TW202031888A - T細胞受體及b細胞受體之功能性次單元成對基因之解析方法 - Google Patents

T細胞受體及b細胞受體之功能性次單元成對基因之解析方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種進行T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之功能性次單元成對基因之序列解析之方法。本發明提供如下方法，其包括：(1)自活化之表現TCR或BCR之細胞提供包含TCR或BCR之核酸之核酸樣本之工序；(2)確定該TCR或該BCR之功能性成對基因之核酸序列之工序；及(3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合而鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之工序。

Description

T細胞受體及B細胞受體之功能性次單元成對基因之解析方法
本發明係關於一種對少量之源自細胞之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之功能性次單元成對基因進行解析之方法。
近年來，藉由急速進步之下一代序列解析技術而能夠實現大規模之基因之鹼基序列確定。自人類樣本將TCR基因進行PCR擴增，並利用下一代序列解析技術，藉此可實現下一代TCR庫解析法，其根據先前獲得小規模且V鏈使用頻度等受限之資訊之TCR庫解析，獲取較純系等級更詳細之基因資訊並進行解析。專利文獻1揭示一種使用自集合細胞藉由接頭引子而非偏差性擴增之核酸樣本，對T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之庫(repertoire)進行定量性解析的方法。
專利文獻2係揭示一種利用用以藉由一步法實施反轉錄模板轉換PCR之技術之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之庫解析方法。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2015/075939號 專利文獻2：國際公開第2017/222056號
[解決問題之技術手段]
本發明係提供一種自單細胞迅速、簡單且以較高之特異性對功能性T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之成對基因進行解析之方法。
本發明例如提供以下之項目。 (項目1)一種進行T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之功能性次單元成對基因之序列解析之方法，其包括： (1)自活化之表現TCR或BCR之細胞提供包含TCR或BCR之核酸之核酸樣本之工序； (2)確定該TCR或該BCR之核酸序列之工序； (3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而鑑定TCR或BCR功能性次單元成對基因之工序。 (項目2)如項目1記載之方法，其於上述工序(1)之前進而包括如下工序：使上述表現TCR或BCR之細胞之至少一部分活化。 (項目3)如項目1或2記載之方法，其中上述活化包括利用任意之抗原或其抗原MHC複合體、或者具有與任意之抗原結合之MHC之抗原呈現細胞對上述細胞進行刺激。 (項目4)如項目3記載之方法，其中上述抗原選自由病毒構成物質、細菌構成物質、非自身細胞構成物質、及癌細胞特異性構成物質所組成之群。 (項目5)如項目3記載之方法，其中上述抗原選自由病毒肽、病毒肽糖脂質複合體、細菌肽、細菌肽糖脂質複合體、非自身細胞肽、非自身細胞肽糖脂質複合體、癌細胞特異性肽、及癌細胞特異性肽糖脂質複合體所組成之群。 (項目6)如項目1或2記載之方法，其中上述活化包括利用選自由抗CD3及/或抗CD28抗體、磷脂酶C(PLC)活化劑、鈣離子載體、蛋白激酶C(PKC)活化劑、植物血凝素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)、及類鐸受體(toll-like receptor)之活化劑所組成之群中之因子對上述細胞進行刺激。 (項目7)如項目1至6中任一項記載之方法，其中上述細胞為末梢血液單核細胞。 (項目8)如項目1至7中任一項記載之方法，其中上述工序(1)包括將上述活化之細胞自未活化之細胞進行分離。 (項目9)如項目8記載之方法，其中上述活化之細胞之分離係藉由抗原-MHC分子複合體或2個～10,000個抗原-MHC分子複合體之聚合物來進行。 (項目10)如項目9記載之方法，其中上述抗原-MHC分子複合體之聚合物選自由表位二聚物、表位三聚物、表位四聚物、及表位五聚物所組成之群。 (項目11)如項目1至10中任一項記載之方法，其中上述核酸樣本為自單一之活化之細胞獲得。 (項目12)如項目1至11中任一項記載之方法，其中上述工序(1)包括： a)將上述細胞之RNA、反轉錄所需之試劑、模板轉換所需之試劑、及聚合酶連鎖反應所需之試劑進行混合，將混合物供於產生反轉錄之條件，而提供包含複數種之TCR或BCR之核酸序列之cDNA之工序；及 b)將自該工序a)獲得之cDNA供於產生聚合酶連鎖反應之條件下，而提供包含該複數種之TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本之工序， 該模板轉換所需要之試劑包含模板轉換寡核苷酸， 該聚合酶連鎖反應所需要之試劑包含該TCR或該BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子，且該C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子係以於該工序a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙，於該工序b)中引子功能之抑制得到解除之方式設計出的修飾寡核苷酸引子。 (項目13)如項目12記載之方法，其中上述聚合酶連鎖反應所需要之試劑視需要進而包含含有上述模板轉換寡核苷酸所含有之錨定序列之至少一部分之5'錨定寡核苷酸引子。 (項目14)如項目13記載之方法，其中上述聚合酶連鎖反應所需要之試劑不包含上述5'錨定寡核苷酸引子，上述模板轉換寡核苷酸作為5'錨定寡核苷酸引子發揮功能。 (項目15)如項目12至14中任一項記載之方法，其中上述反轉錄所需要之試劑包含： (i)與TCRα之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子及與TCRβ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子； (ii)與TCRδ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子及與TCRγ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子；或者 (iii)與BCR重鏈之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子及與BCR輕鏈之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子。 (項目16)如項目12至15中任一項記載之方法，其中上述聚合酶連鎖反應所需要之試劑包含： (i)TCRα之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、以及TCRβ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子； (ii)TCRδ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、以及TCRγ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子；或者 (iii)BCR重鏈之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、以及BCR輕鏈之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子。 (項目17)如項目12至16中任一項記載之方法，其將TCRα及TCRβ兩者、TCRδ及TCRγ兩者、或BCR重鏈及BCR輕鏈兩者共擴增。 (項目18)如項目12至17中任一項記載之方法，其中上述修飾寡核苷酸引子於同一之修飾寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，且在PCR之初期熱改性處理前因該互補區而形成摺疊結構、或者包含熱不穩定性修飾基。 (項目19)如項目12至18中任一項記載之方法，其中引子功能未得到抑制之一部分之修飾寡核苷酸引子藉由雜交為模板RNA而作為開始反轉錄之寡核苷酸引子發揮功能。 (項目20)如項目12至19中任一項記載之方法，其中上述工序(3)包括以下： (3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1個之基因區域每個區域之參照資料庫之工序； (3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者所得之輸入序列集之工序； (3-3)對於該輸入序列集，對該基因區域逐一進行與該參照資料庫之同源性檢索，記錄與近似之參照對偶基因及/或該參照對偶基因之序列之匹配之工序； (3-4)對於該輸入序列集，指定V區及J區，基於指定結果提取D區之核酸序列之工序； (3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類之工序；及 (3-6)基於該工序(3-5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區各自之出現頻度、或其組合，藉此鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之工序。 (項目21)一種用以進行表現TCR或BCR之細胞中之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之功能性次單元成對基因之序列解析的系統，其包含： (A)用以使該細胞之至少一部分活化之活性劑； (B)用以提供自活化之該細胞所獲得之包含TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本的核酸處理用套組； (C)確定活化之該細胞所含有之核酸序列之定序儀；及 (D)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之分析機。 (項目22)一種表現具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之細胞之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如項目1至20中任一項記載之方法所解析，該方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之表現構建物之工序；及 (5)將該表現構建物導入至細胞之工序。 (項目23)一種產生包含具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)核酸之病毒或噬菌體之細胞之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如項目1至20中任一項記載之方法所解析，該方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之病毒產生載體或噬菌體產生載體之工序；及 (5)將該載體導入至細胞之工序。 (項目24)一種包含具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)核酸之病毒或噬菌體之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如項目1至20中任一項記載之方法所解析，該方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之病毒產生載體或噬菌體產生載體之工序； (5)將該載體導入至細胞之工序；及 (6)對該細胞進行培養，自培養上清液獲得包含TCR或BCR核酸之病毒或噬菌體之工序。 (項目25)一種具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之RNA之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如項目1至20中任一項記載之方法所解析，該方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之活體外轉錄RNA合成用之載體、或者使該TCR或BCR之核酸序列與活體外轉錄用啟動子序列結合而成之DNA片段之工序；及 (5)將該載體或DNA片段供於在活體外開始RNA聚合酶反應之條件下之工序。 (項目26)一種具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如項目1至20中任一項記載之方法所解析，該方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之表現構建物之工序； (5)將該表現構建物導入至細胞之工序；及 (6)將該細胞供於表現該TCR或BCR之條件下之工序。 (項目27)一種具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如項目1至20中任一項記載之方法所解析，該方法包括： (4)使細胞感染藉由如項目24記載之方法所製造之病毒或噬菌體之工序；及 (5)將該細胞供於表現該TCR或BCR之條件下之工序。 (項目28)一種具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如項目1至20中任一項記載之方法所解析，該方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之活體外轉錄RNA合成用之載體、或者使該TCR或BCR之核酸序列與活體外轉錄用啟動子序列結合而成之DNA片段之工序； (5)將該載體或DNA片段供於在活體外開始RNA聚合酶反應之條件下，而提供mRNA之工序；及 (6)將該mRNA供於在活體外自該mRNA生成蛋白質之條件下，而提供該蛋白質之工序。
於本發明中，關於上述1個或複數個特徵，意圖除已明示之組合以外，可進一步組合而提供。關於本發明之進一步實施形態及優點，只要視需要閱讀以下之詳細說明來理解，則被業者所理解。
國際公開第2017/222056號及國際公開第2017/222057號之內容其整體係作為參考被引用至本說明書中。 [發明之效果]
根據本發明，可自單細胞更迅速、更簡單且以較高之特異性共擴增T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之成對基因(例如，TCRα/β、TCRδ/γ、BCR重鏈/輕鏈)兩者，而取得功能性TCR或BCR之成對基因序列資訊。
以下對本發明進行說明。本說明書整體中，單數形式之表達只要為未特別提及，則應理解為亦包括其複數形式之概念。因此，單數形式之冠詞(例如，於英語之情形時，為「a」、「an」、「the」等)只要未特別提及，則應理解為亦包括其複數形式之概念。又，本說明書中所使用之用語只要未特別提及，則應理解為可以相關領域中通常使用之含義使用。因此，只要沒有其他定義，則本說明書中所使用之全部專業用語及科學技術用語具有與本發明所屬之領域之業者一般所理解相同之含義。於相矛盾之情形時，本說明書(包括定義)。
(定義) 於本說明書中，數值之前之「約」意指後接數值之±10%。
本說明書中所謂「使細胞活化」，係指使任意之抗原或者誘導TCR或BCR之表現之任意之作用物質與細胞接觸，而使細胞中之TCR或BCR之mRNA表現量增加。作為誘導TCR或BCR之表現之任意之作用物質，例如可列舉：抗CD3及/或抗CD28抗體、離子酶素(ionomycin)、PMA、PHA、ConA、及類鐸受體之活化劑，但並不限定於該等。亦有時將用以使細胞活化之抗原及作用物質稱為「活性劑」。
本說明書中「活化」就代表性而言，伴隨著細胞增生與細胞激素或免疫相關蛋白增加之T細胞/B細胞之免疫作用之亢進及表現發生。作為具體之判定手法之一，於T細胞之情形時可列舉於培養皿內之細胞殺傷分析法。於該手法中，於得到「活化」之情形時T細胞所殺傷之靶細胞之數量增加，因此可藉由對細胞數進行計數而測定活性。
若更詳細地進行說明，則就生物學而言，亦可藉由如下方式進行測定，即由細胞增生引起之純系之增加(若為非特異性活化劑，則所有細胞增加，但另一方面，於特定抗原之情形時，僅與特定抗原結合之T細胞、B細胞增加)；使免疫活性亢進之干擾素或介白素等細胞激素之蛋白質表現量之定量或mRNA表現量之定量；TCR或BCR/免疫球蛋白之蛋白質量之增加。具體而言，作為用以測量其等之更簡單之檢定系統，可利用基於基因表現解析之mRNA量增加或基於顯微鏡觀察之細胞之胚細胞(blastocyte)化(細胞增生並以葡萄串之形式凝集)的判定等手法。又，亦能夠利用對細胞損傷性T淋巴細胞之標記物即CD8及CD103等進行檢測之手法。關於B細胞之活化，亦可藉由免疫球蛋白之蛋白質表現量之定量或mRNA表現量之定量來判定。
本說明書中，所謂TCR或BCR之「功能性次單元成對基因」，於在細胞中表現之情形時，係指自成對基因(TCRα/β、TCRδ/γ、BCR重鏈/輕鏈等之次單元)轉譯及生物合成而成之蛋白質對合而形成TCR蛋白複合體或BCR/免疫球蛋白蛋白複合體，從而構成實際上發揮功能之TCR或BCR之成對基因。
本說明書中所謂「T細胞受體(TCR)」，係指識別掌管免疫系統之T細胞之細胞膜上所表現之抗原的受體。存在α鏈、β鏈、γ鏈及δ鏈，構成αβ或γδ之二聚物。將包含前者之組合之TCR稱為αβTCR，將包含後者之組合之TCR稱為γδTCR，將具有各TCR之T細胞稱為αβT細胞、γδT細胞。結構上，與B細胞產生之抗體之Fab片段非常類似，識別與MHC分子結合之抗原分子。成熟T細胞所具有之TCR基因由於經基因重組，故而一個體具有富於多樣性之TCR，可識別多種抗原。TCR進而與存在於細胞膜之不可變之CD3分子結合而形成複合體。CD3於細胞內區域具有稱為ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，受體免疫酪胺酸活化基序)之胺基酸序列，而認為該結構參與細胞內之訊號傳遞。各TCR鏈包含可變部(V)與恆定部(C)，恆定部貫通細胞膜且具有較短之細胞質部分。可變部存在於細胞外並與抗原-MHC複合體結合。於可變部中存在超可變部、或稱為互補決定區(CDR)之區域3個，該區域與抗原-MHC複合體結合。3個CDR分別稱為CDR1、CDR2、CDR3，於TCR之情形時，認為其中CDR1及CDR2與MHC結合，CDR3與抗原結合。TCR之基因重組係與作為免疫球蛋白所知之B細胞受體之過程相同。αβTCR之基因重組中，首先進行β鏈之VDJ重組，繼而進行α鏈之VJ重組。進行α鏈之重組時δ鏈之基因自染色體上缺失，因此具有αβTCR之T細胞不會同時具有γδTCR。反之於具有γδTCR之T細胞中，經由該TCR之訊號抑制β鏈之表現，因此具有γδTCR之T細胞亦不會同時具有αβTCR。
本說明書中所謂「B細胞受體(BCR)」，係指包含與膜結合型免疫球蛋白(mIg)分子締合之Igα/Igβ(CD79a/CD79b)雜二聚物(α/β)者。mIg次單元與抗原結合而引起受體之凝集，另一方面，α/β次單元向細胞內傳遞訊號。若BCR凝集，則認為與酪胺酸激酶之Syk及Btk同樣地，使Src家族激酶之Lyn、Blk、及Fyn迅速地活化。因BCR訊號傳遞之複雜性而產生較多之不同結果，其中包括存活、耐性(無因變性(anergy)；對於抗原之過敏反應之缺乏)或細胞凋亡、細胞分裂、向抗體產生細胞或記憶B細胞之分化等。
本說明書中所謂「庫(repertoire)」或「可變區之庫」，係指藉由基因重組利用TCR或BCR任意製作之V(D)J區的集合。該等雖以TCR庫、BCR庫等慣用語來使用，但例如亦有時稱為T細胞庫、B細胞庫等。例如，所謂「T細胞庫」，係指藉由於抗原識別中發揮重要作用之T細胞受體(TCR)之表現而賦予特徵之淋巴細胞的集合。T細胞庫之變化會帶來生理狀態及疾病狀態下之免疫狀態之顯著性指標，因此T細胞庫解析係用以與疾病之發病相關之抗原特異性T細胞之鑑定及T淋巴細胞之異常之診斷。為了檢測T細胞庫之變化，基於使用較對於TCR可變區具有特異性之抗體更大之嵌板之螢光活化細胞分選儀分析的可變區之使用之比較(van den Beemd R et al. (2000) Cytometry 40： 336-345； MacIsaac C et al. (2003) J Immunol Methods283： 9-15； Tembhare P et al. (2011) Am J Clin Pathol 135： 890-900； Langerak AWet al. (2001) Blood 98： 165-173)、使用複數個引子之聚合酶連鎖反應(PCR)(Rebai N et al.(1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91： 1529-1533)、或基於PCR之酵素結合免疫吸附檢定法(Matsutani T et al. (1997) Hum Immunol 56：57-69； Matsutani T et al. (2000) Br J Haematol 109： 759-769)得到廣泛使用。作為CDR3譜型所公知之鏈長分佈之分析係基於V-(D)-J區中之非模板核苷酸之附加，且係為了評價T細胞之選殖性(clonality)及多樣性而使用(Matsutani T etal. (2007) Mol Immunol 44： 2378-2387； Matsutani T et al. (2011) Mol Immunol 48：623-629)。為了進一步鑑定T細胞之抗原特異性，需要TCR純系型之PCR選殖及其後之抗原識別區域、CDR3之序列確定。一般使用該等先前之指導法(Approach)，但研究TCR庫耗費時間，為費力之方法。
本說明書中所謂「抗原-MHC分子複合體之聚合物」，係指使抗原(例如肽片段)與MHC分子之複合體之複數個聚合而成者。作為抗原-MHC分子複合體之聚合物之非限定性製作方法，可列舉如下方法：將抗原與MHC分子進行複合體化而形成單體抗原-MHC分子複合體，繼而使單體複合體之C末端之離胺酸殘基生物素化，繼而利用生物素-抗生物素蛋白結合進行四聚物化。為了利用細胞分選儀進行分離，聚合物亦可經螢光標記。作為抗原-MHC分子複合體之聚合物，可列舉：表位二聚物、表位三聚物、表位四聚物、及表位五聚物等，並不限定於該等。
本說明書中「共擴增(co-amplification)」意指將2個以上之核酸分子於相同機會進行擴增。共擴增並非刻意地僅於同時期擴增，即便於在嚴格規定上未同時期擴增之情形時，亦只要於「共擴增」後之至少一時點獲得2個以上之核酸分子較「共擴增」前得到擴增之結果即可，亦包括於同一反應系中將2個以上之核酸分子於不同時期進行擴增之情況。作為2個以上之核酸分子，可列舉：TCRα及TCRβ、TCRδ及TCRγ、以及BCR重鏈及BCR輕鏈等，但並不限定於該等。
本說明書中所謂「資料庫」，係指與基因相關之任意資料庫，尤其是於本發明中，係指包含T細胞受體及B細胞受體庫之資料庫。作為此種資料庫，可列舉：IMGT(免疫遺傳學諮詢系統(the international ImMunoGeneTics information system)，www.imgt.org)資料庫、日本DNA資料庫(DDBJ，DNA Data Bank of Japan，www.ddbj.nig.ac.jp)資料庫、GenBank(美國生物技術資訊中心，www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)資料庫、ENA(EMBL(歐州分子生物學研究所)、www.ebi.ac.uk/ena)資料庫等，但並不限定於此。
本說明書中所謂「可變區之庫(repertoire)」，係指利用TCR或BCR並藉由基因重組而任意產生之V(D)J區之集合。
本說明書中所謂「索引序列」，係用於以可鑑定擴增產物之方式賦予獨特性之序列。因此，較佳為與目標序列不同。又，較佳為不會對擴增造成影響之序列。關於對於索引序列之判定基準及其代表例，係如下所示。即，若對於索引序列之判定基準進行說明，則索引序列係將複數個樣本進行混合而同時定序時，為了識別各樣本而附加之鹼基序列。一個源自樣本之測序片段係與一個索引序列相關聯，可識別所獲得之測序片段序列源自哪個樣本。係A、C、G、T之4種鹼基之任意序列，理論上可以10個鹼基產生約100萬種序列，以20個鹼基產生約1兆種序列。鹼基序列長度較佳為2個鹼基以上40個鹼基以下，更佳為6個鹼基以上10個鹼基以下。較理想為同時使用不包含連續之序列(AA、CC、GG、TT)之序列。
本說明書中所謂「同型」，係指雖IgM、IgA、IgG、IgE及IgD等屬於相同類型，但序列互不相同之類型。同型係使用各種基因之簡稱或符號來表示。
本說明書中所謂「亞型」，於BCR之情形時係IgA及IgG中所存在之類型中之類型，關於IgG，存在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，關於IgA，存在IgA1或IgA2。關於TCR，已經於β鏈及γ鏈中存在，分別存在TRBC1、TRBC2、或TRGC1、TRGC2。
本說明書中所謂基因之「同源性」，係指2個以上之基因序列之相互同一性之程度，一般所謂具有「同源性」，係指同一性或類似性之程度較高。因此，某2個基因之同源性越高，其等之序列之同一性或類似性越高。2種基因是否具有同源性可藉由序列之直接比較、或於核酸之情形時藉由嚴格條件下之雜交法而調查。於將2個基因序列直接比較之情形時，當該等基因序列間DNA序列代表而言至少50%同一時、較佳為至少70%同一時、更佳為至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一時，該等基因具有同源性。因此，於本說明書中「同源體」或「同源基因產物」意指發揮與本說明書中進而記載之複合體之蛋白質構成要素相同之生物學功能的另一種、較佳為哺乳動物中之蛋白質。
本說明書中所謂「受驗體」，係指用以本發明之解析之樣本之來源或本發明之診斷對象，作為受驗體，可列舉哺乳動物(例如人類、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、馬、羊、猴等)，較佳為靈長類，尤佳為人類。
本說明書中所謂「樣本」，係指自受驗體等獲得之任意物質，例如包含核酸(例如RNA)、細胞、組織、器官等。業者可基於本說明書之記載而適當選擇較佳之樣本。
本說明書中所謂「機構」，係指可成為達成某一目的之任意道具者。
本說明書中所謂「診斷」，係指鑑定與受驗體之疾病、障礙、狀態等相關之各種參數，而判定此種疾病、障礙、狀態之現狀或未來。藉由使用本發明之方法、裝置、系統，可調查體內之狀態，使用此種資訊，可選定受驗體之疾病、障礙、狀態、應投予之治療或用以預防之配方物或方法等各種參數。本說明書中，狹義上「診斷」係指診斷現狀，但廣義上包含「早期診斷」、「預測診斷」、「事前診斷」等。本發明之診斷方法原則上可利用源自身體者，且可離開醫生等醫療從業者之手來實施，因此產業上有用。本說明書中，為了明確可離開醫生等醫療從業者之手來實施，尤其是有時將「預測診斷、事前診斷或診斷」稱為「支援」。
作為本發明之診斷藥等醫藥等之配方程序係於相關領域中公知，例如記載於日本藥典、美國藥典、其他國家之藥典等中。因此，只要有本說明書之記載，則業者可不進行過度之實驗而確定應使用之量。
本說明書中所謂「修整」，係指於基因解析中去除不適當之部分。修整係藉由自測序片段兩端將低品質區、或於實驗程序中所賦予之人工核酸序列之部分序列、或者上述兩者削除而進行。修整可參照相關領域中公知之軟體及文獻(例如，cutadapt http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200/(EMBnet.journal、2011)；fastq-mcf Aronesty E.、The Open Bioinformatics Journal (2013) 7、1-8 (DOI:10.2174/1875036201307010001)；及fastx-toolkit http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/(2009))而進行。
本說明書中所謂「適當之長度」，係指如於本發明之基因解析中進行匹配等分析時適合分析之長度。此種長度例如可設為自C區上之序列確定起始位置起包含V區上之靠近D區的100個鹼基之長度以上而確定，例如於本發明中，於TCR之情形時，可為200個核苷酸長度以上、較佳為250個核苷酸長度以上，於BCR之情形時，可為300個核苷酸長度以上、較佳為350個核苷酸長度以上，但並不限定於該等。
本說明書中所謂「輸入序列集」，係指於本發明之基因解析中成為TCR或BCR之解析之對象的序列之集合。
本說明書中所謂「基因區域」，係指V區、D區、J區及C區等各區域。此種基因區域於相關領域中公知，可參考資料庫等而適當確定。本說明書中所謂基因之「同源性」，係指2個以上之基因序列之相互同一性之程度，一般所謂具有「同源性」，係指同一性或類似性之程度較高。因此，某2個基因之同源性越高，其等序列之同一性或類似性越高。2種基因是否具有同源性可藉由序列之直接比較、或者於核酸之情形時可藉由嚴格條件下之雜交法而調查。本說明書中所謂「同源性檢索」，係指同源性之檢索。較佳為可使用電腦於計算機(in silico)上進行。
本說明書中所謂「近似」，係指進行同源性檢索時同源性之程度較高。執行進行同源性檢索之軟體(BLAST、FASTA等)時通常以同源性之高低順序來列舉，可藉由適當選擇排名較高者來近似。
本說明書中所謂「最接近」，係指進行同源性檢索時同源性之程度最高。於利用軟體進行同源性檢索之情形時，選擇排名第1位所表示者。
本說明書中所謂「參照對偶基因」，係指進行同源性檢索時於參照資料庫中命中之參照對偶基因。
本說明書中所謂「匹配」(英語為alignment或align)，係指以為了於生物資訊學(bioinformatics)上可特定DNA或RNA、蛋白質等生物分子之一次結構之類似區域而排列的方式放在一起者、及進行排列。可提供知曉功能性、結構性、或進化性序列之關係性之線索。
本說明書中所謂「指定」，係指對於某一序列(例如核酸序列、蛋白質序列等)指定特定之基因名、功能、特徵區域(例如V區、J區等)等資訊。具體而言，可藉由對於某一序列輸入或連結特定資訊等而達成。
本說明書中所謂「CDR3」，係指第3個互補決定區(complementarity-determining region：CDR)，此處，所謂CDR，係指可變區中直接與抗原接觸之區域之變化尤其大，即該超可變區。於輕鏈與重鏈之可變區分別存在3個CDR(CDR1～CDR3)、及包圍3個CDR之4個FR(FR1～FR4)。由於認為CDR3區域跨及V區、D區、J區而存在，故而被視為掌握可變區之關鍵，而用作分析對象。
本說明書中所謂「參照V區上之CDR3開頭」，係指相當於本發明之對象之V區中之CDR3的開頭之序列。
本說明書中所謂「參照J上之CDR3末尾」，係指相當於本發明之對象之J區中之CDR3的末尾之序列。
本說明書中所謂「容許隨機突變整體性散在之條件」，係指隨機突變作為結果散在之任意條件，例如若為BLAST/FASTA最佳參數，則於以下之條件下充分表現：容許在匹配全長內最大33%之不一致，且關於其中之任意之30bp，容許最大60%之並非一連串之不一致。本發明中所使用之IgG等分子之同型等功能性等效物可藉由檢索資料庫等而找出。本說明書中所謂「檢索」，係指藉由電子或生物學或其他方法，較佳為電子性地利用某一核酸鹼基序列而找出具有特定功能及/或性質之其他核酸鹼基序列。作為電子檢索，可列舉：BLAST(Altschul et al.、 J.Mol.Biol.215: 403-410 (1990))、FASTA(Pearson & Lipman、 Proc.Natl.Acad.Sci.、USA 85:2444-2448 (1988))、史密斯-沃特曼法(Smith and Waterman、J.Mol.Biol.147: 195-197 (1981))、及Needleman and Wunsch法(Needleman and Wunsch、 J.Mol.Biol.48: 443-453 (1970))等，但並不限定於該等。代表性地使用BLAST。作為生物學檢索，可列舉：嚴格雜交、將基因組DNA貼附於尼龍薄膜等之大陣列或貼附於玻璃板之微陣列(微陣列檢定)、PCR及原位雜交等，但並不限定於該等。於本說明書中，意欲使本發明中所使用之基因亦應包含藉由此種電子檢索、生物學檢索所鑑定之對應基因。 (較佳之實施形態)
於以下對本發明之較佳之實施形態進行說明。以下所提供之實施形態係為了更好地理解本發明而提供者，理解本發明之範圍不應限定於以下之記載。因此，明確業者可參照本說明書中之記載，於本發明之範圍內適當進行修飾。關於該等實施形態，業者可適當組合任意之實施形態。 (解析方法)
於一個態樣中，本發明提供一種進行T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之功能性次單元成對基因之序列解析之方法，其包括：(1)自活化之表現TCR或BCR之細胞提供包含TCR或BCR之核酸之核酸樣本之工序；(2)確定該TCR或該BCR之核酸序列之工序；及(3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之工序。本發明之方法可藉由使用活化之細胞，而自單個細胞取得TCR或BCR之功能性成對基因之序列資訊。先前之解析技術(專利文獻1及2)係使用大量細胞者，因此實現自TCR/BCR之絕對量較少之單個細胞取得TCR或BCR之功能性成對基因之序列資訊係預料之外。自大量細胞獲得之TCR/BCR之成對基因之序列資訊僅可明確複數個細胞中之各基因之出現頻度，無法鑑定形成功能性TCR/BCR之成對基因。另一方面，自單個細胞獲得之資訊係於基於實際上功能表現之TCR/BCR之方面上進一步優異。又，本發明之方法亦為能夠實現將TCR/BCR之成對基因共擴增者。於專利文獻1及2中所揭示之方法中，TCRα及TCRβ係藉由不同之PCR反應得到擴增，因此實現將TCR/BCR之成對基因共擴增係預料之外。如上所述，本發明之方法與先前技術相比，能夠更迅速且簡單地取得更有益之資訊(例如，功能性成對基因之序列資訊)。
功能性成對基因係利用如下基準來確定，即成對基因(例如TCRα及TCRβ等)是否兩者均具有可表現全長蛋白之序列。具體而言，成對基因之序列藉由基因重組而對象之CDR3區域於框內相連，直至C區之終止密碼子為止無其他終止密碼子之插入，於具有可表現全長蛋白之序列之情形時，可判斷相關成對基因為功能性成對基因。
亦可追加或替代性地進行用以確認所獲得之成對基因之序列為功能性的試驗。於確認實驗(Validation實驗)中，於使次單元成對基因同時於淋巴細胞、或依據其之細胞表現之情形時，確認如下情況：合成蛋白質(視需要接受BCR之糖鏈修飾等轉譯後修飾)後，可形成存在於膜之TCR複合體/BCR複合體；於BCR複合體之情形時作為免疫球蛋白來分泌；及/或於抗原已知之情形時可與抗原結合。
於本發明之一實施形態中，亦可於上述工序(1)之前進而包括使上述表現TCR或BCR之細胞之至少一部分活化之工序，於另一實施形態中，亦可使用已藉由第三方而活化之細胞。活化之細胞亦可冷凍保存。活化可藉由利用任意之抗原或其抗原MHC複合體、或具有與任意之抗原結合之MHC之抗原呈現細胞(樹狀細胞、巨噬細胞、輔助T細胞等)對上述細胞進行刺激而進行。作為表現TCR或BCR之細胞，可列舉：包含T細胞或B細胞之血液細胞、末梢血液單核細胞、骨髓中淋巴細胞、脾臟內淋巴細胞、胸腺內淋巴細胞、肝臟內淋巴細胞、腎臟內淋巴細胞、其他組織內淋巴細胞、癌組織浸潤淋巴細胞、疾病組織浸潤淋巴細胞、過敏反應組織中之淋巴細胞等，但並不限定於該等。
於特定之實施形態中，活化可進行12小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、10天、2週、3週、4週。於較佳之實施形態中，活化係進行4天～10天之範圍內之任意期間，更佳為7天。活化之期間能夠視細胞增生或細胞激素產生之程度而適當變更。
於本發明之一實施形態中，抗原係選自由病毒構成物質、細菌構成物質、非自身細胞構成物質、及癌細胞特異性構成物質所組成之群，但並不限定於該等。於特定之實施形態中，抗原可選自由病毒肽、病毒肽糖脂質複合體、細菌肽、細菌肽糖脂質複合體、非自身細胞肽(例如動植物細胞或對於供體而言其他人之人類細胞)、非自身細胞肽糖脂質複合體、癌細胞特異性肽、及癌細胞特異性肽糖脂質複合體所組成之群，但並不限定於該等。蛋白質(尤其是膜蛋白)大多經糖或脂質修飾，認為於蛋白質或肽上結合有糖或脂質之物質作為表位而成為TCR或BCR之靶。
於本發明之另一實施形態中，活化可藉由利用選自由抗CD3及/火抗CD28抗體、2,4,6-三甲基-N-(間-3-三氟甲基苯基)苯磺醯胺(m-3M3FBS)等磷脂酶C(PLC)活化劑、離子酶素等鈣離子載體、佛波豆蔻醚乙酸鹽(PMA)等蛋白激酶C(PKC)活化劑、植物血凝素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)、及類鐸受體之活化劑所組成之群中之因子進行刺激而進行。該等因子可使細胞抗原非特異性地活化。
藉由使細胞非特異性地活化，能夠均一且完整地獲得檢體中之T細胞/B細胞中之TCR成對/BCR成對序列。將根據完整之解析所獲得之成對基因資訊進行資料庫化，並進行活用AI(Artificial Intelligence，人工智慧)等之電腦解析，藉此可掌握何種序列彼此成對、或傾向，而期待能夠實現模型化(公式化)。又，對均一取得之成對基因進行選殖，於細胞中進行蛋白質表現，進行純化，對於與蛋白質或肽之結合性進行系統且完整地解析(能夠實施使用BIACORE機器或FRET解析機等機器之方法：結合性解析之指南、教科書：「分子間相互作用解析手冊，羊土社，磯辺俊明・中山敬一・伊藤隆司編輯」、「蛋白質實驗手冊，羊土社，竹繩忠臣編輯」)；或者於適當之細胞中表現，進行利用蛋白質或肽之配體結合試驗(Ligand binding assay)或訊號活化試驗(例如FLIPR細胞內鈣檢測試驗(等)，藉此認為除成對基因以外，亦能夠將抗原序列資訊資料庫化。該等資料藉由進行活用AI等之電腦解析，而期待能夠實現如下模型化，即除何種序列彼此成對以外，該成對序列與何種抗原進行結合。認為最終亦能夠於電腦上設計以特定之抗原作為靶之成對基因序列。
作為類鐸受體之活化劑，可列舉雷西莫特(雷西莫特)(TLR7之活化劑)、脂多醣(LPS)(TLR4之活化劑)等，但並不限定於該等。類鐸受體於人類中存在TLR1～TLR10之10種類，組織或細胞之表現特異性不同，藉由使其等活化，可不經由特定之序列對之TCR或BCR而隨機地使淋巴細胞活化。作為其他類鐸受體，亦能夠同樣地使用咪喹莫特(Imiquimod)及嘎德莫特(Gardiquimod)(TLR7之活化劑)、CpG合成寡核苷酸ODN-2006(序列tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt，TLR9之活化劑)、脂蛋白(TLR1、TLR2、TLR6之活化劑)、肽多糖(TLR2之活化劑)、脂磷壁酸(Lipoteichoic acid)(TLR2之活化劑)、真菌之多糖(TLR2之活化劑)、病毒糖蛋白(TLR2、TLR4之活化劑)、雙鏈RNA(TLR3之活化劑)、合成核酸多聚I/多聚C(TLR3之活化劑)、鞭毛蛋白(TLR5之活化劑)、單鏈RNA(TLR7、TLR8之活化劑)、非甲基化CpG DNA(TLR9之活化劑)等。
於本發明之幾個實施形態中，工序(1)可包括將活化之細胞自未活化之細胞進行分離。活化之細胞之分離例如可藉由抗原-MHC分子複合體或2個～10,000個抗原-MHC分子複合體之聚合物來進行。作為抗原-MHC分子複合體之聚合物，可列舉：表位二聚物、表位三聚物、表位四聚物、及表位五聚物，但並不限定於其等。於較佳之實施形態中，抗原-MHC分子複合體之聚合物係表位四聚物。抗原-MHC分子複合體之聚合物亦可經標記。作為分離之機構，可列舉細胞分選儀等，但並不限定於此。活化之細胞之分離亦可進而將CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD24、CD34、CD45、CD103作為指標。用以分離活化之T細胞之較佳指標為CD8。用以分離活化之B細胞之較佳指標為CD19。
本發明之工序(1)可藉由一步法反轉錄模板轉換PCR進行。具體而言，工序(1)可包括：a)將上述細胞之RNA、反轉錄所需要之試劑、模板轉換所需要之試劑、及聚合酶連鎖反應所需要之試劑進行混合，將混合物供於產生反轉錄之條件下，而提供包含複數種之TCR或BCR之核酸序列之cDNA之工序；及b)將自該工序a)獲得之cDNA供於產生聚合酶連鎖反應之條件下，而提供包含該複數種之TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本之工序。該模板轉換所需要之試劑可包含模板轉換寡核苷酸，該聚合酶連鎖反應所需要之試劑可包含該TCR或該BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子，該C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子可為以於該工序a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙，於該工序b)中引子功能之抑制得到解除之方式設計出的修飾寡核苷酸引子。一步法反轉錄模板轉換PCR係詳細地記載於藉由參照而併入至本案說明書中之國際公開第2017/222056號中。
反轉錄模板轉換PCR係即便於成為模板之RNA之5'末端之序列未知、或不具有共通序列之情形時，亦能夠實現以其RNA作為模板之RT-PCR擴增的技術。於反轉錄模板轉換PCR中，利用如下現象，即若反轉錄酶到達至模板RNA之5'末端，則藉由反轉錄酶所具有之末端轉移酶活性，而於新合成之cDNA之3'末端自動附加特定之短序列。例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)之反轉錄酶(MMLV RT)係將富含胞嘧啶之短序列(例如CC、CCC、CCCC)附加於所合成之cDNA之3'末端。若於反轉錄時向系內添加包含將與該短附加序列互補之序列附加於特定之錨定序列(第一錨定序列)之3'末端而成之核苷酸序列的寡核苷酸(模板轉換寡核苷酸)，則經由cDNA之3'末端之附加序列、與模板轉換寡核苷酸之3'末端之相關附加序列之互補序列之間的相互作用，而與合成有模板轉換寡核苷酸之cDNA之3'末端雜交，從而延長用以反轉錄酶之模板。其結果為，反轉錄酶若到達至模板RNA之5'末端，則將模板轉換為模板轉換寡核苷酸，繼續cDNA合成直至其5'末端，因此於cDNA之3'端附加與模板轉換寡核苷酸之錨定序列(第一錨定序列)互補之序列。作為反轉錄之引子，使用包含與模板RNA中之特定序列互補之序列之寡核苷酸引子、或於5'末端附加有特定之錨定序列(第二錨定序列)之寡核苷酸引子(隨機引子，oligo(dT)引子等)，藉此新合成之cDNA於5'末端亦具備已知序列。其結果為，藉由使用含有包含相關已知序列之寡核苷酸引子、及包含上述第一錨定序列之至少一部分之寡核苷酸引子的引子集合，能夠實現將新合成之cDNA作為模板之PCR擴增。
於本發明之方法中，以「一步法(一階段)」實施反轉錄模板轉換PCR。所謂「一步法反轉錄模板轉換PCR(RT-TS-PCR)」，意指如下根據反轉錄反應之核酸擴增方法，其特徵在於：將反轉錄、模板轉換及PCR所需要之試劑於反應開始時預先全部混合，不進一步追加反轉錄所需要之試劑、模板轉換所需要之試劑、及PCR擴增所需要之試劑，較佳為不開放反應系(即，不進行管之開閉或試劑之添加)而於同一反應系中進行反應。
於本發明之方法中，亦可以「半一步法」實施反轉錄模板轉換PCR(RT-TS-PCR)。所謂「半一步法反轉錄模板轉換PCR(RT-TS-PCR)」，意指如下根據反轉錄反應之核酸擴增方法，其特徵在於：於反轉錄及模板轉換之反應後，不進行緩衝液更換而於同一反應系中添加包含PCR擴增所需要之試劑(引子等)之於反轉錄及模板轉換之反應中所使用的相同緩衝液，藉此於同一反應系中進行其後之PCR反應。
於一個實施形態中，上述模板轉換所需要之試劑可包含模板轉換寡核苷酸。於又一實施形態中，聚合酶連鎖反應所需要之試劑亦可含有包含模板轉換寡核苷酸所包含之錨定序列之至少一部分之5'錨定寡核苷酸引子，亦可不含有該5'錨定寡核苷酸引子。如於本說明書之實施例中所實證般，模板轉換寡核苷酸(TS-Oligo)出乎意料地亦可作為PCR擴增中之正向引子發揮功能。因此，聚合酶連鎖反應所需要之試劑亦可不包含上述5'錨定寡核苷酸引子，亦可為較通常所使用之量少之量。
即便不添加反轉錄用引子而僅添加上述修飾寡核苷酸引子來進行反轉錄PCR，亦可以較高之特異性達成PCR擴增。雖不期望受理論束縛，但於反轉錄反應時，修飾寡核苷酸引子中之一部分其功能未受到阻礙，而功能未受到阻礙之一部分修飾寡核苷酸引子亦可作為反轉錄引子發揮功能，或者於反轉錄反應時，由於修飾寡核苷酸引子之功能之一部分受到阻礙，故而功能之一部分受到阻礙之修飾寡核苷酸引子可限定性地作為反轉錄引子發揮功能。因此，於幾個實施形態中，反轉錄所需要之試劑亦可不包含開始反轉錄之寡核苷酸引子，即便包含，本方法中所使用之開始反轉錄之寡核苷酸引子亦可為較通常所使用之量少之量。於幾個實施形態中，關於上述組合物中之開始反轉錄之寡核苷酸引子之濃度，例如為約40 nM以下、較佳為約20 nM以下、約10 nM以下、約2.5 nM以下、約2.0 nM以下、約0.63 nM以下、約0.2 nM以下、約0.16 nM以下、約0.02 nM以下、約2.0 pM以下、約0.2 pM以下、或約0.02 pM以下。於另一實施形態中，上述組合物中之開始反轉錄之寡核苷酸引子相對於修飾寡核苷酸引子，以約10分之1以下、較佳為約20分之1以下、約40分之1以下、約160分之1以下、約200分之1以下、約635分之1以下、約2,000分之1以下、約2,500分之1以下、約20,000分之1以下、約200,000分之1以下、約2,000,000分之1以下、或約20,000,000分之1以下之莫耳比包含。
關於本發明之方法中之反轉錄模板轉換PCR，作為PCR中之至少一個寡核苷酸引子，藉由修飾而抑制反轉錄中之引子功能之一部分或全部，且於PCR之核酸擴增之工序中引子功能之抑制得到解除。藉此，儘管處於同一反應系中，亦達成將反轉錄反應階段與PCR之核酸擴增階段之各階段中所使用之引子功能性地區分，從而將使各反應階段中之引子濃度產生較大差異設為特徵。
作為引子功能之抑制、解除之方法，例如可列舉以下之指導法。1)藉由包含熱不穩定性修飾基、或以於反轉錄反應階段中保持摺疊結構之方式所設計之引子而抑制反轉錄時之引子功能。反轉錄反應後，藉由熱處理而熱不穩定修飾基背離或摺疊結構消除，藉此引子功能之抑制得到解除。2)藉由包含人工鹼基之引子而於反轉錄反應階段抑制作為引子之功能。
反轉錄反應之結果為，藉由反轉錄反應，自模板RNA合成組入有與引子中所包含之人工鹼基成對之核酸之cDNA，相對於相關人工核酸，引子能夠退火，而引子功能之抑制得到解除。
於一步法RT-PCR中，一般而言，於反轉錄之開始時點，於反應系內包含用以將模板RNA反轉錄為cDNA所需之全部試劑、及用以將所獲得之cDNA作為模板進行PCR所需之全部試劑。PCR引子之Tm通常被設定為50℃以上，因此有於能夠進行反轉錄之溫度區域(例如42℃)未充分地發揮引子之特異性的可能性。又，於PCR中，模板之複製數依指數函數地增加，因此視為需要之PCR引子之濃度壓倒性地高於反轉錄用之引子濃度。因此，有進行反轉錄時PCR引子錯退火為模板RNA，產生以此為起點之非特異性反轉錄，而最終產生非特異性之PCR產物之虞。於本發明中，作為PCR中之反向引子，使用藉由修飾而反轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙，且該反轉錄之結果、或藉由熱改性處理而獲得以該反轉錄之產物作為模板之PCR中之引子功能的修飾寡核苷酸引子，藉此可抑制非特異性反轉錄。
本說明書中，「寡核苷酸」、「引子」、或「寡核苷酸引子」通常表示為單鏈之聚核苷酸。可為天然產生者，亦可為合成者。通常包含約5～約50個核苷酸、更佳為約10～約30個核苷酸、或者更佳為約15～約25個核苷酸之序列。於寡核苷酸中包含DNA、RNA、DNA/RNA嵌合體。
本說明書中，「正向引子」之用語意指將RT-PCR中之模板RNA作為正義鏈時，與其反義鏈退火之寡核苷酸引子。「反向引子」意指與正義鏈退火之寡核苷酸引子。
於一個實施形態中，本發明所使用之修飾寡核苷酸引子包含與模板RNA之部分序列互補之序列。該部分序列之長度並無特別限定，通常為10～40個鹼基、較佳為15～30個鹼基、更佳為18～25個鹼基。該部分序列可為模板RNA所包含之意欲擴增之區域之3'末端之部分序列。該修飾寡核苷酸引子較佳為於其3'末端包含與模板RNA之部分序列互補之序列。該修飾寡核苷酸引子亦可在與模板RNA之部分序列互補之序列之5'末端包含附加序列。附加序列並無特別限定，就避免非特異性之雜交之觀點而言，較佳為不包含與模板RNA之部分序列互補之序列。作為附加序列，例如可列舉特定之限制酶識別序列。附加序列之長度並無特別限定，為了避免非特異性之雜交，較佳為較短之附加序列。附加序列之長度通常為1～50個鹼基、較佳為1～30個鹼基、更佳為1～10個鹼基。於一個實施形態中，該修飾寡核苷酸引子包含與模板RNA之部分序列互補之序列，不包含附加序列。
本發明中所使用之修飾寡核苷酸引子中之修飾之實施形態，例如可列舉以下。 (1)包含熱不穩定性修飾基之寡核苷酸引子 (2)於同一之修飾寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，且在PCR之初期熱改性處理前因該互補區而形成摺疊結構，藉此形成分子內髮夾突環結構(hairpin loop)，呈現與模板RNA之部分序列互補之序列被遮蔽之結構的寡核苷酸引子 (3)包含人工鹼基之寡核苷酸引子
以下對各實施形態進行詳述。
(1)包含熱不穩定性修飾基之寡核苷酸引子 於該實施形態中，由於寡核苷酸引子包含熱不穩定性修飾基，故而修飾核苷酸引子無法沿著其雜交而成之聚核苷酸將鏈伸長，即，藉由抑制酵素、或藉由減少向靶核酸之雜交，無法實現伸長。於較佳之實施形態中，於寡核苷酸引子之1個或1個以上之核苷酸間鍵或3'末端羥基上熱不穩定性修飾基進行取代。因此，鏈伸長只要不去除修飾或經修飾之核苷酸，則於之後被去除之前實質上不會產生。該修飾基係熱不穩定性，但於達到PCR擴增中之最初之改性溫度(例如為約80-105℃、較佳為約85-100℃、更佳為約90-96℃(例如95℃))之前，基本上不會解離，因此反轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙。若達到最初之改性溫度，則藉由熱誘導修飾基自修飾寡核苷酸引子之部分或完全之解離，而修飾寡核苷酸引子被轉化為對應之未修飾寡核苷酸引子。未修飾寡核苷酸引子具有活性狀態之磷酸二酯鍵，能夠藉由聚合酶實現伸長。
作為包含熱不穩定性修飾基之寡核苷酸引子，可列舉：US patent No. 8133669(揭示內容係藉由本說明書中之引用，以與明示出其全部內容相同之程度併入至本說明書中)所揭示之3'末端之羥基被取代為熱不穩定性修飾基而成之修飾寡核苷酸引子、US patent No. 8361753(揭示內容係藉由本說明書中之引用，以與明示出其全部內容相同之程度併入至本說明書中)所揭示之於1個或1個以上之核苷酸間鍵中包含熱不穩定性修飾基之修飾寡核苷酸引子等。
(1-1)3'末端之羥基被取代為熱不穩定性修飾基而成之修飾寡核苷酸引子(US patent No. 8133669) 於一個實施形態中，該修飾寡核苷酸引子之3'末端所包含之該修飾基係選自由如下所組成之群中之任一種基， [化1]
Figure 02_image004
[式中， Z10 係選自由O、S、及Se所組成之群； 各R7 、各R8 、各R9 、及各R10 係獨立地選自由氫、為直鏈狀或支鏈狀且可被取代之具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、較佳為1～6個碳原子之烴基所組成之群，該烴基為亦可包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基之烷基、烯基、或炔基； 各X6 、各X7 、各X8 、及各X9 係獨立地選自包含醯基、醯氧基、烯基、烯基芳基、伸烯基、烷基、低級烷基、伸烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、低級烷氧基、烷基芳基、烷羰基胺基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基、烷基磺醯基胺基、烷硫基、伸炔基、醯胺基、脒基、胺基、芳基炔基、芳烷基、芳醯基、芳基烷基、芳基、芳基羰基胺基、伸芳基、芳氧基、芳基磺醯基胺基、胺基甲酸酯基、二硫代胺基甲酸酯基、環烯基、環烷基、伸環烷基、胍基、鹵基、鹵素、雜芳基、雜芳基羰基胺基、雜芳氧基、雜芳基磺醯基胺基、雜環、雜環、烴基、烴基、烴基羰基、烴氧基羰基、烴基羰氧基亞烴基、有機亞磺醯基、羥基、有機亞磺醯基、有機磺醯基、亞磺醯基、磺醯基、磺醯基胺基、及硫醯基之任意之經取代或未經取代之基； 各X10 係獨立地選自由O、S、Se、NR11 、N-OR11 、及CR11 R12 所組成之群；各R11 及各R12 係獨立地選自包含醯基、醯氧基、烯基、烯基芳基、伸烯基、烷基、低級烷基、伸烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、低級烷氧基、烷基芳基、烷羰基胺基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基、烷基磺醯基胺基、烷硫基、伸炔基、醯胺基、脒基、胺基、芳基炔基、芳烷基、芳醯基、芳基烷基、芳基、芳基羰基胺基、伸芳基、芳氧基、芳基磺醯基胺基、胺基甲酸酯基、二硫代胺基甲酸酯基、環烯基、環烷基、伸環烷基、胍基、鹵基、鹵素、雜芳基、雜芳基羰基胺基、雜芳氧基、雜芳基磺醯基胺基、雜環、雜環、烴基、烴基、烴基羰基、烴氧基羰基、烴基羰氧基、亞烴基(hydrocarbylene)、有機亞磺醯基、羥基、有機亞磺醯基、有機磺醯基、亞磺醯基、磺醯基、磺醯基胺基、及硫醯基之任意之經取代或未經取代之基； 各Y1 係獨立地選自由O、S、Se、NR6 、N-OR6 、及CR6 R7 所組成之群]。
於較佳之實施形態中，該修飾基係選自由O-(對甲苯)磺酸酯；O-磷酸；O-硝酸；O-[4-甲氧基]四氫哌喃基；O-[4-甲氧基]-四氫硫代哌喃基；O-四氫硫代哌喃基；O-[5-甲基]-四氫呋喃基；O-[2-甲基、4-甲氧基]-四氫哌喃基；O-[5-甲基]-四氫哌喃基；O-四氫哌喃基；O-四氫呋喃基；O-苯氧基乙醯基；O-甲氧基乙醯基；O-乙醯基；O-C(O)-OCH3 ；O-C(O)-CH2 CH2 CN；及O-C(S)-OCH3 所組成之群。於一部分之尤佳之形態中，該修飾基係選自由O-甲氧基四氫哌喃基；O-四氫哌喃基；及O-四氫呋喃基所組成之群。
於另一實施形態中，修飾寡核苷酸引子係式V所表示之化合物： [化2]
Figure 02_image005
[式中， Z3 為3'-O-寡核苷酸殘基、或寡核苷酸引子， B係選自較佳為藉由經取代或未經取代之嘌呤或嘧啶、其任意之氮雜衍生物或去氮雜衍生物、或者核酸聚合酶能夠進行識別的基於任意NTP類似物之任意之「萬能鹼基」或「退化鹼基」； A係選自由O、S、Se、CR1 R2 、及NR1 所組成之群； 各R1 及各R2 係獨立地選自由H、F、Cl、Br、I、OR3 、SR3 、NR3 R4 、C(Y)R5 、以及經取代或未經取代之烷基、烯基、炔基、芳基、及芳烷基所組成之群， 任意之取代基分別視情形，有可能含有1個或複數個雜原子； 各Y係獨立地選自由O、S、Se、CR1 R2 、及NR1 所組成之群； 各R3 及各R4 係獨立地選自由H、或者經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之芳基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群，任意之取代基分別視情形，有可能含有1個或複數個雜原子； 各R5 係獨立地選自由H、F、Cl、Br、OR3 、SR3 、NR3 R4 、以及經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之芳基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群，任意之取代基分別視情形，有可能含有1個或複數個雜原子； X4 係獨立地選自由R1 、F、Cl、Br、I、OR3 、SR3 、SeR3 、NR3 R4 、NR3 OR3 、NR3 -NR3 R4 、CN、N3 、C(Y)R5 、NO2 、CN、及SSR3 所組成之群； X5 係選自由O、S、Se、NR6 、N-OR6 、及CR6 R7 所組成之群； Y1 係選自由O、S、Se、NR6 、N-OR6 、CR6 R7 、及C(Y)所組成之群； 各R6 及各R7 係獨立地選自由氫、又為直鏈狀或支鏈狀且可經取代之具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、較佳為1～6個碳原子之烴基所組成之群，且該烴基係可包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基之烷基、烯基、或炔基； X5 及Y1 分別視情形，有可能經由適當之原子或原子群共價鍵結於式IB所示之NTP分子之X4 、X5 、Z3 、A、W、或B部分]。
於式V之特定之實施形態中，B係胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胺基烯丙基尿嘧啶、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮-7-甲基鳥嘌呤、7-去氮-7-碘鳥嘌呤、7-去氮-7-胺基烯丙基鳥嘌呤、7-去氮雜-8-氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤(7-deazadenine)、2,6-二胺基嘌呤、5-硝基胞嘧啶、5-胺基烯丙基胞嘧啶、5-(生物素-16)-胞嘧啶、5-(螢光素-11)-胞嘧啶、4-甲基胺基-胞嘧啶、及2-硫代-5-甲基尿嘧啶、或4-硫代-5-甲基尿嘧啶。
於式V之較佳之實施形態中，B為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、或尿嘧啶。
於較佳之實施形態中，修飾寡核苷酸引子係選自由 [化3]
Figure 02_image006
所組成之群中之任一種化合物。
上述1-1之修飾寡核苷酸引子可藉由US patent No. 8361753所記載之方法進行製造。
(1-2)於1個或1個以上之核苷酸間鍵中包含熱不穩定性修飾基之修飾寡核苷酸引子(US Patent No. 8361753) 於一個實施形態中，該修飾寡核苷酸引子中之修飾基包含式I之化合物： [化4]
Figure 02_image007
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子之直鏈或支鏈之可任意被取代之亞烴基； X為O、S、S(O)、S(O)2 、C(O)、C(S)或C(O)NH；及R1 為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子之直鏈或支鏈之可任意被取代之烴基；較佳為烴基為烷基、烯基或炔基，其亦可任意地包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基]。
於一個實施形態中，修飾基係提供式Ia之化合物： [化5]
Figure 02_image008
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2-5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之亞烴基；及 R1 為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之烴基；較佳為烴基為烷基、烯基或炔基，其亦可任意地包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基]。
式Ia之修飾基之較佳之實施形態係如下所示： [化6]
Figure 02_image009
4-側氧基-1-戊基、 [化7]
Figure 02_image010
5-側氧基-1-己基、 [化8]
Figure 02_image011
6-側氧基-1-庚基、 [化9]
Figure 02_image012
4-側氧基-1-己基、 [化10]
Figure 02_image013
5-甲基-4-側氧基-1-己基、 [化11]
Figure 02_image014
2-甲基-5-側氧基-己基、 [化12]
Figure 02_image015
1-乙基-4-側氧基-戊基、 [化13]
Figure 02_image016
1-甲基-4-側氧基-戊基、 [化14]
Figure 02_image017
1,1-二甲基-4-側氧基-戊基、 [化15]
Figure 02_image018
4-側氧基-1-辛基 [化16]
Figure 02_image019
4-側氧基-1-十四烷基、及 [化17]
Figure 02_image020
4-側氧基-1-二十烷基。
於1個態樣中，修飾基係提供式Ib之化合物： [化18]
Figure 02_image021
[式中， k為0～2之整數； L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代的亞烴基；及 R1 為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代的烴基；較佳為烴基為烷基、烯基或炔基，其亦可任意地包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基]。
於較佳之實施形態中，式Ib之修飾基係下述所示之4-甲硫基-1-丁基： [化19]
Figure 02_image022
於1個態樣中，修飾基提供式Ic之化合物： [化20]
Figure 02_image023
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之亞烴基；及 R1 為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之烴基；較佳為烴基為烷基、烯基或炔基，其亦可任意地包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基]。
於較佳之實施形態中，式Ic之修飾基係下述所示之3-(N-第三丁基甲醯胺)-1-丙基： [化21]
Figure 02_image024
於1個態樣中，修飾基提供式Id之化合物： [化22]
Figure 02_image025
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子之直鏈或支鏈之亞烴基；及 各R1 獨立地為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之烴基；較佳為烴基為烷基、烯基或炔基，其亦可任意地包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基]。
作為修飾基式Id之較佳之實施形態，可列舉：2-(N-甲醯基-N-甲基)胺基乙基或2-(N-乙醯基-N-甲基)胺基乙基(以下所示)： [化23]
Figure 02_image026
2-(N-乙醯基-N-甲基)胺基乙基
於另一態樣中，修飾基提供式II之化合物： [化24]
Figure 02_image027
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子之直鏈或支鏈之亞烴基；及 R2 為氫、氰基、或具有5～10個原子之可任意地被取代之碳環、雜環、芳基或雜芳基]。
於較佳之實施形態中，式II之修飾基係下述所示之N-(2-羥乙基)-鄰苯二甲醯亞胺： [化25]
Figure 02_image028
N-(2-羥乙基)-鄰苯二甲醯亞胺
於另一態樣中，修飾基提供式III之化合物： [化26]
Figure 02_image029
[式中， La 及Lb 分別獨立地選自單鍵、或具有1～8個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之亞烴基； A為O、S、S(O)、S(O)2 、Se、CR3 R4 、NR3 、C(O)、C(S)或CNR3 ； B為C(O)R3 、C(S)R3 、C(O)NR3 R4 、OR3 或SR3 ；及 R3 及R4 分別獨立地為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、較佳為1～6個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之烴基；較佳為烴基為烷基、烯基或炔基，其亦可任意地包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基]。
於另一實施形態中，修飾基提供式IV之化合物： [化27]
Figure 02_image030
[式中， La 、Lb 及Lc 分別獨立地選自單鍵、或具有1～8個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之亞烴基； D為O、S、S(O)、S(O)2 、CR5 R6 、或NR5 ； E為O、S、S(O)、S(O)2 、CR5 R6 、或NR6 ； F為氫、C(O)R7 、C(S)R7 、C(O)NR7 R8 、OR7 或SR7 ； R5 及R6 可分別獨立地為氫、芳基、烷基、鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、芳氧基、或胺基，或者R5 及R6 一起形成包含5～10個原子且包含D、R5 、R6 、E及Lb 之單環或二環，其中，於R5 及R6 一起形成環之情形時，n為0-2；及 R7 及R8 分別獨立地選自芳基、烷基、鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、芳氧基、胺基、醯胺基、可任意地被取代之環烷基、可任意地被取代之雜環烷基、可任意地被取代之芳基、可任意地被取代之芳氧基、或可任意地被取代之雜芳基]。
於R5 及R6 一起形成環之式IV之化合物之一個實施形態中，修飾基係下述所示之甲氧基甲基-環己基-1,3-乙基： [化28]
Figure 02_image031
甲氧基甲基-環己基-1,3-乙基
於1個態樣中，修飾寡核苷酸引子具有結構I之修飾骨架： [化29]
Figure 02_image032
[式中， Nuc係引子序列中之核苷； U及Z獨立為O、S、Se、NR9 、或CR9 R10 ； R9 及R10 分別獨立地為氫、或具有1～10個碳原子之直鏈或支鏈之可任意地被取代之烴基；較佳為烴基為烷基、烯基或炔基，各自亦可獨立地包含選自鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、芳氧基、胺基、醯胺基或能夠檢測之標記中之至少1個取代基； Y為O、S或Se； W為能夠藉由熱切斷Q之任意之化學成分、例如O、S、S(O)、S(O)2 、Se、C(O)、C(S)、C(O)NH、C(N)H、NH、-C(＝NR11 )-或NR9 ； R11 為氫或具有1～10個碳原子、較佳為1～6個碳原子之可任意地被取代之烴基；較佳為R11 為H、烷基或低級烷基；及 Q為包含1個或1個以上之熱切斷性基之修飾基]。
於一個實施形態中，修飾基Q包含選自上述式I、Ia、Ib、Ic、Id、II、III或IV中之1個或1個以上之熱切斷性基。
修飾寡核苷酸引子係於至少1個核苷酸間鍵中包含上述任一種修飾基。修飾寡核苷酸引子較佳為於其3'末端包含1個或1個以上之上述任一種修飾基。修飾寡核苷酸引子較佳為於其3'末端之最後6個核苷酸間鍵之任一結合、較佳為最後3個核苷酸間鍵之任一結合中包含1個或1個以上之上述任一種修飾基。
於另一實施形態中，寡核苷酸引子可包含於寡核苷酸引子之3'-末端結束之2、3、4、5或6個修飾核苷酸間鍵之連續之序列。於又一實施形態中，寡核苷酸引子亦可包含複數個非連續性之3'修飾核苷酸間鍵。於修飾寡核苷酸引子之5'-末端亦可具有包含修飾核苷酸間鍵之核苷酸之序列。於又一實施形態中，亦可對寡核苷酸之全部核苷酸間鍵進行修飾。
於另一較佳之實施形態中，修飾寡核苷酸引子係於寡核苷酸引子之3'n核苷酸間鍵中包含修飾基，此處，n為3'末端之核苷酸間鍵。於又一實施形態中，修飾基係存在於寡核苷酸之3' n-1、n-2、n-3或n-4核苷酸間鍵中。於又一實施形態中，寡核苷酸係於n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5或n-6位之2或2個以上；較佳為n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5或n-6位之2個或2個以上；較佳為n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5或n-6位之3個或3個以上；較佳為n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5或n-6位之4個或4個以上；較佳為n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5或n-6位之5個或5個以上、或者較佳為n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5或n-6位之6個或6個以上中具有修飾基。
上述1-2之修飾寡核苷酸引子可藉由US Patent No. 8361753所記載之方法進行製造。
(2)於同一之修飾寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，且在PCR之初期熱改性處理前因該互補區而形成摺疊結構，藉此形成分子內髮夾突環結構，而呈現與模板RNA之部分序列互補之序列得到遮蔽之結構的寡核苷酸引子 於該實施形態中，於同一之修飾寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，且在PCR之初期熱改性處理前因該互補區而形成摺疊結構，藉此形成分子內髮夾突環結構。該互補區係指包含1個或1個以上之寡核苷酸之第一序列、與包含1個或1個以上之與其互補之寡核苷酸之第二序列的組合。
第一序列與第二序列之位置亦可相互鄰接，但於第一序列與第二序列之間亦可經由1個或1個以上之寡核苷酸而位置。於第一序列或第二序列包含與模板RNA之部分序列互補之序列之情形時，藉由第一序列與第二序列之互補結合，而與模板RNA之部分序列互補之序列得到遮蔽。因此，於該情形時，第一序列與第二序列之寡核苷酸之數量並無特別限定。
於第一序列或第二序列不包含與模板RNA之部分序列互補之序列之情形時，於第一序列與第二序列之寡核苷酸之間包含與模板RNA之部分序列互補之序列，藉由分子內髮夾突環結構形成，而與模板RNA之部分序列互補之序列得到遮蔽。
由於與模板RNA之部分序列互補之序列得到遮蔽，故而於反轉錄時，無法與模板RNA之相對應之部分序列進行雜交，而引子功能之一部分或全部受到阻礙。然而，於PCR擴增中之改性溫度(例如約55～105℃、較佳為約85～100℃、更佳為約90～96℃(例如95℃))下，髮夾突環結構結構解離，而暴露與模板RNA之部分序列互補之序列，因此於接下來之對合溫度下能夠與cDNA中之相對應之部分序列進行雜交(即，獲得引子功能)。髮夾突環結構之環狀部分之長度通常為5～25個鹼基左右。該環狀部分之核苷酸序列只要可形成分子內髮夾突環結構，則無特別限定。
(3)包含人工鹼基之寡核苷酸引子 該實施形態之修飾寡核苷酸引子包含人工鹼基(非天然鹼基)，因此該修飾寡核苷酸引子之核苷酸序列之互補序列於模板RNA(不包含人工鹼基之模板RNA)中實質上不存在。因此，該修飾寡核苷酸引子向模板RNA之雜交受到阻礙，因此反轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙。於一個實施形態中，該修飾寡核苷酸引子之3'末端之15個鹼基中，1個鹼基以上、較佳為3個鹼基以上、5個鹼基以上、10個鹼基以上、12個鹼基以上、較佳為15個鹼基全部為人工鹼基。於較佳之實施形態中，該修飾寡核苷酸引子之最靠近3'末端之鹼基為人工鹼基。
該實施形態之修飾寡核苷酸引子係與包含含有該修飾寡核苷酸引子之人工鹼基之部分序列之用以開始反轉錄的寡核苷酸引子組合來使用。包含人工鹼基之部分序列之長度係10～40個鹼基、較佳為15～30個鹼基、更佳為18～25個鹼基。包含人工鹼基之部分序列並無特別限定，例如可為該修飾寡核苷酸引子之3'末端之部分序列。用以開始反轉錄之寡核苷酸引子包含與模板RNA之部分序列互補之序列、及上述包含人工鹼基之部分序列，該包含人工鹼基之部分序列係附加於與模板RNA之部分序列互補之序列的5'側。模板RNA之部分序列之長度並無特別限定，通常為10～40個鹼基、較佳為15～30個鹼基、更佳為18～25個鹼基。該部分序列可為模板RNA所包含之意欲擴增之區域之3'末端的部分序列。用以開始反轉錄之寡核苷酸引子較佳為於其3'末端包含與模板RNA之部分序列互補之序列。
若使用此種組合而進行一步法反轉錄模板轉換PCR，則於反轉錄中合成於5'末端附加有包含修飾寡核苷酸引子之人工鹼基之部分序列之cDNA，因此其結果為，上述包含人工鹼基之修飾寡核苷酸引子獲得以該cDNA作為模板之PCR中之引子功能。並且，藉由進行以該cDNA作為模板並將該修飾寡核苷酸引子作為一引子之PCR擴增，可將目標區域特異性地擴增。
作為人工鹼基，可列舉：Z鹼基/F鹼基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 105061；Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 950；Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 954)、Q鹼基(J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2323)、iso-G鹼基/iso-C鹼基(J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8322)、2-硫代T(TS )鹼基(Nucleic Acids Res. 2005, 33, 5640)、P鹼基/Z鹼基(Nucleic Acids Res. 2007, 35, 4238)、PICS鹼基(J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11585)、5SICS鹼基/MMO2鹼基/NaM鹼基(J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14620)、2-amino-6-dimethylaminopurine(x)/2-oxopyridine(y)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 4922)、2-胺基-6-(2-噻吩基)嘌呤(s)(J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 17286；Nucleic Acids Res. 2005, 33, e129；Biotechniques 2006, 40, 711)、imidazolin-2-one(z)(J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 13298)、Ds鹼基/Pa鹼基(Nat. Methods 2006, 3, 729)、Pn鹼基(J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15549)、Px鹼基(Nucleic Acids Res. 2009, 37, e14)、xA鹼基、xT鹼基(J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 11826)、Im-NO 鹼基/Nα-ON 鹼基、Im-ON 鹼基/Nα-NO 鹼基(J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1644；Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 596)等，但並不限定於其等。該等人工鹼基藉由形成以下之鹼基對而可有助於反轉錄及/或PCR擴增：Z-F鹼基對、Q-F鹼基對、isoG-isoC鹼基對、A-TS 鹼基對、P-Z鹼基對、PICS-PICS鹼基對(自互補性)、5SICS-MMO2鹼基對、5SICS-NaM鹼基對、x-y鹼基對、s-y鹼基對、s-z鹼基對、Ds-Pa鹼基對、Ds-Pn鹼基對、Ds-Px鹼基對、xA-T鹼基對、A-xT鹼基對、Im-NO -Nα-ON 鹼基對、Im-ON -Nα-NO 鹼基對。
於以下進一步詳細地記載本發明之方法。
於本發明之方法中，首先提供一種組合物，其包含 i)模板轉換寡核苷酸、 ii)包含含有該模板轉換寡核苷酸所包含之錨定序列之至少一部分之5'錨定寡核苷酸引子、及上述修飾寡核苷酸引子之引子集合、以及 iii)模板RNA 且包含用以將模板RNA模板轉換反轉錄為cDNA、及用以將該cDNA之至少一部進行PCR擴增所需要之全部試劑(其中，將開始反轉錄之寡核苷酸引子除外)。
模板轉換寡核苷酸於反轉錄酶到達至模板RNA之5'末端時，藉由反轉錄酶所具有之末端轉移酶活性，而包含與附加於新合成之cDNA之3'末端之序列(有僅稱為RT附加序列之情形)互補之序列、及錨定序列，且於RT附加序列之互補序列之5'末端附加有錨定序列(第一錨定序列)。較佳為RT附加序列之互補序列位於模板轉換寡核苷酸之3'末端。RT附加序列係依賴於反轉錄酶之種類。例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)之反轉錄酶(MMLV RT)係將富含胞嘧啶之短序列(例如CC、CCC、CCCC)附加於所合成之cDNA之3'末端，因此作為其互補序列之富含鳥嘌呤之短序列(例如GG、GGG、GGGG)作為RT附加序列之互補序列包含於模板轉換寡核苷酸中。所謂錨定序列，意指附加於寡核苷酸之5'末端之人工序列。錨定序列較佳為於自然界不存在之序列。錨定序列之長度並無特別限定，通常為10個鹼基～100個鹼基左右、較佳為15個鹼基～50個鹼基左右。
模板轉換寡核苷酸可為DNA，亦可為RNA，或者亦可為DNA/RNA嵌合體。模板轉換寡核苷酸為了作為反轉錄中之模板有效率地發揮功能，而適宜為RNA或DNA/RNA嵌合體，更佳為DNA/RNA嵌合體。於一個實施形態中，RT附加序列之互補序列之部分為RNA，錨定序列之部分為DNA或DNA/RNA嵌合體。模板轉換寡核苷酸亦作為以下所說明之5'錨定寡核苷酸引子發揮功能。因此，於幾個實施形態中，可將5'錨定寡核苷酸引子之添加省略，或添加少量之5'錨定寡核苷酸引子。
5'錨定寡核苷酸引子包含上述模板轉換寡核苷酸所包含之錨定序列(第一錨定序列)之一部分或全部。錨定序列之一部分或全部之長度通常為10～40個鹼基、較佳為15～30個鹼基、更佳為18～25個鹼基。為了可作為PCR中之引子發揮功能，為DNA或DNA/RNA嵌合體，較佳為DNA。5'錨定寡核苷酸引子可為PCR中之正向引子。
作為模板RNA，可使用mRNA、rRNA、tRNA、非編碼RNA、化學合成之RNA等，但並不限定於其等。mRNA、rRNA及tRNA可為源自任意之細胞、組織者。mRNA、rRNA及tRNA亦可為自利用細胞分選儀等所獲得之微量之細胞、組織(例如單細胞)中採取者。mRNA、rRNA及tRNA亦可為如作為總RNA之一部分包含之形態。
於上述組合物中，包含用以將該模板RNA模板轉換反轉錄為cDNA、及用以將該cDNA之至少一部分進行PCR擴增所需要之全部試劑(其中，將開始反轉錄之寡核苷酸引子除外)。作為該試劑，除上述之模板轉換寡核苷酸、引子集合、及模板RNA以外，亦可列舉以下。 ・反轉錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶) ・耐熱性DNA聚合酶(DNA依賴性DNA聚合酶) ・dNTPs混合物
為了於cDNA之3'末端形成RT附加序列，所使用之反轉錄酶具有末端轉移酶活性。作為具有末端轉移酶活性之反轉錄酶，可列舉源自莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)之反轉錄酶(MMLV RT)等，但並不限定於其等。末端轉移酶活性較佳為將富含胞嘧啶之短序列(例如CC、CCC、CCCC)附加於所合成之cDNA之3'末端的活性。
作為耐熱性DNA聚合酶，就代表性而言，可列舉Taq、Tth、KOD、Pfu、Bst等，但並不限定於其等，開發出能夠用於PCR之各種耐熱性DNA聚合酶，且均能夠用於本發明。能夠用於PCR之耐熱性DNA聚合酶係業者所周知，可適當進行選擇。
於一個實施形態中，上述組合物進而包含開始反轉錄之寡核苷酸引子。開始反轉錄之寡核苷酸引子藉由包含與模板RNA之部分序列互補之序列，而與模板RNA雜交，從而開始反轉錄。該部分序列之長度並無特別限定，通常為10～40個鹼基、較佳為15～30個鹼基、更佳為18～25個鹼基。開始反轉錄之寡核苷酸引子較佳為於其3'末端包含與模板RNA之部分序列互補之序列。亦可在與模板RNA之部分序列互補之序列之5'末端附加錨定序列(第二錨定序列)。第二錨定序列較佳為自然界不存在之序列。第二錨定序列之長度並無特別限定，通常為10個鹼基～100個鹼基左右、較佳為15個鹼基～50個鹼基左右。第二錨定序列較佳為與上述第一錨定序列不一致。於一個實施形態中，於第二錨定序列中包含人工鹼基。於一個實施形態中，開始反轉錄之寡核苷酸引子不包含第二錨定序列。開始反轉錄之寡核苷酸引子係對於特定基因具有特異性之引子、與mRNA之多聚腺苷酸尾(poly-A tail)結合之寡dT引子、或者如無規六聚物引子之隨機引子之任一者，較佳為對於特定基因具有特異性之引子。該引子包含與編碼目標基因之RNA(例如mRNA)之部分序列互補之序列。開始反轉錄之寡核苷酸引子為了可作為反轉錄中之引子發揮功能，其為DNA或DNA/RNA嵌合體，較佳為DNA。
於一個實施形態中，模板RNA上之開始反轉錄之寡核苷酸引子所雜交之區域、與上述修飾寡核苷酸引子所雜交之區域係至少一部分重疊。所重疊之雜交區域之長度為通常10個鹼基以上、較佳為15個鹼基以上、更佳為18個鹼基以上，並無特別限定。所重疊之雜交區域之長度例如可為40個鹼基以下、30個鹼基以下、25個鹼基以下。
於較佳之實施形態中，修飾寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端較開始反轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端，更位於模板RNA之5'側(上游)。即，以較開始反轉錄之寡核苷酸引子之3'末端，修飾寡核苷酸引子之3'末端於模板RNA之5'側(上游)與模板RNA雜交之方式設計兩引子。藉由如上述般將上述2個引子設計成半嵌套狀之位置關係，可期待擴增之特異性提昇。於該情形時，可使開始反轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域、與上述修飾寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域一部分重疊而形成半嵌套狀，亦可不重疊而形成完全之嵌套狀。
於使開始反轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域、與上述修飾寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域一部分重疊之情形時，例如較佳為以如下方式設計兩引子，即，修飾寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端較開始反轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端，例如有1～12個鹼基、較佳為1、2、3、4或5個鹼基成為模板RNA之5'側(上游)(即，修飾寡核苷酸引子之3'末端較開始反轉錄之寡核苷酸引子之3'末端，例如有1～10個鹼基、較佳為1、2、3、4或5個鹼基與模板RNA之5'側(上游)雜交)，但並不限定於其等。
於另一實施形態中，開始反轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域、與上述修飾寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域係至少一部分重疊，且修飾寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端與開始反轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端一致。即，修飾寡核苷酸引子之3'末端在與開始反轉錄之寡核苷酸引子之3'末端相同之位置上與模板RNA雜交。
於一個實施形態中，開始反轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域、與上述修飾寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域相同。於該實施形態中，開始反轉錄之寡核苷酸引子可為與上述修飾寡核苷酸引子對應之未修飾寡核苷酸引子。
於另一實施形態中，上述修飾寡核苷酸引子於其3'末端包含開始反轉錄之寡核苷酸引子之部分序列。相關部分序列(以下，有時稱為共通序列)之長度通常為10個鹼基以上、較佳為15個鹼基以上、更佳為18個鹼基以上，但並無特別限定。相關3'末端部分序列之長度例如可為40個鹼基以下、30個鹼基以下、25個鹼基以下。於一個實施形態中，相關共通序列可為開始反轉錄之寡核苷酸引子之3'末端之部分序列。於另一實施形態中，相關共通序列之3'末端較開始反轉錄之寡核苷酸引子之3'末端，至少1個鹼基(例如1～20個鹼基、1～10個鹼基、1～8個鹼基)位於5'側。於一個實施形態中，該共通序列係開始反轉錄之寡核苷酸引子所包含之與模板RNA之部分序列互補之序列、或其部分序列。於一個實施形態中，該共通序列係第二錨定序列或其部分序列。於一個實施形態中，該共通序列係跨及與模板RNA之部分序列互補之序列及第二錨定序列的開始反轉錄之寡核苷酸引子之部分序列。於一個實施形態中，上述修飾寡核苷酸引子為包含人工鹼基之寡核苷酸引子，開始反轉錄之寡核苷酸引子於5'末端包含含有人工鹼基之第二錨定序列，共通序列為第二錨定序列或其部分序列。
於上述組合物包含開始反轉錄之寡核苷酸引子之情形時，該寡核苷酸引子之濃度只要有足夠開始反轉錄之量即可。於反轉錄中，若可將包含意欲擴增之區域之cDNA進行1次複製合成，則能夠藉由之後之PCR進行擴增直至能夠檢測出其之等級。因此，只要於該組合物中(反應系內)包含至少1次複製、較佳為10次複製以上、更佳為100次複製以上之開始反轉錄之寡核苷酸引子即可。若開始反轉錄之寡核苷酸引子之濃度過高，則有可能引起由非特異性之雜交產生之副反應。上述組合物中之開始反轉錄之寡核苷酸引子之濃度例如為約40 nM以下、較佳為約20 nM以下、約10 nM以下、約2.5 nM以下、約2.0 nM以下、約0.63 nM以下、約0.2 nM以下、約0.16 nM以下、約0.02 nM以下、約2.0 pM以下、約0.2 pM以下、或約0.02 pM以下。
於另一實施形態中，上述組合物不包含開始反轉錄之寡核苷酸引子。於該實施形態中，作為上述修飾寡核苷酸引子，使用包含熱不穩定性修飾基，且包含與模板RNA之部分序列互補之序列之寡核苷酸引子。該修飾寡核苷酸引子較佳為包含於1個或1個以上之核苷酸間鍵或3'末端包含熱不穩定性修飾基。該修飾寡核苷酸引子所包含之熱不穩定性修飾基於達到PCR擴增中之最初之改性溫度(例如約80～105℃、較佳為約85～100℃、更佳為約90～96℃(例如95℃))之前基本上未解離，但本發明者發現，該熱不穩定性修飾基於進行反轉錄之溫度(例如45℃)下少量解離，藉此所產生之相對應之未修飾寡核苷酸可作為開始反轉錄之寡核苷酸引子發揮功能。
上述組合物亦可視需要含有緩衝液、鹽(鎂離子等)、核糖核酸酶(RNAase)抑制劑。
關於上述組合物中所包含之模板轉換寡核苷酸之濃度，只要可實施本發明之方法，則無特別限定，例如為0.05～5.0 μM、較佳為0.1～1.0 μM左右。
上述組合物中所包含之5'錨定寡核苷酸引子及上述修飾寡核苷酸引子之濃度係與進行先前方法之PCR時的引子濃度同等，例如為0.1～1.0 μM左右。
關於上述組合物中可包含之其他構成因子(模板RNA、反轉錄酶、耐熱性DNA聚合酶、dNTPs混合物、緩衝液、鹽、核糖核酸酶抑制劑)之濃度，於一步法RT-PCR之先前技術中係周知，進而可根據例行(routine)實驗獲得本發明之上下文中所使用之濃度之最佳化。
繼而，將上述中所提供之組合物於能夠進行反轉錄之溫度下進行培養。能夠進行反轉錄之溫度可根據反轉錄酶之種類而適當進行調整，但通常為37℃～62℃、較佳為37℃～55℃。培養時間可考慮模板RNA之尺寸等而適當進行調整，通常為30秒鐘～120分鐘、較佳為5分鐘～60分鐘。藉由相關培養，熱不穩定性修飾基自組合物中所包含之開始反轉錄之寡核苷酸引子、或修飾寡核苷酸引子解離，藉此產生未修飾寡核苷酸，該未修飾寡核苷酸使反轉錄啟始(prime)而合成與模板RNA互補之cDNA(反義鏈)。反轉錄酶若到達模板RNA之5'末端，則將模板轉換為模板轉換寡核苷酸，繼續cDNA合成直至其5'末端，因此產生於3'端附加有與模板轉換寡核苷酸之錨定序列互補之序列的單鏈cDNA(反義鏈)。
繼而，將包含所獲得之cDNA之反應混合液供於能夠進行PCR之複數次熱循環方案(protocol)。該熱循環方案包括改性(亦稱為熱改性)、退火、伸長之3個溫度步驟之循環。改性只要為足夠使雙鏈DNA解離之溫度即可，無特別限定，較佳之熱改性溫度之下限為90℃且上限為100℃。退火係將引子退火為所解離之DNA之步驟，且此時之溫度(退火溫度)並無特別限定，較佳之退火溫度之下限為45℃，進而較佳為50℃。另一方面，較佳之上限為75℃，進而較佳為70℃。伸長係利用DNA聚合酶合成互補鏈之步驟，且此時之溫度(伸長溫度)並無特別限定，較佳之伸長溫度之下限為50℃且上限為80℃。上述循環中，退火溫度不會超過伸長反應溫度。藉由將退火與伸長於1個溫度下實施，亦能夠以實質上2個溫度步驟之循環構成熱循環方案。於該情形時，較佳之退火及伸長之溫度之下限為50℃，進而較佳為55℃。另一方面，較佳之上限為70℃，進而較佳為65℃。作為各步驟中之培養時間，可例示1秒～5分鐘，若為業者，則可考慮擴增產物之尺寸等而容易地設定適當之培養時間。
於將反應混合液供於熱循環方案之前，亦可實施用以使反轉錄酶失活之改性工序(預培養工序)。該改性溫度只要可使反轉錄酶去活化，則無特別限定，較佳之熱改性溫度之下限為90℃且上限為100℃。改性時間只要可使反轉錄酶去活化，則無特別限定，通常為1分鐘以上且15分鐘以下。
於使用包含熱不穩定性修飾基之寡核苷酸引子作為修飾寡核苷酸引子之情形時，於熱循環方案之最初之改性工序、或預培養工序中，修飾基自修飾寡核苷酸引子解離，而轉化為相對應之未修飾寡核苷酸引子。未修飾寡核苷酸引子具有活性狀態之磷酸二酯鍵，可使利用聚合酶之伸長啟始。
於熱循環之最初之退火及伸長工序中，5'錨定寡核苷酸引子退火為與在反轉錄工序中所獲得之單鏈cDNA(反義鏈)之3'端所存在之錨定序列互補的序列，產生利用聚合酶之伸長，而合成於5'末端附加有錨定序列(第一錨定序列)之cDNA(正義鏈)，結果產生於正義鏈之5'末端附加有錨定序列之雙鏈cDNA。
然後，將包含上述雙鏈cDNA之反應混合物供於接下來之複數次熱循環方案，而將處在5'錨定寡核苷酸引子與修飾寡核苷酸引子之間之區域(即，自5'末端錨定序列至修飾寡核苷酸引子所雜交之區域)擴增。
熱循環之次數可考慮模板RNA之量等而適當設定，例如為20次以上、較佳為30次以上、40次以上、45次以上、50次以上、或55次以上。於一般之RT-PCR之情形時，即便於模板RNA之複製數較少之情形時(例如單複製)，亦只要進行40次左右熱循環，擴增反應就會達到飽和，但於本發明之方法中(尤其是使用包含熱不穩定性修飾基之修飾寡核苷酸引子之情形時)，即便進行45次以上、50次以上、或55次以上之熱循環，擴增反應亦不會達到飽和，而能夠實現進一步擴增。於本發明之方法中(尤其是使用包含熱不穩定性修飾基之修飾寡核苷酸引子之情形時)，有可能1次熱循環之擴增效率較一般之RT-PCR更受到阻礙，但並不受限於理論。因此，例如於意欲擴增之模板RNA之複製數較少之情形時(例如100次複製以下、10次複製以下、單複製)、或於將自單細胞單離之RNA(尤其是總RNA)作為模板RNA而實施本發明之方法之情形時，較佳為將熱循環之次數設為40次以上、45次以上、50次以上、或55次以上。
根據本發明之方法，可期待以較高之特異性並藉由一步法來實施反轉錄模板轉換PCR。於反轉錄模板轉換PCR中，其特異性實質上可僅由反向引子所決定，但於本發明中，藉由採用上述修飾寡核苷酸引子作為反向引子，可以較高之特異性擴增目標基因。尤其是於成為模板之RNA之複製數較少之情形時(例如於將源自單細胞之RNA作為模板之情形時)，即便於增加了PCR之循環數之情形時，亦可期待抑制副反應產生，並且擴增特異性PCR產物。因此，例如藉由使用對於抗原受體(例如抗體(重鏈、輕鏈)、T細胞受體(α鏈、β鏈、γ鏈、δ鏈)之恆定區具有特異性之反向引子作為上述修飾寡核苷酸引子，藉由使用對於抗原受體(例如抗體(重鏈、輕鏈)、T細胞受體(α鏈、β鏈、γ鏈、δ鏈)之恆定區具有特異性之反向引子，可以單細胞等級實施抗原受體之抗原識別部位之序列解析。
於幾個實施形態中，作為於本發明中可使用之反轉錄所需要之試劑，除反轉錄酶以外，還可包含：(i)與TCRα之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子及與TCRβ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子；(ii)與TCRδ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子及與TCRγ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子；或者(iii)與BCR重鏈之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子及與BCR輕鏈之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子。
於本發明之一個實施形態中，聚合酶連鎖反應所需要之試劑亦可視需要，進而包含含有上述模板轉換寡核苷酸所包含之錨定序列之至少一部分之5'錨定寡核苷酸引子。
於本發明之一個實施形態中，聚合酶連鎖反應所需要之試劑不包含上述5'錨定寡核苷酸引子，上述模板轉換寡核苷酸可作為5'錨定寡核苷酸引子發揮功能。
功能性次單元成對基因可為TCRα與TCRβ、TCRδ與TCRγ、及BCR重鏈與BCR輕鏈之基因。因此，於本發明之幾個實施形態中，反轉錄所需要之試劑可為(i)與TCRα之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子及與TCRβ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子；(ii)與TCRδ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子及與TCRγ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子；或者(iii)與BCR重鏈之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子及與BCR輕鏈之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補的開始反轉錄之寡核苷酸引子。又，聚合酶連鎖反應所需要之試劑可包含：(i)TCRα之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、及TCRβ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子；(ii)TCRδ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、及TCRγ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子；或者(iii)BCR重鏈之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、及BCR輕鏈之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子。
本發明之方法出乎預料地能夠將TCR或BCR之成對基因進行共擴增，而無需將各基因分別於個別反應中進行擴增。因此，本發明之方法之特徵在於：TCRα及TCRβ兩者、TCRδ及TCRγ兩者、或BCR重鏈及BCR輕鏈兩者得到共擴增。
於本發明之特定之實施形態中，修飾寡核苷酸引子係於同一之修飾寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，且在PCR之初期熱改性處理前因該互補區而形成摺疊結構、或包含熱不穩定性修飾基。又，引子功能未受到阻礙之一部分修飾寡核苷酸引子可藉由與模板RNA進行雜交而作為開始反轉錄之寡核苷酸引子發揮功能。
確定TCR或BCR之功能性成對基因之核酸序列之工序(2)可使用相關領域中公知之任意之序列確定法。如本實施例中所示般，可利用各種序列確定法。本發明之方法就能夠應用下一代定序儀之方面而言亦有利。於以下對典型之序列確定方法進行說明。
於本發明之方法中，於進行反轉錄模板轉換PCR後亦可進而包括如下工序，即提供為了序列解析而附加有適當序列之核酸樣本。若為業者，則可視序列解析之種類而選擇用以序列解析之適當序列，但作為用以序列解析之適當序列，例如可列舉：適於使用橋式PCR或乳液PCR之序列解析之序列，但並不限定於其等。為了使用橋式PCR之序列解析所附加之適當序列包含索引序列、標籤序列、用以固定於序列解析之基板(例如流槽)之序列等。
於較佳之實施形態中，於本發明之解析方法中，為了提供用以序列解析之核酸樣本，可進行上述反轉錄模板轉換PCR(第一PCR擴增反應)、標籤PCR(第二PCR擴增反應)、及索引PCR(第三PCR擴增反應)。
反轉錄模板轉換PCR(第一PCR擴增反應)中所使用之5'錨定寡核苷酸引子亦有時稱為第一5'錨定寡核苷酸引子。第一5'錨定寡核苷酸引子係含有模板轉換寡核苷酸所包含之錨定序列之至少一部分之寡核苷酸引子。於第一PCR擴增反應中，模板轉換寡核苷酸亦作為5'錨定寡核苷酸引子發揮功能，因此亦可不使用上述第一5'錨定寡核苷酸引子。
於一個實施形態中，確定TCR或BCR之功能性成對基因之核酸序列之工序(2)亦可進而包括：c)將包含反轉錄模板轉換PCR之PCR擴增產物、附加有第一標籤序列之第二5'錨定寡核苷酸引子、附加有第二標籤序列之第二TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子之混合物供於產生聚合酶連鎖反應之條件下，而提供包含附加有標籤序列之複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列之核酸樣本之工序；d)將包含上述工序c)之PCR擴增產物、第三5'錨定寡核苷酸引子、第三TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子之混合物供於產生聚合酶連鎖反應之條件下，而提供包含附加有索引序列之上述複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列之核酸樣本之工序，且該工序中，該第三5'錨定寡核苷酸引子及該第三TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子係附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。
標籤序列係為了進行定序(例如利用MiSeq之定序)而使用之序列，自標籤序列起開始定序。又，標籤序列亦可作為附加索引序列之索引PCR(第三PCR擴增反應)之引發部位發揮功能。第一標籤序列可為附加於第二5'錨定寡核苷酸引子之序列，第二標籤序列可為附加於第二TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子之序列。
本說明書中所謂「第一TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子」，係於利用本發明之反轉錄模板轉換PCR之PCR擴增反應中所使用之引子，且係指包含對於TCR或BCR之C區或3'非轉譯區、或者跨及C區及3'非轉譯區之區域具有特異性之序列之引子。
本說明書中所謂「第二TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子」，係於用以提供包含附加有標籤序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本的PCR擴增反應(第二PCR擴增反應)中所使用之引子，且係指包含對於TCR或BCR之C區或3'非轉譯區、或者跨及C區及3'非轉譯區之區域具有特異性之序列之引子。第二TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子係附加有成為用以第三PCR擴增反應之引發部位之標籤序列。
本說明書中所謂「第三TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子」，係於用以提供包含附加有索引序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本的PCR擴增反應(第三PCR擴增反應)中所使用之引子，且係指包含對於TCR或BCR之C區或3'非轉譯區、或者跨及C區及3'非轉譯區之區域具有特異性之序列之引子。第三TCR或BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子係視需要附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。
本說明書中所謂「第一5'錨定寡核苷酸引子」，係於利用本發明之反轉錄模板轉換PCR之PCR擴增反應中所使用之引子。模板轉換寡核苷酸亦可作為5'錨定寡核苷酸引子發揮功能，因此可不使用第一5'錨定寡核苷酸引子、或以少量使用第一5'錨定寡核苷酸引子。
本說明書中所謂「第二5'錨定寡核苷酸引子」，係於用以提供包含附加有標籤序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本的PCR擴增反應(第二PCR擴增反應)中所使用之引子。
本說明書中所謂「第三5'錨定寡核苷酸引子」，係於用以提供包含附加有索引序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本的PCR擴增反應(第三PCR擴增反應)中所使用之引子。第三5'錨定寡核苷酸引子係視需要附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。
本說明書中所謂「第一PCR擴增反應」，係藉由本發明之一步法反轉錄模板轉換PCR，以自受驗體獲得之RNA作為模板進行之PCR擴增反應。
本說明書中所謂「第二PCR擴增反應」，係於用以本發明之解析之樣本生產中，於第一PCR擴增反應後以其產物作為模板而進行之PCR擴增反應，且係指用以提供包含附加有標籤序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本的PCR擴增反應。於第二PCR擴增反應中，提供附加有標籤序列之核酸樣本，該標籤序列係用以提供用以第三PCR擴增反應之引發部位。該標籤序列亦成為序列解析之開始地點。
本說明書中所謂「第三PCR擴增反應」，係於用以本發明之解析之樣本生產中，以第二PCR擴增反應之擴增產物作為模板進行之PCR擴增反應，且其產物包含適於在本發明之序列解析中使用之序列。第三PCR擴增反應中，附加用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。
於本發明之又一實施形態中，工序(3)可包括：(3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1個之基因區域每個區域之參照資料庫之工序；(3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者所得之輸入序列集之工序；(3-3)對於該輸入序列集，對該基因區域逐一進行與該參照資料庫之同源性檢索，記錄與近似之參照對偶基因及/或該參照對偶基因之序列之匹配之工序；(3-4)對於該輸入序列集，指定V區及J區，基於指定結果而提取D區之核酸序列之工序；(3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類之工序；及(3-6)基於該工序(3-5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區之各出現頻度、或其組合，藉此鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之工序。
於一個實施形態中，進行BCR之功能性次單元成對基因之解析之情形時，上述C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子包含與選自由IgM、IgA、IgG、IgE及IgD所組成之群中之目標之同型之C區或3'非轉譯區、或跨及C區及3'非轉譯區之區域完全匹配的序列，且具有與其他C區或3'非轉譯區不具有同源性之序列。較佳為上述C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子係與為關於IgA或IgG之IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之任一者、或者IgA1或IgA2之任一者的亞型完全匹配之序列。於另一實施形態中，於進行TCR或BCR之功能性次單元成對基因之解析之情形時，上述C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子係與選自由α鏈、β鏈、γ鏈及δ鏈所組成之群中之目標之鏈的C區或3'非轉譯區、或者跨及C區及3'非轉譯區之區域完全匹配，且與其他C區不具有同源性之序列。
於另一實施形態中，上述C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子較佳為選擇與上述資料庫中之相同同型之C區或3'非轉譯區、或者跨及C區及3'非轉譯區之區域之對偶基因序列全部完全匹配之序列部分。藉由選擇此種完全匹配，可進行精度較高之分析。
作為基因解析，可使用任意之解析方法來進行，例如可使用以自公知之免疫遺傳學諮詢系統(IMGT(the international ImMunoGeneTics information system)，http://www.imgt.org)資料庫獲取之V、D、J、C序列作為參考序列而指定各測序片段序列之V、D、J、C序列，並利用IMGT之HighV-Quest之方法；或者於本說明書中亦作為解析系統之較佳例記載之申請人所開發出的新穎軟體(Repetoire Genesis)。
藉由對各擴增分子進行序列確定，可識別不同之序列，因此序列確定具有用以檢測出選殖增生中之量變之感度。總體來說，於所提供之本發明之一個實施形態中，提供一種用以確定T細胞及/或B細胞中之重組DNA序列之概況(profile)的方法。本方法可包括如下工序，該工序包括：自對象單離樣本；進行1回合或複數個回合之核酸擴增並將各核酸空間地單離；及對核酸進行序列確定。 (解析系統)
於另一態樣中，本發明提供一種用以進行表現TCR或BCR之細胞中之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之功能性次單元成對基因之序列解析的系統，其包含：(A)用以使該細胞之至少一部分活化之活性劑；(B)用以提供自活化之該細胞獲得之包含TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本的核酸處理用套組；(C)確定活化之該細胞中所包含之核酸序列之定序儀；及(D)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度及/或其組合，而鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之分析機。此處可使用之解析系統之構成要件可利用實現(解析方法)中所說明之任意之具體實施形態者。
即，作為(A)用以使該細胞之至少一部活化之活性劑，可利用實現(解析方法)中所說明之任意之具體實施形態者。(B)用以提供自活化之該細胞獲得之包含TCR或BCR之核酸序列的核酸樣本之核酸處理用套組可利用實現(解析方法)中所說明之任意之具體實施形態者，且可為包含用以自細胞獲取核酸之任意之試劑等之套組。(C)確定活化之該細胞所包含之核酸序列之定序儀可利用確定任意之序列之裝置，且可利用實現(解析方法)中所說明之任意之具體實施形態者，例如可利用所謂下一代定序儀。本發明之基因鑑定方法例如可參照「下一代定序儀：視目標之先進方法(Advance method)」(細胞工程學附刊)、及Cold Spring Harb Protoc. 2015 Nov; 2015 (11)： 951-969.等文獻而適當實施。(D)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合而鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之分析機可利用實現(解析方法)中所說明之任意之具體實施形態者，且可利用具備任意之CPU(Central Processing Unit，中央處理單元)之電腦等，該任意之CPU實現基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因的計算。
基因之表現之測定可藉由該技術領域中公知之任意方法來進行。例如作為測定基因之表現量之技術，可列舉：微陣列、RNA測序、定量PCR等。較佳為可採用RNA測序。定序之方法只要可確定核酸樣本之序列，則無限定，可應用該技術領域中公知之任意者，但較佳為使用下一代定序(NGS)。作為下一代定序，可列舉：焦磷酸定序、利用合成之定序(合成定序(Sequencing By Synthesis))、利用連接之定序、離子半導體定序等，但並不限定於其等。
於本發明之方法中，(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1個之基因區域每個區域之參照資料庫的步驟例如可藉由如下方式達成：對於V區而言，選擇包含該V區之資訊之資料庫並提供其。
於本發明之方法中，(2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者所得之輸入序列集之步驟係藉由如下方式達成：於需要之情形時使用適當軟體等之功能而進行修整，又，於需要之情形時，適當選擇長度後進行提取而提供輸入序列集。輸入序列例如可為利用公知之方法擴增之擴增產物之集合、或藉由本發明之反轉錄模板轉換PCR進行PCR擴增之擴增產物之集合。
於本發明之方法中，(3)對於該輸入序列集，對該基因區域逐一進行與該參照資料庫之同源性檢索，而記錄與近似之參照對偶基因及/或該參照對偶基因之序列之匹配的步驟係藉由如下方式進行：適當使用進行同源性檢索之軟體，基因區域(例如V區等)每個區域，對於輸入序列集進行與參照資料庫之同源性檢索，記載其結果所獲得之與近似之參照對偶基因及/或該參照對偶基因之序列之匹配。
於本發明之方法中，(4)對於該輸入序列集，指定V區及J區，基於指定結果提取D區之核酸序列之步驟可藉由如下方式達成：基於已知之資訊等，根據序列匹配來確定V區及/或J區，此種提取較佳為可藉由如下方式達成：對於該輸入序列集，指定V區及J區，將參照V區上之CDR3開頭及參照J上之CDR3末尾作為記號來提取CDR3序列。
於本發明之方法中，(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類之步驟可藉由如下方式達成：使用相關領域中公知之方法進行向胺基酸之轉譯，針對該胺基酸序列，藉由同源性檢索等而提取相當於D區之序列等。較佳為可將該CDR3之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類。
於本發明之方法中，(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區各自之出現頻度、或者其組合，藉此導出TCR或BCR之功能性次單元成對基因之步驟可藉由例如利用清單對上述為止之步驟中所算出之V區、D區、J區及/或C區之出現頻度進行整理等而算出。藉此，可導出TCR或BCR之功能性次單元成對基因。
參照圖11對以上之步驟進行說明。
S1(步驟(1))中提供參照資料庫。其亦可為保存於外部記憶裝置1405中者，通常可通過通信器件1411，以公開提供之資料庫之形式取得。或者亦可使用輸入裝置1409進行輸入，視需要記錄於RAM(Random Access Memory，隨機存取記憶體)1403或外部記憶裝置1405中。此處，提供包含V區等目標之區域之資料庫。
S2(步驟(2))中提供輸入序列集。此處，使用輸入裝置1409，或經由通信器件1411輸入例如自利用PCR擴增反應所擴增之擴增產物之集合獲得之序列資訊的集合。此處，亦可接收PCR擴增反應之擴增產物，將其與基因序列解析之裝置連接。此種連接係通過系統匯流排1420進行，或者通過通信器件1411進行。此處，視需要，可進行修整及/或適當長度者之提取。此種處理係由CPU1401進行。用以進行修整及/或提取之程式可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。
S3(步驟(3))中進行匹配。此處，對於該輸入序列集，對該基因區域逐一進行與該參照資料庫之同源性檢索，但該同源性檢索係經由通信器件1411等對於所獲得之參照資料庫進行同源性檢索程式處理。該處理係由CPU1401進行。又，對所獲得之結果進行分析，進行與近似之參照對偶基因/或該參照對偶基因之序列之匹配。該處理亦由CPU1401進行。用以執行其等之程式可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。
S4(步驟(4))中檢測D資訊之核酸序列。該處理亦由CPU1401進行。用以執行其等之程式可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。此處，對於該輸入序列集指定V區及J區。指定處理亦由CPU1401進行。又，基於指定結果，提取D區之核酸序列亦由CPU1401進行。用以指定及提取之處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。此處，較佳為可藉由如下方式達成，即基於已知之資訊等，根據序列匹配來確定V區及/或J區。結果可保存於RAM1403或外部記憶裝置1405中。此種提取較佳為藉由如下方式達成：對於該輸入序列集指定V區及J區，以參照V區上之CDR3開頭及參照J上之CDR3末尾為記號來提取CDR3序列。此種處理亦可由CPU1401進行。用以此之程式亦可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。
S5(步驟(5))中對D區進行分類。進行將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類之處理，其亦由CPU1401進行。用以該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。對於所獲得之胺基酸序列，藉由同源性檢索等而提取相當於D區之序列。此種處理亦由CPU1401進行。用以該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。較佳為可將該CDR3之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類。該處理亦由CPU1401進行。用以該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。
S6(步驟(6))中基於上述分類算出V區、D區、J區及視需要之C區各自之出現頻度、或者其組合之出現頻度，藉此鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因。用以該算出及導出之處理亦由CPU1401進行。用以該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置或通信器件或輸入裝置而提供。
於一個較佳之實施形態中，本發明中所使用之基因區域包含V區、D區、J區及視需要之C區之全部。
於一個實施形態中，上述參照資料庫係各序列被分配到唯一ID之資料。藉由分配唯一ID，而可基於ID這一簡單之指標來分析基因之序列。
於一個實施形態中，上述輸入序列集係非偏差序列集。非偏差之序列集可藉由利用如本說明書中所記載之反轉錄模板轉換PCR進行PCR擴增來實施。
於另一實施形態中，上述序列集係經修整者。藉由進行修整，可將無用或不適當之核酸序列去除，而可提昇分析之效率。
於較佳之實施形態中，修整係藉由如下步驟而達成：自測序片段兩端刪除低品質區域；自測序片段兩端刪除與模板轉換寡核苷酸之序列10 bp以上匹配之區域；及若剩餘長度為200 bp以上(TCR)或300 bp以上(BCR)，則作為高品質用於解析。較佳為上述低品質為QV值之7 bp移動平均未達30者。
於較佳之實施形態中，上述近似之序列係最接近之序列。於具體之實施形態中，上述近似之序列係根據1.一致鹼基數、2.核心長度、3.得分、4.匹配長度之排名來確定。
於另一實施形態中，上述同源性檢索係於容許隨機突變整體分散之條件下進行。關於此種條件，例如若為BLAST/FASTA最佳參數，則可於以下之條件下充分表現：於容許在匹配全長內最大33%之不一致，且關於其中之任意之30 bp，容許最大60%之不連串之不一致的一個實施形態中，上述同源性檢索與預設條件相比，(1)視窗尺寸之縮短、(2)失配罰分之減少、(3)空位罰分之減少及(4)指標之優先順序之首位包含一致鹼基數之至少1個條件。
於另一實施形態中，上述同源性檢索於BLAST或FASTA中於以下之條件 V 失配罰分＝-1、最短匹配長度＝30、最短核心長度＝15 D 字長＝7(BLAST之情形)或K-tup＝3(FASTA之長度)、失配罰分＝-1、空位罰分＝0、最短匹配長度＝11、最短核心長度＝8 J 失配罰分＝-1、最短命中長度＝18、最短核心長度＝10
C 最短命中長度＝30、最短核心長度＝15下進行實施。關於該條件，例如若為使用更短(～200 bp)序列僅一部分區域進行分類之狀況(「較佳例」以外之狀況)，則可使用，且即便為利用ILLUMINA製造之定序儀之狀況，亦可使用。於該情形時，認為同源性檢索有可能使用bwa或bowtie。
於特定之實施形態中，上述D區之分類係根據上述胺基酸序列之出現頻度而進行。
於又一實施形態中，於上述步驟(5)中存在D區之參照資料庫之情形時，將與上述CDR3之核酸序列之同源性檢索結果與胺基酸序列轉譯結果的組合作為分類結果。
於另一實施形態中，於上述步驟(5)中不存在D區之參照資料庫之情形時，係僅根據上述胺基酸序列之出現頻度進行分類。
於具體之實施形態中，上述出現頻度係以基因名單位及/或對偶基因單位算出。
於另一實施形態中，上述步驟(4)包括如下步驟：對於該輸入序列集指定V區及J區，以參照V區上之CDR3開頭及參照J上之CDR3末尾作為記號而提取CDR3序列。
於又一實施形態中，上述步驟(5)包括如下步驟：將該CDR3之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類。
於一個態樣中，本發明係提供一種對TCR或BCR之功能性次單元成對基因進行解析之系統，且該系統包含：(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1個之基因區域每個區域之參照資料庫的機構；(2)提供視需要進行修整且視需要提取適當長度者所得之輸入序列集的機構；(3)對於該輸入序列集，對該基因區域逐一進行與該參照資料庫之同源性檢索，記錄與近似之參照對偶基因及/或該參照對偶基因之序列之匹配的機構；(4)對於該輸入序列集，指定V區及J區，基於指定結果提取D區之核酸序列之機構；(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類之機構；(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區各自之出現頻度、或者其組合之出現頻度，藉此鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之機構。
於另一態樣中，本發明係提供一種使電腦執行對TCR或BCR之功能性次單元成對基因進行解析之方法的處理之電腦程式，該方法包括以下之步驟：(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1個之基因區域每個區域之參照資料庫；(2)提供視需要進行修整且視需要提取適當長度者所得之輸入序列集；(3)對於該輸入序列集，對該基因區域逐一進行與該參照資料庫之同源性檢索，記錄與近似之參照對偶基因及/或該參照對偶基因之序列之匹配；(4)對於該輸入序列集，指定V區及J區，基於指定結果提取D區之核酸序列；(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類；(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區各自之出現頻度、或者其組合之出現頻度，藉此鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因。
於進而另一態樣中，本發明係提供一種儲存使電腦執行對TCR或BCR之功能性次單元成對基因進行解析之方法的處理之電腦程式的記錄媒體，該方法包括以下之步驟：(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1個之基因區域每個區域之參照資料庫；(2)提供視需要進行修整且視需要提取適當長度者所得之輸入序列集；(3)對於該輸入序列集，對該基因區域逐一進行與該參照資料庫之同源性檢索，記錄與近似之參照對偶基因及/或該參照對偶基因之序列之匹配；(4)對於該輸入序列集，指定V區及J區，基於指定結果提取D區之核酸序列；(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類；(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區各自之出現頻度、或者其組合之出現頻度，藉此鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因。
(系統構成) 繼而，參照圖11之功能方塊圖，對本發明之系統1之構成進行說明。再者，於本圖中，表示以單一系統實現之情形。
本發明之基因分析系統1係經由系統匯流排1420將RAM1403、ROM(Read only memory，唯讀記憶體)或HDD(Hard disk drive，硬磁碟驅動機)、磁碟、USB記憶體等快閃記憶體等外部記憶裝置1405及輸入輸出介面(I/F)1425連接於內藏於電腦系統中之CPU1401而構成。於輸入輸出I/F1425分別連接有鍵盤或鼠標等輸入裝置1409、顯示器等輸出裝置1407、及數據機(modem)等通信器件1411。外部記憶裝置1405具備資訊資料庫儲存部1430及程式儲存部1440。均為於外部記憶裝置1405內所得確保之一定之記憶區域。
於此種硬體構成中，藉由經由輸入裝置1409輸入各種指令(command)，或藉由經由通信I/F或通信器件1411等接收指令，而安裝於該記憶裝置1405中之軟體程式被CPU1401叫出至RAM1403上並展開而得以執行，藉此與OS(操作系統)協動而發揮該發明之功能。
向資料庫儲存部1430隨時寫入並更新參照資料庫或輸入序列集或者所生成之分類資料或TCR或者BCR庫之資料等、或者經由通信器件1411等所取得之資訊。藉由將各輸入序列集中之各序列、參照資料庫之各基因資訊ID等資訊於各主表中進行管理，而能夠將成為儲存對象之屬於樣本之資訊藉由各主表中所定義之ID進行管理。
於資料庫儲存部1430中將作為輸入序列集條目資訊之樣本提供者ID、樣本資訊、核酸分析結果、已知之個體-生理資訊、及TCR或BCR之功能性次單元成對基因之分析結果與樣本ID相關聯地儲存。此處，TCR或BCR之功能性次單元成對基因之分析結果係藉由本發明之處理對核酸分析結果進行處理所獲得的資訊。
又，儲存於程式儲存部1440中之電腦程式係將電腦作為上述處理系統、例如實施進行修整、提取、匹配、指定、分類、轉譯等之處理之系統而構成者。該等各功能係各自獨立之電腦程式或其模組、例行程序等，且係藉由上述CPU1401來執行而將電腦作為各系統或裝置而構成者。再者，於以下，各系統中之各功能協動而構成各系統。
(製造方法) 本發明係提供製造以下之製造物之方法。 A. TCR/BCR表現細胞 B. 產生包含TCR/BCR核酸之病毒或噬菌體之細胞 C. 包含TCR/BCR核酸之病毒或噬菌體 D. 具有TCR/BCR或其互補鏈序列之RNA E. TCR/BCR蛋白(細胞內合成) F. TCR/BCR蛋白(活體外無細胞內合成)
本發明之製造方法中所使用之製造用構建物例如可列舉以下： W. 組入TCR/BCR序列所製作之表現載體(根據載體之結構而可表現之細胞不同；哺乳動物細胞用表現載體、昆蟲細胞用表現載體、細菌用表現載體、酵母用表現載體等) X. 組入TCR/BCR序列所製作之病毒或噬菌體產生用載體 Y. 組入靶基因組區域以及TCR/BCR序列所製作之同源重組用載體(小鼠用同源重組載體、人類細胞用同源重組載體等) Z. 於TCR/BCR序列之5'末端結合有T7或SP6等活體外轉錄用啟動子序列之DNA片段， 但並不限定於其等。
以下列舉本發明之製造方法之典型例。
A. TCR/BCR表現細胞
A-1(A＆W或X)：藉由向目標細胞(淋巴細胞、培養細胞株、昆蟲細胞、大腸桿菌、酵母等)導入「W. 組入TCR/BCR序列所製作之表現載體」或「X. 組入TCR/BCR序列所製作之病毒或噬菌體產生用載體」而製造(除通常之表現載體以外，於大多情形時，能夠將病毒產生用載體用於細胞中之基因表現)。
A-2(A＆C)：使目標細胞(淋巴細胞、培養細胞株、昆蟲細胞、大腸桿菌、酵母等)感染下述C項中所製造之「C. 包含TCR/BCR核酸之病毒或噬菌體」而製造。
A-3(A＆Y)：向目標細胞(人類或小鼠、各種模型動物之淋巴細胞、各種初代培養細胞、ES細胞(embryonic stem cell，胚胎幹細胞)、各種細胞株等)導入「Y. 向適當之載體組入靶基因組區域以及TCR/BCR序列所製作之同源重組用載體」而製造。視需要，亦可藉由藥劑選擇等而僅選擇產生同源重組之細胞。
A-4(A＆D)：向目標細胞(人類或小鼠、各種模型動物之淋巴細胞、骨髓細胞、脾細胞、ES細胞、各種細胞株等)導入下述D項中所製造之TCR/BCR之mRNA而製作。
B. 產生包含TCR/BCR核酸之病毒或噬菌體之細胞
B-1(B＆X)：向適當之病毒製作用細胞或細菌導入「X. 組入TCR/BCR序列所製作之病毒或噬菌體產生用載體」，並視需要導入組分蛋白表現載體，進行輔助噬菌體處理而製造。
C. 包含TCR/BCR核酸之病毒或噬菌體
C-1(C＆X)：向適當之病毒包裝細胞導入「X. 組入TCR/BCR序列所製作之病毒或噬菌體產生用載體」，並視需要導入組分蛋白表現載體，進行輔助噬菌體處理，繼而將細胞培養所需之時間，自培養上清液回收包含TCR/BCR核酸之病毒或噬菌體。 D. 具有TCR/BCR或其互補鏈序列之RNA
D-1(D＆W或X)：使用於「W. 組入TCR/BCR序列所製作之表現載體」、或者「X. 組入TCR/BCR序列所製作之病毒或噬菌體產生用載體」中組入至活體外轉錄RNA合成用載體中之TCR/BCR表現載體、或於TCR/BCR序列之5'上游最接近區域具有T7或SP6等活體外轉錄用啟動子之載體，依據相關領域中周知之分子生物學實驗指南或市售之套組，藉由RNA聚合酶反應而製造RNA。
D-2(D＆Z)：使用「Z. 於TCR/BCR序列之5'末端結合有T7或SP6等活體外轉錄用啟動子序列之DNA片段」，與D-1同樣地依據一般之分子生物學實驗指南或市售之套組，藉由RNA聚合酶反應而製造RNA。 E. TCR/BCR蛋白(細胞內合成)
E-1(E＆W或X)：向適於蛋白質表現之細胞(細胞株、酵母、細菌等)中導入「W. 組入TCR/BCR序列所製作之表現載體」或者「X. 組入TCR/BCR序列所製作之病毒或噬菌體產生用載體」而產生蛋白質。或者亦可使A-1、2中所製造之TCR/BCR表現細胞中之基因穩定表現株、蛋白高表現株等增生。
於細胞株或酵母之表現系統中，通常膜結合型蛋白(TCR/BCR)係藉由適當之機構自破碎細胞後所得之細胞破碎液(勻漿)中進行純化，分泌型免疫球蛋白、可被分泌出之TCR Form(C區之膜貫通區經置換、缺失而得之蛋白質等)係藉由適當之機構自培養上清液中進行純化。於細菌之表現系統中，蛋白質定位多種多樣，但係自細胞內之各組分(周質(Periplasm)、細胞質可溶性組分、包涵體等)之溶出液或破碎液中進行純化，或者以分泌型之形式自培養液中進行純化。
E-2(E＆Y)：向目標細胞(人類或小鼠、各種模型動物之淋巴細胞、各種初代培養細胞、ES細胞、各種細胞株等)組入「Y. 向適當之載體組入靶基因組區域以及TCR/BCR序列所製作之同源重組用載體」，而製造同源重組細胞(A-3)，對所製造之細胞蛋白進行純化而製造。
E-3(E＆C)：使目標細胞(淋巴細胞、培養細胞株、昆蟲細胞、酵母、細菌等)感染上述C-1之項中所製造之「C. 包含TCR/BCR核酸之病毒或噬菌體」，進行基因表現及蛋白質之產生。與D-1之項同樣地，視需要實施破碎、溶出處理等後進行純化。
F. TCR/BCR蛋白(活體外無細胞內合成)
F-1(E＆W或X)：使用「W. 組入TCR/BCR序列所製作之表現載體」或「X. 組入TCR/BCR序列所製作之病毒或噬菌體產生用載體」中於TCR/BCR序列之5'上游最接近區域具有T7或SP6等活體外轉錄用啟動子之載體，利用無細胞系統(可應用利用兔網狀紅血球、小麥胚芽、大腸桿菌等細胞萃取液之合成系統，套組亦市售)間斷性地進行mRNA合成、及蛋白質合成並製造。
F-2(E＆Z)：自「Z. 於TCR/BCR序列之5'末端結合有T7或SP6等活體外轉錄用啟動子序列之DNA片段」，利用無細胞系統(可應用利用兔網狀紅血球、小麥胚芽、大腸桿菌等細胞萃取液之合成系統，套組亦市售)間斷性地進行mRNA合成、及蛋白質合成並製造。
E-6(E＆D)：使用上述D之項目中所製造之RNA，利用活體外轉譯系統、無細胞系統(可應用利用兔網狀紅血球、小麥胚芽、大腸桿菌等細胞萃取液之合成系統，套組亦市售)等間斷性地進行蛋白質合成並製造。
因此，於某一態樣中，本發明係提供以下。
本發明係提供一種製造表現具有依據本發明之解析方法所解析之功能性次單元成對基因之序列的T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之細胞之方法，其包括：(4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之表現構建物之工序；及(5)將該表現構建物導入至細胞之工序。
本發明係提供一種製造產生包含具有依據本發明之解析方法所解析之功能性次單元成對基因之序列的T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)核酸之病毒或噬菌體之細胞之方法，其包括：(4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之病毒產生載體或噬菌體產生載體之工序；及(5)將該載體導入至細胞之工序。
本發明係提供一種製造包含具有依據本發明之解析方法所解析之功能性次單元成對基因之序列的T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)核酸之病毒或噬菌體之方法，其包括：(4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之病毒產生載體或噬菌體產生載體之工序；(5)將該載體導入至細胞之工序；及(6)對該細胞進行培養，自培養上清液獲得包含TCR或BCR核酸之病毒或噬菌體之工序。
本發明係提供一種製造具有依據本發明之解析方法所解析之功能性次單元成對基因之序列的T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之RNA之方法，其包括：(4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之活體外轉錄RNA合成用之載體、或者於該TCR或BCR之核酸序列結合有活體外轉錄用啟動子序列之DNA片段之工序；及(5)將該載體或DNA片段供於在活體外開始RNA聚合酶反應之條件下之工序。
本發明係提供一種製造具有依據本發明之解析方法所解析之功能性次單元成對基因之序列的T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之方法，其包括：(4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之表現構建物之工序；(5)將該表現構建物導入至細胞之工序；及(6)將該細胞供於表現該TCR或BCR之條件下之工序。
本發明係提供一種製造具有依據本發明之解析方法所解析之功能性次單元成對基因之序列的T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之方法，其包括：(4)使細胞感染藉由上述製造病毒或噬菌體之方法所製造出之病毒或噬菌體之工序；及(5)將該細胞供於表現該TCR或BCR之條件下之工序。
本發明係提供一種製造具有依據本發明之解析方法所解析之功能性次單元成對基因之序列的T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之方法，其包括：(4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之活體外轉錄RNA合成用之載體、或於該TCR或BCR之核酸序列結合有活體外轉錄用啟動子序列之DNA片段之工序；(5)將該載體或DNA片段供於在活體外開始RNA聚合酶反應之條件下，而提供mRNA之工序；及(6)將該mRNA供於在活體外自該mRNA生成蛋白質之條件下，而提供該蛋白質之工序。
於幾個實施形態中，上述表現構建物例如可選自表現載體、病毒或噬菌體產生用載體、及同源重組用載體。
於又一態樣中，本發明係提供一種基於依據上述本發明之方法所解析之功能性次單元成對基因之序列，而製造T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之方法，其包括：(4)將具有該功能性次單元成對基因之序列之核酸導入至表現載體之工序；(5)將該表現載體導入至細胞或細菌之工序；及(6)該細胞或細菌於可表現該TCR或BCR之條件下使該TCR或BCR表現之工序。(4)將具有該功能性次單元成對基因之序列之核酸導入至表現載體之工序可利用限制酶、連接酶等用以任意之核酸處理之酵素等相關領域中公知之任意之酵素、方法等。(5)將該表現載體導入至細胞之工序可利用用以將核酸導入至細胞或細菌之任意試劑、例如用以基因導入或轉形之任意試劑。(6)該細胞或細菌於可表現該TCR或BCR之條件下使該TCR或BCR表現時，對於細胞或細菌可利用適當之溫度(例如10～50℃、例如37℃等)，細胞可於5%CO2 等環境下利用。TCR或BCR之製造可藉由「視目的不同選擇之核酸實驗之原理與方案」，羊土社，平尾一郎、胡桃阪仁志編輯；「視目的不同選擇之基因導入方案」，羊土社，仲嶋一範、北村義浩、武內恆成編輯；「視目的不同選擇之蛋白質表現方案」，羊土社，永田恭介、奧脇暢編輯；及「蛋白實驗方案1」，Gakken Medical Shujunsha，大野茂男、西村善文監修等文獻中所記載之慣例性手法來進行。或者，不使用細胞或細菌之無細胞系蛋白質合成方法於相關領域中為公知，該方法係進行向於基因DNA片段之5'上游包含T7或SP6之啟動子序列之表現載體進行組入等，利用活體外轉錄法合成mRNA，自所合成之mRNA並利用大腸桿菌勻漿系統或小麥胚芽系統等實驗系統者。
又，表現TCR或BCR之細胞典型而言，可利用以下之方法製作。將具有功能性次單元成對基因之序列之核酸插入至與基因組序列具有同源性之區域中，視需要賦予功能性蛋白區等並插入至同源重組供體載體。繼而，於TCR或BCR之基因座中產生同源重組，視需要，將同源重組細胞自未產生重組之細胞中進行分離、選擇而獲得。同源重組載體或同源重組細胞、同源重組動物之製作可參考「實驗醫學 All About基因組編輯」，羊土社，真下知士、山本 卓編輯，「Nature. 2018 Jul; 559 (7714) : 405-409. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.」Roth TL等人等來進行。
本說明書中所列舉之包含科學文獻、專利公報、公開公報等參考文獻在內之全部刊行物所記載之內容係藉由本說明書中之引用，以與明示出其全部內容相同之程度併入至本說明書中。
以上，針對本發明，為了容易理解而表示較佳之實施形態並進行了說明。以下，基於實施例對於本發明進行說明，但上述之說明及以下之實施例係僅為了例示而提供，並非為了限定本發明而提供。因此，本發明之範圍既不限定於本說明書所具體記載之實施形態，亦不限定於實施例，僅由申請專利範圍來限定。 [實施例]
以下，基於實施例對本發明更具體地進行說明。關於本實施例中所使用之各種試劑，理解到除具體所示者以外，亦可使用自TOYOBO、TAKARA BIO、FUJI FILM WAKO PURE CHEMICAL、NIPPON GENE、NACALAI TESQUE、NACALTHERMO FISHER、NEW ENGLAND BIOLABS、PROMEGA等獲取者。
(製備例) 將實施例中所使用之試劑類之製備例示於以下。 ・試劑之清單 -  PrimeScript II高保真性一步法RT-PCR套組(R026A，TAKARA BIO) -  40U/μl RNasin Plus RNA酶抑制劑(N2611，Promega) -  200U/μl SuperScript IV反轉錄酶(18090010，Invitrogen) -  2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(KK2602，NIPPON Genetics) -  AMPure XP(A63881，Beckman Coulter) -  PE標記HLA-A*02:01 CMV pp65四聚合體(醫學生物學研究所股份有限公司) -  PE標記HLA-A*02:01 Influenza M1四聚合體(醫學生物學研究所股份有限公司) -  MACS緩衝液(130-091-221，Miltenyi Biotec) ・所使用之寡核苷酸序列 -  hTCRα阻斷引子(CA2; 23個鹼基)：GTGCATAGACCTCAT GTCTAGCA (序列編號1) -  hTCRαRT引子(CA1; 23個鹼基)：TGTTGAAGGCGTTTGCAC ATGCA (序列編號2) -  hTCRβ阻斷引子(CB2; 23個鹼基)：AGGCAGTATCTGGAGTCAT TGAG (序列編號3) -  hTCRβRT引子(CB1(3); 23個鹼基)：GAACTGGACTTGACAGC GGAAG T (序列編號4) -   TS-Oligo(30個鹼基)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT[G][G](G)※(序列編號5) ※[]之右端起第2、3位之2個鹼基為RNA，( )之右端之1個鹼基為LNA -  TS引子(30個鹼基)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG(序列編號6) -  正向TS-Tag引子 v1(64個鹼基)：GTCTC{GTGGGCTCGGAGATGTGTAT}AAGAGACAG AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG(序列編號7)(下劃線部為MiSeq定序標籤序列部位，{ }所包圍之序列為桑格(Sanger)定序引子序列) -  hTCRα反向Tag引子(51個鹼基)：TCGTC{GGCAGCGTCAGATGTGTATAA}GAGACAG GAGGGTCAGGGTTCTGGA(序列編號8) (下劃線部為MiSeq定序標籤序列部位，{ }所包圍之序列為桑格定序引子序列) -  hTCRα反向Tag引子/hTCA-R-TP5-1(53個鹼基)：TCGTC{GGCAGCGTCAGATGTGTATAA}GAGACAG ACTTGTCACTGGATTTAGAG(序列編號9) -  hTCRβ反向Tag引子(52個鹼基)：TCGTC{GGCAGCGTCAGATGTGTATAA}GAGACAG GCTCAAACACAGCGACCTC(序列編號10) (下劃線部為MiSeq定序標籤序列部位，{ }所包圍之序列為桑格定序引子序列) ・定序引子 P5-seq(21個鹼基)：GGCAGCGTCAGATGTGTATAA(序列編號11) CA3(23個鹼基)：ACTTTGTGACACATTTGTTTGAG(序列編號12) CB3(23個鹼基)：ACTGTGCACCTCCTTCCCATTCA(序列編號13)
(實施例1：使用單個細胞之解析與大量細胞之解析之比較)
實驗A
(試劑) 實驗A中之追加之試劑係如下所示。 -  APC標記抗人類CD8抗體(Nippon Becton Dickinson股份有限公司)
A1.細胞製備與培養 A1-1.細胞單離 自人類志願者(HLA-A*02型保有，有CMV感染經歷)採集末梢血液，利用聚蔗糖密度梯度法單離末梢血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells；PBMC)，進行細胞培養以用於實驗。
為了利用通常之庫解析進行所有細胞群之解析，而使剛分離後之PBMC(大約100萬個細胞)溶解於Torizol試劑中並於-80℃下保管。
A1-2.細胞培養 利用細胞巨大病毒(Cytomegalovirus；CMV)之pp65蛋白表位肽對PBMC進行「活化」處理，於培養1週後用於單細胞分選庫解析實驗。此處，「活化」例如可以細胞增生活性、干擾素γ或介白素等細胞激素分泌量增加、對於MHC-CMVpp65肽呈現細胞之殺傷活性之增加、TCR蛋白量之增加等為指標來進行確認。
CMV(Human betaherpesvirus 5，人類β疱疹病毒5)之pp65(AKI22842.1)之全長胺基酸序列係如下所示。於本實施例中使用有下劃線部之9個胺基酸殘基之肽表位部位。
MESRGRRCPEMISVLGPISGHVLKAVFSRGDTPVLPHETRLLQTGIHVRVSQPSLILVSQYTPDSTPCHRGDNQLQVQHTYFTGSEVENVSVNVHNPTGRSICPSQEPMSIYVYALPLKMLNIPSINVHHYPSAAERKHRHLPVADAVIHASGKQMWQARLTVSGLAWTRQQNQWKEPDVYYTSAFVFPTKDVALRHVVCAHELVCSMENTRATKMQVIGDQYIKVYLESFCEDVPSGKLFMHVTLGSDVEEDLTMTRNPQPFMRPHERNGFTVLCPKNMIIKPGKISHIMLDVAFTSHEHFGLLCPKSIPGLSISGNLLMNGQQIFLEVQAIRETVELRQYDPVAALFFFDIDLLLQRGPQYSEHPTFTSQYCIKGKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAMAGASTSAGRKRKSASSATACTSGVMTRGRLKAESTVAPEEDTDEDSDNEIHNPAVFTWPPWQAGILARNLVPMVATV QGQNLKYQEFFWDANDIYRIFAELEGVWQPAAQPKRRRHRQDALPGPCIASTPKKHRG(序列編號804)
為了利用通常之庫解析對所有細胞群之解析進行，而使經肽刺激之染色用細胞之一部分(100萬個細胞)溶解於Torizol試劑中並於-80℃下保管。
A2.細胞標記物染色及表位染色與單細胞分選 A2-1.細胞標記物抗體與利用表位肽之染色 利用表位肽進行處理並經過培養之PBMC係於離心分離及利用MACS緩衝液再懸浮之洗淨後，於MACS緩衝液中與螢光物質藻紅素(PE)標記MHC pp65表位四聚物在室溫下反應20分鐘，且與螢光物質別藻藍蛋白(APC)標記抗CD8抗體在4℃下反應15分鐘。 A2-2.單細胞分選
反應後，細胞係進行離心分離、向MACS緩衝液之再懸浮而進行洗淨，利用細胞分選儀(BD公司之FACS Aria)進行分離。將PE標記MHC CMVpp65表位四聚物與經APC標記抗CD8抗體染色之PBMC依據製造商之指南，於FSC-A(Forward Scatter Area，前方散射光區中細胞之尺寸之指標值)及SSC-A(Side Scatter Area(側散射區)，細胞器等複雜性之指標)中展開，於XY軸之右下方獲得淋巴細胞群門(P1)。P1進而於PE(MHC CMVpp65表位四聚物陽性)及APC(CD8陽性)中展開，於PE(MHC CMVpp65表位四聚物陽性)與APC(CD8陽性)之P2門獲得MHC CMVpp65表位四聚物反應性細胞損傷性T細胞，於P3門獲得MHC CMVpp65表位四聚物非反應性之細胞損傷性T細胞之成分。將APC陽性(CD8陽性)、PE陽性(MHC pp65表位四聚物陽性)細胞群(圖1之P2區)以每孔1個細胞之方式分注至96孔培養盤中，供於單細胞庫解析。
單細胞分選後，為了通常之大量細胞之庫解析，將P2區之細胞(大約35萬個細胞)、以及P3區域之APC陽性(CD8陽性)、PE陰性(MHC pp65表位四聚物陰性)細胞(大約24萬個細胞)分選至管中，溶解於Torizol試劑中並於-80℃下保管。
A3.利用一步法RT-TS-PCR法之TCRα及TCRβcDNA之擴增 A3-1.一步法RT-TS-PCR反應 本說明書中所實施之「一步法RT-TS-PCR反應」包括以下之工序。
將以下之表1所示之反應液以10 μl/孔添加至分注有細胞之培養盤中，進行RT-PCR反應。分取反應液2 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認(圖2)。其結果為，於半數以上之孔中確認到DNA譜帶。 [表1]
Figure 02_image033
A3-2.半巢式PCR 分取一步法RT-TS-PCR反應液，為了實現TCRα、TCRβ各自分開之擴增確認、及為了對於DNA片段附加共通定序引子識別序列，而使用分別於5'側賦予模板轉換序列，於3'側在阻斷引子之內側之序列賦予定序用序列之引子，以半巢式進行PCR反應(表2)。分取反應液3 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認(圖3)。其結果為，將確認到400個鹼基對以上之長度之產物之孔作為陽極，TCRα係於64孔中確認DNA譜帶，TCRβ係於32孔中確認DNA譜帶，其中22孔確認到TCRα及TCRβ兩者之cDNA譜帶。 [表2]
Figure 02_image034
A3-3.定序-1 將經PCR擴增之TCRα及TCRβ之cDNA片段利用AMPure XP DNA套組進行純化，利用P5-seq引子實施桑格法定序。所獲得之序列係下載TCRα/β序列資料庫(The International Immunogenetics Information System; IMGT，http://www.imgt.org/)，一面進行blast同源性檢索，一面利用IMGT Web庫序列解析系統IMGT/V-QUEST(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)進行解析，藉此確認有無TCR擴增、經擴增之鹼基序列。將確認到之V區編號示於圖4(電泳圖像之下方)。定序之結果為，TCRα係確認到59孔之TCR cDNA片段之擴增，TCRβ係確認到30孔之TCR cDNA片段之擴增。與表2A中所確定之TCRα/β之序列對資訊(？意指未鑑定)進行純系排位，表示序列例(孔No.3之定序資料)。TRAV21/J49與TRBV6-5/J1-2之對等特定之純系(認為源自CMVpp65表位肽反應性記憶T細胞)顯著地增生。 [表2A]
Figure 02_image036
A3-4.定序-2 將「3-1.一步法RT-TS-PCR反應」中所獲得之RT-PCR產物中利用電泳確認到譜帶之樣本(於本解析中將孔No.1至30作為對象，確認到譜帶的為No.1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、15、18、19、21、22、23、24、25、28、30之20個樣本)進行3倍稀釋，其後，對於反應液17～18 μl，利用AMPure XP DNA套組純化DNA，回收至18 μl之10 mM TrisCl緩衝液中。對於回收到所需DNA量之19個樣本(No.23以外之樣本)，於一個反應系中使用TCRα C區引子(CA3引子)，於另一個反應系中使用TCRβ C區引子(作為C1與C2區之共通序列之CB3引子)，分別實施TCRα cDNA擴增產物及TCRβ擴增產物之桑格法定序。所獲得之序列、使用IMGT TCRα/β序列資料庫，一面進行屋內(in house)blast同源性檢索，一面利用Repertoire Genesis公司內解析系統進行解析等，而確認有無TCR擴增及經擴增之鹼基序列。於表3中表示本解析中解析所得之V、J區之資料、及作為參考之於「A3-3定序-1」中對半巢式PCR擴增產物進行定序所獲得之結果(僅孔No.1～30之結果)。確定了TCRα之V區之樣本為10個孔，確定了TCRβ之V區之樣本為11個孔，以TCRα/β對鑑定出的為6個孔。於對RT-PCR-半巢式PCR產物定序之情形時，相同樣本時，確定到TCRα之V區之樣本為20個孔，確定到TCRβ之V區之樣本為12個孔，以TCRα/β對鑑定出的為9個孔。可解析之比率稍微降低，但能夠更簡單確定序列。
於除序列解析以外，進行TCR cDNA選殖之情形時，利用本方法進行定序，自包含目標序列之孔之一步法RT-PCR反應液，利用選殖引子對TCR cDNA片段進行擴增，另外與基因合成或PCR反應中所合成之C區DNA片段集合選殖(assemble cloning)(複數個DNA片段能夠一次以高概率連接之方法)至選殖載體或表現載體，藉此亦可獲得能夠利用於蛋白質表現實驗之TCRα及TCRβ之cDNA序列。 [表3]
Figure 02_image037
A3-5.定序-3(MiSeq下一代定序儀使用) 利用桑格直接定序法完成了成對序列確定之樣本中，對於16個孔之樣本(孔No.2、3、5、6、13、21、22、30、46、47、49、54、55、78、79、87)，利用MiSeq下一代定序儀進行定序運轉。為了利用下一代定序儀對「A3-2.半巢式PCR」中經擴增及純化之DNA片段進行序列解析，利用表4所示之PCR反應液與反應循環進行索引附加PCR。PCR產物係利用AMPure XP DNA套組進行純化，依據製造商之方案，利用MiSeq下一代定序儀進行定序。所獲得之定序資料係利用Repertoire Genesis軟體或屋內(in house)blast解析等解析所得。 [表4]
Figure 02_image038
將結果示於表5。若為桑格法，則關於J區未確定等一部分序列不明確之孔No.21、46、47之TCRβ之序列，亦獲得到明確之資料。孔No.87之樣本於桑格法中由於資料些許不明確而判定為TRBV28/J2-3，但藉由MiSeq定序儀而獲得到明確之資料，判明正確為TRBV28/J1-1。
又，於孔No.2、3、5、21、22、46、55中表現出TRAV21/J49與TRAV24/J49兩者，對應對之TCRβ判明為僅TRBV6-5/J1-2之1種。關於該結果，若為將多分子之結果彙集並作為1個螢光資料檢測出之桑格毛細管定序法，則解析較難，藉由使用可將多分子之結果作為各分子每個之資料檢測出之下一代定序儀，而初次實現了解析。 [表5]
Figure 02_image039
繼而利用fastq-join程式使MiSeq定序資料之測序片段1(TCR cDNA之3'側C區側起定序所得之資料)與測序片段2(TCR cDNA之5'側起定序所得之資料)結合，轉換為反向互補鏈序列，而轉換為與通常之cDNA相同朝向之序列。僅讀取於序列兩末端具有引子序列之純系，將引子序列去除後，隨機地挑選相應純系，藉由鹼基序列組裝多重匹配解析而獲得經過擴增之cDNA之鹼基序列。於DNA片段較長(大概長於500～580個鹼基對之情形)而結合率欠佳之情形時，除所結合之序列以外，利用無法以分配於該純系之測序片段結合之序列之測序片段1的反向互補佐序列、測序片段2之保持不變之序列，進行低品質區域之去除等後，進行鹼基序列組裝多重匹配解析，而獲得經擴增之cDNA之鹼基序列。確認所獲得之cDNA鹼基序列與Ensemble之基因資料庫等公共資料庫上之基因序列相比，是否自5'之胺基酸序列起始密碼子獲得到序列。又，進行胺基酸序列置換，進行前導區域與可變部區域(框架部4處：FR1～4；及可變區3處：CDR1～3)之胺基酸序列預測。作為解析例，表示所獲得之孔No.13之TCRα、TCRβ之鹼基序列、胺基酸轉譯序列。(下劃線表示於Ensemble之基因資料庫上附有註解之轉譯起始密碼子、及利用電腦解析所鑑定之CDR3區域部位)均於框內自轉譯起始密碼子直至包含CDR3區域之C區之N末端胺基酸序列獲得了蛋白質資訊。又，根據鹼基序列確認，確認到No.13之TCRβ之C區為C1型。
該等解析中所獲得之可變區之cDNA片段、cDNA鹼基序列係視需要進行再擴增或人工基因合成等，藉由選殖或與功能上差異較少之C區之序列結合，而獲得全長編碼區域，藉此實現細菌、細胞系統或人工合成系統中之蛋白質表現、蛋白質合成，而能夠應用於蛋白質標準品製作、表位搜尋、TCR導入T細胞療法等。
＞孔No.13 TCRα鹼基序列 GGGCTGCAAAACGTTTTTCTGCTGTGGGTACGTGAGCAGGAAACATG GAGAAGAATCCTTTGGCAGCCCCATTACTAATCCTCTGGTTTCATCTTGACTGCGTGAGCAGCATACTGAACGTGGAACAAAGTCCTCAGTCACTGCATGTTCAGGAGGGAGACAGCACCAATTTCACCTGCAGCTTCCCTTCCAGCAATTTTTATGCCTTACACTGGTACAGATGGGAAACTGCAAAAAGCCCCGAGGCCTTGTTTGTAATGACTTTAAATGGGGATGAAAAGAAGAAAGGACGAATAAGTGCCACTCTTAATACCAAGGAGGGTTACAGCTATTTGTACATCAAAGGATCCCAGCCTGAAGACTCAGCCACATACCTCTGTGCCCGGAACACCGGTAACCAGTTCTATTTT GGGACAGGGACAAGTTTGACGGTCATTCCAAATA(序列編號14) ＞孔No.13 TCRα胺基酸轉譯序列 AAKRFSAVGT*AGNM EKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCARNTGNQFYF GTGTSLTVIPN(序列編號15) ＞孔No.13 TCRβ鹼基序列 GGTCTCAGAATGACTTCCTTGAGAGTCCTGCTCCCCTTTCATCAATGCACAGATACAGAAGACCCCTCCGTCATGCAGCATCTGCCATG AGCATCGGCCTCCTGTGCTGTGCAGCCTTGTCTCTCCTGTGGGCAGGTCCAGTGAATGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAAATTCCAGGTCCTGAAGACAGGACAGAGCATGACACTGCAGTGTGCCCAGGATATGAACCATGAATACATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGCATGGGGCTGAGGCTGATTCATTACTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGACCAAGGAGAAGTCCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGCTGTCGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTCAACAGACAGGGACGATAGGTGGCTACACCTTC GGTTCGGGGACCAGGTTAACCGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCC(序列編號16) ＞孔No.13 TCRβ胺基酸轉譯序列 SQNDFLESPAPLSSMHRYRRPLRHAASAM SIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSQQTGTIGGYTF GSGTRLTVVEDLNKVFPP(序列編號17)
A3-6.大量細胞庫解析 藉由剛培養後之(1)PBMC(大約100萬個細胞)、(2)經肽刺激並培養1週後之細胞(100萬個細胞)、(3)P2區CD8+陽性、MHC pp65表位四聚物陽性細胞(大約35萬個細胞)、以及(4)P3區域CD8+陽性、MHC pp65表位四聚物陰性細胞コール，進行TCRα及TCRβ庫解析。將其結果(純系排名上位50種之清單)示於表6～13。藉由肽刺激及培養，於(2)之細胞群中，認為藉由刺激所增生之細胞純系之特定序列(TCRα：TRAV21/J49、TRAV24/J49、TRAV3/J26、TRAV5/J20等，TCRβ：TCRBV6-5/J1-2、TRBV28/J1-1、TRBV6-6/J1-2等)之比率增加，該等藉由細胞分選而被區分及濃縮至(3)P2區CD8+陽性、MHC pp65表位四聚物陽性細胞中，於(4)P2區CD8+陽性、MHC pp65表位四聚物陰性細胞中基本上未確認到。若將該等資料與單細胞庫解析結果相比，則可知實際上獲得了TRAV21/J49＆TCRBV6-5/J1-2成對序列、TRAV24/J49＆TCRBV6-5/J1-2成對序列，確認了實驗之成敗。如上所述，可以細胞群整體之庫解析資料作為參照資料，進行實驗過程之成敗之確認、或是否獲得了目標之陽性純系、又確認以何種程度進行單細胞篩選為好。例如於TCR序列之多樣性較低之情形時(選殖性較高之情形)，即便對大量細胞進行解析，所獲得之TCRα/β成對序列之數亦有限，但於多樣性較高之情形，期待與所解析之單細胞數成比例，可獲取更多之TCRα/β成對序列。 [表6-1]
Figure 02_image040
[表6-2]
Figure 02_image041
[表7-1]
Figure 02_image042
[表7-2]
Figure 02_image043
[表8-1]
Figure 02_image044
[表8-2]
Figure 02_image045
[表9-1]
Figure 02_image046
[表9-2]
Figure 02_image047
[表10-1]
Figure 02_image048
[表10-2]
Figure 02_image049
[表11-1]
Figure 02_image050
[表11-2]
Figure 02_image051
[表12-1]
Figure 02_image052
[表12-2]
Figure 02_image053
[表13-1]
Figure 02_image054
[表13-2]
Figure 02_image055
(表6～13中「*」表示終止密碼子)
(實施例2：利用一步法RT-TS-PCR法之TCRα及TCRβ cDNA之擴增)
實驗B
(試劑) 實驗B中之追加試劑係如下所示以下。 -FITC標記抗人類CD8抗體(Beckman Coulter) -Alexa647標記抗人類CD3抗體(Beckman Coulter) -eFluor780(65-0865-14，eBioscience)
B1.細胞製備與培養 B1-1.細胞單離 自人類志願者(HLA-A*02型保有者)採取末梢血液，利用聚蔗糖密度梯度法單離末梢血液單核細胞(PBMC)而用於實驗。
B1-2.細胞培養 PBMC係利用CMVpp65蛋白表位肽進行處理，於培養2週後再一次實施肽處理，於第26天用於單細胞分選庫解析實驗。
B2-1.利用細胞標記物抗體及表位肽之染色 對於利用表位肽處理並培養之PBMC係進行離心分離及利用PBS再懸浮之洗淨。PBS中與死細胞染色螢光試劑eFluor780一併於冰上培養30分鐘，於PBS中進行再懸浮，藉由離心分離使細胞沈降並將上清液去除，藉此洗淨。繼而，與減背景試劑(human FcR blocking試劑)Clear Back一併於冰上培養10分鐘，於PBS中再懸浮，藉由離心分離使細胞沈降並將上清液去除，藉此洗淨。繼而，與藻紅素(PE)標記MHC pp65表位四聚物一併於冰上培養30分鐘，於PBS中再懸浮，藉由離心分離使細胞沈降並將上清液去除，藉此洗淨。繼而，與alexa647標記抗CD3抗體及FITC標記抗CD8抗體一併於冰上培養30分鐘，供於單細胞分選。
B2-2.單細胞分選 細胞於染色後洗淨，於PBS中再懸浮，利用細胞分選儀(SONY公司，SH800)將淋巴細胞群中之eFluor780陰性、alexa647陽性(CD3陽性)、FITC陽性(CD8陽性)、PE陽性(MHC表位四聚物陽性)細胞群以每孔1個細胞、或複數個細胞(5個、25個及100個)之方式分注至96孔培養盤中。
B3.利用一步法RT-TS-PCR法之TCRα及TCRβ cDNA之擴增 B3-1.一步法RT-TS-PCR反應 將分注有細胞之培養盤保管於-80℃超低溫冷凍庫中，於5天後進行乾冰捆包，利用快遞業者之冷凍快遞服務，歷時1天向大約500 km外之研究設施進行輸送，保管於-80℃超低溫冷凍庫中。於8天間保管於-80℃超低溫冷凍庫中後，取出培養盤，於冰上將反應液以10 μl/孔進行添加，進行一步法RT-TS-PCR反應(表14)。 [表14]
Figure 02_image056
Figure 02_image057
B3-2.半巢式PCR 一步法RT-TS-PCR反應液係添加2倍量之純水(DW)並分取1.5 μl，於TCRα及TCRβ各自於不同之管中、或者同一管中，為了對於DNA片段附加定序引子識別序列而使用5'側附加有模板轉換序列且3'側於阻斷引子之內側序列附加有接頭序列(用以附加定序用索引序列之序列)之引子，以半巢式進行PCR反應(表15)。分取反應液3 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認。 [表15]
Figure 02_image058
對於經CMVpp65肽刺激並經分選之細胞中之TCRα及TCRβ分別進行反應，將所得之結果示於圖5。將確認到大約400個鹼基對以上且800個鹼基以下之長度之產物之孔作為陽性，在於1個孔中注入有1個細胞之孔中，全部80個孔中TCRα於26個孔中確認到DNA譜帶，TCRβ於45個孔中確認到DNA譜帶，其中20個孔確認到TCRα及TCRβ兩者之cDNA譜帶。
將經CMVpp65肽刺激並經分選之細胞中之TCRα及TCRβ於同一反應液中進行反應，將所得之結果示於圖6。同樣地將確認到大約400個鹼基對以上且800個鹼基以下之長度之產物之孔作為陽性，在於1個孔中注入有1個細胞之孔中，全部80個孔中50個孔中確認到DNA譜帶。
於在所有條件下均作為反應之陽性對照設定之注入有5個細胞(孔41、42、89及90)、25個細胞(孔43、44、91及92)及100個細胞(孔45、46、93及94)之孔或加入有源自T細胞株之RNA之孔(孔48：投入源自Jurkat細胞之RNA；孔96：投入源自MOLT4細胞之RNA)中，於大致所有條件下發現了良好之擴增。於孔47及95中未注入細胞。
藉由以上之解析，顯示即便為於培養盤中單離後冷凍保管之細胞，亦能夠藉由本一步法RT-TS-PCR法實現T細胞之TCRα/β成對序列之鑑定。
B3-3.定序序列確定(使用MiSeq下一代定序儀) 為了將進行PCR擴增並確認到譜帶之樣本(圖5中分別進行PCR之樣本中關於TCRα為26個樣本、關於TCRβ為45個樣本；於圖6之同一反應液中進行PCR而成之樣本中之50個樣本)利用AMPure XP DNA套組進行純化，並利用ILLUMINA公司之MiSeq下一代定序儀進行序列解析，而於表16所示之PCR反應液及反應循環中進行索引附加PCR。PCR產物係利用AMPure XP DNA套組進行純化，並依據製造商之方案進行利用MiSeq下一代定序儀之定序運轉。所獲得之定序資料係利用Repertoire Genesis軟體解析所得。 [表16]
Figure 02_image059
將分別擴增TCRα及TCRβ並定序之樣本之結果示於表17，將以同一管擴增並定序之結果示於表18。均同樣地鑑定到18個樣本TCRα/β對之序列(V區、J區、CDR3區域)。 [表17]
Figure 02_image060
[表18]
Figure 02_image061
(實施例3：利用一步法RT-TS-PCR法之TCRα及TCRβ cDNA之擴增(2))
實驗C
C1.細胞製備與培養 C1-1.細胞單離 自人類志願者(HLA-A*02型保有者2名)採取末梢血液，利用聚蔗糖密度梯度法單離末梢血液單核細胞(PBMC)而用於實驗(與實驗B相同之實驗)。
C1-2.細胞培養 源自一名志願者之PBMC係利用CMVpp65蛋白表位肽進行處理(以後之CMV處理，染色為與實驗B相同之實驗)，源自另一名志願者之PBMC係利用流行性感冒M1蛋白表位肽進行處理，於培養2週後再一次實施肽處理，於第26天用於單細胞分選庫解析實驗。
流行性感冒M1蛋白(P03485)之全長胺基酸序列係如下所述。下劃線部之9個胺基酸殘基為本實施例中所使用之肽表位。
MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTL TVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFHGAKEISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK(序列編號805)
C2.細胞標記物染色及表位染色與單細胞分選 C2-1.利用細胞標記物抗體及表位肽之染色 經表位肽處理並培養之PBMC係進行離心分離及利用PBS再懸浮之洗淨。於PBS中與死細胞染色螢光試劑eFluor780一併於冰上培養30分鐘，於PBS中進行再懸浮，藉由離心分離使細胞沈降，將上清液去除，藉此洗淨。繼而，與減背景試劑(human FcR blocking試劑)Clear Back一併於冰上培養10分鐘，於PBS中再懸浮，藉由離心分離使細胞沈降，將上清液去除，藉此洗淨。繼而，與藻紅素(PE，phycoerythrin)標記MHC pp65表位四聚物或PE標記MHC M1表位四聚物一併於冰上培養30分鐘，於PBS中再懸浮，藉由離心分離使細胞沈降，將上清液去除，藉此洗淨。繼而，與alexa647標記抗CD3抗體及FITC標記抗CD8抗體一併於冰上培養30分鐘，供於單細胞分選。
C2-2.單細胞分選 細胞係於染色後洗淨，於PBS中再懸浮，利用細胞分選儀(SONY公司，SH800)將淋巴細胞群中之eFluor780陰性、alexa647陽性(CD3陽性)、FITC陽性(CD8陽性)、PE陽性(MHC表位四聚物陽性)細胞群以每孔1個細胞、或複數個細胞(10個及100個)之方式分注至96孔培養盤(經CMV處理及染色之細胞係利用與實驗B相同之檢體，不在-80℃下保管而立即用於一步法RT-TS-PCR實驗)。
C3.利用一步法RT-TS-PCR法之TCRα及TCRβ cDNA之擴增 C3-1.一步法RT-TS-PCR反應 分注細胞後立即於表19所示之反應試劑中進行一步法RT-TS-PCR反應。 [表19]
Figure 02_image062
Figure 02_image063
C3-2.半巢式PCR 一步法RT-TS-PCR反應液係添加2倍量之純水(DW)並分取1.5 μl，於TCRα及TCRβ各自於不同之管中、或者同一管中，為了對於DNA片段附加定序引子識別序列而使用5'側附加有模板轉換序列且3'側於阻斷引子之內側序列附加有接頭序列(用以附加定序用索引序列之序列)之引子，以半巢式進行PCR反應(表20)。分取反應液3 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認。 [表20]
Figure 02_image064
將經CMVpp65肽刺激並經分選之細胞之結果(TCRα及TCRβ分開實施)示於圖7。將確認到大約400個鹼基對以上且800個鹼基以下之長度之產物之孔作為陽性，在於1個孔中注入有1個細胞之孔中，全部80個孔中TCRα於25個孔中確認到DNA譜帶，TCRβ於41個孔中確認到DNA譜帶，其中19個孔確認到TCRα及TCRβ兩者之cDNA譜帶。
將經M1肽刺激並經分選之細胞之結果(TCRα、TCRβ分開實施)示於圖8。若將確認到大約400個鹼基對以上且800個鹼基以下之長度之產物之孔作為陽性，則在於1個孔中注入有1個細胞之孔中，全部80個孔中TCRα於24個孔中確認到DNA譜帶，TCRβ於21個孔中確認到DNA譜帶，其中9個孔確認到TCRα、TCRβ兩者之cDNA譜帶。
於在所有條件下均作為反應之陽性對照設定之注入有10個細胞(孔21及22)、100個細胞(孔23)之孔或加入有源自T細胞株之RNA之孔(孔72：投入源自Jurkat細胞之RNA；孔96：源自MOLT4細胞之RNA)中，於大致所有條件下發現了良好之擴增。
C3-3.定序 將進行PCR擴增並確認到譜帶之樣本(圖7之經CMVpp65肽刺激並經分選之樣本中關於TCRα為25個樣本、關於TCRβ為41個樣本；於圖8之經M1肽刺激並經分選之樣本中關於TCRα為24個樣本、關於TCRβ為21個樣本)利用AMPure XP DNA套組進行純化，利用P5-seq引子實施桑格法定序。將所獲得之定序資料利用Repertoire Genesis軟體進行解析。
將經CMVpp65肽刺激並經分選之樣本之定序及Repertoire Genesis軟體解析結果示於表21。於所定序之TCRα 25個樣本、TCRβ 41個樣本全部中確認到一些TCR cDNA序列，19個樣本實現了TCRα/β對之序列解析(至少鑑定TCRα/β兩者之V區)。
將經M1肽刺激並經分選之樣本之結果示於表22。於所定序之TCRα 24個樣本中之22個樣本、TCRβ 21個樣本全部中確認到一些TCR cDNA序列，7個樣本實現了TCRα/β對之序列解析。 [表21]
Figure 02_image065
[表22]
Figure 02_image066
C3-4.定序序列確定-2 為了利用ILLUMINA公司之MiSeq下一代定序儀對包含「C3-3.定序序列確定」中對TCRα/β對之序列完成了解析者中一部分序列資訊不明確之樣本的源自經CMVpp65肽刺激並經分選之細胞4個孔(孔No.6、12、15、20)、及源自經M1肽刺激並經分選之細胞3個孔(孔No.13、36、39)的PCR產物純化物(「C3-3.定序序列確定」中之利用PCR擴增之DNA樣本)進行序列解析，而利用表23之PCR反應液及反應循環進行索引附加PCR。將PCR產物利用AMPure XP DNA套組進行純化，依據製造商之方案進行利用MiSeq下一代定序儀之定序運轉。 [表23]
Figure 02_image067
將所獲得之定序資料利用Repertoire Genesis軟體進行解析。將其結果、與桑格法定序資料之比較結果示於表24。對於在桑格法中無法精度良好地進行解析之樣本(CMV-No.20 TCRα/β)、及判定為包含終止密碼子之CDR3之樣本(CMV-No.12 TCRβ、CMV-No.15 TCRβ)之序列，獲得了正確之解析結果，重新進行了CDR3胺基酸序列之正確鑑定。確認到於桑格法中因定序錯誤或非特異性擴增DNA片段之混入等而存在無法順利解析之樣本，但藉由利用ILLUMINA公司之MiSeq等所謂下一代定序儀之分子等級之複數個測序片段之解析，可更高精度地獲得序列資料。 [表24]
Figure 02_image068
(實施例4：利用一步法RT-TS-PCR法之BCR之擴增)
實驗D
D1.細胞製備與培養
(製備例) 將實施例中所使用之試劑類之製備例示於以下。 ・試劑之清單(用於實驗D之追加成分) -FITC標記抗人類CD19抗體(560994，Nippon Becton Dickinson股份有限公司) -PE-Cy5標記抗人類CD8抗體(557746，Nippon Becton Dickinson股份有限公司) -Clear back Human Fc受體阻斷試劑(MTG-001，醫學生物學研究所股份有限公司) -雷西莫特(SML0196，Sigmα-Aldrich) -7-AAD(51-88981E，Nippon Becton Dickinson股份有限公司) ・所使用之寡核苷酸序列 -hBCRμ阻斷引子(CM2(2); 19個鹼基)：TCCTGTGCGAGGCA GCCAA (序列編號604) -hBCRμRT引子(CM1(2); 23個鹼基)：TGATGTCAGAGTTGT TCTTG (序列編號605) -hBCR κ阻斷引子(CK2; 18個鹼基)：CTGTACTTTGGCCTCTCT (序列編號606) -hBCR κ RT引子(CK1; 19個鹼基)：TTGTGTTTCTCGTAGTCTG(序列編號607) -hBCR λ阻斷引子(CL2; 16個鹼基)：CCGGGTAGAAGTCACT(序列編號608) -hBCR λRT引子(CL1; 19個鹼基)：TGTCTTCTCCACGGTGCTC(序列編號609) -hBCRμ反向Tag引子(CM-ST1-R-(3)、53個鹼基)：TCGTC{GGCAGCGTCAGATGTGTATAA}GAGACAG GTATCCGACGGGGAATTCTC(序列編號610) -hBCR κ反向Tag引子(CK-ST1-R、51個鹼基)：TCGTC{GGCAGCGTCAGATGTGTATAA}GAGACAG TTATTCAGCAGGCACACA(序列編號611) -hBCR λ-反向Tag引子(CL-ST1-R、51個鹼基)：TCGTC{GGCAGCGTCAGATGTGTATAA}GAGACAG TGTGGCCTTGTTGGCTTG(序列編號612)
D1-1.細胞單離 自人類志願者(2名)採取末梢血液，利用聚蔗糖密度梯度法單離末梢血液單核細胞(PBMC)而用於實驗。
D1-2.細胞培養 PBMC係2個檢體均於細胞製備後培養一夜，於包含10 μg/ml之雷西莫特(雷西莫特)之培養基中培養2天，而用於單細胞分選庫解析實驗。進行2天雷西莫特處理，確認IL-6、BCRμ、BCRκ及BCRλ之mRNA等級上升，藉此事先確認B細胞是否活化(參考文獻：Eur J Immunol. 2018 Feb; 48 (2)： 283-292. BAFF augments IgA2 and IL-10 production by TLR7/8 stimulated total peripheral blood B cells)。將CD19作為B細胞之細胞標記物來使用。
D2.細胞標記物染色與單細胞分選 D2-1.利用細胞標記物抗體之染色 於包含雷西莫特之培養基中培養之PBMC係藉由離心分離而沈降，進行利用MACS緩衝液之再懸浮、利用離心分離之洗淨後，於MACS緩衝液中利用Clear Back Human Fc受體阻斷試劑於冰上進行5分鐘處理，進行利用MACS緩衝液之再懸浮、利用離心分離之洗淨2次後，利用FITC標記CD19抗體及PE-Cy7標記抗CD8抗體於冰上進行30分鐘染色、利用MACS緩衝液之再懸浮、及利用離心分離之洗淨後，利用死細胞染色試劑7-AAD於冰上進行10分鐘染色、利用MACS緩衝液之再懸浮、及利用離心分離之洗淨後，最終於1 ml之MACS緩衝液中懸浮，供於單細胞分選。
D2-2.單細胞分選 所染色之細胞係利用細胞分選儀(Nippon Becton Dickinson股份有限公司，FACSMelody)，於淋巴細胞群門中將7-AAD陰性、FITC陽性(CD19陽性)、PE-Cy7陰性(CD8陰性)細胞群向添加有一步法RT-TS-PCR反應液(D3-1)之96孔培養盤投入1個細胞(各供體24個孔每孔各1個細胞)、或者實驗之陽性對照性之複數個細胞(各供體每3個孔各5個細胞、25個細胞)。將作為陰性對照之未投入細胞之孔設置4個孔。
D3.利用一步法RT-TS-PCR法之BCRμ(Ig重鏈μ)、BCRκ(Ig輕鏈κ)、BCRλ(Ig輕鏈λ)之擴增 D3-1.一步法RT-TS-PCR反應 於分注有細胞之培養盤中細胞係立即於表25之反應試劑中進行一步法RT-TS-PCR反應。 [表25]
Figure 02_image070
D3-2.半巢式PCR 一步法RT-TS-PCR反應液係添加2倍量之純水(DW)並分取1.5 μl，將BCRμ、BCRκ、BCRλ於同一管中、或於不同之管中在表.24之反應液中進行半巢式之PCR反應。為了對於DNA片段附加定序引子識別序列，而使用5'側附加有模板轉換序列且3'側於阻斷引子之內側序列附加有接頭序列(用以附加定序用索引序列之序列)之引子。分取反應液3 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認。 [表26]
Figure 02_image071
將於同一管內進行半巢式PCR所得之結果示於圖9。若將確認到大約400個鹼基對以上且800個鹼基以下之長度之產物之孔作為陽性，則於進行單細胞解析(於1個孔中注入1個細胞)之孔中48個孔中在37個孔(供體A：20個孔、供體B：17個孔)中確認到目標長度之DNA譜帶。於作為反應之陽性對照設定之注入有5個細胞(孔25～27及57～59)、25個細胞(孔38～30及60～62)之孔中，於所有孔中發現了良好之擴增。孔31、32、63及64係未注入細胞。
於不同之管內將BCRμ、BCR κ、BCR λ進行半巢式PCR，將所得之結果示於圖10。若將確認到大約400個鹼基對以上且800個鹼基以下之長度之產物之孔設為陽性，則於單細胞解析之孔中BCRμ於48個孔中在15個孔中確認到目標長度之DNA譜帶，BCR κ於48個孔中在14個孔中確認到目標長度之DNA譜帶，BCR λ於48個孔中在15個孔中確認到目標長度之DNA譜帶。在9個孔(No.13、17、18、22、23、36、38、55、56)中確認到成對基因(重鏈BCRμ、輕鏈BCR κ、及BCR λ之任一者或兩者)之擴增。
D3-3.定序序列確定 進行PCR擴增並確認到譜帶之同一管反應系之37個孔之半巢式PCR樣本、源自於不同之反應系中確認到對擴增之9個孔之19個半巢式PCR樣本為了利用AMPure XP DNA套組進行純化，並利用ILLUMINA公司之MiSeq下一代定序儀進行序列解析，而利用如下之PCR反應液及反應循環進行索引附加PCR。將PCR產物利用AMPure XP DNA套組進行純化，依據製造商之方案進行利用MiSeq下一代定序儀之定序運轉。將所獲得之定序資料利用Repertoire Genesis軟體進行解析。 [表27]
Figure 02_image072
其結果為，若為於同一管中所得之結果，則對於獲得了總測序片段之10%之數之純系進行序列確定，結果為，所定序之37個孔之樣本中，BCRμ於16個孔中解析出框內包含CDR3之基因序列，BCR κ係於13個孔中解析出框內包含CDR3之基因序列，BCR λ係於17個孔中解析出框內包含CDR3之基因序列(其中，3個孔係鑑定認為源自2條染色體之2個序列)，於10個孔(No.)中解析出BCR重鏈・輕鏈之成對基因。(於表中表示出複數個V、D、J區之情形時，同源性之得分相同且候補成為2個；認為原因在於：於大多數之情形時，該等2個序列基本無差異，儘管基因組上之位置不同，但於cDNA上無法區別)
即便為分別解析所得之定序結果，對於獲得了總測序片段之20%之數之純系進行序列確定，亦結果為，所解析之19個BCR cDNA片段全部可進行序列解析，18個序列中獲得了能夠蛋白質轉譯之框內CDR3序列，其結果為，9個孔之樣本全部實現了插入有終止密碼子之BCR重鏈・輕鏈之成對基因之解析。認為No.38 BCR κ係於CDR3中存在終止密碼子，並非框內序列選殖，但認為BCR λ為框內序列，其等作為輕鏈與重鏈結合。分別解析之19個序列係與在同一管中解析所得之結果完全相同。於在同一管中進行反應時，簡便且電泳檢查所耗之時間較少便可，但供定序之檢體總數變多，於在不同管中進行反應之情形時，中途之實驗雖耗費時間，但定序數較少便可等，存在各種優點，在預想與TCR之解析時同樣地，成對基因之鑑定率會良好之情形時，關於在同一管中對樣本進行定序而鑑定率欠佳之難解析樣本，認為有效的是分別進行擴增等來靈活應用。 [表28-1] 表28將BCRμ、BCRκ、BCRλ於同一管中擴增、定序結果 (?係未鑑定之含義，*係終止密碼子、塗黃表示經基因鑑定之BCR，灰色 表示未完成者，淡藍色表示不插入有終止密碼子之序列被鑑定出者)
Figure 02_image073
[表28-2]
Figure 02_image075
[表29] 表29 將BCRμ、BCRκ、BCRλ分別擴增、定序結果 (?係未鑑定之含義，*係終止密碼子)
Figure 02_image077
繼而利用fastq-join程式使MiSeq定序資料之測序片段1(BCR cDNA之3'側C區側起定序所得之資料)與測序片段2(BCR cDNA之5'側起定序所得之資料)結合，轉換為反向互補佐序列，而轉換為與通常之cDNA相同朝向之序列。僅讀取於序列兩末端具有引子序列之純系，將引子序列去除後，隨機地挑選相應純系，藉由鹼基序列組裝多重匹配解析而獲得經過擴增之cDNA之鹼基序列。於DNA片段較長(大概長於500～580個鹼基對之情形)而結合率欠佳之情形時，除所結合之序列以外，利用無法以分配於該純系之測序片段結合之序列之測序片段1的反向互補佐序列、測序片段2之保持不變之序列，進行低品質區域之去除等後，進行鹼基序列組裝多重匹配解析，而獲得經擴增之cDNA之鹼基序列。確認所獲得之cDNA鹼基序列與Ensemble之基因資料庫等公共資料庫上之基因序列相比，是否自5'之胺基酸序列起始密碼子獲得到序列。又，進行胺基酸序列置換，進行前導區域與可變部區域(框架部4處：FR1～4；及可變區3處：CDR1～3)之胺基酸序列預測。作為解析例，表示所獲得之孔No.18之BCRμ、BCRλ、孔No.55之BCRμ、BCRλ之鹼基序列、胺基酸轉譯序列。(下劃線表示於Ensemble之基因資料庫上附有註解之轉譯起始密碼子、及利用電腦解析所鑑定之CDR3區域部位)均於框內自轉譯起始密碼子直至包含CDR3區域之C區之N末端胺基酸序列獲得了蛋白質資訊。
＞孔No.18 BCRμ鹼基序列 GGCACTAGAAGTCGGCGGTGTTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATG GAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGGGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCAAATCCCGACCCCTGAAGGTGGTAGCTGCTACTTTTCTTGACTACTGG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGT(序列編號796) ＞孔No.18 BCRμ胺基酸轉譯序列 GTRSRRCFHSVISTEHRGLTM EFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRPLKVVAATFLDYW GQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSC(序列編號797) ＞孔No.18 BCRλ鹼基序列 GGGGGTCTCAGGAGGCAGCGCTCTCGGGACGTCTCCACCATG GCCTGGGCTCTGCTATTCCTCACCCTCCTCACTCAGGGCACAGGGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTCTCGGGGTATTC GGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTT(序列編號798) ＞孔No.18 BCRλ胺基酸轉譯序列 GGLRRQRSRDVSTM AWALLFLTLLTQGTGSWAQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLGVF GGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEEL(序列編號799) ＞孔No.55 BCRμ鹼基序列 GCCTCGCACAGTGAATCCTGCTCCCCACCATG GACATACTTTGTTCCACGCTCCTGCTACTGACTGTCCCGTCCTGGGTCTTATCCCAGGTCACCTTGAGGGAGTCTGGTCCTGCGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACACTGACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAGCACTAGTGGAATGTGTGTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACGCATTGATTGGGATGATGATAAATACTACAGCACATCTCTGAAGACCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTCCTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGTGCACGGATAGGTCTAGGTGGCTATTCTTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGG GGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGT(序列編號800) ＞孔No.55 BCRμ胺基酸轉譯序列 LAQ*ILLPTM DILCSTLLLLTVPSWVLSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMCVSWIRQPPGKALEWLARIDWDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIGLGGYSYYYYYGMDVW GQGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSC(序列編號801) ＞孔No.55 BCRκ鹼基序列 GGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGACGGAACCATG GAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACTGGAGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGGAGTACACTTTT GGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGT(序列編號802) ＞孔No.55 BCRκ胺基酸轉譯序列 EELLS*DPDGTM EAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPEYTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS(序列編號803)
該等解析中所獲得之可變區之cDNA片段、cDNA鹼基序列係視需要進行再擴增或人工基因合成等，並藉由選殖而與功能上差異較少之C區之序列結合，而獲得全長編碼區域、或者與CD3ζ細胞內區域、CD28細胞內區域、4-1BB細胞內區域、ICOS細胞內區域、OX40細胞內區域等各種蛋白質之細胞內區域或訊號傳遞區、功能區、蛋白質片段、人工設計蛋白質片段、該等之嵌合體蛋白質結合，而獲得嵌合體蛋白質編碼區域，藉此實現細菌、細胞系統或人工合成系統中之蛋白質表現、蛋白質合成，而能夠應用於抗體製作、抗體醫藥品、CART療法等。
(實施例5：TCR(或BCR)成對基因選殖)
實驗E
(試劑) 實驗E中之追加之試劑係如下所示。 -大腸桿菌勝任細胞(Nippon Gene) -pcDNA3.1(+)/V5His(B)載體(Themofisher Scientific) -pMXs載體(CELL BIOLABS) -限制酶EcoRI(Nippon Gene) -限制酶EcoRV(Nippon Gene) -NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEW England BioLabs) -NucleoSpin Plasmid(TAKARA BIO) ・所使用之寡核苷酸序列 〇TCR選殖pcDNA3.1(+)/V5His(B)用正向引子 -TS-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT AAGCAGTGGTATCAACGCA (序列編號745) -hTCRα-VX-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT (序列編號746)NNNN------NNNN(「NNNN------NNNN」係TCRαV區5'非轉譯區之16-35個鹼基左右之序列) -hTCRα-V24-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT TTTCT GCTGTGGGTACGTGAG (序列編號747) -hTCRb-VX-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT (序列編號748)NNNN------NNNN(「NNNN------NNNN」係TCRβV區5'非轉譯區之16-35個鹼基左右之序列) -hTCRb-V6.5-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT GAGAGT CCTGCTCCCCTTTC (序列編號749) 〇TCR選殖pMXs用正向引子 -TS-AdpMXEI：CCAGTGTGGTGGTACGGG AAGCAGTGGTATC AACGCA (序列編號750) -hTCRα-VX-F-AdpMXEI：CCAGTGTGGTGGTACGGG (序列編號751)NNNN------NNNN(「NNNN------NNNN」係TCRαV區5'非轉譯區之16-35個鹼基左右之序列) -hTCRb-VX-F-AdpMXEI：CCAGTGTGGTGGTACGGG (序列編號752)NNNN------NNNN(「NNNN------NNNN」係TCRβV區5'非轉譯區之16-35個鹼基左右之序列) -hTCRα-V24-F-AdpMXEI：CCAGTGTGGTGGTACGGG TTTCT GCTGTGGGTACGTGAG (序列編號753) -hTCRb-V6.5-F-AdpMXEI：CCAGTGTGGTGGTACGGG GAGAGT CCTGCTCCCCTTTC (序列編號754) (下劃線部係與載體之臂區(arm region)相同之用以組合連接之接頭序列) 〇TCR選殖共通反向引子 -hTCRα-C-R:AGGGTCAGGGTTCTGGATAT(序列編號755) -hTCRb-C1-R:GAACACCTTGTTCAGGTCCT(序列編號756) -hTCRb-C2-R:GAACACGTTTTTCAGGTCCT(序列編號757) 〇hTCRα用定序引子 hTCRaC-F0：TCTGCCTATTCACCGATTTTG(序列編號758) hTCRaC-F1：GGACTTCAAGAGCAACAGTGC(序列編號759) hTCRaC-F2：TGTCAAGCTGGTCGAGAAAAG(序列編號760) hTCRaC-F3：ACGCCTTCAACAACAGCATTA(序列編號761) hTCRaC-R1v1：CTTTTCTCGACCAGCTTGACA(序列編號762) hTCRaC-R2：CCACTTTCAGGAGGAGGATTC(序列編號763) hTCRaC-R4：CAAAATCGGTGAATAGGCAGA(序列編號764) hTCRaC-R5：ATAGACCTCATGTCTAGCACAG(序列編號765) 〇hTCRβ用定序引子 hTCR-CB-F2：GCTGTGTTTGAGCCATCAGAA(序列編號766) hTCRbC-F5：TGAATGGGAAGGAGGTGCACAGT(序列編號767) hTCR-CB-R2：TTCTGATGGCTCAAACACAGC(序列編號768) hTCR-CB2：AGGCAGTATCTGGAGTCATTGAG(序列編號769) hTCR-CB3：ACTGTGCACCTCCTTCCCATTCA(序列編號770) hTCRbC2-CloR1：GTTTAGCCTATTTCGTACTTGG(序列編號771) hTCRbC1-R1：AGTCACTTAGGCATGCTAAGGTC(序列編號772) ・所使用之合成基因片段(可藉由雙鏈DNA之定製合成、Thermofisher Scientific或Gene Design、INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES等實現合成；作為另外之方法，亦能夠自巨PBMC細胞製備RNA，將cDNA進行PCR擴增。已知基因存在人種或個人層面上之多型性，視需要變更目標基因型之鹼基序列)
〇pcDNA3.1(+)/V5His(B)用
-hTCRaCFull-AdpD3EV: ATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGAATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號773)
-hTCRaCFull_noSTOP-AdpD3EV: ATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTTAATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號774)
-hTCRbC1Full-AdpD3EV: AGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGAATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號775)
-hTCRbC1Full_noSTOP-AdpD3EV: AGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTTAATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號776)
-hTCRbC2Full-AdpD3EV: AGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號777)
-hTCRbC2Full_noSTOP-AdpD3EV: AGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTTAATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號778)
〇pMXs用
-hTCRaCFull-AdpMXEI: ATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGACCAGCTGAGCGCCGGTCG (序列編號779)
-hTCRbC1Full-AdpMXEI: AGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGACCAGCTGAGCGCCGGTCG (序列編號780)
-hTCRbC2Full-AdpMXEI: AGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGCCAGCTGAGCGCCGGTCG (序列編號781)
E1.選殖用DNA片段之製備 E1-1.可變區DNA片段之製備 針對TCR(或BCR)之單個細胞之功能性成對基因，藉由一步法RT-TS-PCR反應、或以半巢式PCR擴增產物純化DNA作為模板藉由以下之PCR反應而對可變區進行擴增。TCRβ係存在2種C區，根據定序資料或J區資料(J1-1～6係結合有C1，J2-1～7係結合有C2)來判別為C1純系還是為C2純系，選擇反向側引子。(其中，認為TCRβ之C1序列與C2序列於功能上無較大差異，能夠使用任一者之情形較多)DNA之擴增係利用瓊脂糖凝膠電泳等進行確認。於一步法RT-TS-PCR時將附加於5'側之序列用於正向側之引子，且將TCR之C區之序列用於反向側之引子，藉此不管何種V區均可一次擴增。根據電泳或定序之結果，可獲得不包含起始密碼子之短片段，或於認為存在非特異性序列之情形時或確認到源自2條染色體之轉錄產物之情形時等，藉由使用該V區特異性序列進行擴增，可獲得純度更高之DNA片段。將擴增產物利用AMPureXP或DNA純化用管柱進行純化。於發現400個鹼基以下之短DNA片段或7000個鹼基以上之長片段等之情形時，視需要，利用瓊脂糖凝膠電泳切出目標長度之DNA片段並進行純化。於本方案中，雖僅擴增了可變區，但藉由將一步法RT-TS PCR之反轉錄引子及阻斷引子、或半巢式PCR之引子較終止密碼子設計於3'下游(若PCR產物中包含終止密碼子部位，則亦可為包含編碼區域之形態)來進行PCR，亦可自轉譯起始密碼子直至終止密碼子包含(於組入至pcDNA3.1(+)/V5His(B)等中而構建附帶標籤之蛋白質用構建物之情形時，將終止密碼子轉換為任何胺基酸編碼密碼子)。亦可同樣地不進行PCR而合成包含全長編碼區域之DNA片段。 [表30]
Figure 02_image079
例如，認為實施例1(實驗A)中所獲得之孔No.13之TCRα(V24・J49・C純系)/TCRβ(V6-5・D1・J1-2・C1純系)對可利用如下反應進行擴增。 [表31]
Figure 02_image080
[表32]
Figure 02_image081
E1-2.選殖載體之製備 依據製造商之方案，表現載體pcDNA3.1(+)/V5His(B)係由EcoRV消化，反轉錄病毒載體pMXs係由EcoRI消化。視需要進行瓊脂糖凝膠電泳，切出經酶消化之直鏈DNA譜帶，利用DNA純化管柱等將DNA進行純化。
E2.DNA片段之連接、利用向大腸桿菌導入之純系取得、序列確認 E2-1.DNA片段之連接及向大腸桿菌之導入 使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix等，將所製備之可變區DNA片段、基因合成之C區片段(亦能夠進行PCR擴增)、及經限制酶消化之載體DNA之3種DNA片段進行組合連接。
組合連接係藉由使DNA之5'末端與3'末端15～25個鹼基相同並重疊而進行DNA之結合，因此將相對應之DNA片段彼此用於反應。於利用pcDNA3.1(+)/V5His(B)等可於C末端附加蛋白標籤序列者作為載體之情形時，若直接利用C區之終止密碼子，則通常之TCR使終止密碼子變化為能夠轉譯之胺基酸密碼子，藉此可獲得能夠表現於TCR附加有標籤序列之蛋白質之構建物。
連接之反應液組成或反應條件係依據製造商之方案。分取一部分連接產物，將勝任細胞進行轉形，平板接種至瓊脂培養基中而獲得基因重組大腸桿菌。
於以下之表中表示表現載體pcDNA3.1(+)/V5His(B)與反轉錄病毒載體pMXs使用時之TCRα/β之可變區擴增引子集合、C區DNA片段之種類、及自表現載體或製備病毒表現之蛋白質種類。 [表33-1]
Figure 02_image082
[表33-2]
Figure 02_image083
[表34]
Figure 02_image084
E2-2.質體DNA製備 質體基因重組體單菌落係於液體培養基中進行培養並集菌，利用一般之鹼提取法或NucleoSpin Plasmid等市售之套組製備質體DNA。
E2-3.質體DNA插入之序列確認 所獲得之質體分別使用TCRα用定序引子、TCRβ用定序引子、載體引子，利用一般之桑格序列解析法進行插入序列之定序。將無鹼基序列之置換(至少無誤義突變或無意義突變)、插入、缺失之純系用作TCR表現構建物。
E3.TCR(或BCR)表現構建物之利用 TCR表現構建物係兩組成對基因，且視目的亦可僅為其中一組，藉由磷酸鈣法、脂轉染法、電穿孔法、熱休克法等，導入至視需要進行預處理而提昇了導入能力之淋巴細胞、各種初代培養細胞或細胞株、細菌、真菌等中以進行基因表現，從而可利用於在細胞基質中之基於各種生物檢定之表位搜尋、功能解析、蛋白質合成等。
向pMXs等病毒載體中組入TCR而成者可藉由與所需要之其他病毒構成蛋白表現構建物共轉染至293T細胞等包裝細胞來培養，而製備基因導入用病毒。所製作之病毒為兩組成對基因，且視目的亦可僅為其中一組，可使細胞感染該病毒而進行蛋白質表現。組入有T7啟動子之pcDNA3.1(+)/V5His(B)載體等活體外轉錄起始啟動子位於轉譯起始點之上游的構建物可藉由不對細胞或細菌進行基因導入而依據一般之分子生物學或生化學之教科書、實驗方案書籍，或者利用市售之套組等來進行TCRα/β之mRNA之合成、蛋白質合成。
所合成之蛋白質可直接、或成對進行重折迭等所需要之處理後，作為用以表位或配體、結合蛋白之搜尋、立體結構解析確定之標準品、西方墨點法等之陽性對照標準品等廣泛地應用。
(實施例6：BCR(或TCR)成對基因選殖)
實驗F
・試劑之清單(用於實驗F之追加成分) -大腸桿菌勝任細胞(Nippon Gene) -pcDNA3.1(+)/V5His(B)載體(Themofisher Scientific) -pMXs載體(CELL BIOLABS) -限制酶EcoRI(Nippon Gene) -限制酶EcoRV(Nippon Gene) -NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEW England BioLabs) -NucleoSpin Plasmid(TAKARA BIO) ・所使用之寡核苷酸序列 〇BCR選殖pcDNA3.1(+)/V5His(B)用正向引子 -TS-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT AAGCAGTGGTAT CAACGCA (序列編號782) -hBCRH-VX-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT (序列編號783)NNNN------NNNN(「NNNN------NNNN」係BCR重鏈V區5'非轉譯區之16-35個鹼基左右之序列) -hBCRH-V3.30-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT ACTAGA AGTCGGCGGTGTTTC (序列編號784)-hBCRH-V2.70-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT ACAGTGAATCCTGCTCCCCAC(序列編號785)-hBCRLam-VX-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT (序列編號786)NNNN------NNNN(「NNNN------NNNN」係BCR輕鏈λ、V區5'非轉譯區之16-35個鹼基左右之序列) -hBCRLam-V2.14-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT TCT CAGGAGGCAGCGCTCTC (序列編號787) -hBCRKap-VX-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT (序列編號788)NNNN------NNNN(「NNNN------NNNN」係BCR輕鏈κ、V區5'非轉譯區之16-35個鹼基左右之序列) -hBCRK-V3.15-F-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT AGGAA CTGCTCAGTTAGGAC (序列編號789) (下劃線部係與載體之臂區相同之用以組合連接之接頭序列) 〇BCR選殖共通反向引子 -hBCRM-C-R：GTTGGGGCGGATGCACTCCC(序列編號790) -hBCRLam-C2-R：GGCAGCCTTGGGCTGACC(序列編號791) -hBCRKap-C1-R：CAGATGGTGCAGCCACAGTTC(序列編號792) ・所使用之合成基因片段(可藉由雙鏈DNA之定製合成、Thermofisher Scientific或Gene Design、INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES等進行合成；作為另外之方法，亦能夠自巨PBMC細胞製備RNA，將cDNA進行PCR擴增；已知基因存在人種或個人層面上之多型性，視需要變更目標基因型之鹼基序列)
〇pcDNA3.1(+)/V5His(B)用
-hBCRKapCFull-AdpD3EV: GAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號793) -hBCRLamC2Full-AdpD3EV:
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAGATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號794)
-hBCRμCFull-AdpD3EV: GGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTTGGCTGCCTCGCACAGGACTTCCTTCCCGACTCCATCACTTTCTCCTGGAAATACAAGAACAACTCTGACATCAGCAGCACCCGGGGCTTCCCATCAGTCCTGAGAGGGGGCAAGTACGCAGCCACCTCACAGGTGCTGCTGCCTTCCAAGGACGTCATGCAGGGCACAGACGAACACGTGGTGTGCAAAGTCCAGCACCCCAACGGCAACAAAGAAAAGAACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCTGAGCTGCCTCCCAAAGTGAGCGTCTTCGTCCCACCCCGCGACGGCTTCTTCGGCAACCCCCGCAAGTCCAAGCTCATCTGCCAGGCCACGGGTTTCAGTCCCCGGCAGATTCAGGTGTCCTGGCTGCGCGAGGGGAAGCAGGTGGGGTCTGGCGTCACCACGGACCAGGTGCAGGCTGAGGCCAAAGAGTCTGGGCCCACGACCTACAAGGTGACCAGCACACTGACCATCAAAGAGAGCGACTGGCTCGGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGCGTGGATCACAGGGGCCTGACCTTCCAGCAGAATGCGTCCTCCATGTGTGTCCCCGATCAAGACACAGCCATCCGGGTCTTCGCCATCCCCCCATCCTTTGCCAGCATCTTCCTCACCAAGTCCACCAAGTTGACCTGCCTGGTCACAGACCTGACCACCTATGACAGCGTGACCATCTCCTGGACCCGCCAGAATGGCGAAGCTGTGAAAACCCACACCAACATCTCCGAGAGCCACCCCAATGCCACTTTCAGCGCCGTGGGTGAGGCCAGCATCTGCGAGGATGACTGGAATTCCGGGGAGAGGTTCACGTGCACCGTGACCCACACAGACCTGCCCTCGCCACTGAAGCAGACCATCTCCCGGCCCAAGGGGGTGGCCCTGCACAGGCCCGATGTCTACTTGCTGCCACCAGCCCGGGAGCAGCTGAACCTGCGGGAGTCGGCCACCATCACGTGCCTGGTGACGGGCTTCTCTCCCGCGGACGTCTTCGTGCAGTGGATGCAGAGGGGGCAGCCCTTGTCCCCGGAGAAGTATGTGACCAGCGCCCCAATGCCTGAGCCCCAGGCCCCAGGCCGGTACTTCGCCCACAGCATCCTGACCGTGTCCGAAGAGGAATGGAACACGGGGGAGACCTACACCTGCGTGGTGGCCCATGAGGCCCTGCCCAACAGGGTCACCGAGAGGACCGTGGACAAGTCCACCGGTAAACCCACCCTGTACAACGTGTCCCTGGTCATGTCCGACACAGCTGGCACCTGCTACTGAATCCAGCACAGTGGCGGC (序列編號795) (下劃線部係與載體之臂區相同之用以組合連接之接頭序列)
F1.選殖用DNA片段之製備 對於BCR(或TCR)之單細胞功能性成對基因，藉由一步法RT-TS-PCR反應、或以半巢式PCR擴增產物純化DNA作為模板藉由以下之PCR反應而將可變區進行擴增。於一步法RT-TS-PCR時，藉由將附加於5'側之序列用於正向側之引子，將TCR/BCR之C區之序列用於反向側之引子，而無論何種V區均可一次擴增。根據電泳或定序之結果，可獲得不包含起始密碼子之短片段，或者於認為存在非特異性序列之情形時或確認到源自2條染色體之轉錄產物之情形時等，藉由使用該V區特異性序列進行擴增，可獲得純度更高之DNA片段。將擴增產物利用AMPureXP或DNA純化用管柱進行純化。於發現400個鹼基以下之短DNA片段或7000個鹼基以上之長片段等之情形時，視需要利用瓊脂糖凝膠電泳切出目標長度之DNA片段並進行純化。於本方案中，雖僅擴增了可變區，但藉由將一步法RT-TS PCR之反轉錄引子及阻斷引子、或半巢式PCR之引子較終止密碼子設計於3'下游(若PCR產物中包含終止密碼子部位，則亦可為包含編碼區域之形態)來進行PCR，亦可自轉譯起始密碼子直至終止密碼子包含(於組入至pcDNA3.1(+)/V5His(B)等中而構建附帶標籤之蛋白質用構建物之情形時，將終止密碼子轉換為任何胺基酸編碼密碼子)。亦可同樣地不進行PCR而合成包含全長編碼區域之DNA片段。
例如，認為實施例4(實驗D)中所獲得之孔No.18之BCR重鏈(V3-30・D2-15・J4純系)/BCR輕鏈λ(V2-14・J2・C2純系)對、孔No.55之BCR重鏈(V2-70・D?・J6純系)/BCR輕鏈κ(V3-15・J2純系)對可利用如下反應進行擴增。 [表35]
Figure 02_image085
[表36]
Figure 02_image086
[表37]
Figure 02_image087
[表38]
Figure 02_image088
F1-2.選殖載體之製備 依據製造商之方案，表現載體pcDNA3.1(+)/V5His(B)係由EcoRV消化。視需要進行瓊脂糖凝膠電泳，切出經酶消化之直鏈DNA譜帶，利用DNA純化管柱等將DNA進行純化。
F2.DNA片段之連接、利用向大腸桿菌導入之純系取得、序列確認 F2-1.DNA片段之連接及向大腸桿菌之導入 使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix等，將所製備之可變區DNA片段、基因合成之C區片段(亦能夠進行PCR擴增)、及經限制酶消化之載體DNA之3種DNA片段進行組合連接。
組合連接係藉由使DNA之5'末端與3'末端15～25個鹼基相同並重疊而進行DNA之結合，因此將相對應之DNA片段彼此用於反應。
於本實施例中示出重鏈對經序列解析之原本之BCR類別(BCRμ)之全長序列進行選殖的方案，但使C區之合成DNA為BCRγ、α、δ、ε之序列，使用基因合成或J區3'末端與其他類型之C區5'末端之嵌合體引子將可變區進行PCR擴增等，藉此亦可製備不同類型之BCR全長序列。
於利用pcDNA3.1(+)/V5His(B)等於C末端可附加蛋白標籤序列者作為載體之情形時，若直接利用C區之終止密碼子，則通常之BCR使終止密碼子變化為能夠轉譯之胺基酸密碼子，藉此可獲得能夠表現於BCR附加有標籤序列之蛋白質之構建物。
連接之反應液組成或反應條件係依據製造商之方案。分取一部分連接產物，將勝任細胞進行轉形，平板接種至瓊脂培養基中而獲得基因重組大腸桿菌。 F2-2質體DNA製備
質體基因重組體單菌落係於液體培養基中進行培養並集菌，並利用一般之鹼提取法或NucleoSpin Plasmid等市售之套組製備質體DNA。
F2-3.質體DNA插入之序列確認 所獲得之質體分別使用於BCR重鏈C區、輕鏈κC區、輕鏈λC區中設計成純系共通之定序引子、以及載體引子，利用一般之桑格序列解析法進行插入序列之定序。(已知BCR以體細胞變異完成鹼基置換，且亦可設計未出現變異之部位之引子或每個純系含有變異之引子)將無鹼基序列之置換(至少無誤義突變或無意義突變)、插入、缺失之純系用作BCR表現構建物。
F3.BCR(或TCR)表現構建物之利用 BCR表現構建物係兩組成對基因，且視目的亦可僅為其中一組，但藉由磷酸鈣法、脂轉染法、電穿孔法、熱休克法等，導入至視需要進行預處理而提昇了導入能力之淋巴細胞、各種初代培養細胞或細胞株、細菌、真菌等中以進行基因表現，而可利用於在細胞基質中之基於各種生物檢定之表位搜尋、功能解析、蛋白質合成等。
向pMXs等病毒載體組入BCR而成者可藉由與所需要之其他病毒構成蛋白表現構建物共轉染至293T細胞等包裝細胞來培養，而製備基因導入用病毒。所製作之病毒為兩組成對基因，且視目的亦可僅為其中一組，但可使細胞感染該病毒而進行蛋白質表現。組入有T7啟動子之pcDNA3.1(+)/V5His(B)載體等活體外轉錄起始啟動子位於轉譯起始點之上游的構建物可藉由不對細胞或細菌進行基因導入而依據一般之分子生物學或生化學之教科書、實驗方案書籍，或者利用市售之套組等來進行BCR重鏈/輕鏈之mRNA之合成、蛋白質合成。藉由製作表現BCR重鏈/輕鏈與噬菌體蛋白之嵌合體蛋白之噬菌體製作用載體，可製造能夠用於用以抗原肽搜尋之噬菌體呈現法等之人工噬菌體。
所合成之蛋白質可直接、或成對進行重折迭等進行需要之處理後，作為表位或配體、用以結合蛋白之搜尋、立體結構解析確定之標準品、西方墨點法等之陽性對照標準品等廣泛活用。エ抗原或表位所判明之免疫球蛋白係使該等蛋白質之檢測抗體(西方墨點法、免疫染色)或重鏈可變區及輕鏈可變區與CD3ζ細胞內區域、CD28細胞內區域、4-1BB細胞內區域、ICOS細胞內區域、OX40細胞內區域等各種蛋白質之細胞內區域或者訊號傳遞區、功能區、蛋白質片段、人工設計蛋白質片段、該等之嵌合體蛋白質結合，而製備嵌合體蛋白質表現構建物，從而可活用於向CART療法之應用等。 (實施例7：利用半一步法RT-TS-PCR法之TCRα及TCRβcDNA之擴增) 實驗G G1.細胞製備及培養 (製備例) 將本實施例中所使用之試劑類之製備例示於以下。 ・試劑之清單(用於實驗G之追加成分) -D-PBS(14249-24、Nacalai Tesque) -BAMBANKER(CS-02-001、NIPPON Genetics) -Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(DB11161、ThermoFisher Scientific) -PE-Cy7標記抗人類CD8抗體(557746、Nippon Becton Dickinson股份有限公司) -FITC標記抗人類C4抗體(560994、Nippon Becton Dickinson股份有限公司) -40U/μl RNasin RNase抑制劑(N211B、Promega) -40U/μl RNase抑制劑(315-08121、Nippon Gene) -ECOS X Competent E. coli DH5 α(310-07733、Nippon Gene) -NucleoSpin轉染級質體(U0490B、TAKARA BIO) ・所使用之寡核苷酸序列 〇RT-TS-PCR用引子 -hTCRαRT引子(CA1; 23個鹼基)：TGTTGAAGGCGTTTGCA CATGCA (序列編號2) -hTCRαRT引子(hTCRaC-CloR1; 21個鹼基)：ATAGCAGGGCCTCG ATAATGA (序列編號806) -hTCRαRT引子(hTCRaC-CloR2; 22個鹼基)：AGGACCTAGAGCCC AAGAGAAC (序列編號807) -hTCRαPCR引子(hTCRaC-R4; 21個鹼基)：CAAAATCGGTGAATA GGCAGA (序列編號764) -hTCRαPCR引子(hTCRaC-R2v0; 21個鹼基)：GGAGCACAGGCTG TCTTACAA (序列編號808) -hTCRβRT引子(CB1(3); 23個鹼基)：GAACTGGACTTGACAGCG GAAGT (序列編號4) -hTCRβRT引子(hTCRbC1-R1; 23個鹼基)：AGTCACTTAGGCAT GCTAAGGTC (序列編號772) -hTCRβRT引子(hTCRbC1-R3; 21個鹼基)：CTGGGTTAGGGAGAT TTCAGC (序列編號809) -hTCRβRT引子(hTCRbC2-CloR1; 23個鹼基)：GGTTTAGCCTAT TTCGTACTTGG (序列編號771) -hTCRβRT引子(hTCRbC2-CloR2; 21個鹼基)：GTTGGGAGCTCAA TCTTCAGG (序列編號810) -hTCRβPCR引子(CB2; 23個鹼基)：AGGCAGTATCTGGAGT CATTGAG (序列編號3) -hTCRβPCR引子(hTCRbC1-R2v2; 20個鹼基)：CTAAGGTCCCCC TGGGTTAG (序列編號811) -hTCRβPCR引子(hTCRbC2-CloR3; 21個鹼基)：CTAGCCTCTGGA ATCCTTTCT (序列編號812) -正向TS-Tag引子v1(64個鹼基)：GTCTC{GTGGGCTCGGAGATGTGTAT}AAGAGACAG AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG(序列編號7)(下劃線部為MiSeq定序標籤序列部位，{ }所包圍之序列為桑格定序引子序列) -hTCRα反向Tag引子/hTCA-R-TP5-1(53個鹼基)：TCGTC{GGCAGCGTCAGATGTGTATAA}GAGACAG ACTTGTCACTGGATTTAGAG(序列編號9) -hTCRβ反向Tag引子(52個鹼基)：TCGTC{GGCAGCGTCAGATGTGTATAA}GAGACAG GCTCAAACACAGCGACCTC(序列編號10) (下劃線部為MiSeq定序標籤序列部位，{ }所包圍之序列為桑格定序引子序列) 〇TCR選殖用附帶V序列特異性接頭之正向引子 -hTCRaV38.2-F1-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT AGCAGG GACCTGTGAGCAT (序列編號813) -hTCRbV14-F1-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT GGGTCCT GCCATGGTTTCCA (序列編號814) -hTCRaV13.2-F2-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT GGCT GGAGATTGCAGGTTTAT (序列編號815) -hTCRbV4.1-F1-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT AGGCT AGCATGGGCTGCAGGCT (序列編號816) -hTCRaV27-F3-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT GGCTCTT TCAGGAGCAGCTAA (序列編號817) -hTCRbV7.6-F1-AdpD3EV：TGGTGGAATTCTGCAGAT GGTAAAG CCCTCATCCTGTC (序列編號818) (下劃線部係與載體之臂區相同之用以組合連接之接頭序列) 〇TCR選殖用附帶接頭之共通反向引子 -hTCRaC-AdpD3EV：GCCGCCACTGTGCTGGAT TCAGCTGGA CCACAGCCGCAG (序列編號819) -hTCRaC-NT-AdpD3EV：CCGCCACTGTGCTGGAT TAAGCTGGA CCACAGCCGCAG (序列編號820) -hTCRbC1-AdpD3EV：GCCGCCACTGTGCTGGAT TCAGAAATCC TTTCTCTTGAC (序列編號821) -hTCRbC1-NT-AdpD3EV：GCCGCCACTGTGCTGGAT TAAGAAA TCCTTTCTCTTGAC (序列編號822) -hTCRbC2-AdpD3EV：GCCGCCACTGTGCTGGAT CTAGCCT CTGGAATCCTTTCT (序列編號823) -hTCRbC2-NT-AdpD3EV：GCCGCCACTGTGCTGGAT TAAGCCT CTGGAATCCTTTCT (序列編號824) (下劃線部係與載體之臂區相同之用以組合連接之接頭序列) 〇TCRC區選殖與定序用共通正向引子 -hTCRα-C-F：ATATCCAGAACCCTGACCCT(序列編號825) -hTCRb-C1-F：AGGACCTGAACAAGGTGTTC(序列編號826) -hTCRb-C2-F：AGGACCTGAAAAACGTGTTC(序列編號827) 〇TCR-VJ區選殖用共通反向引子 -hTCRα-C-R:AGGGTCAGGGTTCTGGATAT(序列編號755) -hTCRb-C1-R:GAACACCTTGTTCAGGTCCT(序列編號756) -hTCRb-C2-R:GAACACGTTTTTCAGGTCCT(序列編號757) 〇TCRC區選殖用共通正向引子 -hTCRaC1E4-R2:CTTCCAAATCATTTTAATGAAGGCATC -hTCRbC1-R1v2:AGTCACTTAGGCATGCTAAGGTC -hTCRbC2E4-R1:GCAACCAGGCCCAACACACAA 〇TCR定序用引子 hTCRaC-R4: CAAAATCGGTGAATAGGCAGA(序列編號764) hTCRaC-R5：ATAGACCTCATGTCTAGCACAG(序列編號765) hTCR-CB2-R2: TTCTGATGGCTCAAACACAGC(序列編號828) hTCR-CB2：AGGCAGTATCTGGAGTCATTGAG(序列編號769) hTCR-CB3：ACTGTGCACCTCCTTCCCATTCA(序列編號770) 〇定序用載體引子 T7：TAATACGACTCACTATAGGG(序列編號853) CMV-Fwd2：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(序列編號854) BGH-Reverse：TAGAAGGCACAGTCGAGG(序列編號855) G1-1 細胞單離 自人類志願者採取末梢血液，利用聚蔗糖密度梯度法單離末梢血液單核細胞(PBMC)，於細胞冷凍保存試劑(BAMBANKER)中懸浮，於-80℃下冷凍保管，而用於實驗。 G1-2 細胞培養 冷凍保管PBMC係於復蘇後，於包含Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28之培養基中培養3天。於即將實驗之前於磁性台架上去除Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，而用於單細胞分選庫解析實驗。 G2. 細胞標記物染色及單細胞分選 G2-1 利用細胞標記物抗體之染色 於包含Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28之培養基中所培養之PBMC係藉由離心分離而沈降，進行利用D-PBS緩衝液之再懸浮、利用離心分離之洗淨後，於D-PBS緩衝液中利用PE-Cy7標記抗人類CD8抗體及FITC標記抗人類CD4抗體於冰上處理30分鐘。將利用D-PBS緩衝液之再懸浮、利用離心分離之洗淨進行2次後，最終於0.7 ml之D-PBS緩衝液中懸浮而供於單細胞分選。 G2-2 單細胞分選 染色之細胞係利用細胞分選儀(Nippon Becton Dickinson股份有限公司，FACSMelody)，於淋巴細胞群門中將PE-Cy7陽性(CD8陽性)、FITC陰性(CD4陰性)細胞群向添加有使用TCRα/β分別不同之識別部位之反轉錄引子的RT-TS-PCR反應液(G3-2)之96孔培養盤中以如下方式投入1個細胞(各RT引子集合群15個孔、或19個孔每孔1個)、或實驗之陽性對照之複數個細胞(每孔10個細胞)。 G3. 利用半一步法RT-TS-PCR法之TCRα及TCRβ cDNA之擴增 G3-1 半一步法RT-TS-PCR反應 利用分注有細胞之培養盤，立即於表39之反應試劑中以45℃加熱30分鐘，藉此進行RT-TS反應。關於表39中之條件1，使用退火為與此前之實驗相同之TCR、C區編碼區域之RT引子及PCR引子，但於條件2及3中，以於之後之實驗中可選殖全長蛋白編碼區域(全長open reading frame；ORF區域)之方式將RT引子與PCR引子設計於終止密碼子之3'下流部位、或者包含終止密碼子之序列部位來使用。 [表39]
Figure 02_image089
接下來，將表40之包含PCR引子之反應試劑添加至各孔中並進行混合，進行PCR反應。進行反轉錄反應後，暫時停止反應，不進行緩衝液變更等而簡單地添加包含PCR引子之同一緩衝液，由於該方法，將一連串本解析手法稱為半一步法RT-TS PCR反應，將所獲得之反應液作為半一步法RT-TS PCR反應液。 [表40]
Figure 02_image090
G3-2 半巢式PCR 半一步法RT-TS-PCR反應液係添加3倍量之純水(DW)並分取2.0 μl，將TCRα、TCRβ於不同之管中在表41之反應液中進行半巢式之PCR反應。為了對於DNA片段附加定序引子識別序列，而使用5'側附加有模板轉換序列且3'側係於PCR引子之內側序列附加有接頭序列(用以附加MiSeq定序用索引序列之序列)之引子。分取3 μl反應液，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認。 [表41]
Figure 02_image091
將半巢式PCR之結果示於圖12。於單細胞解析(於1個孔中注入1個細胞)之孔中，於條件1下15個孔中在14個孔中確認到TCRα、TCRβ兩者之DNA譜帶，於條件2下19個孔中在12個孔中確認到TCRα、TCRβ兩者之DNA譜帶，於條件3下19個孔中在10個孔中確認到TCRα、TCRβ兩者之DNA譜帶。於作為反應之陽性對照所設定之注入有10個細胞之孔中，於全部3個條件下發現了TCRα、TCRβ兩者之良好擴增。 G3-3 定序庫序列確定 繼而將所獲得之半巢式PCR反應液進行純化，利用桑格法進行定序。於本實驗中，以之後表示之自RT-PCR反應液進行全長蛋白編碼區域(全長ORF區域)之選殖為目的，而將要件中之條件2及3中相對良好之條件2作為解析對象。於本實驗中由於譜帶之訊號強度普遍較弱，故而對於條件2之單細胞解析全部19個樣本及作比較對象之將條件1之No1～4之TCRα、TCRβ半巢式PCR反應液中之DNA進行純化，TCRα、TCRβ任一者之樣本均回收到一定量以上之DNA者(條件2之No1～12、16～19之16個樣本、條件1之No1～4之4樣本)，進行定序解析。所獲得之序列係相對於TCRα/β序列資料庫進行blast同源性檢索，進行TCR擴增之有無、擴增之鹼基序列之VJ庫序列(除TCRβ外還包括C區)之鑑定。表42中表示所確定之TCRα/β之序列對資訊(？係未鑑定之含義)。 [表42]
Figure 02_image092
其結果為，包括DNA譜帶不明確之樣本在內，於所定序之全部半巢式PCR反應物之DNA純化物中確認到源自TCR之序列。利用電泳檢測DNA譜帶之限界為數奈克/譜帶左右。根據該結果，TCR擴增不應僅憑電泳結果來判定成敗，就成本效益之觀點而言，認為將所解析之全部孔推進至定序為止亦有效果。 G4 TCR成對基因之全長蛋白編碼區域cDNA選殖及表現載體構建 G4-1 PCR反應 為了進行條件3之No1、3、4之TCRα、TCRβ成對基因選殖，分別設計可變區(V區)之起始密碼子上游、或包含起始密碼子之起始密碼子上游與ORF區域之引子。轉譯起始密碼子係設為於Ensemble之基因資料庫上附有註解之部位。如實施例5中所示，為了進行與載體之組合連接，對於所設計之V區引子附加與載體序列同一之序列(本實施例中，以與實施例5相同之方式設計為pcDNA3.1(+)V5His(B)用)。終止密碼子側之引子亦製作於自終止密碼子起上游側20個鹼基程度之序列附加有與載體序列同一之序列而成的引子。為了製作與載體之V5His標籤序列之融合蛋白質表現用之DNA序列，亦製作將終止密碼子變更為胺基酸編碼密碼子(TCRαC與TCRβC1係TGA向TTA/白胺酸編碼置換，TCRβC2係自TAG向TTA/白胺酸編碼置換)而成之引子，而用於實驗。 經純水4倍稀釋之半一步法RT-TS-PCR反應液係分取2.0 μl，將TCRα、TCRβ於不同之管中在表43之反應液中進行PCR反應，嘗試全長蛋白編碼區域cDNA選殖。V區F引子需要對每個純系逐一變更，如表44之清單所示般使用。分取反應液3 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認(圖13)。再者，該反應亦可將利用TCRα、TCRβ兩者且有終止密碼子及無終止密碼子之引子的反應於同一管中進行。於該情形時，若與載體組合連接，則可期待利用1根管中之一次反應而可更簡單地構建4種TCR表現構建物(pcDNA3.1V5His(B)之情形時，pcDNA3.1載體之hTCRα表現質體、hTCRα V5His融合蛋白表現質體、hTCRβ表現質體、hTCR βV5His融合蛋白表現質體之4種)。 [表43]
Figure 02_image094
[表44]
Figure 02_image095
G4-2 定序反應 所獲得之DNA片段係利用AMPure XP DNA進行純化，使用TCRα用定序引子(hTCRα-C-F、hTCRaC-R4、hTCRaC-R5)、TCRβ用定序引子(hTCRb-C2-F、hTCR-CR-R2、hTCR-CB2、hTCR-CB3)，利用一般之桑格序列解析法進行鹼基序列之定序。以所獲得之定序資料作為參考，將G3-3之半巢式PCR反應純化DNA之定序資料作為參考資料而確定全長蛋白編碼區域cDNA之鹼基序列。將所確定之鹼基序列與所預想之胺基酸序列示於以下。(下劃線部意指起始密碼子ATG或終止密碼子，*意指藉由終止密碼子而終止蛋白質合成之部位，//意指框移部位)表中表示藉由本解析結果所獲得之更新版之TCRVJ庫資訊。 於No.1及No.3中實現了包含全長蛋白編碼區域之TCR對之DNA選殖。No.4之TCRβ包含全長蛋白編碼區域，但TCRα於VJ接合區域中發生框移，而認為通常之全長蛋白無法表現，但可能有生物學上之意義而成為有意思之結果。 ＞條件3 No.1 TCRα PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列(序列編號829) AGCAGGGACCTGTGAGCATG GCATGCCCTGGCTTCCTGTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGTCTTGAATTTAGCATGGCTCAGACAGTCACTCAGTCTCAACCAGAGATGTCTGTGCAGGAGGCAGAGACCGTGACCCTGAGCTGCACATATGACACCAGTGAGAGTGATTATTATTTATTCTGGTACAAGCAGCCTCCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTTATTCGCCAAGAAGCTTATAAGCAACAGAATGCAACAGAGAATCGTTTCTCTGTGAACTTCCAGAAAGCAGCCAAATCCTTCAGTCTCAAGATCTCAGACTCACAGCTGGGGGATGCCGCGATGTATTTCTGTGCCCGGTATTCAGGAGGAGGTGCTGACGGACTCACCTTTGGCAAAGGGACTCATCTAATCATCCAGCCCTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA ＞條件3 No.1 TCRα PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列(序列編號830) MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCARYSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* ＞條件3 No.1 TCRα PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列(序列編號831) AGCAGGGACCTGTGAGCATGGCATG CCCTGGCTTCCTGTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGTCTTGAATTTAGCATGGCTCAGACAGTCACTCAGTCTCAACCAGAGATGTCTGTGCAGGAGGCAGAGACCGTGACCCTGAGCTGCACATATGACACCAGTGAGAGTGATTATTATTTATTCTGGTACAAGCAGCCTCCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTTATTCGCCAAGAAGCTTATAAGCAACAGAATGCAACAGAGAATCGTTTCTCTGTGAACTTCCAGAAAGCAGCCAAATCCTTCAGTCTCAAGATCTCAGACTCACAGCTGGGGGATGCCGCGATGTATTTCTGTGCCCGGTATTCAGGAGGAGGTGCTGACGGACTCACCTTTGGCAAAGGGACTCATCTAATCATCCAGCCCTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTTA ＞條件3 No.1 TCRα PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列(序列編號832) MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCARYSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSL ＞條件3 No.1 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列(序列編號833) GGGTCCTGCCATG GTTTCCAGGCTTCTCAGTTTAGTGTCCCTTTGTCTCCTGGGAGCAAAGCACATAGAAGCTGGAGTTACTCAGTTCCCCAGCCACAGCGTAATAGAGAAGGGCCAGACTGTGACTCTGAGATGTGACCCAATTTCTGGACATGATAATCTTTATTGGTATCGACGTGTTATGGGAAAAGAAATAAAATTTCTGTTACATTTTGTGAAAGAGTCTAAACAGGATGAGTCCGGTATGCCCAACAATCGATTCTTAGCTGAAAGGACTGGAGGGACGTATTCTACTCTGAAGGTGCAGCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGGAGTTTATTTCTGTGCCAGCAGCCAAGATCGCATCGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG ＞條件3 No.1 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列(序列編號834) MVSRLLSLVSLCLLGAKHIEAGVTQFPSHSVIEKGQTVTLRCDPISGHDNLYWYRRVMGKEIKFLLHFVKESKQDESGMPNNRFLAERTGGTYSTLKVQPAELEDSGVYFCASSQDRIEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG* ＞條件3 No.1 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列(序列編號835) GGGTCCTGCCATG GTTTCCAGGCTTCTCAGTTTAGTGTCCCTTTGTCTCCTGGGAGCAAAGCACATAGAAGCTGGAGTTACTCAGTTCCCCAGCCACAGCGTAATAGAGAAGGGCCAGACTGTGACTCTGAGATGTGACCCAATTTCTGGACATGATAATCTTTATTGGTATCGACGTGTTATGGGAAAAGAAATAAAATTTCTGTTACATTTTGTGAAAGAGTCTAAACAGGATGAGTCCGGTATGCCCAACAATCGATTCTTAGCTGAAAGGACTGGAGGGACGTATTCTACTCTGAAGGTGCAGCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGGAGTTTATTTCTGTGCCAGCAGCCAAGATCGCATCGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTTA ＞條件3 No.1 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列(序列編號836) MVSRLLSLVSLCLLGAKHIEAGVTQFPSHSVIEKGQTVTLRCDPISGHDNLYWYRRVMGKEIKFLLHFVKESKQDESGMPNNRFLAERTGGTYSTLKVQPAELEDSGVYFCASSQDRIEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGL ＞條件3 No.3 TCRα PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列(序列編號837) GGCTGGAGATTGCAGGTTTATGACTGATCCTATTTGGGAAGAACAATGATG GCAGGCATTCGAGCTTTATTTATGTACTTGTGGCTGCAGCTGGACTGGGTGAGCAGAGGAGAGAGTGTGGGGCTGCATCTTCCTACCCTGAGTGTCCAGGAGGGTGACAACTCTATTATCAACTGTGCTTATTCAAACAGCGCCTCAGACTACTTCATTTGGTACAAGCAAGAATCTGGAAAAGGTCCTCAATTCATTATAGACATTCGTTCAAATATGGACAAAAGGCAAGGCCAAAGAGTCACCGTTTTATTGAATAAGACAGTGAAACATCTCTCTCTGCAAATTGCAGCTACTCAACCTGGAGACTCAGCTGTCTACTTTTGTGCAGAGACCTCCCCCTTTTCAGATGGCCAGAAGCTGCTCTTTGCAAGGGGGACCATGTTAAAGGTGGATCTTAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA ＞條件3 No.3 TCRα PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列(序列編號838) MAGIRALFMYLWLQLDWVSRGESVGLHLPTLSVQEGDNSIINCAYSNSASDYFIWYKQESGKGPQFIIDIRSNMDKRQGQRVTVLLNKTVKHLSLQIAATQPGDSAVYFCAETSPFSDGQKLLFARGTMLKVDLNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* ＞條件3 No.3 TCRα PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列(序列編號839) GGCTGGAGATTGCAGGTTTATGACTGATCCTATTTGGGAAGAACAATGATG GCAGGCATTCGAGCTTTATTTATGTACTTGTGGCTGCAGCTGGACTGGGTGAGCAGAGGAGAGAGTGTGGGGCTGCATCTTCCTACCCTGAGTGTCCAGGAGGGTGACAACTCTATTATCAACTGTGCTTATTCAAACAGCGCCTCAGACTACTTCATTTGGTACAAGCAAGAATCTGGAAAAGGTCCTCAATTCATTATAGACATTCGTTCAAATATGGACAAAAGGCAAGGCCAAAGAGTCACCGTTTTATTGAATAAGACAGTGAAACATCTCTCTCTGCAAATTGCAGCTACTCAACCTGGAGACTCAGCTGTCTACTTTTGTGCAGAGACCTCCCCCTTTTCAGATGGCCAGAAGCTGCTCTTTGCAAGGGGGACCATGTTAAAGGTGGATCTTAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTTA ＞條件3 No.3 TCRα PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列(序列編號840) MAGIRALFMYLWLQLDWVSRGESVGLHLPTLSVQEGDNSIINCAYSNSASDYFIWYKQESGKGPQFIIDIRSNMDKRQGQRVTVLLNKTVKHLSLQIAATQPGDSAVYFCAETSPFSDGQKLLFARGTMLKVDLNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSL ＞條件3 No.3 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列(序列編號841) AGGCTAGCATG GGCTGCAGGCTGCTCTGCTGTGCGGTTCTCTGTCTCCTGGGAGCAGTTCCCATAGACACTGAAGTTACCCAGACACCAAAACACCTGGTCATGGGAATGACAAATAAGAAGTCTTTGAAATGTGAACAACATATGGGGCACAGGGCTATGTATTGGTACAAGCAGAAAGCTAAGAAGCCACCGGAGCTCATGTTTGTCTACAGCTATGAGAAACTCTCTATAAATGAAAGTGTGCCAAGTCGCTTCTCACCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTCTTAAACCTTCACCTACACGCCCTGCAGCCAGAAGACTCAGCCCTGTATCTCTGCGCCAGCAGCCAGGGGCGGAGAAACTACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG ＞條件3 No.3 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列(序列編號842) MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQGRRNYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG* ＞條件3 No.3 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列(序列編號843) AGGCTAGCATG GGCTGCAGGCTGCTCTGCTGTGCGGTTCTCTGTCTCCTGGGAGCAGTTCCCATAGACACTGAAGTTACCCAGACACCAAAACACCTGGTCATGGGAATGACAAATAAGAAGTCTTTGAAATGTGAACAACATATGGGGCACAGGGCTATGTATTGGTACAAGCAGAAAGCTAAGAAGCCACCGGAGCTCATGTTTGTCTACAGCTATGAGAAACTCTCTATAAATGAAAGTGTGCCAAGTCGCTTCTCACCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTCTTAAACCTTCACCTACACGCCCTGCAGCCAGAAGACTCAGCCCTGTATCTCTGCGCCAGCAGCCAGGGGCGGAGAAACTACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTTA ＞條件3 No.3 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列(序列編號844) MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQGRRNYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGL ＞條件3 No.4 TCRα PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列(序列編號845) GGCTCTTTCAGGAGCAGCTAAAGTCAGGGGCCATGTCCACCATGTGATAGAAAGACAAGATG GTCCTGAAATTCTCCGTGTCCATTCTTTGGATTCAGTTGGCATGGGTGAGCACCCAGCTGCTGGAGCAGAGCCCTCAGTTTCTAAGCATCCAAGAGGGAGAAAATCTCACTGTGTACTGCAACTCCTCAAGTGTTTTTTCCAGCTTACAATGGTACAGACAGGAGCCTGGGGAAGGTCCTGTCCTCCTGGTGACAGTAGTTACGGGTGGAGAAGTGAAGAAGCTGAAGAGACTAACCTTTCAGTTTGGTGATGCAAGAAAGGACAGTTCTCTCCACATCACTGCGGCCCAGCCTGGTGATACAGGCCTCTACCTCTGTGCCTATCCGAGGAGGAGGTGCTGACGGACTCACCTTTGGCAAAGGGACTCATCTAATCATCCAGCCCTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA ＞條件3 No.4 TCRα PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列(序列編號846) MVLKFSVSILWIQLAWVSTQLLEQSPQFLSIQEGENLTVYCNSSSVFSSLQWYRQEPGEGPVLLVTVVTGGEVKKLKRLTFQFGDARKDSSLHITAAQPGDTGLYLCA//IRQERTVLSTSLRPSLVIQASTSVPIRGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* ＞條件3 No.4 TCRα PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列(序列編號847) GGCTCTTTCAGGAGCAGCTAAAGTCAGGGGCCATGTCCACCATGTGATAGAAAGACAAGATG GTCCTGAAATTCTCCGTGTCCATTCTTTGGATTCAGTTGGCATGGGTGAGCACCCAGCTGCTGGAGCAGAGCCCTCAGTTTCTAAGCATCCAAGAGGGAGAAAATCTCACTGTGTACTGCAACTCCTCAAGTGTTTTTTCCAGCTTACAATGGTACAGACAGGAGCCTGGGGAAGGTCCTGTCCTCCTGGTGACAGTAGTTACGGGTGGAGAAGTGAAGAAGCTGAAGAGACTAACCTTTCAGTTTGGTGATGCAAGAAAGGACAGTTCTCTCCACATCACTGCGGCCCAGCCTGGTGATACAGGCCTCTACCTCTGTGCCTATCCGAGGAGGAGGTGCTGACGGACTCACCTTTGGCAAAGGGACTCATCTAATCATCCAGCCCTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTTA ＞條件3 No.4 TCRα PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列(序列編號848) MVLKFSVSILWIQLAWVSTQLLEQSPQFLSIQEGENLTVYCNSSSVFSSLQWYRQEPGEGPVLLVTVVTGGEVKKLKRLTFQFGDARKDSSLHITAAQPGDTGLYLCA//IRQERTVLSTSLRPSLVIQASTSVPIRGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSL ＞條件3 No.4 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列(序列編號849) GGTAAAGCCCTCATCCTGTCCTGACCCTGCCATG GGCACCAGTCTCCTATGCTGGGTGGTCCTGGGTTTCCTAGGGACAGATCACACAGGTGCTGGAGTCTCCCAGTCTCCCAGGTACAAAGTCACAAAGAGGGGACAGGATGTAGCTCTCAGGTGTGATCCAATTTCGGGTCATGTATCCCTTTATTGGTACCGACAGGCCCTGGGGCAGGGCCCAGAGTTTTTGACTTACTTCAATTATGAAGCCCAACAAGACAAATCAGGGCTGCCCAATGATCGGTTTTTTGCAGAGAGGCCTGAGGGATCCATCTCCACTCTGACGATCCAGCGCACAGAGCAGCGGGACTCGGCCATGTATCGCTGTGCCAGCAGCTCCTCTAGCGGGAGCTCCTACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG ＞條件3 No.4 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列(序列編號850) MGTSLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWYRQALGQGPEFLTYFNYEAQQDKSGLPNDRFFAERPEGSISTLTIQRTEQRDSAMYRCASSSSSGSSYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG* ＞條件3 No.4 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列(序列編號851) GGTAAAGCCCTCATCCTGTCCTGACCCTGCCATG GGCACCAGTCTCCTATGCTGGGTGGTCCTGGGTTTCCTAGGGACAGATCACACAGGTGCTGGAGTCTCCCAGTCTCCCAGGTACAAAGTCACAAAGAGGGGACAGGATGTAGCTCTCAGGTGTGATCCAATTTCGGGTCATGTATCCCTTTATTGGTACCGACAGGCCCTGGGGCAGGGCCCAGAGTTTTTGACTTACTTCAATTATGAAGCCCAACAAGACAAATCAGGGCTGCCCAATGATCGGTTTTTTGCAGAGAGGCCTGAGGGATCCATCTCCACTCTGACGATCCAGCGCACAGAGCAGCGGGACTCGGCCATGTATCGCTGTGCCAGCAGCTCCTCTAGCGGGAGCTCCTACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTTA ＞條件3 No.4 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列(序列編號852) MGTSLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWYRQALGQGPEFLTYFNYEAQQDKSGLPNDRFFAERPEGSISTLTIQRTEQRDSAMYRCASSSSSGSSYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGL [表45]
Figure 02_image096
G4-3. DNA片段之連接及向大腸桿菌之導入 對於經限制酶EcoRV消化並純化之pcDNA3.1V5His(B)載體20 ng，添加所選殖之全長蛋白編碼區域cDNA之DNA片段(條件3 No1 TCRα-有終止密碼子、TCRβ-有終止密碼子)10 ng並利用純水體積增加至4 μl。作為陰性對照，設置僅載體之TCR DNA片段未添加條件。於DNA溶液中添加NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix 4 μl並進行混合，於50℃下反應30分鐘。反應液係分取1.65 μl，將大腸桿菌DH5α株勝任細胞依據製造商之方案進行轉形。經轉形處理之大腸桿菌係添加19倍量之SOC培養基並於37℃下培養30分鐘，分取一部分並平板接種至含有安比西林之LB瓊脂培養基。於37℃下培養一晩，結果於添加有TCRα/βDNA片段之樣本中發現了更多數之菌落。 EcoRV消化載體成為平滑末端DNA片段，PCR片段亦為平滑末端，因此此次之實驗可藉由利用T4接合酶等進行連接而進行。(但是，於該情形時，需要事先將EcoRV消化pcDNA3.1V5His(B)載體進行鹼性磷酸酶消化)。 根據方法不同而產生質體構建物之序列之些許不同，所有方法均能夠構建天然型之TCR、附帶V5His標籤之TCR之表現載體。 連接之反應液組成或反應條件係依據製造商之方案。如本實施例所示，分取連接產物之一部分，將勝任細胞進行轉形，平板接種至瓊脂培養基，而獲得基因重組大腸桿菌之菌落。 G4-4.質體DNA製備 所獲得之大腸桿菌轉形體(G4-3)係對各反應群、單菌落讀取幾個，於含有安比西林之SOC培養基中進行植菌，於37℃下培養8小時，對於培養液所懸浮之樣本進行質體製備。 所獲得之質體係直接進行電泳、或為了確認插入而利用載體之選殖位點中之限制酶(EcoRI、XhoI)消化後進行電泳。將電泳圖像示於圖14。關於限制酶未消化質體，與原本之質體(區帶1)或僅利用載體組合連接所得者(區帶2、3)相比，添加有TCRα DNA片段(區帶4～7)或TCRβ DNA片段(區帶8～11)者中譜帶向上側位移，關於限制酶消化樣本，利用TCRα DNA片段或TCRβ DNA片段組合連接僅確認到1 kbp弱之插入DNA片段。使用載體引子或TCR序列中之引子，利用桑格法對該等質體進行定序，結果除1個純系(pcDNA3.1V5HisB+TCRα-菌落B)外，確認到PCR擴增DNA片段定序時之序列。源自pcDNA3.1V5HisB+TCRα-菌落B之質體係具有於蛋白ORF(Open Reading Frame，開放閱讀框架)中產生胺基酸之誤義突變(天冬胺酸置換為天冬醯胺)之1個鹼基之變異之純系。 EcoRV消化載體成為平滑末端DNA片段，PCR片段亦為平滑末端，因此此次之實驗可藉由通常之T4接合酶等進行連接。(但是，於該情形時，需要事先將EcoRV消化pcDNA3.1V5His(B)載體進行鹼性磷酸酶消化)又，向接頭序列組入限制酶位點，限制酶消化後，即便與經相同酶消化之載體連接，亦獲得表現質體。 所有方法均能夠於該等實驗系統中構建天然型之TCR、附帶V5His標籤之TCR之表現載體。連接之反應液組成或反應條件係依據製造商之方案。如本實施例所示，分取連接產物之一部，將勝任細胞轉形，平板接種至瓊脂培養基，而獲得基因重組大腸桿菌。 G4-5.質體DNA插入之序列確認 所獲得之質體分別使用TCRα用定序引子、TCRβ用定序引子、載體引子，利用一般之桑格序列解析法進行插入序列之定序。其結果為，以高效率獲得了8個純系中7個純系之無鹼基序列變異之純系。8個純系中1個純系(pcDNA3.1V5HisB+TCRα-菌落B)中確認到於蛋白質ORF中產生胺基酸之誤義突變(天冬胺酸置換為天冬醯胺)之1個鹼基之變異。繼而表示對於載體中之包含V5His標籤序列之形態之序列(下劃線部意指起始密碼子ATG或終止密碼子，*意指藉由終止密碼子終止蛋白質合成之部位)。 該pcDNA3.1V5HisTCRα、pcDNA3.1V5HisTCRβ質體純系均能夠表現利用相同之方法事先所製備之(G4-2.)將無終止密碼子之DNA片段插入至pcDNA3.1V5HisB載體中而第一個終止密碼子被置換為L(白胺酸)，於蛋白質C末端融合有V5His標籤之TCR蛋白。 該等TCRα/β成對基因之表現質體可同時藉由電穿孔法、或脂轉染法、磷酸鈣法等向細胞導入而進行成對基因表現。又，可利用載體中之T7啟動子，於活體外轉錄反應中合成TCRα/β成對基因mRNA，導入至細胞中而進行蛋白質表現，或可將TCRα/β成對基因mRNA進而於活體外轉譯系統中用於TCRα/β成對基因合成而進行蛋白質合成。 ＞pcDNA3.1V5HisB/TCRα(有終止密碼子)質體-(源自pcDNA3.1V5HisB+TCRα-菌落A、C、D之質體且序列同一)(序列編號856) AGCAGGGACCTGTGAGCATG GCATGCCCTGGCTTCCTGTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGTCTTGAATTTAGCATGGCTCAGACAGTCACTCAGTCTCAACCAGAGATGTCTGTGCAGGAGGCAGAGACCGTGACCCTGAGCTGCACATATGACACCAGTGAGAGTGATTATTATTTATTCTGGTACAAGCAGCCTCCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTTATTCGCCAAGAAGCTTATAAGCAACAGAATGCAACAGAGAATCGTTTCTCTGTGAACTTCCAGAAAGCAGCCAAATCCTTCAGTCTCAAGATCTCAGACTCACAGCTGGGGGATGCCGCGATGTATTTCTGTGCCCGGTATTCAGGAGGAGGTGCTGACGGACTCACCTTTGGCAAAGGGACTCATCTAATCATCCAGCCCTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA ATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGCGGTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGA ＞pcDNA3.1V5HisB/TCRα(有終止密碼子)質體表現蛋白序列-(源自pcDNA3.1V5HisB+TCRα--菌落A、C、D之質體且序列同一)(序列編號857) MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCARYSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*IQHSGGRSSLEGPRFEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH* ＞pcDNA3.1V5HisB/TCRβ(有終止密碼子)質體-(源自pcDNA3.1V5HisB+TCRβ-菌落A、B、C、D之質體且序列同一)(序列編號858) GGGTCCTGCCATG GTTTCCAGGCTTCTCAGTTTAGTGTCCCTTTGTCTCCTGGGAGCAAAGCACATAGAAGCTGGAGTTACTCAGTTCCCCAGCCACAGCGTAATAGAGAAGGGCCAGACTGTGACTCTGAGATGTGACCCAATTTCTGGACATGATAATCTTTATTGGTATCGACGTGTTATGGGAAAAGAAATAAAATTTCTGTTACATTTTGTGAAAGAGTCTAAACAGGATGAGTCCGGTATGCCCAACAATCGATTCTTAGCTGAAAGGACTGGAGGGACGTATTCTACTCTGAAGGTGCAGCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGGAGTTTATTTCTGTGCCAGCAGCCAAGATCGCATCGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG ATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGCGGTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGA ＞pcDNA3.1V5HisB/TCRβ(有終止密碼子)質體表現蛋白序列-(源自pcDNA3.1V5HisB+TCRβ-菌落A、B、C、D之質體且序列同一)(序列編號859) MVSRLLSLVSLCLLGAKHIEAGVTQFPSHSVIEKGQTVTLRCDPISGHDNLYWYRRVMGKEIKFLLHFVKESKQDESGMPNNRFLAERTGGTYSTLKVQPAELEDSGVYFCASSQDRIEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*IQHSGGRSSLEGPRFEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH* G5. TCR成對基因之V(D)J區片段、C區片段之cDNA選殖及全長蛋白編碼區域表現載體 G5-1 PCR反應-1 為了進行條件3之No1、3、4之TCRα、TCRβ成對基因選殖，如實施例5中所示，分別製備V(D)J區片段及C區片段，為了構建全長蛋白編碼區域表現載體，首先，以源自人類CD8陽性T細胞之cDNA為模板於表46之反應液中進行PCR反應，進行TCRαC區、TCRβC2區之cDNA選殖。使用反應液3 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認(圖15)。 [表46]
Figure 02_image098
雖此次未使用，但嘗試過將無接頭之C區片段擴增至3'UTR之相對末端區域。以公共基因組資料庫之註解資訊等作為參考，於3'UTR之相對末端區域設計反向側之引子，以源自人類CD8陽性T細胞之cDNA作為模板於表47之反應液中進行PCR反應，進行自TCR之C區至3'UTR區之cDNA選殖。使用反應液3 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認(圖16)。本DNA未附加有接頭，但可將作為TCRC區標準品之用以連接於各種載體之附帶接頭之cDNA片段等用作PCR製備時之模板等。 [表47]
Figure 02_image099
G5-2 PCR反應-2 為了進行條件3之No1、3、4之TCRα、TCRβ成對基因選殖，分別設計出可變區(V區)之起始密碼子上游、或包含起始密碼子之起始密碼子上游與ORF區域之引子(F4-1)。 將半巢式PCR反應液純化DNA溶液(G3-2中製備且G3-3中為了用於定序所純化之DNA樣本)分取2.0 μl，於表48之反應液中進行PCR反應，進行TCR V(D)J蛋白編碼區域cDNA選殖。V區F引子需要對每個純系逐一變更，如表49之清單所示般使用。分取反應液3 μl，利用瓊脂糖凝膠電泳進行譜帶之確認(圖17)。 [表48]
Figure 02_image100
[表49]
Figure 02_image101
G5-3.DNA片段之連接及向大腸桿菌之導入 向經限制酶EcoRV消化且經純化之pcDNA3.1V5His(B)載體，將G5-1中所選殖之附帶3'接頭之TCR C區DNA片段(有終止密碼子、或無終止密碼子均可)及F5-2中所選殖之附帶5'接頭之TCR V(D)J蛋白編碼區域cDNA使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix等進行組合連接。 藉由此次之一連串實驗系統，能夠構建天然型之附帶TCR、V5His標籤之TCR之表現載體。 連接之反應液組成或反應條件係依據製造商之方案。分取連接產物之一部分，將勝任細胞轉形，平板接種至瓊脂培養基，而獲得基因重組大腸桿菌。 G5-4.質體DNA製備 質體基因重組體單菌落係於液體培養基中進行培養、集菌，利用一般之鹼提取法或NucleoSpin Plasmid等市售之套組製備質體DNA。 G5-5.質體DNA插入之序列確認 所獲得之質體分別使用TCRα用定序引子、TCRβ用定序引子、載體引子，利用一般之桑格序列解析法進行插入序列之定序。與PCR擴增片段之定序資料相比，將無鹼基序列之置換(至少無誤義突變或無意義突變)、插入、缺失之純系用作TCR表現構建物。 (附註)
強調較佳之實施形態對本發明進行了說明，但對業者來說，當然可變更較佳之實施形態。本發明意欲藉由本說明書中所詳細記載以外之方法來實施。因此，本發明包含隨附之「申請專利範圍」之精神及範圍內所包含之所有變更。
包含此處所述之專利及專利申請說明書之所有刊行物所記載之內容係藉由引用至此處，而以與明示出其全部相同之程度併入至本說明書。本申請案係請求2018年8月24日提出申請之日本專利申請第2018-157760號之優先權之利益，其內容係藉由參照併入至本說明書中。 [產業上之可利用性]
根據本發明，提供一種對TCR或BCR之功能性成對基因進行解析之非常簡單且精度較高之方法，於需要疾病特異性且功能性之TCR或BCR之製造、或大規模之定量分析之臨床應用場景中特別有用。 [序列表非關鍵文字]
序列編號1：hTCRα阻斷引子(CA2; 23個鹼基) 序列編號2：hTCRαRT引子(CA1; 23個鹼基) 序列編號3：hTCRβ阻斷引子(CB2; 23個鹼基) 序列編號4：hTCRβRT引子(CB1(3); 23個鹼基) 序列編號5：TS-Oligo(30個鹼基) 序列編號6：TS引子(30個鹼基) 序列編號7：正向TS-Tag引子 v1(64個鹼基) 序列編號8：hTCRα反向Tag引子(51個鹼基) 序列編號9：hTCRα反向Tag引子/hTCA-R-TP5-1(53個鹼基) 序列編號10：hTCRβ反向Tag引子(52個鹼基) 序列編號11：P5-seq(21個鹼基) 序列編號12：CA3(23個鹼基) 序列編號13：CB3(23個鹼基) 序列編號14：實驗A中之孔No.13 TCRα鹼基序列 序列編號15：實驗A中之孔No.13 TCRα胺基酸轉譯序列 序列編號16：實驗A中之孔No.13 TCRβ鹼基序列 序列編號17：實驗A中之孔No.13 TCRβ胺基酸轉譯序列 序列編號18～416：表6～13中之CDR3序列 序列編號417～485：表17～18中之CDR3序列 序列編號486～579：表21～22中之CDR3序列 序列編號580～603：表24中之CDR3序列 序列編號604：hBCRμ阻斷引子(CM2(2); 19個鹼基) 序列編號605：hBCRμRT引子(CM1(2); 23個鹼基) 序列編號606：hBCR κ阻斷引子(CK2; 18個鹼基) 序列編號607：hBCR κRT引子(CK1; 19個鹼基) 序列編號608：hBCR λ-阻斷引子(CL2; 16個鹼基) 序列編號609：hBCR λ-RT引子(CL1; 19個鹼基) 序列編號610：hBCRμ反向Tag引子(CM-ST1-R-(3)、53個鹼基) 序列編號611：hBCR κ反向Tag引子(CK-ST1-R、51個鹼基) 序列編號612：hBCR λ-反向Tag引子(CL-ST1-R、51個鹼基) 序列編號613～744：表28～29中之CDR3序列 序列編號745：TS-AdpD3EV 序列編號746：hTCRα-VX-F-AdpD3EV 序列編號747：hTCRα-V24-F-AdpD3EV 序列編號748：hTCRb-VX-F-AdpD3EV 序列編號749：hTCRb-V6.5-F-AdpD3EV 序列編號750：TS-AdpMXEI 序列編號751：hTCRα-VX-F-AdpMXEI 序列編號752：hTCRb-VX-F-AdpMXEI 序列編號753：hTCRα-V24-F-AdpMXEI 序列編號754：hTCRb-V6.5-F-AdpMXEI 序列編號755：hTCRα-C-R 序列編號756：hTCRb-C1-R 序列編號757：hTCRb-C2-R 序列編號758：hTCRaC-F0 序列編號759：hTCRaC-F1 序列編號760：hTCRaC-F2 序列編號761：hTCRaC-F3 序列編號762：hTCRaC-R1v1 序列編號763：hTCRaC-R2 序列編號764：hTCRaC-R4 序列編號765：hTCRaC-R5 序列編號766：hTCR-CB-F2 序列編號767：hTCRbC-F5 序列編號768：hTCR-CB-R2 序列編號769：hTCR-CB2 序列編號770：hTCR-CB3 序列編號771：hTCRbC2-CloR1 序列編號772：hTCRbC1-R1 序列編號773：hTCRaCFull-AdpD3EV 序列編號774：hTCRaCFull_noSTOP-AdpD3EV 序列編號775：hTCRbC1Full-AdpD3EV 序列編號776：hTCRbC1Full_noSTOP-AdpD3EV 序列編號777：hTCRbC2Full-AdpD3EV 序列編號778：hTCRbC2Full_noSTOP-AdpD3EV 序列編號779：hTCRaCFull-AdpMXEI 序列編號780：hTCRbC1Full-AdpMXEI 序列編號781：hTCRbC2Full-AdpMXEI 序列編號782：TS-AdpD3EV 序列編號783：hBCRH-VX-F-AdpD3EV 序列編號784：hBCRH-V3.30-F-AdpD3EV 序列編號785：hBCRH-V2.70-F-AdpD3EV 序列編號786：hBCRLam-VX-F-AdpD3EV 序列編號787：hBCRLam-V2.14-F-AdpD3EV 序列編號788：hBCRKap-VX-F-AdpD3EV 序列編號789：hBCRK-V3.15-F-AdpD3EV 序列編號790：hBCRM-C-R 序列編號791：hBCRLam-C2-R 序列編號792：hBCRKap-C1-R 序列編號793：hBCRKapCFull-AdpD3EV 序列編號794：hBCRLamC2Full-AdpD3EV 序列編號795：hBCRμCFull-AdpD3EV 序列編號796：實驗D中之孔No.18 BCRμ鹼基序列 序列編號797：實驗D中之孔No.18 BCRμ胺基酸轉譯序列 序列編號798：實驗D中之孔No.18 BCRλ-鹼基序列 序列編號799：實驗D中之孔No.18 BCRλ-胺基酸轉譯序列 序列編號800：實驗D中之孔No.55 BCRμ鹼基序列 序列編號801：實驗D中之孔No.55 BCRμ胺基酸轉譯序列 序列編號802：實驗D中之孔No.55 BCRκ鹼基序列 序列編號803：實驗D中之孔No.55 BCRκ胺基酸轉譯序列 序列編號804：CMV(人類β疱疹病毒5)之pp65(AKI22842.1)之胺基酸序列 序列編號805：Infuluenza M1蛋白(P03485)之胺基酸序列 序列編號806：hTCRαRT引子(hTCRaC-CloR1; 21個鹼基) 序列編號807：hTCRαRT引子(hTCRaC-CloR2; 22個鹼基) 序列編號808：hTCRαPCR引子(hTCRaC-R2v0; 21個鹼基) 序列編號809：hTCRβRT引子(hTCRbC1-R3; 21個鹼基) 序列編號810：hTCRβRT引子(hTCRbC2-CloR2; 21個鹼基) 序列編號811：hTCRβPCR引子(hTCRbC1-R2v2; 20個鹼基) 序列編號812：hTCRβPCR引子(hTCRbC2-CloR3; 21個鹼基) 序列編號813：hTCRaV38.2-F1-AdpD3EV 序列編號814：hTCRbV14-F1-AdpD3EV 序列編號815：hTCRaV13.2-F2-AdpD3EV 序列編號816：hTCRbV4.1-F1-AdpD3EV 序列編號817：hTCRaV27-F3-AdpD3EV 序列編號818：hTCRbV7.6-F1-AdpD3EV 序列編號819：hTCRaC-AdpD3EV 序列編號820：hTCRaC-NT-AdpD3EV 序列編號821：hTCRbC1-AdpD3EV 序列編號822：hTCRbC1-NT-AdpD3EV 序列編號823：hTCRbC2-AdpD3EV 序列編號824：hTCRbC2-NT-AdpD3EV 序列編號825：hTCRα-C-F 序列編號826：hTCRb-C1-F 序列編號827：hTCRb-C2-F 序列編號828：hTCR-CB2-R2 序列編號829：No.1 TCRα PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列 序列編號830：No.1 TCRα PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列 序列編號831：No.1 TCRα PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列 序列編號832：No.1 TCRα PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列 序列編號833：No.1 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列 序列編號834：No.1 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列 序列編號835：No.1 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列 序列編號836：No.1 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列 序列編號837：No.3 TCRα PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列 序列編號838：No.3 TCRα PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列 序列編號839：No.3 TCRα PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列 序列編號840：No.3 TCRα PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列 序列編號841：No.3 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列 序列編號842：No.3 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列 序列編號843：No.3 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列 序列編號844：No.3 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列 序列編號845：No.4 TCRα PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列 序列編號846：No.4 TCRα PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列 序列編號847：No.4 TCRα PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列 序列編號848：No.4 TCRα PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列 序列編號849：No.4 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)鹼基序列 序列編號850：No.4 TCRβ PCR產物(有終止密碼子)胺基酸序列 序列編號851：No.4 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)鹼基序列 序列編號852：No.4 TCRβ PCR產物(無終止密碼子)胺基酸序列 序列編號853：T7 序列編號854：CMV-Fwd2 序列編號855：BGH-Reverse 序列編號856：pcDNA3.1V5HisB/TCRα(有終止密碼子)質體 序列編號857：pcDNA3.1V5HisB/TCRα(有終止密碼子)質體表現胺基酸序列 序列編號858：pcDNA3.1V5HisB/TCRβ(有終止密碼子)質體 序列編號859：pcDNA3.1V5HisB/TCRβ(有終止密碼子)質體表現胺基酸序列
1401:CPU 1403:RAM 1405:外部記憶裝置 1407:輸出裝置 1409:輸入裝置 1411:通信器件 1420:系統匯流排 1425:輸入輸出介面(I/F) 1430:資訊資料庫儲存部 1440:程式儲存部
圖1係表示利用細胞分選儀之PBMC之分離之結果。P1表示淋巴細胞門，P2表示CMVpp65肽MHC複合體四聚物陽性之CD8陽性T細胞(細胞損傷性T細胞)門、P3表示CMVpp65肽MHC複合體四聚物陰性之CD8陽性T細胞(細胞損傷性T細胞)門。 圖2係表示實施例1中之一步法RT-TS-PCR反應產物之電泳圖像。孔16、32、48、64、及90係表示未投入細胞之陰性對照孔。 圖3係表示實施例1中之半巢式PCR反應產物之電泳圖像。孔16、32、48、64、及90係表示未投入細胞之陰性對照孔。 圖4係表示實施例1中之半巢式PCR反應產物之電泳圖像及利用定序之V區之確定結果。孔16、32、48、64、及90係表示未投入細胞之陰性對照孔。 圖5係表示於實施例2中將TCRα及TCRβ於不同之反應系中擴增之半巢式PCR反應產物的電泳圖像。孔10、12、15、25～28、36、50、53、54、59、61、65、67、70、72、75、77及81表示TCRα/β兩者均確認到譜帶之孔，TCRα之孔4、34、51、52、68及85、與TCRβ之孔1、5～9、11、13、19、20、29、32、33、40、55、56、58、62、63、66、73、74、78、83及86表示僅一者確認到譜帶之孔。 圖6係表示於實施例2中將TCRα及TCRβ於同一反應系中擴增之半巢式PCR反應產物之電泳圖像。孔1、5～13、15、19、20、25～29、32～34、36、40、50～56、58、59、61～63、65～68、70、72～75、77、78、81、83、85及86係表示確認到譜帶之孔。 圖7係表示於實施例3中經CMVpp65肽刺激並分選之細胞中之半巢式PCR反應產物之電泳圖像。孔6、7、12、13、15、18、20、29、31、32、33、37、38、44、52、60、77、86及87表示TCRα/β兩者均確認到譜帶之孔，TCRα之孔1、11、26、49、50及74、與TCRβ之孔1、3、5、8、10、14、17、25、27、30、40、51、54～58、61、63、67、76及78表示僅一者確認到譜帶之孔。 圖8係表示於實施例3中經M1肽刺激並分選之細胞中之半巢式PCR反應產物的電泳圖像。孔13、36、39、42、54、57、67、82及90表示TCRα/β兩者均確認到譜帶之孔，TCRα之孔2、3、26～28、31、32、34、35、40、41、75、77、85及89與TCRβ之孔8、11、25、33、37、38、61、74、76、78、79、83及87表示僅一者確認到譜帶之孔。 圖9係表示於實施例4中將BCRμ、BCRκ及BCRλ於同一反應系中擴增之半巢式PCR產物之電泳圖像。 圖10係表示於實施例4中將BCRμ、BCRκ及BCRλ於不同反應系中擴增之半巢式PCR產物之電泳圖像。 圖11係表示本發明之庫解析系統之方塊圖。 圖12係表示於實施例7中將TCRα及TCRβ於不同反應系中擴增之半巢式PCR產物之電泳圖像。於條件1下，孔1～5及7～15表示TCRα/β兩者均確認到譜帶之孔，TCRα之孔6表示僅一者確認到譜帶之孔。於條件2下，孔3～5、7、8、11、12及15～19表示TCRα/β兩者均確認到譜帶之孔，TCRα之孔1及2與TCRβ之孔6、10及13表示僅一者確認到譜帶之孔。於條件3下，孔1、5、8、12～17及19表示TCRα/β兩者均確認到譜帶之孔，TCRα之孔11與TCRβ之孔2、7、9、10及18表示僅一者確認到譜帶之孔。 圖13係表示TCR成對基因全長蛋白編碼區域cDNA之PCR選殖結果。 圖14係表示所構建之pcDNA3.1V5HisB/TCRα、pcDNA3.1V5HisB/TCRβ表現質體之電泳圖像。 圖15係表示TCRC區cDNA之PCR選殖結果。 圖16係表示自TCRC區至3'UTR區之cDNA之PCR選殖結果。 圖17係表示TCR成對基因V(D)J蛋白編碼區域cDNA之PCR選殖結果。
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Claims (28)

  1. 一種進行T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之功能性次單元成對基因之序列解析之方法，其包括： (1)自活化之表現TCR或BCR之細胞提供包含TCR或BCR之核酸之核酸樣本之工序； (2)確定該TCR或該BCR之核酸序列之工序；及 (3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而鑑定TCR或BCR功能性次單元成對基因之工序。
  2. 如請求項1之方法，其中於上述工序(1)之前進而包括如下工序：使上述表現TCR或BCR之細胞之至少一部分活化。
  3. 如請求項1或2之方法，其中上述活化包括：利用任意之抗原或其抗原MHC複合體、或者具有與任意之抗原結合之MHC之抗原呈現細胞對上述細胞進行刺激。
  4. 如請求項3之方法，其中上述抗原選自由病毒構成物質、細菌構成物質、非自身細胞構成物質、及癌細胞特異性構成物質所組成之群。
  5. 如請求項3之方法，其中上述抗原選自由病毒肽、病毒肽糖脂質複合體、細菌肽、細菌肽糖脂質複合體、非自身細胞肽、非自身細胞肽糖脂質複合體、癌細胞特異性肽、及癌細胞特異性肽糖脂質複合體所組成之群。
  6. 如請求項1或2之方法，其中上述活化包括：利用選自由抗CD3及/或抗CD28抗體、磷脂酶C(PLC)活化劑、鈣離子載體、蛋白激酶C(PKC)活化劑、植物血凝素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)、及類鐸受體之活化劑所組成之群中之因子對上述細胞進行刺激。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中上述細胞為末梢血液單核細胞。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中上述工序(1)包括將上述活化之細胞自未活化之細胞進行分離。
  9. 如請求項8之方法，其中上述活化之細胞之分離係藉由抗原-MHC分子複合體或2個～10,000個抗原-MHC分子複合體之聚合物進行。
  10. 如請求項9之方法，其中上述抗原-MHC分子複合體之聚合物選自由表位二聚物、表位三聚物、表位四聚物、及表位五聚物所組成之群。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中上述核酸樣本係自單個之活化細胞所獲得。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中上述工序(1)包括： a)將上述細胞之RNA、反轉錄所需之試劑、模板轉換所需之試劑、及聚合酶連鎖反應所需之試劑進行混合，將混合物供於產生反轉錄之條件下，而提供包含複數種之TCR或BCR之核酸序列之cDNA之工序；及 b)將自該工序a)獲得之cDNA供於產生聚合酶連鎖反應之條件下，而提供包含該複數種之TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本之工序；且 該模板轉換所需之試劑包含模板轉換寡核苷酸， 該聚合酶連鎖反應所需之試劑包含該TCR或該BCR之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子，該C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子係以於該工序a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙，於該工序b)中引子功能之抑制得到解除之方式所設計出之修飾寡核苷酸引子。
  13. 如請求項12之方法，其中上述聚合酶連鎖反應所需之試劑視需要進而包含含有上述模板轉換寡核苷酸所包含之錨定序列之至少一部分之5'錨定寡核苷酸引子。
  14. 如請求項13之方法，其中上述聚合酶連鎖反應所需之試劑不包含上述5'錨定寡核苷酸引子，上述模板轉換寡核苷酸作為5'錨定寡核苷酸引子發揮功能。
  15. 如請求項12至14中任一項之方法，其中上述反轉錄所需之試劑包含： (i)與TCRα之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子及與TCRβ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子； (ii)與TCRδ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子及與TCRγ之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子；或者 (iii)與BCR重鏈之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子及與BCR輕鏈之C區、3'非轉譯區或跨及C區及3'非轉譯區之區域互補之開始反轉錄的寡核苷酸引子。
  16. 如請求項12至15中任一項之方法，其中上述聚合酶連鎖反應所需之試劑包含： (i)TCRα之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、以及TCRβ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子； (ii)TCRδ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、以及TCRγ之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子；或者 (iii)BCR重鏈之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子、以及BCR輕鏈之C區特異性引子、3'非轉譯區特異性引子、或跨及C區及3'非轉譯區之引子。
  17. 如請求項12至16中任一項之方法，其將TCRα及TCRβ兩者、TCRδ及TCRγ兩者、或BCR重鏈及BCR輕鏈兩者共擴增。
  18. 如請求項12至17中任一項之方法，其中上述修飾寡核苷酸引子於同一之修飾寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，且在PCR之初期熱改性處理前因該互補區而形成摺疊結構、或者包含熱不穩定性修飾基。
  19. 如請求項12至18中任一項之方法，其中引子功能未受到阻礙之一部分修飾寡核苷酸引子藉由與模板RNA雜交而作為開始反轉錄之寡核苷酸引子發揮功能。
  20. 如請求項12至19中任一項之方法，其中上述工序(3)包括以下： (3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少一個之基因區域每個區域之參照資料庫之工序； (3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者所得之輸入序列集之工序； (3-3)對於該輸入序列集，對該基因區域逐一進行與該參照資料庫之同源性檢索，記錄與近似之參照對偶基因及/或該參照對偶基因之序列之匹配之工序； (3-4)對於該輸入序列集，指定V區及J區，基於指定結果而提取D區之核酸序列之工序； (3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，利用該胺基酸序列對D區進行分類之工序；及 (3-6)基於該工序(3-5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區各自之出現頻度、或者其組合，藉此鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之工序。
  21. 一種用以進行表現TCR或BCR之細胞中之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之功能性次單元成對基因之序列解析的系統，其包含： (A)用以使該細胞之至少一部分活化之活性劑； (B)用以提供自活化之該細胞獲得之包含TCR或BCR之核酸序列之核酸樣本的核酸處理用套組； (C)確定活化之該細胞中所包含之核酸序列之定序儀；及 (D)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而鑑定TCR或BCR之功能性次單元成對基因之分析機。
  22. 一種表現具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之細胞之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如請求項1至20中任一項之方法所解析，該製造方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之表現構建物之工序；及 (5)將該表現構建物導入至細胞之工序。
  23. 一種產生包含具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)核酸之病毒或噬菌體之細胞之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如請求項1至20中任一項之方法所解析，該製造方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之病毒產生載體或噬菌體產生載體之工序；及 (5)將該載體導入至細胞之工序。
  24. 一種包含具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)核酸之病毒或噬菌體之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如請求項1至20中任一項之方法所解析，該製造方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之病毒產生載體或噬菌體產生載體之工序； (5)將該載體導入至細胞之工序；及 (6)對該細胞進行培養，自培養上清液獲得包含TCR或BCR核酸之病毒或噬菌體之工序。
  25. 一種具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之RNA之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如請求項1至20中任一項之方法所解析，該製造方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之活體外轉錄RNA合成用之載體、或者使該TCR或BCR之核酸序列與活體外轉錄用啟動子序列結合而成之DNA片段之工序；及 (5)將該載體或DNA片段供於在活體外開始RNA聚合酶反應之條件下之工序。
  26. 一種具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如請求項1至20中任一項之方法所解析，該製造方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之表現構建物之工序； (5)將該表現構建物導入至細胞之工序；及 (6)將該細胞供於表現該TCR或BCR之條件下之工序。
  27. 一種具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如請求項1至20中任一項之方法所解析，該製造方法包括： (4)使細胞感染藉由如請求項24之方法所製造之病毒或噬菌體之工序；及 (5)將該細胞供於表現該TCR或BCR之條件下之工序。
  28. 一種具有功能性次單元成對基因之序列之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)蛋白之製造方法，該功能性次單元成對基因之序列係依據如請求項1至20中任一項之方法所解析，該製造方法包括： (4)提供包含該TCR或BCR之核酸序列之活體外轉錄RNA合成用之載體、或者使該TCR或BCR之核酸序列與活體外轉錄用啟動子序列結合而成之DNA片段之工序； (5)將該載體或DNA片段供於在活體外開始RNA聚合酶反應之條件下，而提供mRNA之工序；及 (6)將該mRNA供於在活體外自該mRNA生成蛋白質之條件下，而提供該蛋白質之工序。
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