド間結合」という用語は、オリゴヌクレオチドプライマーまたは核酸の２つのヌクレオシドを連結する１つまたは複数の結合を指し、これは、天然のホスホジエステル結合の場合もあり、修飾結合の場合もある。

本明細書で用いられる「標的」、「標的核酸配列」、または「核酸標的」という用語は、同定されるヌクレオチド配列を指す。

本明細書で用いられる「標識」または「検出可能な標識」という用語は、標識を検出することにより、分子が直接的または間接的に検出されうるように、分子と結合する場合もあり、他の形でこれと会合する場合もある、任意の化合物または化合物の組合せを指す。検出可能な標識は、放射性同位体（例えば、炭素、リン、ヨウ素、インジウム、硫黄、トリチウムなど）、質量同位体（例えば、Ｈ^２、Ｃ^１３、またはＮ^１５）、色素またはフルオロフォア（例えば、シアニン、フルオレセイン、またはロダミン）、ハプテン（例えば、ビオチン）、または直接的もしくは間接的に検出されうる他の任意の薬剤でありうる。標識化したＮＴＰを、単位複製配列または他の重合化産物内に組み込んだ後には、標識を検出することができる。

本明細書で用いられる「熱誘導」または「熱転換」という用語は、熱を加えて３’置換ＮＴＰの３’置換基を除去または変換し、これにより、核酸ポリメラーゼに適する基質を生成させる過程を指す。熱誘導または熱転換という用語はまた、伸長可能プライマーを生成する終結プライマーの３’置換基を除去または変換するように加熱し、これにより、終結プライマーを核酸ポリメラーゼの基質とする過程も指す。

本明細書で用いられる「ホットスタート」という用語は、反応が、酵素に最適な伸長温度を上回る初期温度であることが好ましい所望の温度に達するまで、ポリメラーゼを介する核酸複製が損なわれる核酸複製反応を指す。ホットスタートによるＰＣＲ適用において、初期温度は、約８０〜１０５℃、または少なくとも８０℃、または少なくとも８５℃、または少なくとも９０℃、または約９４℃、または約９５℃、または約９６℃、または約１００℃に達する。好ましくは、「ホットスタート」ＰＣＲは、核酸ポリメラーゼおよび他のすべてのＰＣＲ成分が、初期変性ステップの前に添加されることを要請する。ホットスタートという用語は当技術分野でよく知られており、修飾ポリメラーゼ、ハイブリダイゼーションを損なう二次構造を伴うオリゴヌクレオチド、または伸長を損なう化学修飾を伴うオリゴヌクレオチド、および蝋など、温度感受性の障壁剤内に含有される試薬など、複製を損なう多くの方法が知られている。好ましい実施形態において、ホットスタートによる増幅は、熱誘導により、非基質ＮＴＰ、終結ＮＴＰ、または終結プライマーにおける３’置換基を、開環の３’−ＯＨ基に転換することにより誘発される。

本明細書で用いられる「ミスプライミング」という用語は、核酸ポリメラーゼを介するプライマー伸長の非特異的な誘発を指す。特に、それは、プライマーに対してある程度の非相補性を有し、標的配列と共に増幅されうる望ましくない伸長産物の合成を誘発する可能性がある核酸配列に関する。

ＮＴＰとの関連において本明細書で用いられる「不活性状態」または「不活性」という用語は、３’置換基を伴う非基質ＮＴＰを指す。一実施形態において、ＮＴＰに対する３’置換基の結合は、ＮＴＰを不活性とし、オリゴヌクレオチドプライマーへの３’置換ＮＴＰの組込みを損ない、これにより、核酸ポリメラーゼによる３’伸長を防止する（図１Ａ）。終結ＮＴＰとの関連において本明細書で用いられる「終結状態」という用語は、プライマーの３’端に組み込まれ、Ｎ＋１ヌクレオチドに伸長した伸長不可能なプライマー（すなわち、終結プライマー）を形成することが可能な、３’置換ＮＴＰを指す（図１Ｂ）。

プライマーとの関連において本明細書で用いられる「終結状態」という用語は、その３’端において３’置換基を含有するプライマーを指す（図１Ｂ）。一実施形態において、プライマーの３’端への、３’置換された終結ＮＴＰの組込みは、該プライマーの伸長を一次的に終結させる。結果として得られる終結プライマーは、３’置換基が開環の３’−ＯＨ基に転換されるまで、核酸複製反応を支援せず、これをさらに伸長させることができない。

ＮＴＰとの関連において本明細書で用いられる「活性状態」または「活性」という用語は、ポリメラーゼの基質でありうるＮＴＰを指す。好ましくは、「活性」ＮＴＰは、３’置換を有さないか、または転換された３’置換基を含有する終結ＮＴＰでありうる。好ましくは、活性ＮＴＰは、非修飾の３’−ＯＨ基を有し、複製反応における核酸ポリメラーゼの基質として用いられうる。活性状態のＮＴＰは、３’置換を有したことのないＮＴＰの場合もあり、３’置換が転換されるか、除去されるか、または変換されたＮＴＰの場合もある。

本明細書で用いられる「（１つまたは複数の）プライマー二量体」という用語は、これといった介在配列なしに、互いの配列間でハイブリダイズした、２本の伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの増幅から生じる、非特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの（１つまたは複数の）伸長産物を指す。

本明細書で用いられる「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」という用語は、２本の相補的な核酸鎖が、適切な程度に厳密な条件下において互いにアニールする過程を指す。標的核酸に対するハイブリダイゼーションは、２０〜１００ヌクレオチドの長さであることが好ましい、プローブ長の核酸分子により実施されることが典型的であり、また好ましい。核酸のハイブリダイゼーション法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２版、ニューヨーク州、プレーンビュー、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ社（１９８９年）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ニュージャージー州、セコーカス、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社（１９９４年）を参照されたい。

本明細書で用いられる「厳密なハイブリダイゼーション条件」という用語は、完全に相補的でない２つの核酸のハイブリダイゼーションを許容しないハイブリダイゼーション条件を指す。

本明細書で用いられる「試料」または「検査試料」という用語は、対象の核酸を包含すると考えられる任意の液体または固体の材料を指す。検査試料は、培養中の細胞もしくは組織試料など、任意の生物学的供給源（すなわち、生物学的試料）から得る場合もあり、化学合成される鋳型を含め、合成により作製する場合もある。

オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーまたは標的核酸などのヌクレオチド配列）との関連において本明細書で用いられる「相補体」、「相補的」、または「相補性」という用語は、ワトソン／クリックによる標準的な塩基対合則を指す。相補体配列はまた、ＤＮＡ配列またはその相補体配列に相補的なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の場合もあり、また、ｃＤＮＡでもありうる。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−５’」に対して相補的である。天然の核酸において一般に見出されないか、または化学合成される特定のヌクレオチドを、本明細書で説明される核酸に含めることができ、これらには、イノシン、７−デアザグアノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、ロックト核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）など、塩基および糖が修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸が含まれるがこれらに限定されない。相補性は完全である必要がなく、安定的な二重鎖は、ミスマッチした塩基対、縮重ヌクレオチド、またはマッチしないヌクレオチドを含有しうる。核酸技術分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、ミスマッチ塩基対の発生、イオン強度、他のハイブリダイゼーション緩衝液の成分および条件を含めた多くの変数を経験的に考慮して、二重鎖の安定性を決定することができる。

塩基対合則に従いマッチする２本の核酸鎖のヌクレオチド塩基がごく一部である場合、相補性は「部分的」でありうる。２本の核酸鎖のすべてのヌクレオチド塩基が塩基対合則に従いマッチする場合、相補性は完全または全体的でありうる。塩基対合則に従いマッチする２本の核酸鎖のヌクレオチド塩基が皆無である場合、相補性は不在でありうる。核酸鎖間における相補性の程度は、核酸鎖間におけるハイブリダイゼーションの効率および強度に対して著明な影響を及ぼす。これは、増幅反応のほか、核酸間における結合に依存する検出法においても特に重要である。該用語はまた、個々のヌクレオチドに関して、とりわけ、ポリヌクレオチドとの関連においても用いることができる。例えば、オリゴヌクレオチド内における特定のヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの残りの部分と別の核酸鎖との間における相補性と対比した、またはこれと比較した、該核酸鎖内のヌクレオチドに対するその相補性、またはその欠如について言及されうる。

本明細書で用いられる「実質的に相補的な」という用語は、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２つの配列を指す。当業者は、実質的に相補的な配列が、それらの全長にわたってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。特に、実質的に相補的な配列は、厳密なハイブリダイゼーション条件下において標的配列にハイブリダイズする連続塩基配列に対して３’側または５’側に位置し、標的配列にはハイブリダイズしない連続塩基配列を含む。

本明細書で用いられる「順方向プライマー」という用語は、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖にアニールするオリゴヌクレオチドプライマーを指す。「逆方向プライマー」は、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡのセンス鎖にアニールする。

本明細書で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーが核酸に対して「特異的」であるのは、オリゴヌクレオチドプライマーと該核酸とを整列させるとき、オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション配列が、該核酸の一部と少なくとも５０％の配列同一性を有する場合である。核酸に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーとは、適切なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下において、対象の標的にハイブリダイズすることは可能であるが、対象でない核酸配列には実質的にハイブリダイズすることが可能でないオリゴヌクレオチドプライマーである。より高レベルの配列同一性が好ましく、これには、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またより好ましくは１００％の配列同一性が含まれる。

本明細書で用いられる「ヌクレオシド」という用語には、天然の核酸中において見出されるヌクレオシド塩基およびフラノシドのすべての形態を含めた、すべての天然ヌクレオシドが含まれる。天然のヌクレオシド中において最も一般的に見出される塩基環は、プリン環およびピリミジン環である。天然のプリン環には、例えば、アデニン、グアニン、およびＮ^６−メチルアデニンが含まれる。天然のピリミジン環には、例えば、シトシン、チミン、および５−メチルシトシンが含まれる。天然のヌクレオシドには、例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジン、イノシン、７−デアザグアノシン、７−メチルグアノシンのリボ誘導体および２’−デオキシリボ誘導体が含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で用いられる「ヌクレオシド類似体」、「修飾ヌクレオシド」、または「ヌクレオシド誘導体」という用語には、本明細書で説明される合成ヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシド誘導体にはまた、保護基を伴うかまたは伴わない、修飾塩基部分および／または修飾糖部分を有するヌクレオシドも含まれる。このような類似体には、例えば、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジンなどが含まれる。本明細書で提供される化合物および方法には、このような塩基環およびそれらの合成類似体のほか、非天然のヘテロ環で置換された塩基糖、さらにまた、非環式の置換塩基糖も含まれる。さらに、ヌクレオシド誘導体には、他のプリン誘導体およびピリミジン誘導体、例えば、ハロゲン置換されたプリン（例えば、６−フルオロプリン）、ハロゲン置換されたピリミジン、Ｎ^６−エチルアデニン、Ｎ^４（アルキル）−シトシン、５−エチルシトシンなども含まれる。ヌクレオシドの誘導体および類似体は、米国特許第６，７６２，２９８号において説明される修飾など、多種多様な修飾を包含する。

本明細書で用いられる「ユニバーサル塩基によるＮＴＰ」、「縮重塩基によるＮＴＰ」、「ユニバーサル塩基によるＮＴＰ類似体」、および「縮重塩基によるＮＴＰ類似体」という用語には、例えば、ｄＡＴＰ、ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＧＴＰ、および他の具体的なＮＴＰなど、任意の具体的なＮＴＰに対する代替物として核酸ポリメラーゼにより認識可能であることが好ましい、人工的な塩基を伴うＮＴＰ類似体が含まれる。ユニバーサル塩基または縮重塩基を伴うＮＴＰもまた用いることができ、例は、Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２９巻、２４３７〜２４４７頁（２００１年）；Ｃｒｅｙ−Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓ，Ｃ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３巻、１５３２〜１５４３頁（２００５年）；Ｋｉｎｃａｉｄ，Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３巻、２６２０〜２６２８頁（２００５年）；Ｐｒｅｐａｒａｔａ，ＦＰ、Ｏｌｉｖｅｒ，ＪＳ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．、１１巻、７５３〜７６５頁（２００４年）およびＨｉｌｌ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、９５巻、４２５８〜４２６３頁（１９９８年）において見出すことができる。

本明細書で用いられる「修飾オリゴヌクレオチド」という用語には、例えば、修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド間結合を含有するか、または修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチド間結合の任意の組合せ（オリゴヌクレオチド鎖内に存在するのが天然ヌクレオシドだけであっても）を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間結合の修飾の例は、例えば、Ｗａｌｄｎｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、６巻、２３６３〜２３６６頁（１９９６年）において見出すことができる。修飾オリゴヌクレオチドの例は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステルであり、オリゴヌクレオチドのメチルホスホン酸誘導体は、例えば、Ｓｔｅｃ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３巻、７０９〜７２２頁（１９９４年）；Ｌｅｂｅｄｅｖ，Ａ．Ｖ．ら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｓ．、４巻、１７〜４０頁（１９９６年）およびＺｏｎら、米国特許出願第２００７０２８１３０８号において見出すことができる。修飾オリゴヌクレオチドという用語は、３’末端のヌクレオチドにおいて３’置換を有するオリゴヌクレオチドを包含する。

本明細書で用いられる「アシル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ^ａ基［式中、Ｒ^ａは、水素、低級アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールなどである］を指す。

本明細書で用いられる「置換アシル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ^ａ’基［式中、Ｒ^ａ’は、置換低級アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、置換アリール、置換ヘテロアリールなどである］を指す。

本明細書で用いられる「アシルオキシ」という用語は、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ^ｂ基［式中、Ｒ^ｂは、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールなどである］を指す。

本明細書で用いられる「アルカン」という用語は、炭素原子および水素原子を包含する有機化合物を指し、Ｃ−Ｈ結合を包含し、加えて、メタン以外のアルカンにおいてはＣ−Ｃ単結合も包含する。「アルカン」という用語には、１〜２０個の炭素原子を有するアルカンなどの直鎖アルカンが含まれる。一部の実施形態において、アルカンには、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、およびオクタンなど、１〜８個の炭素原子を有するアルカンなどの直鎖アルカンが含まれる。「アルカン」という用語にはまた、１〜２０個の炭素原子を有する分枝鎖アルカン、また、一部の実施形態においては、２−メチルプロパン、２，２−ジメチルプロパン、２−メチルブタン、２，３−ジメチルブタン、２，２−ジメチルブタン、２-メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルペンタン、３−エチル−２−メチルペンタン、３−エチルヘキサンなどであるがこれらに限定されない、１〜８個の炭素原子を有する分枝鎖アルカンなどであるがこれらに限定されない分枝鎖アルカンも含まれる。アルカンのＣ−Ｃ結合またはＣ−Ｈ結合は、ヒドロキシル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩなどのハロゲン、スルフヒドリル基、またはアミン基など別の基に対する結合により置換することができる。このような基により置換されたアルカンは、それぞれ、ヒドロキシアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカンなどのハロアルカン、メルカプトアルカン、およびアミノアルカンと呼ばれる。

本明細書で用いられる「アルケニル」という用語は、１つまたは複数の二重結合を有し、別段に特定されない限り、約２〜約２０個の炭素原子、好ましくは約２〜約１０個の炭素原子、より好ましくは約２〜約８個の炭素原子、また最も好ましくは約２〜約６個の炭素原子を含有する、直鎖または分枝鎖のヒドロカルビルを指す。アルケニルラジカルの例には、ビニル、アリル、１，４−ブタジエニル、イソプロペニルなどが含まれる。

本明細書で用いられる「アルケニルアリール」という用語は、アルケニル置換されたアリール基を指し、「置換アルケニルアリール」は、本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに保有するアルケニルアリール基を指す。

本明細書で用いられる「アルケニレン」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素間二重結合を有し、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を含有することが典型的な、直鎖または分枝鎖の２価ヒドロカルビル基を指し、「置換アルケニレン」は、本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに保有するアルケニレン基を指す。

本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、通常１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子の範囲にある炭化水素の単結合鎖を指し、例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルなどが含まれる。このようなアルキルラジカルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチル、ドデカニルなどが含まれる。

本明細書で用いられる「低級アルキル」という用語は、通常１〜６個の炭素原子、好ましくは２〜５個の炭素原子の範囲にある炭化水素の直鎖または分枝鎖を指す。例には、エチル、プロピル、イソプロピルなどが含まれる。

本明細書で用いられる「アルキレン」という用語は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１５個の炭素原子を含有し、それに由来する２つの水素原子が、同じ炭素原子から奪われるか、または異なる炭素原子から奪われる、直鎖または分枝鎖の２価ヒドロカルビルを指す。アルキレンの例には、メチレン（−ＣＨ_２−）、エチレン（−ＣＨ_２ＣＨ_２−）などが含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で用いられる「アルキニル」という用語は、１つまたは複数の三重結合を有し、約２〜２０個の炭素原子、好ましくは約２〜１０個の炭素原子、より好ましくは約２〜８個の炭素原子、また、最も好ましくは約２〜６個の炭素原子を含有する、直鎖または分枝鎖のヒドロカルビルを指す。アルキニルラジカルの例には、エチニル、プロピニル（プロパルギル）、ブチニルなどが含まれる。

本明細書で用いられる「アルキニルアリール」という用語は、アルキニル置換されたアリール基を指し、「置換アルキニルアリール」は、本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに保有するアルキニルアリール基を指す。

本明細書で用いられる「アルコキシ」という用語は、−ＯＲ^ｃ基［式中、Ｒ^ｃは、本明細書で定義される、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「低級アルコキシ」という用語は、−ＯＲ^ｄ基［式中、Ｒ^ｄは、低級アルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「アルキルアリール」という用語は、アルキル置換されたアリール基を指し、「置換アルキルアリール」は、本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに保有するアルキルアリール基を指す。

本明細書で用いられる「アルキルカルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲ^ｅＣ（Ｏ）Ｒ^ｆ基［式中、Ｒ^ｅは、場合によって、置換アルキルであり、Ｒ^ｆは水素またはアルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「アルキルスルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）Ｒ^ｇ基［式中、Ｒ^ｇは、場合によって、置換アルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「アルキルスルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^ｇ基［式中、Ｒ^ｇは、場合によって、置換アルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「アルキルスルホニルアミノ」という用語は、−ＮＲ^ｅＳ（Ｏ）_２Ｒ^ｆ基［式中、Ｒ^ｅは、場合によって、置換アルキルであり、Ｒ^ｆは水素またはアルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「アルキルチオ」という用語は、−Ｓ−Ｒ^ｈ基［式中、Ｒ^ｈはアルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「置換アルキルチオ」という用語は、−Ｓ−Ｒ^ｉ基［式中、Ｒ^ｉは置換アルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「アルキニレン」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素間三重結合を有し、約２〜１２個の炭素原子、好ましくは約２〜８個の炭素原子を有することが典型的な、直鎖または分枝鎖の２価ヒドロカルビル基を指し、「置換アルキニレン」は、本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに保有するアルキニレン基を指す。

本明細書で用いられる「アミド」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｊＲ^ｊ’基［式中、Ｒ^ｊおよびＲ^ｊ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールである］を指す。

本明細書で用いられる「置換アミド」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｋＲ^ｋ’基［式中、Ｒ^ｋおよびＲ^ｋ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであるが、Ｒ^ｋおよびＲ^ｋ’のうちの少なくとも１つは水素ではない］を指す。窒素と組み合わされたＲ^ｋＲ^ｋ’は、場合によって、置換ヘテロ環または置換ヘテロアリール環を形成しうる。

本明細書で用いられる「アミジノ」という用語は、−Ｃ（＝ＮＲ^ｍ）ＮＲ^ｍ’Ｒ^ｍ”基［式中、Ｒ^ｍ、Ｒ^ｍ’、およびＲ^ｍ”は、独立に、水素であるか、または場合によって、置換アルキル、アリール、もしくはヘテロアリールである］を指す。

本明細書で用いられる「アミノ」または「アミン」という用語は、−ＮＲ^ｎＲ^ｎ’基［式中、Ｒ^ｎおよびＲ^ｎ’は独立に、本明細書で定義される、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールでありうる］を指す。「２価アミン」とは、−ＮＨ−基を指す。「置換２価アミン」とは、−ＮＲ−基［式中、Ｒは、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールである］を指す。

本明細書で用いられる「置換アミノ」または「置換アミン」という用語は、−ＮＲ^ｐＲ^ｐ’基［式中、Ｒ^ｐおよびＲ^ｐ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであるが、Ｒ^ｐおよびＲ^ｐ’のうちの少なくとも１つは水素ではない］を指す。窒素と組み合わされたＲ^ｐＲ^ｐ’は、場合によって、置換ヘテロ環または置換ヘテロアリール環を形成しうる。

本明細書で用いられる「アリールアルキニル」という用語は、アリール置換されたアルキニル基を指し、「置換アリールアルキニル」は、本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに保有するアリールアルキニル基を指す。

本明細書で用いられる「アラルキル」という用語は、その水素原子が、本明細書で定義されるアリールにより置換される、本明細書で定義されるアルキルを指す。アラルキルラジカルの例には、ベンジル、フェネチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピル、３−ナフチルプロピル、３−ナフチルブチルなどが含まれる。

本明細書で用いられる「アロイル」という用語は、ベンゾイルなどのアリール−カルボニル分子種を指し、「置換アロイル」は、本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに保有するアロイル基を指す。

本明細書で用いられる「アリールアルキル」という用語は、アリール置換されたアルキル基を指し、「置換アリールアルキル」は、本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに保有するアリールアルキル基を指す。

本明細書において、単独、または組合せで用いられる「アリール」という用語は、場合によって、好ましくは環員が５〜７個、より好ましくは環員が５〜６個のシクロアルキルを伴い、かつ／または、場合によって、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、場合によって、アルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基により単置換または二重置換されたアミノ、アミジノ、場合によって、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、またはヘテロシクリル基により置換された尿素、場合によって、アルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基によりＮ−単置換またはＮ，Ｎ−二重置換されたアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノなど、１〜３個の基または置換基により置換される、フェニル、ナフチル、または融合芳香族ヘテロ環を指す。

本明細書で用いられる「アリールカルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲ^ｑＣ（Ｏ）Ｒ^ｒ基［式中、Ｒ^ｑは、水素もしくは低級アルキルまたはアルキルであり、Ｒ^ｒは、場合によって置換アリールである］を指す。

本明細書で用いられる「アリーレン」という用語は、６〜１４個の炭素原子を有することが典型的な２価の芳香族基を指し、「置換アリーレン」とは本明細書に記載の１個または複数個の置換基をさらに有するアリーレン基を指す。

本明細書で用いられる「アリールオキシ」という用語は、−ＯＡｒ基［式中、Ａｒは、アリール基、または置換アリール基である］を指す。

本明細書で用いられる「アリールスルホニルアミノ」という用語は、−ＮＲ^ｑＳ（Ｏ）_２Ｒ^ｒ基［式中、Ｒ^ｑは、水素もしくは低級アルキル、またはアルキルであり、Ｒ^ｒは、場合によって置換アリールである］を指す。

本明細書で用いられる「カルバメート基」という用語は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ_２基［式中、各Ｒは、独立に、本明細書に記載のＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールである］を指す。

本明細書で用いられる「ジチオカルバメート基」という用語は、−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ_２基［式中、各Ｒは、独立に、本明細書に記載のＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールである］を指す。

本明細書で用いられる「炭素環」という用語は、結合した炭素原子からなる単環または多重縮合環を有する、飽和基、不飽和基、または芳香族基を指す。（１個または複数個の）環は、場合によって、置換されていない、または例えば、ハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、ヘテロ環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドなどにより置換されていてもよい。

本明細書で用いられる「シクロアルケニル」という用語は、３〜２０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素間二重結合を有する環含有基を指し、「置換シクロアルケニル」は、本明細書で示される１個または複数個の置換基をさらに保有するシクロアルケニル基を指す。

本明細書で用いられる「シクロアルキル」という用語は、３〜１５個の炭素原子を含有する単環式または多環式のアルキル基を指し、「置換シクロアルキル」は、本明細書で示される１個または複数個の置換基をさらに保有するシクロアルキル基を指す。

本明細書で用いられる「シクロアルキレン」という用語は、３〜１２個の炭素原子を含有する２価環含有基を指し、「置換シクロアルキレン」は、本明細書で示される１個または複数個の置換基をさらに保有するシクロアルキレン基を指す。

本明細書で用いられる「グアニジニル」という用語は、−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ_２）_２を指し、「置換グアニジニル」は、−Ｎ＝Ｃ（ＮＲ_２）_２基［式中、各Ｒは、独立に、本明細書に記載のＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールである］を指す。

本明細書で用いられる「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、すべてのハロゲン、すなわち、クロロ（Ｃｌ）、フルオロ（Ｆ）、ブロモ（Ｂｒ）およびヨード（Ｉ）を指す。

本明細書で用いられる「ヘテロアリール」という用語は、独立にＯ基、Ｓ基、およびＮ基から選択され、また場合によって、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、場合によって、アルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基により単置換または二重置換されたアミノ、アミジノ、場合によって、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、またはヘテロシクリル基により置換された尿素、場合によって、アルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基によりＮ−単置換またはＮ，Ｎ−二重置換されたアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノなど、１〜３個の基または置換基により置換された、１個または複数個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらにより好ましくは１〜２個のヘテロ原子を含有する、５個もしくは６個の環原子を含有する単環式の芳香環構造、または８〜１０個の原子を有する二環式の芳香族基を指す。ヘテロアリールはまた、スルフィニル、スルホニル、および三級環状窒素によるＮ−オキサイドなど、酸化されたＳまたはＮを包含することも意図する。安定的な芳香環が保持されるように、炭素原子または窒素原子が、ヘテロアリール環構造の結合点となる。ヘテロアリール基の例は、フタルイミド、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、キナゾリニル、プリニル、インドリル、キノリニル、ピリミジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、イソキサゾリル、オキサチアジアゾリル、イソチアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアジニル、フラニル、ベンゾフリル、インドリルなどである。置換ヘテロアリールは、安定的な化合物をもたらすのに結合可能な炭素または窒素に結合する置換基を含有する。

本明細書で用いられる「置換ヘテロアリール」は、場合によって、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、ヘテロ環、置換ヘテロ環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドなど、１つまたは複数の官能基により単置換または多重置換されたヘテロ環を指す。

本明細書で用いられる「ヘテロアリールカルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲ^ｑＣ（Ｏ）Ｒ^ｒ基［式中、Ｒ^ｑは、水素もしくは低級アルキルであり、Ｒ^ｒは、場合によって置換アリールである］を指す。

本明細書で用いられる「ヘテロアリールオキシ」という用語は、−ＯＨｅｔ基［式中、Ｈｅｔは、場合によって、置換ヘテロアリール基である］を指す。

本明細書で用いられる「ヘテロアリールスルホニルアミノ」という用語は、−ＮＲ^ｑＳ（Ｏ）_２Ｒ^ｓ基［式中、Ｒ^ｑは、水素もしくは低級アルキルであり、Ｒ^ｓは、場合によって置換ヘテロアリールである］を指す。

本明細書で用いられる「ヘテロ環」という用語は、単環（例えば、モルホリノ環、ピリジル環、またはフリル環）または多重縮合環（例えば、ナフトピリジル環、キノキサリル環、キノリニル環、インドリジニル環、またはベンゾ［ｂ］チエニル環）を有し、炭素原子、および、場合によって、置換されていない、または例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、ヘテロ環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドなどにより置換されていてもよい、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの、少なくとも１個のヘテロ原子を環内に有する、飽和基、不飽和基、または芳香族基を指す。

本明細書で用いられる「置換ヘテロ環」という用語は、安定的な化合物をもたらすのに結合可能な任意の点において結合する、場合によって、置換アルキル、場合によって、置換アルケニル、場合によって、置換アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アミノ、アミド、アミジノ、場合によって、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、またはヘテロシクリル基により置換された尿素、場合によって、アルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基によりＮ−単置換またはＮ，Ｎ−二重置換されたアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アシル、カルボキシル、ヘテロ環、置換ヘテロ環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルホンアミド、およびオキソからなる群から選択される１個または複数個、例えば、１、２、または３個の置換基により置換されたヘテロ環を指す。

本明細書で用いられる「ヒドロカルビル」という用語は、その骨格が炭素および水素だけを含む任意の有機ラジカルを指す。したがって、ヒドロカルビルは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アルケニルアリール、アリールアルキニル、アルキニルアリールなどを包含する。

本明細書で用いられる「置換ヒドロカルビル」という用語は、ヒドロキシ、ヒドロカルビルオキシ、置換ヒドロカルビルオキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、カルボキシ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ_２［式中、各Ｒは、独立に、水素、アルキル、または置換アルキルである］、ニトロ、シアノ、ハロ、−ＳＯ_３Ｍまたは−ＯＳＯ_３Ｍ［式中、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、Ｚｎ、Ｃａ、またはメグルミンである］、グアニジニル、置換グアニジニル、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、置換ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、置換ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ、アシル、アシルオキシ、ヘテロ環、置換ヘテロ環、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、カルバメート基、ジチオカルバメート基、アロイル、置換アロイル、オルガノスルホニル、置換オルガノスルホニル、オルガノスルフィニル、置換アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、置換アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、置換アリールスルホニルアミノ、スルホンアミド基、スルフリルなどから選択される１個または複数個の置換基をさらに保有する、上記で言及されたヒドロカルビル基のうちのいずれかを指し、これには、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−［式中、Ｒは、水素、アルキル、または置換アルキルである］、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ’）−、−Ｃ（＝ＣＲ’_２）−［式中、Ｒ’は、アルキルまたは置換アルキルである］、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−（または−ＮＲ-Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−（または−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−）、−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ-Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ_２−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）Ｒ_２−、または−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）Ｒ_２−［式中、各Ｒは、独立に、水素、アルキル、または置換アルキルである］などのリンカー／スペーサー部分によりヒドロカルビル部分に結合された上記の基のうちの２つ以上が含まれる。

本明細書で用いられる「ヒドロカルビルオキシ」という用語は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｏ−ヒドロカルビル基を指し、「置換ヒドロカルビルオキシ」は、本明細書で示される１個または複数個の置換基をさらに保有するヒドロカルビルオキシ基を指す。

本明細書で用いられる「ヒドロカルビルカルボニル」という用語は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｃ（Ｏ）−ヒドロカルビル基を指し、「置換ヒドロカルビルカルボニル」は、本明細書で示される１個または複数個の置換基をさらに保有するヒドロカルビルカルボニル基を指す。

本明細書で用いられる「ヒドロカルビルオキシカルボニル」という用語は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ヒドロカルビルを指し、「置換ヒドロカルビルオキシカルボニル」は、本明細書で示される１個または複数個の置換基をさらに保有するヒドロカルビルオキシカルボニル基を指す。

本明細書で用いられる「ヒドロカルビルカルボニルオキシ」という用語は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ヒドロカルビル基を指し、「置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ」は、本明細書で示される１個または複数個の置換基をさらに保有するヒドロカルビルカルボニルオキシ基を指す。

本明細書で用いられる「ヒドロカルビレン」という用語は、その骨格が炭素および水素だけを含む任意の２価有機ラジカルを指す。したがって、ヒドロカルビレンは、アルキレン、シクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリールアルキレン、アリールアルケニレン、アルケニルアリーレン、アリールアルキニレン、アルキニルアリーレンなどを包含し、「置換ヒドロカルビレン」は、本明細書で示される１個または複数個の置換基をさらに保有する、上記で言及されたヒドロカルビレン基のうちのいずれかを指す。

本明細書で用いられる「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨ基を指す。

本明細書で用いられる「オルガノスルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）−オルガノ基［式中、オルガノは、アルキル部分、アルコキシ部分、アルキルアミノ部分、およびアリール部分のほか、置換アルキル部分、置換アルコキシ部分、置換アルキルアミノ部分、および置換アリール部分も包含する］を指す。

本明細書で用いられる「オルガノスルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）_２−オルガノ基［式中、オルガノは、アルキル部分、アルコキシ部分、およびアルキルアミノ部分のほか、置換アルキル部分、置換アルコキシ部分、および置換アルキルアミノ部分も包含する］を指す。

本明細書で用いられる「オキソ」という用語は、結合される炭素に二重結合する酸素置換基を指す。

本明細書で用いられる「スルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）−基を指す。

本明細書で用いられる「置換スルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）Ｒ^ｔ基［式中、Ｒ^ｔは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリルアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキル、または置換アラルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「スルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）_２−基を指す。

本明細書で用いられる「置換スルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^ｔ基［式中、Ｒ^ｔは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリルアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキル、または置換アラルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「スルホニルアミノ」という用語は、−ＮＲ^ｑＳ（Ｏ）_２−基［式中、Ｒ^ｑは、水素または低級アルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「置換スルホニルアミノ」という用語は、−ＮＲ^ｑＳ（Ｏ）_２Ｒ^ｕ基［式中、Ｒ^ｑは、水素または低級アルキルであり、Ｒ^ｕは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキル、または置換アラルキルである］を指す。

本明細書で用いられる「スルフリル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）_２−基を指す。

数値との関連において本明細書で用いられる「およそ」および「約」という用語は、示される値の３０％を意味する。

ホットスタートによる活性化前において、核酸ポリメラーゼを介するプライマー伸長が、どのようにして３’置換ｄＮＴＰにより損なわれるのかを示す２つの機構についての概略表示である。 熱誘導されるホットスタートによる活性化の例示的な図式についての概略表示である。「Ｘ」は、置換基を表す。図２Ａは、非置換の活性状態３’−ＯＨｄＮＴＰへの、３’−Ｘ基を含有する３’置換ｄＮＴＰの転換を示す図である。図２Ｂは、非置換の伸長可能プライマーへの、３’−Ｘ置換基を含有する「終結プライマー」の転換を示す図である。 ９５℃のＰＣＲ緩衝液中において、３’置換ｄＴＴＰからｄＴＴＰが形成されるときの動態を示す図である。 非加熱の３’置換ｄＴＴＰ（上図）およびあらかじめ加熱された３’置換ｄＴＴＰ（下図）を伴うプライマー伸長実験における、クレノウＤＮＡポリメラーゼによる、３’−エーテルで置換されたｄＴＴＰの負荷組込みの結果を示す図である。 ラムダ系における複数の３’置換ｄＴＴＰ誘導体によるホットスタートＰＣＲ実験の結果：ゲル電気泳動解析（上図）および非標的産物に対する単位複製配列の比率についてのグラフ表示（下図）を示す図である。 ＨＩＶ ＤＮＡ系における複数の３’置換ｄＴＴＰ誘導体によるホットスタートＰＣＲ実験の結果：ゲル電気泳動解析（上図）および非標的産物に対する単位複製配列の比率についてのグラフ表示（下図）を示す図である。 ホットスタートＰＣＲにより３６５ｂｐのＨＩＶ−１フラグメントを増幅するときの効率に対する、３’−ＴＨＦで置換されたｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの組合せ効果：ゲル電気泳動解析（上図）および非標的産物に対する単位複製配列の比率についてのグラフ表示（下図）を示す図である。 ３’置換ｄＮＴＰをホスホトリエステルプライマーと組み合わせて用いる、１試験管による、好ましいギャップ伸長ライゲーションＰＣＲ（ＧＥＸＬ−ＰＣＲ）法についてのグラフ表示である。

ＰＣＲなどの核酸複製反応は、（ａ）標的核酸に対するオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションの後、（ｂ）核酸ポリメラーゼを介するオリゴヌクレオチドへのヌクレオシド５’−三リン酸（ＮＴＰ）の組込みによる、標的配列の少なくとも１つのコピー、好ましくは複数のコピーの形成を伴う。しかし、複製反応は、手順の有効性および精度、ならびに行われる可能性のある下流の手順に影響を及ぼす、ミスプライミングおよびプライマー二量体形成に起因する望ましくない産物をもたらすことが多い。多くの望ましくない産物は、試料調製時、および複製反応の初期温度の上昇（初期変性ステップ）時において生成される。

本明細書における方法および組成物は、核酸複製のための、改善された方法および組成物を提供する。特定の態様において、方法および組成物は、温度に依存する核酸複製反応におけるＮＴＰの使用を対象とする。他の態様において、核酸複製の過程は、好ましくは、糖の３’位置において、その存在により、望ましくない増幅産物の形成が損なわれる、熱を介して除去可能な修飾基を伴う、１つまたは複数の３’置換ＮＴＰを用いる。

一態様において、本明細書では、３’位置における少なくとも１個の置換基を伴う、１個または複数個の修飾基を包含する、少なくとも１つの修飾ＮＴＰを使用する、核酸複製の方法が提供される。一部の好ましい実施形態において、３’位置における置換基は、複製反応の初期変性ステップにおいて、３’−ＯＨ基に転換されるか、またはＮＴＰから解離する。例えば、初期変性ステップは、逆転写反応では、約４２〜７０℃で１０〜１００分間にわたって生じ、ＰＣＲ反応では、約９４℃、約９５℃、約９６℃、または約１００℃で３〜３０分間にわたって生じる。当業者であれば、本明細書で提供される３’置換ＮＴＰにより実施される複製適用に基づき初期変性ステップが生じる場合のパラメータを決定することができるであろう。

好ましい実施形態において、本明細書における方法および組成物は、３’置換ＮＴＰを提供し、該ＮＴＰは、１つまたは複数の修飾基を保有し、少なくとも１つの修飾は、３’位置にある（すなわち、３’置換ＮＴＰ）。１つの機構によれば、３’置換ＮＴＰは、非基質ＮＴＰであり、核酸ポリメラーゼにより基質として用いることができない（図１Ａ）。したがって、３’置換ＮＴＰは、３’置換基が除去されるか、または他の形で遊離ヒドロキシル基に転換されるまでは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに組み込まれない。第二の機構において、３’置換ＮＴＰは、終結ＮＴＰであり、核酸ポリメラーゼにより組み込まれて、３’位置において修飾ヌクレオシド１単位だけポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させ、終結プライマーをもたらすことができる（図１Ｂ）。したがって、３’置換基が除去されるか、または他の形で遊離ヒドロキシル基に転換されて、伸長可能プライマーが生成されない限り、また、それまでは、終結プライマーのさらなる鎖伸長が防止される。したがって、ＮＴＰの３’置換は、約９５℃で１〜１２０分間にわたることが好ましい、ＰＣＲの初期変性ステップの場合など、高温における複製の初期インキュベーション時間の前には、核酸ポリメラーゼを介するプライマーの伸長を損なう。所望の温度、例えば、高温に達すると、３’置換基を除去するか、または他の形で３’置換基を開環（すなわち、非修飾）の３’−ヒドロキシル基に転換する、熱により誘導される分子内および／または分子間におけるフラグメント化により、終結プライマーは、伸長可能プライマーとなる。開環の３’−ヒドロキシル基（３’−ＯＨ基）を保有する伸長可能プライマーは、核酸ポリメラーゼを介して効率的に伸長させることができる。

３’−ヒドロキシル基への、本明細書で提供される３’置換基の部分的な転換（例えば、全修飾分子の一部からの）または完全な転換（例えば、全修飾分子からの）は、約９５℃で、１〜１２０分以内、好ましくは１〜３０分以内、好ましくは１〜１５分以内、好ましくは１〜１０分以内、より好ましくは１〜５分以内、また、より好ましくは１〜２分以内のインキュベーション後において生じることが好ましい。特定の実施形態において、３’置換ＮＴＰまたは終結プライマーの活性状態への転換は温度に関して生じ、酵素、さらなる化学物質、または重合化反応条件の変更を必要としないが、これらと共に用いることができる。特定の実施形態において、複製反応は、さらなる物質を包含しない。さらなる物質の例には、化合物および酵素が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、複製反応に包含されないさらなる物質は、３’置換基を除去するのに当技術分野で用いられる試薬などの化学開裂試薬（例えば、高温の中性水溶液中におけるパラジウム触媒（例えば、Ｊｕら、米国特許第６，６６４，０７９号；Ｍｅｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、７８巻、３２４８〜３２５２頁（２００６年）およびＢｉ，Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２８巻、２５４２〜２５４３頁（２００６年）を参照されたい））、ｐＨ２をもたらす塩酸（例えば、Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ、ＷＯ９１／０６６７８を参照されたい）、メルカプトエタノールなどの還元剤（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．、米国特許第７，２７９，５６３号を参照されたい）、またはトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（例えば、Ｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第７，４１４，１１６号を参照されたい）である。特定の実施形態において、３’置換基の除去は、ＵＶ照射（例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９２／１０５８７を参照されたい）によらない。一部の実施形態において、複製反応は、３’置換基の化学開裂（例えば、開裂酵素による）を包含しない。他の実施形態において、複製反応は、さらなる物質を包含しない配列決定反応であり、好ましくは、複製反応に包含されないさらなる物質は、開裂剤である。他の一部の実施形態において、複製反応は、段階的合成による配列決定（例えば、標的配列の直線的複製）ではない。

一態様において、本発明に従う３’置換ＮＴＰおよびそれらの誘導体は、式ＩＡ：

［式中、
ｎは、０または１であり、
Ｂは、置換もしくは非置換のプリンもしくはピリミジン、その任意のアザ誘導体もしくはデアザ誘導体、または核酸ポリメラーゼにより認識可能であることが好ましい、任意のＮＴＰ類似体による任意の「ユニバーサル塩基」もしくは「縮重塩基」から選択され；
Ａは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ^１Ｒ^２、およびＮＲ^１からなる群から選択され；
Ｗは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ^１Ｒ^２、およびＮＲ^１からなる群から選択され；
各Ｒ^１および各Ｒ^２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＳｅＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、Ｃ（Ｙ）Ｒ^５、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、１つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各Ｒ^３および各Ｒ^４は、Ｈ、または置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、１つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各Ｒ^５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＳｅＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、Ｃ（Ｙ）Ｒ^３、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、１つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ^１Ｒ^２、およびＮＲ^１からなる群から選択され；
Ｚ^１、Ｚ^４、およびＺ^７は各々、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ^１Ｒ^２、およびＮＲ^１からなる群から独立に選択され；
Ｚ^０およびＺ^６は各々、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ_２、ＣＲ^１Ｒ^２、ＮＲ^１、およびＣ（Ｙ）からなる群から独立に選択され；
Ｚ^３は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ_２、ＣＲ^１Ｒ^２、ＮＲ^１、Ｃ（Ｙ）、３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、およびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択され；
ｎが０のとき、Ｚ^３は、３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、
ｎが１のとき、Ｚ^３は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ_２、ＣＲ^１Ｒ^２、ＮＲ^１、またはＣ（Ｙ）であり；
Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８は各々、Ｈ、Ｆ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＳｅＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、ＮＲ^３ＯＲ^３、ＮＲ^３−ＮＲ^３Ｒ^４、ＣＮ、Ｎ_３、（ＢＨ_３）⁻ Ｍ^＋、およびＣ（Ｙ）Ｒ^５からなる群から独立に選択され；
Ｚ^９は、Ｈ、Ｆ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＳｅＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、ＮＲ^３ＯＲ^３、ＮＲ^３−ＮＲ^３Ｒ^４、ＣＮ、Ｎ_３、（ＢＨ_３）⁻ Ｍ^＋、Ｃ（Ｙ）Ｒ^５、およびリン酸からなる群から選択され；
Ｚ^１０は、Ｏ、Ｓ、およびＳｅからなる群から選択され；
Ｍ^＋は、陽イオンであり；
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５は、各々、Ｒ^１、ＮＲ^３ＯＲ^３、ＮＲ^３−ＮＲ^３Ｒ^４、ＣＮ、Ｎ_３、ＮＯ、ＮＯ_２、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、およびＳＳＲ^３からなる群から独立に選択され；
Ｒは、

からなる群から選択され、
Ｒは、場合によって、式ＩＡで示されるＮＴＰ分子のＸ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^２、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^５、Ｚ^６、Ｚ^７、Ｚ^８、Ｚ^９、Ａ、Ｗ、またはＢ部分に対して、適切な原子または原子群を介して共有結合する可能性があり；
各Ｒ^６は、炭酸を除く無機酸残基またはその誘導体からなる群から独立に選択され、該誘導体には、ハロゲン、スルホン酸、チオスルホン酸、セレノ硫酸、セレノスルホン酸、硫酸エステル、硫酸チオエステル、亜硫酸、スルフィン酸、スルフィンエステル、硝酸、亜硝酸、リン、セレニウム、およびホウ素を含有する酸が含まれうるがこれらに限定されず；
各Ｒ^７、各Ｒ^８、各Ｒ^９、および各Ｒ^１０は、水素、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
該ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも１個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
各Ｘ^６、各Ｘ^７、各Ｘ^８、および各Ｘ^９は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され；
各Ｘ^１０は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ^１１、Ｎ−ＯＲ^１１、およびＣＲ^１１Ｒ^１２からなる群から独立に選択され；
各Ｒ^１１および各Ｒ^１２は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され；
各Ｙ^１は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ^６、Ｎ−ＯＲ^６、およびＣＲ^６Ｒ^７からなる群から独立に選択される］
の化合物を提供する。

式ＩＡの特定の実施形態において、Ｂは、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシル、アミノアリルウラシル、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−メチルグアニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−アミノアリルグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザデニン、２，６−ジアミノプリン、５−ニトロシトシン、５−アミノアリルシトシン、５−（ビオチン−１６）−シトシン、５−（フルオレセイン−１１）−シトシン、４−メチルアミノ−シトシン、２−チオ−５−メチルウラシル、または４−チオ−５−メチルウラシルである。

式ＩＡの好ましい実施形態において、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。

以下に示す通り、式ＩＡの特定の実施形態において、Ｘ^１、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^５およびＺ^８はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＡの特定の実施形態において、ＡはＮＨ、Ｏ、ＣＨ_２、またはＳであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＡの特定の実施形態において、Ｘ^２はＨ、ＯＨ、Ｆ、ＣＨ_３、ＯＣＨ_３、Ｎ_３、ＮＨ_２、またはＮＨＣＨ_３であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＡの特定の実施形態において、Ｘ^５はＨ、ＳＨ、ＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、またはＮＨＣＨ_３であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＡの特定の実施形態において、Ｚ^２はＯＨ、ＳＨ、ＢＨ_３、ＣＨ_３、ＯＣＨ_３、またはＯＣＨ_２ＣＨ_３であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＡの特定の実施形態において、Ｚ^４はＯまたはＳであり；ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＡの特定の実施形態において、Ｚ^９はＳＨ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_３、ＯＣ_６Ｈ_５、ＮＨＣＨ_３、ＮＨ_２、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、またはリン酸基であり；ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８はＯＨである。

以下に示す通り、式の特定の実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

式ＩＡの特定の好ましい実施形態は、以下（上から下へ、左から右へ）の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＳであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−（ｐ−トルエン）スルホネートである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；Ｘ^２はＯ−ＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−（ｐ−トルエン）スルホネートである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；Ｘ^５＝ＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−（ｐ−トルエン）スルホネートである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２はＳＨであり；Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−（ｐ−トルエン）スルホネートである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｚ^４はＳであり；ＲはＯ−（ｐ−トルエン）スルホネートである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８はＯＨであり；Ｚ^９はＳＨであり；ＲはＯ−（ｐ−トルエン）スルホネートである。

式のさらにより好ましい実施形態は、以下の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−（ｐ−トルエン）スルホネートである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−リン酸である。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−硝酸である。

式ＩＡの特定の好ましい実施形態は、以下（左から右へ、上から下へ）の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＳであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロフラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；Ｘ^２はＯ−ＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロフラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；Ｘ^５＝ＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロフラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２はＳＨであり；Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロフラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｚ^４はＳであり；ＲはＯ−テトラヒドロフラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８はＯＨであり；Ｚ^９はＳＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロフラニルである。

式ＩＡの特定の好ましい実施形態は、以下（左から右へ、上から下へ）の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−［４−メトキシ］−テトラヒドロピラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロピラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロフラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−［４−メトキシ］−テトラヒドロチオピラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロチオピラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−［５−メチル］−テトラヒドロフラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−［２−メチル，４−メトキシ］−テトラヒドロピラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−［５−メチル］−テトラヒドロピラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロチオフラニルである。

式ＩＡのさらにより好ましい実施形態は、以下の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−［４−メトキシ］−テトラヒドロピラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロピラニルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−テトラヒドロフラニルである。

式ＩＡの特定の好ましい実施形態は、以下（左から右へ、上から下へ）の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＳであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−フェノキシアセチルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；Ｘ^２はＯ−ＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−フェノキシアセチルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；Ｘ^５はＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−フェノキシアセチルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｚ^２はＳＨであり；ＲはＯ−フェノキシアセチルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^４はＳであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−フェノキシアセチルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８はＯＨであり；Ｚ^９はＳＨであり；ＲはＯ−フェノキシアセチルである。

式ＩＡのさらにより好ましい実施形態は、以下の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−フェノキシアセチルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−メトキシアセチルである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−アセチルである。

式ＩＡの特定の好ましい実施形態は、以下（上から下へ、左から右へ）の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＳであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ_３である。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；Ｘ^２はＯ−ＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ_３である。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；Ｘ^５はＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ_３である。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２はＳＨであり；Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ_３である。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^４はＳであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ_３である。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８はＯＨであり；Ｚ^９はＳＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ_３である。

式ＩＡのさらにより好ましい実施形態は、以下の通りである。式ＩＡの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｏ）−ＯＣＨ_３である。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮである。式ＩＡの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、およびＸ^５はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；ＲはＯ−Ｃ（Ｓ）−ＯＣＨ_３である。

式ＩＡの特定の実施形態において、Ｚ^４、Ｚ^５、Ｚ^６、Ｚ^７、Ｚ^８、Ｚ^９、Ｐ^２、およびＰ^３が存在しないように、ｎは０であり；Ｚ^３は３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、これにより、「終結プライマー」が提供される。

一態様において、本発明に従う３’置換ＮＴＰおよびそれらの誘導体は、式ＩＢ：

［式中、
ｎは、０または１であり、
Ｂは、置換もしくは非置換のプリンもしくはピリミジン、その任意のアザ誘導体もしくはデアザ誘導体、または核酸ポリメラーゼにより認識可能であることが好ましい、任意のＮＴＰ類似体による任意の「ユニバーサル塩基」もしくは「縮重塩基」から選択され；
Ａは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ^１Ｒ^２、およびＮＲ^１からなる群から選択され；
Ｗは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ^１Ｒ^２、およびＮＲ^１からなる群から選択され；
各Ｒ^１および各Ｒ^２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、Ｃ（Ｙ）Ｒ^５、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、１つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ^１Ｒ^２、およびＮＲ^１からなる群から独立に選択され；
各Ｒ^３および各Ｒ^４は、Ｈ、または置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、１つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各Ｒ^５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、ならびに置換または非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、１つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
Ｚ^１、Ｚ^４、およびＺ^７は各々、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ^１Ｒ^２、およびＮＲ^１からなる群から独立に選択され；
Ｚ^０およびＺ^６は各々、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ_２、ＣＲ^１Ｒ^２、ＮＲ^１、およびＣ（Ｙ）からなる群から独立に選択され；
Ｚ^３は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ_２、ＣＲ^１Ｒ^２、ＮＲ^１、Ｃ（Ｙ）、３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、およびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択され；
ｎが０のとき、Ｚ^３は３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、
ｎが１のとき、Ｚ^３は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ_２、ＣＲ^１Ｒ^２、ＮＲ^１、またはＣ（Ｙ）であり；
Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８は各々、Ｈ、Ｆ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＳｅＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、ＮＲ^３ＯＲ^３、ＮＲ^３−ＮＲ^３Ｒ^４、ＣＮ、Ｎ_３、（ＢＨ_３）⁻ Ｍ^＋、およびＣ（Ｙ）Ｒ^５からなる群から独立に選択され；
Ｚ^９は、Ｈ、Ｆ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＳｅＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、ＮＲ^３ＯＲ^３、ＮＲ^３−ＮＲ^３Ｒ^４、ＣＮ、Ｎ_３、（ＢＨ_３）⁻ Ｍ^＋、Ｃ（Ｙ）、およびリン酸からなる群から選択され；
Ｍ^＋は、陽イオンであり；
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４は各々、Ｒ^１、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ^３、ＳＲ^３、ＳｅＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、ＮＲ^３ＯＲ^３、ＮＲ^３−ＮＲ^３Ｒ^４、ＣＮ、Ｎ_３、Ｃ（Ｙ）Ｒ^５、ＮＯ_２、ＣＮ、および ＳＳＲ^３からなる群から独立に選択され；
Ｘ^５は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ^６、Ｎ−ＯＲ^６、およびＣＲ^６Ｒ^７からなる群から選択され；
Ｙ^１は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ^６、Ｎ−ＯＲ^６、ＣＲ^６Ｒ^７、およびＣ（Ｙ）からなる群から選択され；
各Ｒ^６および各Ｒ^７は、水素、また、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
該ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも１個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｘ^５およびＹ^１は各々、場合によって、式ＩＢで示されるＮＴＰ分子のＸ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^２、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^５、Ｚ^６、Ｚ^７、Ｚ^８、Ｚ^９、Ａ、Ｗ、またはＢ部分に対して、適切な原子または原子群を介して共有結合する可能性がある］
の化合物を提供する。

式ＩＢの特定の実施形態において、Ｂは、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシル、アミノアリルウラシル、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−メチルグアニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−アミノアリルグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザデニン、２，６−ジアミノプリン、５−ニトロシトシン、５−アミノアリルシトシン、５−（ビオチン−１６）−シトシン、５−（フルオレセイン−１１）−シトシン、４−メチルアミノ−シトシン、および２−チオ−５−メチルウラシル、または４−チオ−５−メチルウラシルである。

式ＩＢの好ましい実施形態において、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。

以下に示す通り、式ＩＢの特定の実施形態において、ＡはＮＨ、Ｏ、ＣＨ_２、またはＳであり；Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^５およびＺ^８はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＢの特定の実施形態において、ＡはＮＨ、Ｏ、ＣＨ_２、またはＳであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＢの特定の実施形態において、Ｘ^４はＨ、ＳＨ、ＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、またはＮＨＣＨ_３であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３はＨであり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＢの特定の実施形態において、Ｚ^２はＯＨ、ＳＨ、ＢＨ_３、ＣＨ_３、ＯＣＨ_３、またはＯＣＨ_２ＣＨ_３であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＢの特定の実施形態において、Ｚ^４はＯまたはＳであり；ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＢの特定の実施形態において、Ｚ^９はＳＨ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣＨ_３、ＮＨ_２、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、またはリン酸基であり；ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８はＯＨである。

以下に示す通り、式ＩＢの特定の実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨである。

式ＩＢの特定の好ましい実施形態は、以下（左から右へ、上から下へ）の通りである。式ＩＢの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；ＡはＳであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｙ^１はＣ＝Ｓである。式ＩＢの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３はＨであり；Ｘ^４はＣＨ_３であり；ＷはＣＨ_２であり；Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｙ^１はＣ＝Ｓである。式ＩＢの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２はＳＨであり；Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｙ^１はＣ＝Ｓである。式ＩＢの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｚ^４はＳＨであり；Ｙ^１はＣ＝Ｓである。式ＩＢの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；ＡはＯであり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、およびＺ^８はＯＨであり；Ｚ^９はＳＨであり；Ｙ^１はＣ＝Ｓである。

式ＩＢのさらにより好ましい実施形態は、以下の通りである。式ＩＢの好ましい一実施形態において、ｎは１であり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ａ、Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｙ^１はＣ＝Ｏである。式ＩＢの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；ＷはＣＨ_２であり；Ａ、Ｘ^５、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｙ^１はＣ＝Ｓである。式ＩＢの別の好ましい実施形態において、ｎは１であり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４はＨであり；Ｘ^５はＳであり；ＷはＣＨ_２であり；Ａ、Ｚ^０、Ｚ^１、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^６、およびＺ^７はＯであり；Ｚ^２、Ｚ^５、Ｚ^８、およびＺ^９はＯＨであり；Ｙ^１はＣ＝Ｏである。

式ＩＢの特定の実施形態において、Ｚ^４、Ｚ^５、Ｚ^６、Ｚ^７、Ｚ^８、Ｚ^９、Ｐ^２、およびＰ^３が存在しないように、ｎは０であり；Ｚ^３は３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、これにより、「終結プライマー」が提供される。

一態様において、本明細書における方法および組成物は、核酸を複製するための３’置換ＮＴＰを提供する。一部の実施形態において、３’置換ＮＴＰは、いずれの位置においても他の修飾基を有さない場合がある。他の実施形態において、３’置換ＮＴＰは、塩基、三リン酸鎖、糖、またはこれらの組合せにおける修飾など、さらなる修飾を含有する。３’置換ＮＴＰは、本明細書に記載の式ＩＡ〜ＩＢの化学式を有しうる。好ましい実施形態において、３’置換ＮＴＰは、３’置換されたｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＵＴＰである。

別の態様において、本明細書では、本明細書でさらに説明される式ＩＡ〜ＩＢで示される化学構造を有する、３’置換ＮＴＰを合成する方法が提供される。３’置換基を含めた修飾基は、既存の合成的方法または酵素的方法を用いることにより、ＮＴＰに組み込むことができる。本明細書で提供される方法および組成物による３’置換ＮＴＰは、当技術分野でよく知られる任意の方法により合成することができる。修飾ＮＴＰまたは非修飾ＮＴＰを合成する各種の方法についての包括的な概観が公表されている（Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．およびＣｏｏｋ，Ｄ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、１００巻、２０４７〜２０５９頁（２０００年）；「Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｖａｇｈｅｆｉ，Ｍ．編、ボカラトン、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ社（２００５年））。３’置換ＮＴＰを合成および精製した後では、複数の異なる手順を用いて、構造および純度の点におけるＮＴＰの許容可能性を決定することができる。このような手順の例は、核磁気共鳴分光分析法、質量分析法、蛍光分光分析法、紫外分光分析法、高速液体クロマトグラフィー法である。これらの手順は、当業者によく知られている。当技術分野において、分離、精製、および分析のために用いられる現行の方法は、本明細書で提供される方法および組成物による３’置換ＮＴＰにも同様に適用可能である。

本明細書で提供される方法および組成物の目的を達成する任意の３’置換基を用いることができる。３’置換基は、３’置換ＮＴＰが用いられる複製反応条件下において、解離するか、除去可能であるか、または他の形で、開環のヒドロキシル基に転換される３’置換基であるものとする。他方、３’置換基は、周囲温度ではあまり急速に解離されないか、または開環の３’−ＯＨ基に転換されないものとする。３’置換基の喪失は、本明細書で提供される方法および組成物の利益を達成する使用者により制御可能であるものとする。ＮＴＰの３’位置における置換の種類および程度は一般に、ＮＴＰまたは終結プライマーの３’置換基の解離を制御するための上記のパラメータを達成する目的により経験的に決定される。一部の実施形態において、３’置換基から開環の３’−ＯＨ基への転換は部分的であり（例えば、３’置換基が、修飾（例えば、３’置換）分子の部分から解離する場合）、例えば、修飾ＮＴＰ（例えば、３’置換基を伴うＮＴＰ）の少なくとも１０％；または少なくとも２０％；または少なくとも３０％；または少なくとも４０％；または少なくとも５０％；または少なくとも６０％；または少なくとも７０％；または少なくとも８０％；または少なくとも９０％；または少なくとも９５％；または少なくとも９８％；または少なくとも９９％が、非修飾ＮＴＰ（例えば、３’−ＯＨを伴うＮＴＰ）に転換される。一部の実施形態において、３’置換基の転換は、約０〜１０５℃；または約０〜１００℃；または約２０〜１００℃；または約３７〜１００℃；または約５０〜１００℃；または約７０〜１００℃；または約４５℃；または約５０℃；または約５５℃；または約６０℃；または約６５℃；または約７０℃；または約７５℃；または約 ８０℃；または約９０℃；または約９５℃；または約９６℃；または約９７℃；または約９８℃；または約９９℃；または約１００℃の温度で生じる。一部の実施形態では、２つの異なる種類の３’置換ＮＴＰが用いられ、２つの異なる種類の３’置換ＮＴＰは、ほぼ同じ温度で転換される場合もあり、異なる温度で転換される場合もある。好ましい実施形態では、第１の３’置換ＮＴＰが、ＰＣＲ反応の初期変性温度（約９５℃）で転換され、第２の３’置換ＮＴＰが、逆転写酵素反応の初期変性温度（約５０℃）で転換される。それらの転換特性に基づき３’置換基を選択することができれば、使用者には、同じ反応容器内において、異なる複製反応のための試薬を組み合わせることが可能となる（例えば、使用者は、各反応につき１つずつのプレミックスを調製する標準的な慣行の代わりに、２つの異なる反応に単一のプレミックスを調製しさえすればよいことになろう）。したがって、異なる各複製反応に対して選択的な３’置換ＮＴＰを用いることにより、単一の反応容器内において、複製反応の各種組合せを実施することができる。

別の実施形態において、本明細書で提供される方法および組成物による３’置換ＮＴＰは、３’置換基、または、１つもしくは複数の修飾基を含めたＮＴＰ分子の他の任意の部分においてキラル原子を含有しうる。対掌性は、３’置換ＮＴＰの個々のジアステレオマーまたは該ジアステレオマーの混合物をもたらしうる。３’置換ＮＴＰは、ラセミ混合物またはジアステレオマー混合物の場合もあり、７０％、または８０％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％対掌的に純粋な化合物の場合もある。

一部の複製反応では、複製反応におけるすべてのＮＴＰ分子が、３’置換基を含有するわけではない。不活性状態／終結状態の、または３’置換ＮＴＰ、および３’置換されない活性ＮＴＰ両方の混合物であっても、３’置換ＮＴＰを全く用いない場合と比較して、混合物集団内における複製の有効性および特異性が改善されることが好ましい。初期変性温度でのインキュベーションの前において、３’置換ＮＴＰは、全ＮＴＰ分子の少なくとも２５％、好ましくは全ＮＴＰ分子の少なくとも５０％、好ましくは全ＮＴＰ分子の少なくとも７５％、またより好ましくは全ＮＴＰ分子の９０％、好ましくは全ＮＴＰ分子の少なくとも９５％、好ましくは全ＮＴＰ分子の少なくとも９８％、より好ましくは全ＮＴＰ分子の少なくとも９９％、またより好ましくは全ＮＴＰ分子の１００％を占めることが好ましい。別の実施形態では、２、３、４種、またはすべての種類のＮＴＰが、３’置換ＮＴＰでありうる。

一実施形態において、複製反応におけるＮＴＰのうち、３’置換体は１種だけであり、他のすべての種類のＮＴＰは通常のＮＴＰ分子である。例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰが複製反応におけるＮＴＰの種類である場合、ｄＡＴＰだけが３’置換体であり、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰは通常のＮＴＰ分子である。別の実施形態では、２種以上のＮＴＰが３’置換体である。別の実施形態では、３種以上のＮＴＰが３’置換体である。別の実施形態では、４種以上のＮＴＰが３’置換体である。

別の実施形態では、複数種の３’置換ＮＴＰが、複製反応において存在しうる。複製反応では、３’置換ＮＴＰの混合物を用いることができる。一実施形態では、非基質ＮＴＰおよび終結ＮＴＰの混合物が、同じ複製反応において存在しうる。別の実施形態では、置換基の異なる３’置換ＮＴＰの混合物が、同じ複製反応において存在しうる。

一態様において、本明細書で提供される方法および組成物は、熱を介して除去可能であるか、または開環の３’−ヒドロキシル基に転換可能な３’置換基により化学修飾されたヌクレオシドを提供する。このような修飾ヌクレオシドは、現行の合成法に適合する方法により、対応するＮＴＰに転換することができる。任意のヌクレオシドに対応する３’置換ＮＴＰを調製することができる。これに対し、これもまた熱不安定性基を表す（しかし、３’置換基ではない）グリオキシル修飾（Ｂｏｎｎｅｒら、米国特許出願第２００３０１６２１９９号）を添加しうるのは、ＮＴＰを含有するグアニンのヘテロ環塩基だけである。したがって、熱不安定性のグリオキシル修飾が１種類のＮＴＰに制約されるのに対し、本明細書で提供される方法および組成物では、任意またはすべてのＮＴＰが熱不安定性の３’置換基を有しうる。

さらに別の態様において、本明細書では、本明細書に記載の３’置換ＮＴＰを用いる、鋳型に依存する核酸の合成方法が提供される。

好熱菌（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼのほか、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含めた、他のＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼも、本明細書で提供される方法および組成物と共に用いることができる。一部の実施形態において、複製反応は、核酸ポリメラーゼと、第２の核酸ポリメラーゼ、リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ）、シンセターゼ、ヌクレアーゼ（例えば、核酸制限酵素、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ修復タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、スルフリラーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ヘリカーゼ、および当技術分野で知られる他の酵素を含めた、１つまたは複数のさらなる酵素とを包含する。

本明細書で提供される方法および組成物の一態様は、現在用いられる複製手順または将来において開発されうる複製手順に適合する温度の熱を介して除去可能な３’置換基により３’置換された非基質ＮＴＰを提供する。３’置換基の存在は、核酸ポリメラーゼを介する３’置換ＮＴＰの組込みを損なう場合もあり、核酸ポリメラーゼによる３’置換ＮＴＰの認識を破壊する場合もあり、ポリメラーゼを介するプライマーの伸長を他の形で防止する場合もある（図１Ａ）。ＮＴＰの３’置換基を３’−ＯＨ基に転換し、該ＮＴＰを活性状態に変換する、最適のホットスタート温度に複製反応が達するまで、核酸ポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドプライマーが伸長することはない。その活性状態への３’置換ＮＴＰの転換は、ＰＣＲの初期変性ステップと符合することが好ましい。「ホットスタート」による、核酸複製反応のこの活性化は、低温におけるプライマー伸長を防止することにより、望ましくない複製産物の形成を著明に低下させる。

本明細書で提供される方法および組成物の別の態様は、現在用いられる複製手順または将来において開発されうる複製手順に適合する温度の熱を介して除去可能であるか、または開環のヒドロキシル基に転換可能な３’置換基により３’置換された終結ＮＴＰを提供する。３’置換された終結ＮＴＰは、核酸ポリメラーゼによりプライマーの３’端に組み込まれ、終結プライマーを生成させる。終結プライマーは、終結状態にあり、核酸ポリメラーゼを介して伸長可能ではなく、これにより、望ましくない複製産物が形成されることを防止する。複製反応が、最適な高厳密性によるホットスタート温度に達すると、３’置換基が除去されるか、または開環の３’−ＯＨ基に転換される結果、終結プライマーは、核酸の複製に適合的な伸長可能プライマーに転換され、これをさらに伸長させることができる（図１Ｂ）。

緩衝液中室温で安定的であることに加え、本明細書で開示される３’置換ＮＴＰは、複製反応混合物のクロマトグラフィー、沈殿、長期にわたる保存、および調製など、ＮＴＰの合成過程、分離過程、および精製過程の条件下においても安定的であることが好ましい。

ここで、以下の非限定的な実施例を参照することにより、本明細書で提供される方法および組成物をさらに詳細に説明する。

３’置換された２’−デオキシリボヌクレオシドの調製
ｄＴＴＰの３’置換体として、６個の基：テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）基、テトラヒドロフラニル（ＴＨＦ）基、アセチル（Ａｃ）基、メトキシアセチル（ＣＨ_３ＯＡｃ）基、およびフェノキシアセチル（ＰｈＯＡｃ）基を選択した。

以下の通りの一般的な合成経路に従い、チミジンの３’−エーテル誘導体を合成した。まず、チミジンを、ピリジン中１．２等量の無水酢酸と反応させた。結果として得られる、３’−Ｏ−アセチルで置換されたチミジン、５’−Ｏ−アセチルで置換されたチミジン、および３’，５’−Ｏ−ビス−アセチルで置換されたチミジンの混合物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて個々の化合物に分離した。単離された５’−Ｏ−アセチルチミジンを、ジオキサン中におけるｐ−トルエンスルホン酸の存在下において、２，３−ジヒドロフラン、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン、５，６−ジヒドロ−４−メトキシ−２Ｈ−ピランと５時間にわたり反応させた。その後、メタノール性アンモニアにより処理して５’−Ｏ−アセチル保護基を除去し、チミジンの３’−ＴＨＦ誘導体、３’−ＴＨＰ誘導体、または３’−ＭＴＨＰ誘導体をそれぞれ作製した。３’−ＴＨＦ−ｄＴの合成と同様の手法を用いて、Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン、およびＮ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジンから出発して３’−ＴＨＦで置換されたデオキシリボヌクレオシドであるｄＡおよびｄＣを調製し、上記のヌクレオシドを、ピリジン中における塩化ベンゾイルと反応させることにより、必要とされる５’−位置の保護を達成した。３’−ＴＨＦ−ｄＴを合成するための、上記で概括した同じ一般的な合成経路を用いて、市販される５’−レブリニル−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシンから出発して、３’−ＴＨＦ−２’−デオキシグアノシンを合成した。

以下の通りの別の一般的経路に従い、チミジンの３’−Ｏ−メトキシアセチルエステルおよび３’−Ｏ−フェノキシアセチルエステルを調製した。５’−ＤＭＴ−チミジンを、ピリジン中における塩化メトキシアセチルまたはフェノキシ酢酸無水物により処理した後、酸によりＤＭＴ基を除去して、対応するチミジンの３’−エステル誘導体を形成させた。上記で具体的に述べた通り、シリカゲルクロマトグラフィーにより３’−Ｏ−アセチルチミジンを単離した。

全体では、３’置換された２’−デオキシヌクレオシドが、全収量の１２〜６０％で単離された。

３’置換された２’−デオキシリボヌクレオシドの５’−三リン酸化
以下の通り、ルートヴィッヒ−エクスタイン手順（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５４巻、６３１〜６３５頁（１９８９年））に従い、３’−エーテルおよび３’−エステルで置換された２’−デオキシヌクレオシドから、３’置換された２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸を調製した。

３’置換された２’−デオキシヌクレオシドを、ジオキサン−ピリジン溶液中１．１等量の２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンと反応させた後、１．６等量のピロリン酸トリブチルアンモニウムと反応させ、その後、ヨウ素によるＰ（ＩＩＩ）からＰ（Ｖ）への酸化を行い、最後に、含水重炭酸トリエチルアンモニウムにより処理した。結果として得られる３’置換ｄＮＴＰを、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを組み合わせて単離および精製し、ナトリウム塩またはカリウム塩としての、純度９８〜９９％の３’置換ｄＮＴＰを得た。合成された化合物の構造は、プロトンＮＭＲおよびリンＮＭＲならびに質量分析により確認された。

３’置換基を含有するｄＴＴＰが対応する天然ｄＴＴＰに転換される場合の反応速度
２０℃および９５℃のＰＣＲ緩衝液（２５℃でｐＨ８．４、表１）中において、対応する非修飾ｄＴＴＰへの３’置換ｄＴＴＰの転換について調べた。インキュベートした混合物を、逆相ＨＰＬＣおよび陰イオン交換ＨＰＬＣを介して解析することにより、反応をモニタリングした。９５℃における、結果として得られるｄＴＴＰの形成対時間を、図３に示す。９５℃でのインキュベーションの２、１０、および２０分後における３’置換ｄＴＴＰから形成されたｄＴＴＰの推定濃度を、表１に示す。

室温（約２０℃）のＰＣＲ緩衝液中では、３’−エーテルで置換されたすべてのｄＴＴＰが、少なくとも数日間にわたり安定的であった。室温でＰＣＲ緩衝液中６０分以内のインキュベーションにおいて、ｄＴＴＰの３’−エステル誘導体のうち、ｄＴＴＰの３’−Ｏ［ＣＨ_３ＯＡｃ］誘導体、および３’−Ｏ［ＰｈＯＡｃ］誘導体が、それぞれ４％および１０％の開裂を示したのに対し、ｄＴＴＰの３’−Ｏ−［Ａｃ］誘導体の場合、２４時間のインキュベーション後において検出された３’−アセチル基の開裂は、６％に過ぎなかった。

プライマー伸長実験における、好熱菌（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびクレノウＤＮＡポリメラーゼを介する３’置換ｄＴＴＰの組込み
プレアニールされたプライマー／鋳型二重体を、室温においてプライマー伸長させるクレノウ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼの能力を、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５単位の酵素、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ中、また、以下の３’置換ｄＴＴＰ誘導体：３’−ＴＨＰ−ｄＴＴＰ、３’−ＭＴＨＰ−ｄＴＴＰ、または３’−ＴＨＦ−ｄＴＴＰのうちの１つの存在下において評価した（図４（上図））。組込み実験および伸長実験では、ｄＴＴＰの３’置換誘導体（３’−ＴＨＰ−ｄＴＴＰ、３’−ＭＴＨＰ-ｄＴＴＰ、および３’−ＴＨＦ−ｄＴＴＰ）のうちのいずれもが、プライマー内には組み込まれない（「ｄＴＴＰなし」の陰性対照と符合する）ことが見出された。３’置換されたｄＴＴＰ誘導体が、クレノウ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼの基質ではなかったというこれらの知見は、図１Ａで提起される機構と符合する。さらなる対照として、本発明者らは、９５℃で４０分間にわたるプレヒーティングステップ後において、上記の３’置換されたｄＴＴＰ類似体のすべてが酵素の基質となり、非修飾ｄＴＴＰと同様に挙動することも見出した（図４（下図））。これにより、プレヒーティングステップは、３’置換ｄＴＴＰを、組込み反応および伸長反応に適するｄＴＴＰに転換することが確認される。

３’−Ｏ−アセチル−ｄＴＴＰにより、経時的な組込み／伸長実験を実施したところ、３’−Ｏ−アセチル−ｄＴＴＰは、クレノウ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼの基質はないことが示されたが、これは、公表データ（Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２巻、４２５９〜４２６７頁（１９９４年））と符合する。反応速度実験（実施例３）により、ｄＴＴＰの３’−Ｏ−メトキシアセチル誘導体および３’−Ｏ−フェノキシアセチル誘導体は、伸長反応時において安定的でないことが示されたため、これらの３’置換基は被験対象としなかった。

室温で２５単位の酵素、および３’−ＴＨＦ−ｄＴＴＰまたは３’−Ａｃ−ｄＴＴＰを用い、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼについて伸長実験を反復した。いずれの３’置換されたｄＴＴＰ誘導体もＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの基質ではなかったので、結果は、クレノウ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られた結果と同様であった。

プライマー伸長実験における３’−ＴＨＦ−ｄＣＴＰのパフォーマンスもまた評価された。この類似体についてもたらされた結果が、３’−ＴＨＦ−ｄＴＴＰの結果と同様であったことは、３’置換されたｄＡＴＰ誘導体およびｄＧＴＰ誘導体が、クレノウ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに適する基質ではないことを示唆する。

３’置換ｄＴＴＰの存在下にあるＰＣＲ時のＤＮＡ鋳型不在下における非特異的増幅産物の形成
ＰＣＲパフォーマンスに対する３’置換ＮＴＰの効果を探索するため、鋳型不在下において、非特異的増幅産物の形成を促進するＰＣＲ条件を用いて実験を実施した。ＨＩＶ−１ ｔａｔ遺伝子の３６５ｂｐフラグメント、またはラムダＤＮＡの１．９ｋｂフラグメントを標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを用いた（表２）。いずれの系も、ＰＣＲ時において、プライマー二量体を含めた、高レベルの非特異的増幅産物をもたらすことが知られている。増幅反応は、鋳型の不在下において実施された。各ＰＣＲ混合物（５０μＬ）は、順方向および逆方向のＨＩＶ−１プライマー（０．５μＭずつ）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（２００μＭずつ）、Ｔａｑポリメラーゼ（０．５単位）、１倍濃度のＰＣＲ緩衝液（表１に対するキャプションを参照されたい）およびヒトゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）を含有した。ｄＴＴＰの異なる３’誘導体を、２００μＭの最終濃度で、各反応物に添加した。ＰＣＲのサイクリングパラメータは、２分間にわたる９５℃の初期ステップの後、４０サイクルの［４０秒間にわたる９５℃；３０秒間にわたる５６℃；２分間にわたる７２℃］に続き、７分間にわたる７２℃を包含した。アガロースゲル電気泳動により、ＨＩＶ ＤＮＡ系中における約５０塩基対のフラグメント、また、ラムダＤＮＡ系における約５００塩基対のフラグメントとして、プライマー二量体を含めた非特異的増幅産物が検出された（図５（レーン５および６）および６（レーン６〜９））。

３’置換されたｄＴＴＰ誘導体（アセチル誘導体、フェノキシアセチル誘導体、テトラヒドロピラニル誘導体、メトキシテトラヒドロピラニル誘導体、およびテトラヒドロフラニル誘導体）を、上述の増幅系において調べた。全体として、アガロースゲル電気泳動データ（図５および６）の解析により、鋳型の不在下において３’置換ｄＴＴＰを天然ｄＴＴＰの代わりに用いた場合、ＰＣＲにおける非特異的増幅産物レベルが数倍低下することが明らかとなった。３’置換ｄＴＴＰは、プライマー二量体を含めた非特異的増幅産物の蓄積を低下させた。

３’置換ｄＮＴＰの存在下にあるＰＣＲ時における、ＤＮＡ鋳型の存在下での非特異的増幅産物の形成
ラムダＤＮＡ系およびＨＩＶ−１ＤＮＡ系（表２）には、鋳型の存在下において、プライマー二量体を含めた非特異的な増幅産物が容易に形成されるＰＣＲ条件が用いられた。これらの条件では、濃度１μＭの順方向および逆方向両方のオリゴヌクレオチドプライマー、１０コピーのＨＩＶ−１ ＤＮＡ鋳型または１０，０００コピーのラムダＤＮＡ鋳型、０．２ｍＭずつのｄＮＴＰまたは３’置換ｄＮＴＰ、および２．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２が用いられた。各混合物は、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを含有した。熱サイクリングパラメータは、以下：２分間にわたる９５℃の後、４０サイクルの［４０秒間にわたる９５℃；３０秒間にわたる５６℃；２分間にわたる７２℃］に続き、７分間にわたる７２℃の通りであった。アガロースゲル電気泳動により、反応を解析した（図５および６）。

すべての場合において、１つの３’置換されたｄＴＴＰ誘導体による天然ｄＴＴＰの置換は、４つの天然ｄＮＴＰすべてを用いた対照のＰＣＲ反応と比較して、ＰＣＲのパフォーマンスを改善した（図５のレーン４および１〜３、ならびに図６のレーン１および３〜５を比較されたい）。ラムダ鋳型系およびＨＩＶ−１鋳型系の両方において、分析は、プライマー二量体を含めた非特異的増幅産物の量の低下を示しただけでなく、単位複製配列形成の対応する上昇も示した。ｄＴＴＰの３’−ＴＨＦ誘導体および３’−ＰｈＯＡｃ誘導体により、プライマー二量体を含めた非特異的産物に対する単位複製配列の比率がｄＴＴＰと比較して３〜８倍改善された（図５および６）のに対し、ｄＴＴＰの３’−ＴＨＦ誘導体および３’−Ａｃ誘導体では、全体的なＰＣＲパフォーマンスは、天然ｄＴＴＰによる場合ほど良好ではなかった（示さない）。

１つ、２つ、３つ、または４つの３’−ＴＨＦ−ｄＮＴＰ（３’−ＴＨＦ−ｄＡＴＰ、３’−ｄＧＴＰ、３’−ＴＨＦ−ｄＣＴＰ、および３’−ＴＨＦ−ｄＴＴＰの群に由来する）による置換のすべての順列を、それらの天然対応物について、また、プライマー二量体形成の低減に対して結果としてもたらされる効果について検証した。一般に、３’−ＴＨＦ ｄＮＴＰによるその天然ｄＮＴＰの任意の単一の置換は、ＰＣＲパフォーマンスを改善することが判明した。したがって、３’−ＴＨＦ−ｄＡＴＰ誘導体の場合、両方の非特異的増幅産物の大幅な減少、および特異的な単位複製配列形成の上昇が観察された（図７）。２つ以上のｄＮＴＰの３’−ＴＨＦ誘導体による天然ｄＮＴＰの置換の組合せは、ＰＣＲパフォーマンスをさらに改善した。このようにして、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰに対する置換としての、３’−ＴＨＦ−ｄＴＴＰおよび３’−ＴＨＦ−ｄＡＴＰの組合せは、ＨＩＶ−１系における非特異的増幅産物をほぼ完全に消失させた（約１０倍の改善、図７）。全体として、ＰＣＲ混合物中における複数種の３’置換ｄＮＴＰの使用と、単位複製配列作製の効率および特異性との間には強い相関関係が存在した。

３’置換ｄＮＴＰによるリアルタイムの「ホットスタート」ＰＣＲ
リアルタイムのＰＣＲ増幅における３’−ＴＨＦ ｄＮＴＰのパフォーマンスを、病原体検出のための原型的実験として、ヒトゲノムＤＮＡの存在下におけるモデルであるＨＩＶ−１系において検証した。特に、３通りに置換されたｄＮＴＰのセット（３’−ＴＨＦ−ｄＡＴＰ、３’−ＴＨＦ−ｄＣＴＰ、および３’−ＴＨＦ−ｄＴＴＰ、ならびに非修飾ｄＧＴＰ）のパフォーマンスを、４つの非修飾ｄＮＴＰすべてを含有するセットと比較した。単位複製配列の蓄積を反映するＳ字型の増幅プロットを検討したところ、３’−ＴＨＦ ｄＮＴＰのデータセットの曲線の形は、非修飾の天然ｄＮＴＰの対応する曲線よりはるかに急であることが判明した。曲線の形は、ＰＣＲ増幅の効率が、３’−ＴＨＦ ｄＮＴＰの存在下において、天然ｄＮＴＰと比較してより良好であることの指標である（Ｒａｍａｋｅｒｓ Ｃ、Ｒｕｉｊｔｅｒ ＪＭ、Ｄｅｐｒｅｚ ＲＨ、およびＭｏｏｒｍａｎ ＡＦ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．、３３９巻、６２〜６頁（２００３年））。さらに、鋳型コピーの投入数と、Ｃｔ値との間に良好な相関が存在すること（リアルタイムの実験において、３’置換ｄＮＴＰを用いて信頼できるデータを発生させうることの指標）が判明した。

ＳＮＰ検出アッセイに適用される「ホットスタート」による活性化法
疾患の感受性および／または薬剤の有効性に相関する遺伝子多型の同定は、診断法および治療剤開発の一助となるであろう。一塩基多型（ＳＮＰ）を発見し、遺伝子型決定を行うための多くの手法が開発されている（例えば、Ｃｏｚｚａ，Ａ．ら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００７年、８巻、１０頁；Ｋｗｏｋ，Ｐ．Ｙ．、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、２００１年、２巻、２３５〜５８頁を参照されたい）。ＳＮＰを発見する一部の市販化された手法には、Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ社によるＩｎｖａｄｅｒ−Ｃｌｅａｖａｓｅ法（Ａｌｌａｗｉ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００６年、４４巻、９号、３４４３〜７頁）；Ｌｕｍｉｎｅｘ社による懸濁ビーズアレイ法（Ｄｕｎｂａｒ，Ｓ．Ａ．、Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ、２００６年、３６３巻、１〜２号、７１〜８２頁）；Ｂｉｏｔａｇｅ社によるパイロシークエンシング法（Ｌａｎｇａｅｅ，Ｔ．ら、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ、２００５年、５７３巻、１〜２号、９６〜１０２頁）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社によるＴａｑＭａｎ法、およびＳＮＰｌｅｘ遺伝子型決定法（Ｄｅ ｌａ Ｖｅｇａ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ、２００５年、５７３巻、１〜２号、１１１〜３５頁）；ならびにＲｏｃｈｅ社によるＣｏｂａｓ対立遺伝子特異的ＰＣＲ法、および鋳型指向単一塩基伸長法（Ｃｈｅｎ，Ｘ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、１９９９年、９巻、５号、４９２〜８頁）など、多重化可能なプラットフォームが含まれる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社によるＢｅａｄＡｒｒａｙ−ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ遺伝子型決定アッセイ（Ｓｈｅｎ，Ｒ．ら、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ、２００５年、５７３巻、１〜２号、７０〜８２頁）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ上における、ＰａｒＡｌｌｅｌｅ社によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅアッセイ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉｌ，Ｈ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、２００４年、１４巻、３号、４１４〜２５頁）およびＰｅｒｌｅｇｅｎ社製高密度アレイ上における遺伝子型決定法（Ｅａｓｔｏｎ，Ｄ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４７巻、７１４８号、１０８７〜９３頁）を含めた複数のハイスループットプラットフォームが存在し、その各々により、複数のＳＮＰ部位を同時に遺伝子型決定することが可能である。

ＳＮＰ検出の主要な困難の１つは、野生型配列と、対応する、点突然変異を含有する配列とを区別する頑健な手段を開発することの困難である。多くの有効な手法は、逐次的な各ステップにより検出の特異性がさらに改善される一連の連鎖反応における複数の酵素の使用を伴う。現行の多酵素によるＳＮＰ検出プロトコールの最も顕著な欠点の１つは、アッセイの中間段階において、反応産物を移送する試験管を開放し、かつ／または下流の酵素によるステップに必要とされる試薬および反応成分を添加する必要である。使用者による中間の介入ステップを軽減または廃止すれば、ａ）アッセイ効率が改善され、ｂ）時間、費用が軽減され、ｃ）試料操作時における技術的な過誤の可能性が軽減されるであろう。

ＳＮＰを検出するための密閉型試験管フォーマットによるアッセイ改善の概略を、図８に示す。ＧＥＸＬ−ＰＣＲフォーマットにより、３’置換ｄＮＴＰ、および熱不安定性ホスホトリエステル修飾プライマーの有用性（Ｚｏｎ，Ｇら、米国特許出願第２００７０２８１３０８号）が、ギャップ充填反応（ＤＮＡポリメラーゼ）、ニック結合（ＤＮＡリガーゼ）、およびホットスタートＰＣＲ増幅と組み合わされる。この手法は、複数の企業（ＰａｒＡｌｌｅｌｅ社、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により開発されたＳＮＰアッセイの改変形を表す。１試験管フォーマットに可能となる重要な特徴は、低温のギャップ充填ステップとライゲーションステップに対するそれらの干渉なしに、下流のＰＣＲ増幅反応のためのすべての成分（酵素、ｄＮＴＰ、およびプライマー）を包含する能力である。特に、ギャップを充填するのに必要とされるｄＮＴＰを除くすべてのｄＮＴＰが、３’−ＴＨＦ ｄＮＴＰにより置換される。加えて、熱不安定性ホスホトリエステルプライマーの修飾を用いて、ドナープローブ（５’−リン酸基を含有するライゲーションのためのオリゴヌクレオチド）のジップコード領域（ホスホトリエステルプライマーの３’末端配列に相補的なヌクレオチド配列）に結合する、ビオチニル化したホスホトリエステルプライマーの伸長が遮断される。低温（０〜２０℃）において、ギャップ充填／伸長ステップ（ステップ２）およびニックシーリング／ライゲーションステップ（ステップ３）を実施することにより、ギャップへの不正確なｄＮＴＰの組込みの可能性、その後のライゲーション、またはビオチニル化したプライマーの制御不能な伸長を伴う、３’置換ｄＮＴＰからの３’置換基の喪失など、望ましくない発生の可能性が大幅に低下する。熱活性化ステップ（ステップ４）では、３’置換ｄＮＴＰの３’−ＴＨＦ基、およびプライマーのホスホトリエステル保護基が除去され、ＰＣＲ増幅の開始と進行が可能となる。全体として、置換成分（３’置換ｄＮＴＰおよびホスホトリエステルプライマー）を用いることにより、ステップ２および４の間の操作ステップの必要を廃することにより、ＳＮＰ解析の材料を調製するためのより効率化された手法が可能となる。

別段に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

本明細書で例示的に説明される発明は、本明細書で具体的に開示されていない１つまたは複数のエレメント、１つまたは複数の限定の不在下において、適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む」、「包含する」、「含有する」などの用語は、拡張的に、限定なしに読まれるものとする。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は、説明のために用いられており、限定のためには用いられておらず、このような用語および表現の使用において、示され、また、説明される特徴の任意の同等物またはその一部を除外する意図はなく、特許請求される発明の範囲内においては、各種の変更が可能であると認識される。

したがって、本発明は、本発明の好ましい実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示されているが、本明細書で開示される本発明の改変、改善、および変更は、当業者により復元することができ、このような改変、改善、および変更は、本発明の範囲内にあるものと考えられることを理解されたい。本明細書で提供される材料、方法、および例は、好ましい実施形態を表し、例示的であり、また、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではない。

本明細書では、本発明を広範にわたり包括的に説明してきた。包括的な開示内に収まる、より狭義の種分類および亜属分類の各々もまた、本発明の部分を形成する。これには、削除される材料が本明細書で具体的に列挙されているかどうかに関わらず、属から任意の対象物を除去する条件または否定的限定を伴う、本発明の包括的説明が含まれる。

加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群との関係で説明される場合、当業者は、本発明がまた、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群との関係においても説明されていることを認めるであろう。

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許適用、特許、および他の参考文献は、各々が参照により独立に組み込まれると仮定した場合と同じ程度に、参照によりその全体において本明細書に顕示的に組み込まれる。齟齬が生じた場合は、定義を含めた本明細書により裁定される。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲において記載される。

Claims (22)

1. 核酸を複製する方法であって、
   少なくとも１つのＮＴＰと複製反応緩衝液を含む複製反応混合物中で核酸を複製するステップを含み、
   前記複製反応緩衝液に添加される前記少なくとも１つのＮＴＰが、熱不安定性の３’置換基を含み、
   前記複製反応混合物を高温でインキュベートすることにより、前記複製に熱誘導が先行する方法。
2. 前記３’置換ＮＴＰが、ポリメラーゼによる核酸伸長を損なうか、または防止する、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つの３’置換ＮＴＰが非基質ＮＴＰか終結ＮＴＰである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記３’置換基が、前記核酸複製時に開環の３’−ヒドロキシル基に転換される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記３’置換基が、前記核酸複製の前記最初の熱誘導ステップの間に開環の３’−ヒドロキシル基に転換される、請求項４に記載の方法。
6. 前記３’置換基が、３７℃〜１００℃の温度で開環の３’−ヒドロキシル基に転換される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記３’置換基が、７０℃〜１００℃の温度で開環の３’−ヒドロキシル基に転換される、請求項６に記載の方法。
8. 前記３’置換基が、５０℃の温度で開環の３’−ヒドロキシル基に転換される、請求項６に記載の方法。
9. 前記複製反応混合物が、２つ以上の異なる３’置換基を伴う前記３’置換ＮＴＰを含み、前記異なる３’置換基が、異なる温度で開環の３’−ヒドロキシル基に転換される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記複製反応混合物が、２つ以上の異なる３’置換基を伴う前記３’置換ＮＴＰを含み、最初の３’置換基が５０℃で開環の３’−ヒドロキシル基に転換され、第２の３’置換基が９５℃で転換される請求項９に記載の方法。
11. 前記核酸複製が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリー（ＰＣＡ）、非対称的ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、急速ＰＣＲ、ギャップ伸長ライゲーションＰＣＲ（ＧＥＸＬ−ＰＣＲ）、ギャップライゲーション連鎖反応（Ｇａｐ ＬＣＲ）、ホットスタートＰＣＲ、配列間特異的（ＩＳＳＲ）ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ（Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ−ＰＣＲ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、多重ライゲーション依存型プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、多重ＰＣＲ、ネストＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ、ＰＡＮ−ＡＣ、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、逆転写（ＲＴ）、ｃＤＮＡ端の急速増幅（ＲＡＣＥ ＰＣＲ）、単一分子増幅ＰＣＲ（ＳＭＡ ＰＣＲ）、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ）、タッチダウンＰＣＲ、ロングＰＣＲ等温増幅法、または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 核酸複製反応混合物が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびレストリクターゼからなる群から選択される１つまたは複数の酵素を含む、および／または前記核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの組合せである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記ＮＴＰが、３’置換ｄＡＴＰ、３’置換ｄＴＴＰ、３’置換ｄＧＴＰ、３’置換ｄＣＴＰ、および３’置換ｄＵＴＰからなる群から選択される１つまたは複数の３’置換ＮＴＰである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記３’置換ＮＴＰが、３’置換ｄＡＴＰ、３’置換ｄＴＴＰ、３’置換ｄＧＴＰ、および３’置換ｄＣＴＰを含むか、前記３’置換ＮＴＰが、３’置換ｄＡＴＰ、３’置換ｄＵＴＰ、３’置換ｄＧＴＰ、および３’置換ｄＣＴＰを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記３’置換ＮＴＰが、１つまたは複数のさらなる修飾基および／または検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記３’置換基が、Ｏ−フェノキシアセチル；Ｏ−メトキシアセチル；Ｏ−アセチル；Ｏ−（ｐ−トルエン）スルホネート；Ｏ−リン酸；Ｏ−硝酸；Ｏ−［４−メトキシ］−テトラヒドロチオピラニル；Ｏ−テトラヒドロチオピラニル；Ｏ−［５−メチル］−テトラヒドロフラニル；Ｏ−［２−メチル，４−メトキシ］−テトラヒドロピラニル；Ｏ−［５−メチル］−テトラヒドロピラニル；およびＯ−テトラヒドロチオフラニルからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. ３’置換ＮＴＰおよびそれらの誘導体が、式ＩＡ：
    ［式中、
    ｎは、０または１であり、
    Ｂは、置換もしくは非置換のプリンもしくはピリミジン、その任意のアザ誘導体もしくはデアザ誘導体、または任意のＮＴＰ類似体による任意の「ユニバーサル塩基」もしくは「縮重塩基」から選択され；
    Ａは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ²、およびＮＲ¹からなる群から選択され；
    Ｗは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ²、およびＮＲ¹からなる群から選択され；
    各Ｒ¹および各Ｒ²は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＳｅＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁵、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
    任意の置換基は各々、１つまたは複数のヘテロ原子を含有でき；
    各Ｒ³および各Ｒ⁴は、Ｈ、または置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
    任意の置換基は各々、１つまたは複数のヘテロ原子を含有でき；
    各Ｒ⁵は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＳｅＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、Ｃ（Ｙ）Ｒ³、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から選択され、
    任意の置換基は各々、１つまたは複数のヘテロ原子を含有でき；
    各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ²、およびＮＲ¹からなる群から選択され；
    Ｚ¹、Ｚ⁴、およびＺ⁷は各々、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ²、およびＮＲ¹からなる群から独立に選択され；
    Ｚ⁰およびＺ⁶は各々、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ₂、ＣＲ¹Ｒ²、ＮＲ¹、およびＣ（Ｙ）からなる群から独立に選択され；
    Ｚ³は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ₂、ＣＲ¹Ｒ²、ＮＲ¹、Ｃ（Ｙ）、３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、およびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択され；
    ｎが０のとき、Ｚ³は、３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、
    ｎが１のとき、Ｚ³は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ₂、ＣＲ¹Ｒ²、ＮＲ¹、またはＣ（Ｙ）であり；
    Ｚ²、Ｚ⁵、およびＺ⁸は各々、Ｈ、Ｆ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＳｅＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、ＮＲ³ＯＲ³、ＮＲ³−ＮＲ³Ｒ⁴、ＣＮ、Ｎ₃、（ＢＨ₃）^- Ｍ⁺、およびＣ（Ｙ）Ｒ⁵からなる群から独立に選択され；
    Ｚ⁹は、Ｈ、Ｆ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＳｅＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、ＮＲ³ＯＲ³、ＮＲ³−ＮＲ³Ｒ⁴、ＣＮ、Ｎ₃、（ＢＨ₃）^- Ｍ⁺、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁵、およびリン酸からなる群から選択され；
    Ｚ¹⁰は、Ｏ、Ｓ、およびＳｅからなる群から選択され；
    Ｍ⁺は、陽イオンであり；
    Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、およびＸ⁵は各々、Ｒ¹、ＮＲ³ＯＲ³、ＮＲ³−ＮＲ³Ｒ⁴、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、およびＳＳＲ³からなる群から独立に選択され；
    Ｒは、
    からなる群から選択され、
    Ｒは、式ＩＡで示されるＮＴＰ分子のＸ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、Ｘ⁵、Ｚ⁰、Ｚ¹、Ｚ²、Ｚ³、Ｚ⁴、Ｚ⁵、Ｚ⁶、Ｚ⁷、Ｚ⁸、Ｚ⁹、Ａ、Ｗ、またはＢ部分に対して、適切な原子または原子群を介して共有結合でき；
    各Ｒ⁶は、炭酸を除く無機酸残基またはその誘導体からなる群から独立に選択され、前記誘導体には、ハロゲン、スルホン酸、チオスルホン酸、セレノ硫酸、セレノスルホン酸、硫酸エステル、硫酸チオエステル、亜硫酸、スルフィン酸、スルフィンエステル、硝酸、亜硝酸、リン、セレニウム、およびホウ素を含有する酸が含まれうり；
    各Ｒ⁷は、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から選択され、
    前記ヒドロカルビルは、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびアリールオキシからなる群から選択される少なくとも１個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
    各Ｒ⁸、各Ｒ⁹、および各Ｒ¹⁰は、水素、および、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
    前記ヒドロカルビルは、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびアリールオキシからなる群から選択される少なくとも１個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
    各Ｘ⁶、各Ｘ⁷、各Ｘ⁸、および各Ｘ⁹は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され；
    各Ｘ¹⁰は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ¹¹、Ｎ−ＯＲ¹¹、およびＣＲ¹¹Ｒ¹²からなる群から独立に選択され；
    各Ｒ¹¹および各Ｒ¹²は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され；
    各Ｙ¹は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ⁶、Ｎ−ＯＲ⁶、およびＣＲ⁶Ｒ⁷からなる群から独立に選択される］
    の構造を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
18. ３’置換ＮＴＰおよびそれらの誘導体が、式ＩＢ：
    ［式中、
    ｎは、０または１であり、
    Ｂは、置換もしくは非置換のプリンもしくはピリミジン、その任意のアザ誘導体もしくはデアザ誘導体、または任意のＮＴＰ類似体による任意の「ユニバーサル塩基」もしくは「縮重塩基」から選択され；
    Ａは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ²、およびＮＲ¹からなる群から選択され；
    Ｗは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ²、およびＮＲ¹からなる群から選択され；
    各Ｒ¹および各Ｒ²は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁵、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
    任意の置換基は各々、１つまたは複数のヘテロ原子を含有でき；
    各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ²、およびＮＲ¹からなる群から独立に選択され；
    各Ｒ³および各Ｒ⁴は、Ｈ、または置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
    任意の置換基は各々、１つまたは複数のヘテロ原子を含有でき；
    各Ｒ⁵は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、ならびに置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルからなる群から選択され、
    任意の置換基は各々、１つまたは複数のヘテロ原子を含有でき；
    Ｚ¹、Ｚ⁴、およびＺ⁷は各々、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ²、およびＮＲ¹からなる群から独立に選択され；
    Ｚ⁰およびＺ⁶は各々、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ₂、ＣＲ¹Ｒ²、ＮＲ¹、およびＣ（Ｙ）からなる群から独立に選択され；
    Ｚ³は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ₂、ＣＲ¹Ｒ²、ＮＲ¹、Ｃ（Ｙ）、３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、およびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択され；
    ｎが０のとき、Ｚ³は、３’−Ｏ−オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、
    ｎが１のとき、Ｚ³は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ₂、ＣＲ¹Ｒ²、ＮＲ¹、またはＣ（Ｙ）であり；
    Ｚ²、Ｚ⁵、およびＺ⁸は各々、Ｈ、Ｆ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＳｅＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、ＮＲ³ＯＲ³、ＮＲ³−ＮＲ³Ｒ⁴、ＣＮ、Ｎ₃、（ＢＨ₃）^- Ｍ⁺、およびＣ（Ｙ）Ｒ⁵からなる群から独立に選択され；
    Ｚ⁹は、Ｈ、Ｆ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＳｅＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、ＮＲ³ＯＲ³、ＮＲ³−ＮＲ³Ｒ⁴、ＣＮ、Ｎ₃、（ＢＨ₃）^- Ｍ⁺、Ｃ（Ｙ）およびリン酸からなる群から選択され；
    Ｍ⁺は、陽イオンであり；
    Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、およびＸ⁴は各々、Ｒ¹、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ³、ＳＲ³、ＳｅＲ³、ＮＲ³Ｒ⁴、ＮＲ³ＯＲ³、ＮＲ³−ＮＲ³Ｒ⁴、ＣＮ、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁵、ＮＯ₂、および ＳＳＲ³からなる群から独立に選択され；
    Ｘ⁵は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ⁶、Ｎ−ＯＲ⁶、およびＣＲ⁶Ｒ⁷からなる群から選択され；
    Ｙ¹は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ⁶、Ｎ−ＯＲ⁶、ＣＲ⁶Ｒ⁷、およびＣ（Ｙ）からなる群から選択され；
    各Ｒ⁶および各Ｒ⁷は、水素、また、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
    前記ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも１個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
    Ｘ⁵およびＹ¹は各々、式ＩＢで示されるＮＴＰ分子のＸ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、Ｘ⁵、Ｚ⁰、Ｚ¹、Ｚ²、Ｚ³、Ｚ⁴、Ｚ⁵、Ｚ⁶、Ｚ⁷、Ｚ⁸、Ｚ⁹、Ａ、Ｗ、またはＢ部分に対して、適切な原子または原子群を介して共有結合してもよい］
    の構造を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
19. Ｂが、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシル、アミノアリルウラシル、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−メチルグアニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−アミノアリルグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザデニン、２，６−ジアミノプリン、５−ニトロシトシン、５−アミノアリルシトシン、５−（ビオチン−１６）−シトシン、５−（フルオレセイン−１１）−シトシン、４−メチルアミノ−シトシン、および２−チオ−５−メチルウラシル、または４−チオ−５−メチルウラシルである、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１〜１９のいずれかに記載の１つまたは複数の３’置換ＮＴＰを含む、核酸を複製するためのキットであって、前記１つまたは複数の３’置換ＮＴＰを用いる方法を実施するための指示書、核酸複製用と明記された容器、非修飾ｄＮＴＰ、修飾ＮＴＰ、核酸ポリメラーゼ、塩化マグネシウムまたは他の２価陽イオン、および反応緩衝液からなる群から選択される１つまたは複数をさらに含むキット。
21. 核酸ポリメラーゼ、および１つまたは複数のさらなる酵素を含む、請求項２０に記載のキット。
22. Ｒが
    である請求項１７に記載の方法。