PT726324E

PT726324E - Utilizacao de exonuclease e/ou glicosilase como suplementos para anticorpo anti-polimerase para aumentar a especificidadena reaccao em cadeia da polimerase

Info

Publication number: PT726324E
Application number: PT96300791T
Authority: PT
Inventors: John W H Sutherland; David R Patterson
Original assignee: Johnson & Johnson Clin Diag
Priority date: 1995-02-07
Filing date: 1996-02-06
Publication date: 2001-08-30
Also published as: EP0726324B1; DE69612885T2; US5985619A; KR960031627A; ATE201452T1; FI960540A0; DE69612885D1; AU4339196A; NO960484D0; EP0726324A2; DK0726324T3; FI960540A; AU709788B2; NO960484L; JPH08266298A; SI0726324T1; ES2156978T3; CA2168712A1; EP0726324A3; GR3036391T3

Description

r

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE EXONUCLEASE E/OU GLICOSILASE COMO SUPLEMENTOS PARA ANTICORPO ANTI-POLIMERASE PARA AUMENTAR A ESPECIFICIDADE NA REACÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE"

CAMPO DA INVENÇÃO A reacção em cadeia da polimerase (PCR) permite a amplificação e detecção de pequenas quantidades de um ácido nucleico alvo. As limitações práticas da PCR incluem a produção e amplificação de produtos colaterais não específicos, em particular dímeros de iniciadores e oligómeros de ordem superior, como por exemplo tetrâmeros de iniciador. A presente invenção proporciona composições e métodos para superar tais limitações e assim aumentar a precisão e a sensibilidade da PCR.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A tecnologia da PCR permite a amplificação e subsequente detecção de quantidades diminutas de um ácido nucleico alvo. Os detalhes da PCR estão bem descritos na técnica, incluindo, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4 683 195 de Mullis et al., 4 683 202 de Mullis e 4 965 188 de Mullis et al. De um modo geral, os oligonucleótidos iniciadores são emparelhados com as cadeias desnaturadas de um ácido nucleico alvo e os produtos de extensão dos iniciadores são formados através da polimerização de trifosfatos de desoxinucleósidos por uma polimerase. Um método típico de PCR envolve ciclos repetitivos de desnaturação de ácido nucleico molde, emparelhamento de iniciador e extensão dos iniciadores emparelhados, através da acção de uma polimerase termoestável. O processo resulta numa amplificação exponencial do ácido nucleico alvo, e permite assim a detecção de alvos existentes em concentrações muito baixas numa amostra. 1 Γ A PCR é utilizada numa larga variedade de aplicações, incluindo pesquisa biotecnológica, diagnóstico clinico e ciências forenses. Contudo, a metodologia está sujeita a limitações práticas que resultam em eficiência e especificidade abaixo do óptimo. Em particular, antes do primeiro ciclo de uma experiência de PCR (i.e. no "ciclo zero"), os reagentes para amplificação são tipicamente misturados e armazenados à temperatura ambiente ou abaixo. Devido ao facto de as polimerases termoestáveis, por exemplo a polimerase de Thermus aquaticus (Taq), possuírem actividade residual, mesmo a 0°C, podem ser formadas quantidades relativamente grandes de produtos não específicos, através de iniciação e replicação a severidade baixa. Os produtos não específicos, conhecidos como artefactos de ciclo zero, incluem dímeros de iniciadores, formados pela ligação de iniciadores possuindo homologia nas suas extremidades 3' . Devido às concentrações micromolares dos iniciadores utilizados na PCR, em relação às quantidades frequentemente diminutas de alvo, a formação de dímeros de iniciador é predominante. Os dímeros de iniciadores são por isso artefactos de ciclo zero particularmente frequentes. Outros sistemas de amplificação, tais como amplificação de fase sólida, sofrem de igual modo destes artefactos de dímeros de iniciador. A formação de artefactos de ciclo zero durante a amplificação tem consequências práticas. Os reagentes, incluindo iniciadores e desoxirribonucleósidos, podem ser empobrecidos e os produtos colaterais não específicos actuam como inibidores competitivos em relação ao alvo para a polimerase e outros componentes limitantes da reacção. Consequentemente, a eficiência da amplificação pode ser diminuída e a precisão do ensaio ser degradada. Qualquer diminuição 11a eficiência da amplificação pode afectar adversamente o limite de detecção do ensaio e assim provocar potencialmente resultados falsos negativos. Como demonstrado de acordo com a presente invenção, a formação de dímeros de iniciadores pode reduzir a eficiência da 2

U

V Γ amplificação alvo, num tal grau que o produto amplificado não seja detectável num gel corado. Um tal resultado seria claramente indesejável em testes para organismos patogénicos, tais como HIV. A especificidade é particularmente importante em reacções de PCR homogéneas. Ver, p. ex., EPA 487218 de Mitoma; EPA 512334 de Higuchi. Nos ensaios homogéneos, a amplificação e detecção da PCR estão ligadas colocando em contacto a mistura de reacção, durante ou após amplificação, com um pigmento fluorescente que sofre uma alteração detectável na fluorescência durante a reacção com um ácido nucleico de cadeia dupla. Por exemplo, quando a PCR é realizada na presença de brometo de etídio, a produção de ADN de cadeia dupla está correlacionada com um aumento da fluorescência na medida em que o brometo de etídio livre fica intercalado no ADN de cadeia dupla. De um modo geral, a amplificação e a detecção são realizadas no mesmo recipiente. As alterações de fluorescência são detectadas espectrofotometricamente, e assim a detecção não requer nem a separação dos produtos da PCR nem hibridação. Dado que a detecção se baseia geralmente na formação de ADN de cadeia dupla e não consegue discriminar entre ADN alvo e produtos não específicos, a formação de artefactos de cadeia dupla tais como dímeros de iniciadores é fatal para a especificidade do ensaio homogéneo.

Foram desenvolvidas várias estratégias para aumentar a especificidade da PCR. Teoricamente, os artefactos de dímeros de iniciadores podem ser evitados seleccionando iniciadores que não possuam homologia em 3' . Contudo, na prática, pode ser inevitável alguma homologia em 3', particularmente em aplicações que requeiram misturas de iniciadores. A co-amplificação de numerosas estirpes ou alelos de um alvo são aplicações típicas que requerem um grande número de iniciadores. A especificidade também pode ser melhorada aumentando a severidade, por exemplo, aumentando a temperatura de 3

V r emparelhamento ou incorporando solventes de desnaturação. Contudo, o aumento da severidade pode levar a resultados falsos negativos, porque a capacidade do ensaio para detectar formas mutadas do alvo, que podem ter sido amplificadas a severidade mais baixa, é reduzida.

Noutro método de redução de artefactos de ciclo zero, o denominado método de PCR de "inicio quente", a reacção é iniciada através da adição da polimerase a misturas de reagentes quentes. (Ver, p. ex., Erlich et al. (1991) Science 252:1643). Os dímeros de iniciadores são reduzidos uma vez que os intermediários reactivos formados por reacção cruzada dos iniciadores são termicamente instáveis. Contudo, este método não proporciona a conveniência da preparação à temperatura ambiente e está sujeito a complicações provocadas por erros de cronometragem, resultantes da adição manual da polimerase a múltiplos tubos de PCR (normalmente 96).

Barreiras físicas termolábeis, tais como contas de parafina ou camadas de sobreposição, têm sido utilizadas para separar fisicamente um ou mais componentes de PCR uns dos outros, até serem alcançadas temperaturas adequadas para iniciação a elevada severidade (Ver, p. ex., Hébert et al. (1993) Molecular and Celular Probes 7: 249). Contudo, estes métodos são geralmente inconvenientes e requerem considerável destreza manual. Têm sido utilizados anticorpos termicamente lábeis contra a polimerase Taq, para inibir a polimerase Taq a baixas temperaturas, numa tentativa de limitar artefactos de ciclo zero. (Ver, p. ex., Sharkey et al. (1994) Bio/Technology 12:506; Patente U.S. No. 5 338 671 de Scalice et al.) . Quando a temperatura é aumentada nos ciclos térmicos da PCR, os anticorpos são desnaturados termicamente e a polimerase activa é libertada. Contudo, mesmo anticorpos ávidos não inibem completamente a actividade da polimerase. Por exemplo, um anticorpo micromolar possuindo afinidade de IO10 M_1 actuando sobre a polimerase a uma concentração de 10 nanomolar num volume 4 U, í de 100 microlitros deixaria 60 milhões de moléculas de polimerase activa livre em equilíbrio. Uma vez que os níveis de iniciadores utilizados são elevados, podem ser formados e amplificados, apesar de tudo, números bastante grandes de dímeros de iniciadores intermediários. Como resultado, e como demonstrado de acordo com a presente invenção, o anticorpo anti-Tag isolado pode ser insuficiente para suprimir a formação de dímeros de iniciadores, especialmente em casos em que os iniciadores possuem homologia 3' substancial ou em que a homologia consiste em ligações G-C fortes.

Também têm sido reveladas enzimas capazes de digerir dímeros de iniciadores intermediários, para utilização na supressão de produtos colaterais. Zhu et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 2511) relataram a utilização de exonuclease III (Exo III) para "esterilização pré-PCR" para reduzir o transporte de amplicões e de dímeros de iniciadores. Contudo, dado que Exo III catalisa a clivagem sequencial de mononucleótidos 5' a partir da extremidade hidroxilo 3' do ADN de cadeia dupla, pode também atacar o ADN alvo. Além disso, Zhu et al. relataram que a Exo III não degrada ADN de cadeia simples, e assim é de esperar que os dímeros de iniciadores de cadeia simples escapem ao tratamento com Exo III e assim sejam susceptíveis de ser amplificados. Muralidhar et al. (1992) Gene 117:107 relataram a utilização de exonuclease de T7, para reduzir a amplificação de moléculas de produtos de PCR transportadas. As moléculas de PCR contaminantes são preferencialmente inactivadas devido à sua geometria simétrica relativa a moléculas alvo genómicas. Muralidhar et al. não conseguiram reduzir produtos de dímeros de iniciadores e notaram que a geometria de dímeros de iniciadores não foi estabelecida. A enzima uracil-N-glicosilase (UNG) também foi utilizada num passo de pré-amplificação, para clivar produtos produzidos durante o ciclo zero em resíduos de uracilo incorporados. (Ver, p. ex., Longo et al. (1990) Gene 93:125; Espy et al. (1993) J. 5 p Lc, ^—ç-

Clin. Microbiol. 31:2361). Trifosfato de desoxiuridina (dUTP) é substituído por trifosfato de desoxitimidina (dTTP) na PCR e assim, os produtos da PCR podem ser diferenciados do ADN molde. A enzima UNG é incluída na pré-mistura e catalisa a excisão de uracilo a partir de ADN de cadeia simples ou dupla presentes na reacção antes do primeiro ciclo de PCR. Os polinucleótidos não básicos resultantes são susceptíveis de hidrolisar e não podem funcionar como moldes durante a PCR. Embora a UNG seja referida como inactivada por desnaturação térmica, a actividade residual pode degradar produtos de amplificação sintetizados durante a PCR. Além disso, Longo et al. compararam a quantidade relativa de produto de amplificação na presença e ausência de tratamento com UNG e relataram uma redução na intensidade do alvo amplificado, em reacções com tratamento com UNG. Assim, não se espera que o tratamento com UNG resolva o problema da ineficiência de amplificação do produto.

Epsy et al. relataram que a eficiência de UNG na inactivação de ADN amplificado está dependente do comprimento do ADN. Em particular, a UNG foi ineficaz na inactivação de amplicões de menos do que 100 pares de bases. De acordo com isto, a UNG não inactiva dimeros de iniciadores.

Como demonstrado de acordo com a presente invenção, nem Exo III nem UNG é particularmente eficaz na supressão de dimeros de iniciadores e no melhoramento da eficiência de amplificação. Além disso, como aqui acima discutido, os métodos da técnica anterior de supressão de artefactos de ciclo zero sofrem de deficiências práticas. De acordo com isto, há a necessidade na técnica de métodos práticos e eficazes de supressão de artefactos de ciclo zero aumentando assim a eficiência e especificidade da PCR.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 6 f u —ΐ A presente invenção é dirigida a um método para a ampliticação de um ácido nucleico alvo compreendendo colocar em contacto uma amostra suspeita de conter um ácido nucleico alvo com pelo menos dois oligonucleótidos iniciadores, que são suficientemente complementares em regiões conservadas do ácido nucleico alvo para hibridar entre eles, em pelo menos quatro trifosfatos de nucleósido diferentes, uma polimerase de ADN termoestável, pelo menos um anticorpo especifico contra a polimerase de ADN, e pelo menos uma de entre exonuclease e glicosilase, para formar uma mistura de reacção; aquecer a referida mistura de reacção para desnaturar o anticorpo, a exonuclease e/ou a glicosilase, e separar as cadeias do ácido nucleico alvo, e formar os produtos de extensão do iniciador. Nestas realizações utilizando uma glicosilase, um dos trifosfatos de nucleósido é um que, quando incorporado no ADN, é clivado especificamente por uma glicosilase.

Noutra realização, a presente invenção proporciona um método para reduzir a formação de ácidos nucleicos não específicos e aumentar a eficiência da amplificação de um alvo desejado, num método de amplificação por PCR que compreende: colocar em contacto a amostra a ser testada com reagentes para amplificação incluindo uma polimerase de ADN, pelo menos um anticorpo específico contra a polimerase de ADN, e pelo menos uma de entre exonuclease e glicosilase; aquecer a referida amostra para desnaturar o anticorpo, a exonuclease e/ou a glicosilase, e separar as cadeias do ácido nucleico alvo, e amplificar o referido ácido nucleico alvo. A presente invenção proporciona um "kit" para amplificação de um ácido nucleico compreendendo um primeiro recipiente adaptado para conter uma polimerase de ADN LeriuoesLável, um segundo recipiente adaptado para conter um anticorpo específico contra a polimerase de ADN, e um terceiro recipiente adaptado para conter uma exonuclease. Noutra realização, o "kit" compreende ainda um quarto recipiente adaptado para conter uma 7 Γ u glicosilase. Podem ser fornecidos recipientes adicionais ao "kit" para incorporar anticorpos e/ou outros reagentes de PCR adicionais, como desejado. A presente invenção compreende ainda um "kit" para amplificação de um ácido nucleico compreendendo um primeiro recipiente adaptada para conter uma polimerase de ADN termoestável, um segundo recipiente adaptado para conter um anticorpo especifico contra a polimerase de ADN, e um terceiro recipiente adaptado para conter uma glicosilase. Noutra realização, os "kits" da presente invenção contêm ainda reagentes para PCR incluindo trifosfatos de nucleósido, iniciadores, tampões e anticorpos adicionais.

Outro aspecto da presente invenção proporciona uma composição de mistura útil para amplificação por PCR e em particular para reduzir a formação de ácidos nucleicos não específicos durante a PCR. Esta mistura compreende pelo menos um anticorpo contra a polimerase de ADN termoestável, empregue no processo da PCR e pelo menos uma de entre exonuclease e glicosilase. A composição de mistura pode também incluir pelo menos quatro trifosfatos de nucleósidos diferentes, uma polimerase de ADN, pelo menos dois oligonucleótidos iniciadores e outros reagentes de PCR tais como tampões e afins.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método para a amplificação de um ácido nucleico alvo, no qual a amplificação não especifica de ácidos nucleicos, também conhecidos como artefactos de ciclo zero, é reduzida em relação a métodos convencionais de PCR. Em particular, a formação de dimeros de iniciadores é reduzida e assim, a eficiência de amplificação de ácidos nucleicos alvo é aumentada através da inclusão, na mistura de reacção da PCR, de um anticorpo específico contra a polimerase de ADN termoestável e pelo menos uma de entre uma 8 r“ \l t exonuclease e uma glicosilase.

Os princípios da PCR e as condições para amplificação e detecção de ácidos nucleicos alvo são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados em numerosas referências conhecidas de um especialista na técnica, incluindo, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4 683 195 de Mullis et al. , 4 683 202 de Mullis et al. e 4 965 188 de Mullis et al. Resumidamente, uma amostra suspeita de conter um ácido nucleico alvo é aquecida para desnaturar ácido nucleico de cadeia dupla na presença de dois oligonucleótidos iniciadores, que são complementares a sequências alvo flanqueando a região a ser amplificada. Os iniciadores emparelham com as cadeias alvo separadas e são sujeitos a extensão a partir da extremidade hidroxilo 3', através de uma polimerase termoestável. Pode ser amplificado por PCR ADN de cadeia simples ou de cadeia dupla. O ARN também serve como um alvo por transcrição reversa de ARN em ADNc. Os passos de desnaturação, emparelhamento de iniciadores e síntese de ADN são realizados a temperaturas discretas, e os ciclos repetidos resultam em acumulação exponencial do ácido nucleico alvo. O tubo da PCR é geralmente um tubo de plástico com tampa ou uma "cuvette" ou bolsa, como descrito na Patente U.S. No. 5 229 297. Os reagentes para amplificação por PCR são misturados tipicamente num único recipiente, e geralmente incluem iniciadores, trifosfatos de nucleósidos (geralmente dATP, dCTP, dGTP e dTTP ou dUTP), polimerase de ADN termostável, tampão contendo magnésio e ácido nucleico alvo. Os reagentes e as condições para PCR são bem conhecidos de alguém com experiência média na técnica, e podem ser encontrados, por exemplo, em

Guatelli et al. (1989) Clin. Microbiol. Rev. 2:217. Para a amplificação de alvos de ARN pode ser utilizada uma transcriptase reversa adicionalmente a, ou em vez de, uma polimerase de ADN termoestável. As transcriptases reversas termoestáveis são particularmente úteis, tal como o são polimerases de ADN termoestáveis possuindo actividade de 9 p ^^ transcriptase reversa. Os métodos para amplificação por PCR de alvos de ARN são conhecidos dos especialistas na técnica e estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5 176 995, 5 310 652 e 5 322 770. A presente invenção proporciona uma modificação de métodos conhecidos de PCR, de modo a melhorar a eficiência e a amplificação de um ácido nucleico alvo. Em particular, os métodos da presente invenção reduzem a formação de artefactos de ciclo zero, incluindo dímeros de iniciadores com um aumento concomitante da eficiência da amplificação de ADN alvo. Os dimeros de iniciadores podem ser produtos de PCR de cadeia dupla consistindo em dois iniciadores e sua sequência complementar. Podem ser inseridas bases adicionais entre os iniciadores. (Erlich et ai., (1991) Science 252:1643). A desnaturação destas espécies resultam em artefactos de cadeia simples, também incluídos no termo dímero de iniciadores. A formação de dimeros de iniciadores é particularmente favorecida quando os iniciadores possuem homologia nas extremidades 3', e podem resultar em eficiência de amplificação reduzida até um grau em que não seja possível detectar o alvo amplificado. Embora tenham sido propostos vários métodos na técnica para reduzir a formação de dímeros de iniciadores e para aumentar a eficiência de amplificação, foi demonstrado de acordo com a presente invenção que os métodos anteriores na técnica de utilização de anticorpo anti-rag ou Exo III ou UNG individualmente são incapazes de reduzir dímeros de iniciadores detectáveis ou aumentar a eficiência em muitas situações. O método da presente invenção permite assim eficiência ou amplificação melhoradas, redução de resultados falsos negativos, e também permite ao praticante mais flexibilidade na escoiha de sequências de iniciadores, uma vez que a homologia 3' dos iniciadores não necessita de ser evitada.

Em primeiro lugar, a presente invenção proporciona uma mistura útil para amplificação por PCR e particularmente para 10 Γ reduzir a formação de ácidos nucleicos não específicos durante a PCR. Esta mistura inclui pelo menos um anticorpo contra a polimerase de ADN termoestável, empregue no processo de PCR e pelo menos uma de entre uma exonuclease e uma glicosilase. A mistura inclui preferencialmente uma exonuclease e uma glicosilase e pelo menos um anticorpo. A mistura inclui também outros reagentes de PCR tais como trifosfatos de nucleósidos, uma polimerase de ADN, iniciadores, tampões e afins.

Verificou-se surpreendentemente, de acordo com a presente invenção, que os ácidos nucleicos não específicos são reduzidos e a eficiência de amplificação de ácidos nucleicos alvo é aumentada, colocando em contacto a amostra contendo o ácido nucleico alvo e os reagentes para PCR, com um anticorpo específico para a polimerase de ADN da PCR e uma exonuclease; ou um anticorpo especifico contra a polimerase de ADN da PCR e uma glicosilase; ou um anticorpo específico para a polimerase de ADN da PCR, uma exonuclease e uma glicosilase. Pode ser utilizado mais do que um anticorpo específico contra a polimerase de ADN da PCR. 0 método da presente invenção permite assim melhorar a eficiência de amplificação e reduzir os resultados falsos negativos, e permite ainda ao praticante mais flexibilidade na escolha das sequências dos iniciadores, uma vez que a homologia 3' dos iniciadores não necessita ser evitada. 0 método da presente invenção é particularmente útil na amplificação por PCR e métodos de detecção conhecidos na técnica como ensaios homogéneos ou sistemas de detecção homogéneos. Tais sistemas são bem conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, nos Pedidos de Patente Europeia publicados 91310062.4 (487218) e 92106989.4 (512334). Nos sistemas homogéneos, a detecção de ADN amplificado baseia-se nas alterações de fluorescência induzidas pela ligação de um composto fluorescente a ADN de cadeia dupla. Dado que a detecção se baseia na formação de ADN de cadeia dupla geralmente, e não consegue diferenciar 11

V Γ entre ADN alvo e produtos não específicos, a formação de artefactos de cadeia dupla, tais como dímeros de iniciadores é prejudicial à especificidade do ensaio homogéneo. De acordo com a presente invenção os dímeros de iniciadores são reduzidos e por isso a especificidade do método de detecção homogéneo é aumentada.

Os reagentes requeridos para a PCR são conhecidos do técnico com experiência média e geralmente incluem pelo menos dois oligonucleótidos iniciadores que são suficientemente complementares a regiões conservadas do ácido nucleico alvo para hibridarem com estas, quatro trifosfatos de nucleósidos diferentes, uma polimerase de ADN termoestável e quaisquer cofactores requeridos para a polimerase de ADN. Os trifosfatos de nucleósidos preferidos são os trifosfatos de desoxirribonucleósidos dATP, dCTP, dGTP e dTTP, denominados colectivamente de dNTPs. Nos métodos da presente invenção utilizando UNG, dUTP é substituído por dTTP. Os trifosfatos de nucleósidos estão disponíveis comercialmente.

Os iniciadores incluem oligonucleótidos que ocorrem naturalmente ou produzidos sinteticamente, capazes de se ligar ao ácido nucleico alvo e actuar como ponto de iniciação da síntese de ácido nucleico em condições apropriadas, i.e., na presença de trifosfatos de nucleósido, de uma polimerase de ADN, temperatura, pH e tampão adequados. Os iniciadores possuem sequências suficientemente complementares ao ácido nucleico alvo para hibridar com este, e são suficientemente compridos, tipicamente entre 10-60 nucleótidos, para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença de uma polimerase de ADN. Os iniciadores podem ser produzidos sinteticamente por síntese automatizada, através de métodos bem conhecidos de alguém com experiência na técnica.

As considerações de concepção dos iniciadores são bem conhecidas na técnica. Os iniciadores são seleccionados de modo a serem substancialmente complementares às sequências das 12 r cadeias do ácido nucleico especifico a ser amplificado, de modo a que o produto da extensão de um iniciador, quando separado do seu complementar, possa servir como molde para o produto de extensão do outro iniciador. Preferencialmente, os iniciadores possuem complementaridade exacta com a cadeia alvo.

As polimerases de ADN são compostos que funcionam para realizar a síntese dos produtos da extensão do iniciador. As polimerases de ADN são termoestáveis, i.e., não são inactivadas permanentemente quando aquecidos durante breves períodos a temperaturas tipicamente utilizadas na PCR para a desnaturação das cadeias de ADN, p. ex., 93-95°C, e são preferencialmente activas a temperaturas elevadas. As polimerases de ADN termoestáveis podem ser obtidas a partir de bactérias termofílicas tais como, Thermococcus litoralis, Bacillus stearothermophilus, Methanothermus fervidus, Thermus aquaticus, T. filiformis, T. flavus, T. lacteus, T. rubens, T. ruber e Γ. thermophilus; ou a partir de archaebactérias tais como Desulforococcus mobilis, Methanobacterium thermoautotrophilcum, Sulfolobus solfataricus, S. acidocaldarius e Thermoplasma acidophilum. Numa realização mais preferida, a polimerase de ADN é a polimerase de Thermus aquaticus (Taq), a polimerase de T. thermophilus (Tth) ou a polimerase de Thermococcus litoralis. Também está contemplada a utilização de polimerases de ADN termoestáveis possuindo actividade de transcriptase reversa.

As polimerases termoestáveis podem ser obtidas comercialmente ou através de métodos conhecidos na técnica. Em particular, a polimerase Taq está comercialmente disponível nas formas recombinante e nativa (Perkin Elmer-Cetus) ou pode ser produzida através do método descrito por Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:6427 ou na Patente U.S. No. 4 889 818. A polimerase Tth está comercialmente disponível na Finnzyme Co., Finlândia e na Toyobo Co., Japão. A de Thermococcus litoralis está comercialmente disponível na New England Biolabs e pode ser 13 r produzida através do método descrito na Patente U.S. No. 5 322 785.

Os anticorpos específicos para a polimerase termoestável podem ser produzidos através de métodos conhecidos de alguém com experiência na técnica. De acordo com a presente invenção, o termo anticorpos inclui, anticorpos monoclonais e policlonais produzidos por metodologias convencionais, anticorpos produzidos de forma recombinante, e fragmentos de anticorpos produzidos quimicamente ou de forma recombinante, tais como fragmentos Fab. Numa realização preferida, os anticorpos são monoclonais.

Os anticorpos podem ser obtidos a partir de métodos conhecidos de um técnico com experiência, e encontrados, por exemplo em Harlowe et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos monoclonais imunizando um mamífero hospedeiro adequado com uma polimerase de ADN e um adjuvante adequado (por exemplo, adjuvante completo de Freund). Podem ser administradas injecções de reforço a vários intervalos para aumentar o título. São geralmente recolhidas amostras de soro a certos intervalos de tempo e testadas quanto à especificidade para a polimerase de ADN de interesse, por exemplo, através de ELISA ou imunotransferência. Os soros desejados de título suficiente são geralmente purificados utilizando meios convencionais tais como cromatografia de troca iónica e de afinidade (por exemplo, utilizando matrizes de Proteína A ou Proteína G).

Os anticorpos monoclonais são convenientemente preparados a partir de células imunes de murganho ou de rato, imunizadas com a polimerase de ADN, utilizando procedimentos convencionais. Por exemplo, são isoladas células secretoras de anticorpo do animal hospedeiro, a partir de tecido linfóide (tal como o baço) e fundidas com células de mieloma (por exemplo, células de mieloma de murino SP2/0-Agl4) na presença de polietilenoglicol, diluídas em meios selectivos e plaqueadas em placas de cultura de tecidos 14

U, de poços múltiplos. Cerca de 7-14 dias mais tarde, as células de hibridoma que secretam os anticorpos desejados são recolhidas para utilização ou armazenadas congeladas. Os sobrenadantes das culturas também podem ser testados quanto à presença dos anticorpos desejados. Para produzir uma quantidade suficiente de anticorpo, as células de hibridoma podem ser crescidas em cultura estática, biorreactores de fibra oca ou utilizadas para produzir tumores asciticos em murganhos. A purificação pode ser realizada como descrito para os anticorpos policlonais.

De modo semelhante, os anticorpos monoclonais contra a polimerase Taq podem ser obtidos como descrito na Patente U.S. No. 5 338 671.

Numa realização preferida da presente invenção, o anticorpo é um anticorpo monoclonal contra a polimerase Taq, a polimerase Tth ou a polimerase de Thermococcus litoralis. Numa realização preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal contra a polimerase Taq. São conhecidos na técnica anticorpos monoclonais contra a polimerase Taq e estão descritos , por exemplo, na Patente U.S. No. 5 338 671. Numa realização preferida, os anticorpos monoclonais contra a polimerase Taq são TP4-9,2 e TPl-12,2, obtidos a partir de hibridomas depositados na American Type Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20853 e designados pelos Números de Acesso ATCC HB11807 e HB11127, respectivamente. Os anticorpos preferidos possuem uma constante de associação para a polimerase de pelo menos cerca de 1 x 107 M"1. De acordo com a presente invenção, os anticorpos definidos como específicos contra a polimerase de ADN são aqueles anticorpos que são capazes de inibir a actividade enzimática da polimerase de ADN a temperaturas de cerca de 20-40UC. Os anticorpos da invenção são inactivados por temperaturas elevadas utilizadas durante os ciclos térmicos da PCR. A capacidade dos anticorpos para inibir a actividade enzimática da polimerase pode ser determinada através de ensaios conhecidos de alguém com experiência na técnica, como descrito, por exemplo, 15 Γ L·, por Sharkey et al. (1984) BioTechnology 12:506. Por exemplo, ensaios convencionais para a actividade enzimática de polimerases de ADN podem basear-se na capacidade da polimerase em incorporar 3H-dNTP em lacunas de cadeia simples feitas no ADN. A capacidade de um anticorpo para inibir a actividade de polimerase é determinada através da pré-incubação do anticorpo com a polimerase e depois a realização do ensaio de polimerase convencional. Os anticorpos capazes de uma diminuição significativa da actividade da polimerase num tal ensaio são úteis na presente invenção. Podem ser utilizados ensaios semelhantes para determinar se os anticorpos desejados são inactivados por aquecimento. Resumidamente, o ensaio para a capacidade do anticorpo em inibir a polimerase é modificado através da elevação até à temperatura desejada, seguido por arrefecimento e ensaio da actividade da polimerase. Os anticorpos desejados, de acordo com a presente invenção, são inactivados através de temperaturas de 85-95°C, libertando assim a polimerase activa.

As exonucleases utilizadas de acordo com a presente invenção estão disponíveis comercialmente, ou podem ser obtidas através de métodos conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, exonuclease III (Exo III), exonuclease I, exonuclease de λ, exonuclease de T7, ribonuclease II, fosforilase de polinucleótido e nuclease de BAL 31. As exonucleases são conhecidas do técnico com experiência, e são descritas, por exemplo, por Fasman, ed. (1989) Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, BocaRaton, FL. Tanto as exonucleases de 5' como de 3' estão contempladas de acordo com a presente invenção, tal como estão as exonucleases que digerem ADN de cadeia simples, ADN de cadeia dupla ou ambas. São particularmente preferidas as exonucleases que atacam preferencialmente ADN de cadeia dupla. Numa realização preferida, a exonuclease é Exo III, exonuclease de λ ou exonuclease I. A Exo III é particularmente preferida. A 16 r inactivação da exonuclease a 95°C evita a actividade posterior da exonuclease durante os ciclos térmicos. De acordo com isto, a exonuclease deve ser inactiva a 95°C.

As glicosilases úteis na presente invenção são aquelas que clivam especificamente bases não convencionais, i.e., bases que não sejam A, G, C ou T em ADN e A, G, C e U em ARN. Em realizações da presente invenção utilizando a glicosilase, o trifosfato de desoxirribonucleósido apropriado para o qual a glicosilase é especifica é substituído pelo dNTP convencional correspondente. As glicosilases que clivam especificamente bases não convencionais tais como N-7 metilguanina, 3-metiladenosina, uracilo e hipoxantina são bem conhecidas para alguém com experiência média na técnica e estão descritas, por exemplo, em PCT/US91/05210 de Sninsky et al. As glicosilases preferidas incluem N-glicosilase de uracilo (UNG), glicosilase de hipoxantina-ADN, e glicosilases I e II de 3-metiadenina-ADN. A glicosilase mais preferida de acordo com a presente invenção é UNG. A UNG está comercialmente disponível (Perkin-Elmer) . A UNG catalisa a excisão de uracilo a partir de ADN de cadeia simples ou dupla. Em realizações da presente invenção utilizando UNG, o trifosfato de desoxirribonucleósido dUTP é substituído por dTTP de modo a que dUTP seja incorporado nos produtos de amplificação. Dado que a UNG é inactivada por temperaturas utilizadas nos ciclos térmicos, a UNG ataca apenas ADN contendo uracilo que é produzido antes dos ciclos térmicos, i.e., no ciclo zero. Os polinucleótidos não básicos resultantes da clivagem com UNG não podem funcionar como moldes de PCR. (Longo et al. (1990) Gene 93:125). A presente invenção proporciona um método para a amplificação de um ãcido nucleico alvo e, opcionalmente, a subsequente detecção do ácido nucleico, numa amostra suspeita de conter o ácido nucleico alvo. A amostra pode ser qualquer amostra suspeita de conter um ácido nucleico alvo, incluindo, por exemplo, uma amostra de tecido, sangue, cabelo, fluido 17 LCj corporal, bactéria, vírus, fungo, célula infectada com bactéria, célula infectada com vírus, e afins. 0 ácido nucleico alvo pode ser ADN ou ARN. Tem que ser conhecido um número suficiente de bases em ambas as extremidades da sequência a ser amplificada, de modo a conceber iniciadores capazes de hibridarem com as diferentes nadei as do ácido nucleico alvo em posições adequadas para a amplificação por PCR. 0 ácido nucleico alvo pode ser extraído ou parcialmente extraído da amostra de tecido antes da PCR, por exemplo removendo as proteínas ou o material celular da amostra. São conhecidos de alguém com experiência na técnica métodos para extracção de ácidos nucleicos a partir de amostras, e podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY e Saiki et al. (1985) BioTechnology 3:1008.

No método de amplificação da presente invenção, a amostra ou uma preparação de ácidos nucleicos extraídos da amostra é colocada em contacto com os reagentes utilizados tipicamente para PCR, incluindo pelo menos dois oligonucleótidos iniciadores, quatro trifosfatos de nucleósido diferentes, uma polimerase de ADN termoestável e um tampão apropriado e além disso com pelo menos um anticorpo específico contra a polimerase de ADN e pelo menos uma de entre uma exonuclease e uma glicosilase para proporcionar uma mistura reaccional de PCR. Numa realização preferida, são incluídas ambas a exonuclease e a glicosilase.

Os reagentes de PCR convencionais incluindo iniciadores, trifosfatos de nucleósido, polimerase de ADN e tampão apropriado são utilizados a concentrações geralmente apropriadas para PCR e conhecidas de alguém com experiência na técnica. Numa realização preferida, os trifosfatos de nucleósido são dATP, dCTP, dGTP e dTTP. Em métodos utilizando uma glicosilase, dUTP é substituído por dTTP e a concentração de magnésio no tampão é diminuída, por exemplo, para cerca de 5 mM em tampão de PCR a lOx. Polimerases 18 Γ de ADN preferidas são a polimerase Taq, a polimerase Tth e a polimerase de Thermococcus litoralis. A polimerase Taq é particularmente preferida. O anticorpo especifico contra a polimerase de ADN é utilizado a uma concentração eficaz para inibir a polimerase de ADN à temperatura ambiente. O anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal, ou um fragmento de anticorpo. Numa realização preferida, o anticorpo é monoclonal e é utilizado a uma razão molar de desde cerca de 5 até cerca de 500 acima da polimerase de ADN. Numa realização mais preferida, a polimerase de ADN é polimerase Taq, o anticorpo é um anticorpo monoclonal especifico contra a polimerase Taq, e a razão molar de anticorpo para polimerase Taq é de cerca de 50:1. A exonuclease pode ser utilizada a uma concentração de desde cerca de 0,001 Unidades/pL até cerca de 0,2 Unidades/μΐι. Numa realização preferida, a exonuclease é Exo III e é utilizada a uma concentração de desde cerca de 0,0025 Unidades^L até cerca de 0,05 Unidades/μΙ,. Noutra realização preferida a glicosilase é UNG. O especialista na técnica pode determinar concentrações apropriadas de anticorpo, de exonuclease e de glicosilase, que podem variar dependendo da concentração do alvo e de outras condições experimentais. Por exemplo, podem ser testados vários intervalos de concentração como referido nos Exemplos VI e VII, de modo a determinar as concentrações mais eficazes.

De acordo com a presente invenção, verificou-se que em certas condições de PCR, e em particular quando os oligonucleótidos iniciadores se sobrepuseram a regiões capazes de formar facilmente dimeros de iniciadores, a amplificação do alvo fica de tal forma comprometida que o produto pode ser indetectável. Os agentes que se alegam na técnica para reduzir artefactos de ciclo zero, tais como anticorpo anti-Tag e Exo III, são individualmente incapazes de diminuir os artefactos para um nivel em que o produto se torne visualmente detectável. 19

No método da presente invenção, a combinação de uma exonuclease e de um anticorpo contra a polimerase de ADN, ou uma glicosilase e o anticorpo, ou ã exonuclease, glicosilase e anticorpo, reduz detectavelmente a formação de dimeros de iniciadores e aumenta detectavelmente a eficiência da amplificação do alvo. De acordo com a presente invenção, um aumento ou redução detectável é aquela que pode ser visualizada qualitativamente num gel corado com brometo de etídio por um técnico com experiência. De acordo com isto, a presente invenção proporciona um método de redução da formação de ácidos nucleicos não específicos e aumentar a eficiência da amplificação de um alvo desejado numa reacção de PCR. A presente invenção é particularmente útil para ensaios de PCR utilizando iniciadores que formam prontamente dimeros de iniciadores e assim expande a escolha de iniciadores disponíveis para PCR.

Em seguida a colocar em contacto a amostra com os reagentes para a PCR, o anticorpo, e pelo menos uma de entre exonuclease e glicosilase, e antes dos ciclos térmicos, a mistura reaccional é aquecida para desnaturar o anticorpo, exonuclease e glicosilase e o ADN de cadeia dupla. Numa realização preferida, a mistura é aquecida até cerca de 85°C - 95°C durante cerca de dez minutos. Em métodos utilizando glicosilase, e particularmente UNG, pode ser realizada uma curta incubação, por exemplo de dois a cinco minutos a cerca de 50°C, para permitir que a UNG degrade os dimeros de iniciadores. Esta incubação é realizada antes da desnaturação por aquecimento.

Seguindo a desnaturação por aquecimento, são realizados ciclos de PCR convencionais de emparelhamento, extensão e desnaturação. Os parâmetros dos ciclos são conhecidos de um técnico com experiência média e podem ser facilmente adaptados para condições particulares. 0 método de amplificação é preferencialmente realizado de um modo contínuo, automatizado. A instrumentação apropriada para PCR automatizada é bem conhecida do técnico com experiência e está descrita, por exemplo, nas 20 f L-Cj

Patentes U.S. Nos. 4 965 188, 5 089 233 e 5 229 297. O especialista na técnica pode também detectar facilmente o produto amplificado, por exemplo por separação dos produtos da PCR por electroforese em gel de agarose e visualização por coloração com brometo de etídio, ou detecção por hibridação com uma sonda marcada, capaz de hibridar com o ácido nncleico amplificado, ou uma variedade de outros métodos de detecção bem conhecidos de alguém com experiência média na técnica. A presente invenção proporciona ainda um "kit" para PCR compreendendo uma polimerase de ADN, um anticorpo especifico contra a polimerase de ADN e uma exonuclease. Noutra realização, o "kit" compreende ainda um quarto recipiente adaptado para conter uma glicosilase. A presente invenção também compreende um "kit" para PCR compreendendo um primeiro recipiente adaptado para conter uma polimerase de ADN, um segundo recipiente adaptado para conter um anticorpo especifico contra a polimerase de ADN e um terceiro recipiente adaptado para conter uma glicosilase. Podem também ser fornecidos recipientes adicionais para a inclusão de, por exemplo, anticorpos adicionais específicos contra a polimerase de ADN da PCR. Os "kits" da presente invenção podem também compreender reagentes para PCR, incluindo por exemplo, trifosfatos de nucleósidos, iniciadores e tampões.

Numa realização preferida a polimerase de ADN de polimerase é Taq, polimerase Tth, ou polimerase de Thermococcus litoralis. A polimerase Taq é particularmente preferida. O anticorpo preferido é um anticorpo monoclonal específico contra a polimerase Taq. A glicosilase é preferencialmente a UNG. Noutra realização preferida, a exonuclease é Exo III, exonuclease de λ ou exonuclease I. A Exo III é par Licularmente preferida. Os "kits" da presente invenção são úteis no aumento da eficiência de amplificação de ácidos nucleicos alvo em ensaios de PCR.

Os seguintes exemplos ilustram ainda a invenção. 21 Γ

EXEMPLO I

Controlo da Formação de Dímeros de Iniciadores com Exonuclease III e Anticorpo contra a Taq

Este exemplo utiliza um sistema modelo para a formação de dímeros de iniciadores, no qual os iniciadores foram concebidos de modo a que a amplificação de ADN de citomegalovírus alvo seja de eficiência extremamente baixa e as bandas de dímeros de iniciadores sejam proeminentes. Embora as bandas do produto não possam ser visualizadas em géis corados com brometo de etídio, métodos mais sensíveis, tais como captura por hibridação seguida de oxidação do corante triarilimidazol leuco mediada por peroxidase de rabanetes, indicam que uma pequena quantidade do produto é produzida no sistema do modelo.

Os oligonucleótidos iniciadores foram preparados por química de fosforoamidite de fase sólida, utilizando um sintetizador de ADN da Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division, Modelo 380B. Os iniciadores foram biotinilados na extremidade 5' para detecção não radioactiva. Os iniciadores empregues foram: Iniciador JKCMV53: 5' - CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT-3' (SEQ ID N0:1) Iniciador JKCMV55: 5' - TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT-3' (SEQ ID NO:2) 0 conjunto de iniciadores JKCMV possui uma região de sobreposição de quatro nucleótidos 3' que forma prontamente complexos de dímeros de iniciadores. A concentração do iniciador JKCMV (0,8 μΜ) utilizada foi o dobro da concentração utilizada tipicamente em PCR, de modo a promover ainda mais a formação de dímeros de iniciadores. A exonuclease III (obtida de Promega) foi testada Isoladamente a duas concentrações diferentes (2 e 6 Unidades por 100 μΐι de mistura de PCR) e em combinação com anticorpo contra a Taq, quanto à capacidade para controlar a formação de dímeros de iniciadores. O anticorpo contra a Taq foi utilizado a uma razão 22 p U, ^ molar de 50:1 em relação à polimerase Taq. A polimerase Taq foi preparada de forma recombinante, como descrito em EP-A 0 482 714. O anticorpo monoclonal (TP4-9,2) especifico para a polimerase Taq foi preparado como descrito na Patente U.S. No. 5 338 671 e foi utilizado em todos os exemplos salvo indicação em contrário. A mistura de PCR continha os seguintes reagentes:

Tampão de PCR a 10X (Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0 com KC1 a 50 mM e MgCl2 a 10 mM);

Iniciadores JKCMV 53/55 a 0,8 μΜ; dNTPs (Sigma) a 1,5 mM cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP;

Polimerase Taq a 16 Unidades por 100 pL de mistura de PCR; Uma unidade é definida como a quantidade de actividade enzimática requerida para incorporar 10 nmoles de nucleótidos totais numa cadeia de ácido nucleico em extensão, em 30 minutos a 74°C; ADN de esperma de arenque a 1 pg por 100 pL de mistura de PCR; e

Alvo de CMV cultivado a diluição final de 100 000 x (estirpe controlo de hCMV AD169 (ATCC VR538) foi propagado em células MRC-5 (ATCC CCL171) até que o efeito citopático caracteristico fosse evidente em valores superiores a 90% da monocamada).

A seguir à preparação da amostra, todas as amostras foram mantidas à temperatura ambiente durante duas horas para permitir a formação de dimeros de iniciadores. As amostras do Grupo A 23 * V ^^ r foram imediatamente submetidas a PCR após as duas horas de incubação, As amostras do Grupo B foram submetidas a mais 20 minutos de incubação a 40°C antes da PCR. No grupo C, o anticorpo contra a Taq e a Exo III foram adicionados após a incubação de duas horas à temperatura ambiente e antes da incubação de 20 minutos a 40°C.

Foram testadas as seguintes amostras em duplicado: Ά. Sem incubação adicional após as duas horas antes da PCR. (1) Sem anticorpo contra a Taq ou Exo III (controlo positivo de dimeros de iniciadores) (2) Apenas anticorpo contra a Taq (sem Exo III); (3) Apenas Exo III [0,02 Unidades/pL ou 2 Unidades/ 100 pL de mistura de PCR]; (4) Apenas Exo III [0,06 Unidades/pL ou 6 Unidades/ 100 pL de mistura de PCR] ; (5) Anticorpo contra a Taq + Exo III [0,02 Unidades/pL ou 2 Unidades/100 pL de mistura de PCR]; (6) Anticorpo contra a Taq + Exo III [0,06 Unidades/pL ou 6 Unidades/100 pL de mistura de PCR].

B. Incubação durante mais 20 minutos a 40°C antes da PCR para a Exo III (7) Sem anticorpo contra a Taq ou Exo III (controlo positivo de dímero de iniciadores) (8) Apenas anticorpo contra a Taq (sem Exo III) 24

..1., ι (9) Apenas Exo III [0,02 Unidades/pL ou 2 Unidades/ 100 pL de mistura de PCR] (10) Apenas Exo III [0,06 Unidades/pL ou 6 Unidades/ 100 pL de mistura de PCR] (11) Anticorpo contra a Taq + Exo III [0,02 Unidades/pL ou 2 Unidades/100 pL de mistura de PCR] (12) Anticorpo contra a Taq + Exo III [0,06 Unidades/pL ou 6 Unidades/100 pL de mistura de PCR] C. Anticorpo contra a Taq/Exo III adicionado após as 2 horas de incubação a TA antes da incubação durante mais

20 minutos a 40°C (13) Anticorpo contra a Taq e Exo III [0,02 Unidades/pL ou 2 Unidades/100 pL de mistura de PCR] (14) Anticorpo contra a Taq e Exo III [0,06 Unidades/pL ou 6 Unidades/100 pL de mistura de PCR] A amplificação por PCR foi realizada na bolsa de PCR de Clinicai Diagnostics descrita na Patente U.S. No. 5 229 297, utilizando o Prototype Analyzer descrito na Patente U.S. No. 5 089 233.

Foram utilizados os parâmetros de PCR convencionais após a incubação de 2 horas ou a incubação adicional de 20 minutos. Foi utilizado um pré-aquecimento das amostras a 95°C para desnaturar por aquecimento o anticorpo contra a Taq e a Exonuclease III, bem como para separar o ADN de cadeia dupla na mistura de PCR. Ocorreram então 40 ciclos de PCR (95°C durante 15 segundos para a fusão e 68 °C durante 35 segundos para o emparelhamento e extensão). O produto da PCR foi então retirado das bolsas da PCR 25 e separado num gel de agarose a 2,5%, corado com brometo de etidio. Os géis foram então fotografados com uma câmara Polaroid.

Os produtos da PCR e os complexos de dímeros de iniciadores foram comparados de amostra em amostra e os resultados foram como se segue: 26

u κ t AMOSTRA Ab Exo BANDA DE PRODUTO BANDA DE DíMERO DE INICIADORES A. Sem Incubação Adicional la - - Negativo Positivo Forte lb - - Negativo Positivo Forte 2a + Negativo Positivo 2b + - Negativo Positivo 3a - 2U Negativo Positivo Forte 3b - 2U Negativo Positivo Forte 4a — 6U Negativo Positivo Forte 4b - 6U Negativo Positivo Forte 5a + 2U Positivo Forte Negativo 5b + 2U Positivo Forte Negativo Muito Fraco 6a + 6U Positivo Negativo Muito Fraco 6b + 6U Positivo Negativo Muito Fraco B. Incubação de Mais 20 Minutos a 40°C 7a — Negativo Positivo Forte 7b - - Negativo Positivo Forte 8a + - Negativo Positivo Forte 8b + - Negativo Positivo Forte 9a - 2U Negativo Positivo Forte 9b - 2U Negativo Positivo Forte 10a - 6U Negativo Positivo Fraco 10b - 6U Negativo Positivo Fraco 11a + 2U Negativo Positivo 11b + 2U Positivo Fraco Positivo 12a + 6U Positivo Positivo Muito Fraco 12b + 6U Negativo Positivo Muito Fraco C. Ab contra a Taq e Exo III adicionado após incubação de 2 horas, Antes cia incubação de 20 minutos a 40°C 13a + 2 Negativo Positivo 13b + 2 Positivo Fraco Positivo 14a + 6 Positivo Fraco Positivo Fraco 14b + 6 Positivo Fraco Positivo Fraco 27 Ά partir dos resultados do gel pode ser verificado que a Amostra #5, que foi a combinação de anticorpo contra a Taq e Exo III a 0,02 Unidades por μΐ, ou 2 Unidades por 100 pL de mistura de PCR sem incubação adicional, apresentou a mais eficiente amplificação de PCR e controlo de dimeros de iniciadores. Bandas de produto de PCR de sinal ligeiramente mais baixo e controlo equivalente de dimeros de iniciadores, foram produzidos pela Amostra #6 que foi a combinação de anticorpo contra a Taq e Exo III a 0,06 Unidades por pL ou 6 Unidades por 100 μΐί de mistura de PCR sem incubação adicional. Foram obtidas bandas de produto de PCR mais fracas com as Amostras #11 e #12, que foram a combinação de anticorpo contra a Taq e Exo III a ambas as concentrações com a incubação adicional. As amostras #13 e #14 foram o teste de maior severidade da capacidade da Exonuclease III para suprimir a formação de dimeros de iniciadores na medida em que as amostras foram deixadas durante 2 horas à temperatura ambiente sem o anticorpo contra a Taq e Exo III na mistura de PCR. Então, após as 2 horas, foram adicionados tanto o anticorpo contra a Taq como a Exo III e as amostras foram mantidas a 40°C durante 20 minutos para permitir que a Exo III degradasse o dimero de iniciadores pré-formado. Foram produzidas bandas de PCR fracas com bandas de dimeros de iniciadores mais fracos comparadas com outras amostras, demonstrando o efeito positivo que a Exo III tem na eficiência da amplificação por PCR, através do controlo da formação de dimeros de iniciadores.

Este exemplo demonstra que a utilização da Exo III isolada ou do anticorpo contra a Taq isolado não conseguem suprimir a formação de dimeros de iniciadores ou aumentar a eficiência, enquanto que a combinação de Exo III e anticorpo contra a Taq aumentaram a eficiência de amplificação por PCR e controlaram os dimeros de iniciadores, mesmo nas condições de maior confronto (Grupo C). 28 Γ

EXEMPLO II

Este exemplo compara a capacidade da Exo III e do anticorpo contra a Taq relativamente a qualquer agente isolado para controlar a formação de dímeros de iniciadores durante incubações de três e de quatro horas. Além disso, uma vez que as amostras clinicas variam no nivel de ADN de fundo, foi também avaliado o efeito do ADN de fundo na capacidade da Exo III e do anticorpo contra a Taq controlarem a formação de dimeros de iniciadores. A mistura da amostra da PCR continha os seguintes reagentes:

Tampão de PCR a 10X com magnésio a 10 mM;

Iniciadores JKCMV 53/55 a 0,8 μΜ; dNTPs da Sigma a 1,5 mM cada;

Polimerase Taq a 16 Unidades por 100 μΐ, de mistura de PCR; Alvos de CMV cultivados a diluição final de 100 000 x.

As amostras no Grupo B (amostras 7-12) continham ainda ADN de esperma de arenque a 1 pg por 100 pL de mistura de PCR. 0 anticorpo contra a Taq (a uma razão molar de 50:1 sobre a polimerase Taq) e a Exo III (2 a 6 Unidades por 100 pL de mistura de PCR) foram testados isoladamente e em combinação tanto para as amostras do Grupo A como para as do Grupo B.

Foram preparadas as seguintes amostras: Ά. Sem ADN de fundo (1) Sem anticorpo contra a Taq ou Exo III (controlo positivo de dimeros de iniciadores) (2) Apenas anticorpo contra a Taq (sem Exo III); (3) Apenas Exo III [0,02 Unidades/pL ou 2 Unidades/ 100 μΐ de mistura de PCR]; 29 ι (4) Apenas Εχο III [0,06 Unidades/μΙ, ou 6 Unidades/ 100 μΐ, de mistura de PCR] ; (5) Anticorpo contra a Taq + Εχο III [0,02 Unidades/μΙ, ou 2 Unidades/100 μΐ, de mistura de PCR] ; (6) Anticorpo contra a Taq + Εχο III [0,06 Unidades/μΙ, ou 6 Unidades/100 μΐ, de mistura de PCR] . B. Com ADN de Fundo Incluído (7) Sem anticorpo contra a Taq ou Εχο III (controlo positivo de dimero de iniciadores) (8) Apenas anticorpo contra a Taq (sem Εχο III) (9) Apenas Εχο III [0,02 Unidades/μΙ, ou 2 Unidades/ ' 100 μΐ, de mistura de PCR] (10) Apenas Εχο III [0,06 Unidades/μΙ, ou 6 Unidades/ 100 μΐ, de mistura de PCR] (11) Anticorpo contra a Taq + Εχο III [0,02 Unidades/μΙ, ou 2 Unidades/100 μΐ, de mistura de PCR] (12) Anticorpo contra a Taq + Εχο III [0,06 Unidades/μΙ, ou 6 Unidades/100 μΐ, de mistura de PCR]

As amostras foram deixadas à temperatura ambiente durante três ou quatro horas para permitir que a formação de dimeros de iniciadores ocorresse antes da amplificação por PCR. A amplificação por PCR foi realizada na bolsa de Clinicai 30 p' U, ^^

Diagnostics utilizando o Prototype Analyzer. Foi utilizado um pré-aquecimento das amostras a 95°C para desnaturar por aquecimento o anticorpo contra a Taq e a Exonuclease III, bem como para separar o ADN de cadeia dupla na mistura da PCR. Ocorreram então 40 ciclos de PCR (95°C durante 15 segundos para a fusão e 68°C durante 35 segundos para o emparelhamento e a extensão). O produto da PCR foi então recolhido das bolsas de PCR e separado num gel de agarose a 2,5%, corado com brometo de etidio. Os géis foram então fotografados com uma câmara Polaroid.

Os produtos da PCR e os complexos de dímeros de iniciadores foram comparados de amostra em amostra e os resultados foram como se segue: 31

AMOSTRA Ab Exo BANDA DE PRODUTO BANDA DE DÍMERO DE INICIADORES (1) Incubação de 3 horas à Temperatura Ambiente A. Sem ADN de fundo 1 - - Negativo Positivo Forte 2 + - Positivo Fraco Positivo 3 - 2U Positivo Muito Fraco Positivo Forte 4 - 6U Negativo Positivo 5 + 2U Positivo Forte Positivo Muito Fraco 6 + 6U Negativo Negativo B. ADN de Fundo 7 - - Negativo Positivo Forte 8 + “ Positivo Positivo 9 - 2U Negativo Positivo 10 - 6U Negativo Positivo Fraco 11 + 2U Positivo Forte Negativo 12 + 6U Negativo Negativo (2) Incubação de 4 Horas à Temperatura Ambiente A. Sem ADN de Fundo 1 - - Negativo Positivo Forte 2 + - Positivo Forte Positivo 3 - 2U Positivo Fraco Positivo Forte 4 - 6U Positivo Muito Fraco Positivo 5 + 2U Positivo Forte Negativo Muito Fraco 6 + 6U Positivo Forte Negativo B. ADN de Fundo 7 - - Negativo Positivo Forte 8 + - Positivo Positivo 9 - 2U Positivo Muito Fraco Positivo 10 - 6U Negativo Positivo 11 + 2U Positivo Muito Forte Negativo 12 + 6U Positivo Forte Negativo 32 r u,

Os resultados do gel demonstraram que para amostras incubadas durante três horas à temperatura ambiente antes da PCR, a eficiência de amplificação foi aumentada e a formação de dimeros de iniciadores reduzida para as amostras #5 e #11, que continham a combinação do anticorpo contra a Taq e Exo III (0,02 Unidades por pL) na ausência e na presença de adn de fundo, respectivamente. Para a incubação de quatro horas, as amostras #5 (Ab Taq, 0,02 Unidades de Exo III por pL, sem ADN de fundo), #6 (Ab Taq, 0,06 Unidades de Exo III por pL, sem ADN de fundo), #11 (Ab Taq, 0,02 Unidades de Exo III por pL, com ADN de fundo), e #12 (Ab Taq, 0,06 Unidades de Exo III por pL, com ADN de fundo) exibiram eficiência de amplificação aumentada e formação de dimeros de iniciadores reduzida. Estes resultados confirmam os resultados do Exemplo I, em que a combinação de anticorpo contra a Taq e Exonuclease III aumenta a eficiência de amplificação da PCR e o controlo de dimeros de iniciadores, e demonstram que a combinação do anticorpo contra a Taq e a Exonuclease III é eficaz na presença ou ausência de ADN de fundo e longas incubações à temperatura ambiente antes da PCR. Tal robustez é critica para sistemas práticos para utilização clínica e é alcançada apenas através da utilização de uma combinação de elementos como acima descrito. 33 Γ L· t

EXEMPLO III A N-glicosilase de uracilo (UNG) e o anticorpo contra a Taq foram testados isoladamente e em combinação com Exo III quanto ao controlo da formação de dimeros de iniciadores e ao efeito na eficiência de amplificação na PCR. Foram utilizados nesta experiência a bolsa de PCR da Clinicai Diagnostic e o "prototype analyzer". A mistura de PCR tinha dUTP substituída por dTTP e níveis de magnésio mais baixos para utilização de UNG, como se segue:

Tampão de PCR a 10X com magnésio a 5 mM;

Iniciadores JKCMV 53/55 a 0,8 μΜ cada; dATP, dCTP e dGTP a 0,2 mM cada; dUTP a 0,4 mM;

Polimerase Taq a 8 Unidades por 100 μΙ1 de mistura de PCR; ADN de esperma de arenque a 1 μς por 100 μΙ, de mistura de PCR;

Alvo de CMV cultivados a uma diluição final de 100 000X.

As amostras foram preparadas contendo UNG e anticorpo contra a Taq isolado ou em combinações com Exo III nas concentrações descritas abaixo. O anticorpo foi utilizado a uma razão molar de 50:1 sobre a polimerase Taq. A UNG foi obtida de Perkin-Elmer. Foram preparadas as seguintes amostras. (1) Sem anticorpo, UNG ou Exo III (controlo positivo de dimeros de iniciadores) 34 (2) Apenas anticorpo; (3) Apenas UNG [1 Unidade/100 μL de mistura de PCR]; (4) Anticorpo e UNG [1 unidade/100 μι, de mistura de PCR] ; (5) Anticorpo e UNG [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR] . (6) Anticorpo e Exo III [2 Unidades/100 μΙ< de mistura de PCR]; (7) Anticorpo, UNG e Exo III [1 Unidade e 2

Unidades/100 μΙ; de mistura de PCR, respectivamente] (8) Anticorpo, UNG e Exo III [2 Unidades/100 μΐ, de mistura de PCR, cada].

Todas as amostras foram deixadas à temperatura ambiente durante 2-3 horas antes da PCR, para permitir que ocorresse a formação de dimeros de iniciadores. As amostras únicas foram testadas ao fim de 2 horas e as amostras em duplicado foram testadas ao fim de 3 horas. Foram necessárias condições de pré-amplificação adicionais após as 2 ou 3 horas de incubação à temperatura ambiente para a utilização de UNG e foram como se segue: (1) 2 minutos de incubação a 50°C para a degradação dos dimeros de iniciadores pela UNG, e (2) 10 minutos de incubação a 95°C para a desnaturação de UNG. Foram utilizados parâmetros dos ciclos de PCR convencionais, imediatamente a seguir a estas incubações adicionais (95°C durante 15 segundos para fusão e 68 °C durante 35 segundos para emparelhamento e extensão). Os 35 Γ produtos de PCR foram recolhidos das bolsas imediatamente após a PCR e foram separados num gel de agarose a 2,5% corado com brometo de etidio. Os géis foram fotografados com uma câmara Polaroid.

Os produtos da PCR e os complexos de dimeros de iniciadores foram comparados amostra a amostra e os resultados foram como se segue: 36 AMOSTRA Ab UNG Exo III BANDA DE PRODUTO BANDA DE DÍMERO DE INICIADORES A. Incubação de 2 Horas à Temperatura Ambiente 1 - - - Negativo Positivo Forte 2 + - “ Positivo Muito Fraco Positivo 3 - 1U - Negativo Positivo Forte 4 + 1U Positivo Muito Fraco Positivo 5 + 2U Positivo Muito Fraco Positivo 6 + 2U Positivo Forte Positivo Fraco 7 + 1U 2U Positivo Forte Positivo Muito Fraco 8 + 2U 2U Positivo Forte Positivo Muito Fraco B. Incubação de 3 Horas à Temperatura Ambiente la - - - Positivo Forte Positivo Forte lb - - Negativo Positivo Forte 2a + - Positivo Muito Fraco Positivo 2b + Positivo Muito Fraco Positivo 3a - 1U Negativo Positivo Forte 3b - 1U Negativo Positivo Forte 4a + 1U - Positivo Muito Fraco Positivo 4b + 1U - Positivo Muito Fraco Positivo 5a + 2U Negativo Positivo Forte 5b + 2U ~ Positivo Muito Fraco Positivo 6a + - 20 Positivo Positivo Fraco 5b + - 20 Positivo Forte Positivo Muito Fraco 7a + 1U 20 Positivo Forte Positivo Fraco 7b + 1U 20 Positivo Forte Positivo Muito Fraco 8a + 2U Positivo Forte Positivo Fraco | 8b + 2U Positivo Forte Positivo Muito Fraco 37 t Γ

Dos resultados do gel pode ser observado que as Amostras #6, #7 e #8 produziram os melhores resultados para ambas as incubações de 2 e de 3 horas à temperatura ambiente. As amostras #6 (anticorpo e Exo III a 0,2 Unidades por 100 pL de mistura de PCR) confirmam os resultados anteriores nos Exemplos I e II. As amostras #7 e #8 (anticorpo, UNG a 1 e 2 Unidades por 100 pL de mistura de PCR, respectivamente, e Exo III a 2 Unidades por 100 pL de mistura de PCR em ambas as amostras) demonstram que a combinação de anticorpo, UNG e Exo III melhora a eficiência de amplificação por PCR reduzindo ainda a formação de dímeros de iniciadores em comparação com qualquer dos agentes isolados ou com apenas dois dos três agentes combinados. O anticorpo ou a UNG isoladamente produziram bandas no produto muito fracas ou nenhumas e bandas de dímeros de iniciadores muito fortes. O anticorpo e a Exo III produziram resultados muito bons, com bandas do produto fortes, mas a combinação de todos os três métodos produziu bandas de dímeros de iniciadores ainda mais fracas e fortes bandas de produto. 38 r L-Cj

EXEMPLO IV N-Glicosilase de uracilo, Exo III e uma combinação dos dois anticorpos contra a Taq foram testados isoladamente e em combinação quanto ao controlo da formação de dimeros de iniciadores e ao seu efeito na eficiência de amplificação por PCR. Foram utilizados nesta experiência a bolsa de PCR da

Clinicai Diagnostics e o prototype analyzer. A mistura da PCR continha dUTP substituído por dTTP e níveis de magnésio mais baixos para utilização de UNG e foram como se segue:

Tampão de PCR a 10X com magnésio a 5 mM;

Polimerase Taq a 8 Unidades por 100 μΙ. de mistura de PCR; ADN de esperma de arenque a 1 pg por 100 μΐι de mistura de PCR;

Alvo de CMV cultivados a uma diluição final de 100 000X.

As amostras foram preparadas contendo UNG e anticorpos contra a Taq isolados ou em combinações com Exo III nas concentrações descritas abaixo. A combinação com o anticorpo contra a Taq consistiu em TP4 - 9,2 a uma razão molar de 5:1 sobre a polimerase Taq e anticorpo contra a Taq TP1 - 12,2 a uma razão molar de 50:1 sobre a polimerase Taq. A UNG foi obtida de Perkin-Elmer. Foram preparadas as seguintes amostras. 39 Γ (1) Sem anticorpo, UNG ou Exo III (controlo positivo de dimeros de iniciadores) (2a, b) Apenas UNG [1 Unidade/100 pL de mistura de PCR]; (3a,b) Apenas UNG [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR]; (4) Apenas anticorpos; (5) Apenas Exo III [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR] . (6a, b) Anticorpos e UNG [1 Unidade/100 pL de mistura de PCR] ; (7a,b) Anticorpos e UNG [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR] ; (8) Anticorpos e Exo III [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR]; (9a,b) Anticorpos, UNG e Exo III [1 Unidade e 2 Unidades/100 pL de mistura de PCR, respectivamente]. (10a,b) Anticorpos, UNG e Exo III [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR cada]

Todas as amostras foram deixadas à temperatura ambiente durante 2 horas antes da PCR, para permitir que ocorresse a formação de dimeros de iniciadores. Foram necessárias condições adicionais de pré-amplificação após a incubação de 2 horas, para Utilização de UNG e foram como se segue: (1) incubação de 2 40

t minutos a 50°C para degradação de dímeros de iniciadores por UNG, e (2) incubação de 10 minutos a 95°C para desnaturação de UNG. Foram utilizados parâmetros de ciclos de PCR convencionais imediatamente após estas incubações adicionais (95°C durante 15 segundos para fusão e 68°C durante 35 segundos para cmparelhamento e extensão). Os produtos da PCR foram recolhidos imediatamente após a PCR e foram separados num gel de agarose a 2,5% com brometo de etidio. Os géis foram fotografados com uma câmara Polaroid.

Os produtos da PCR e os complexos de dimeros de iniciadores foram comparados de amostra em amostra e os resultados foram como se segue: 41 r u AMOSTRA Abs UNG Exo III BANDA DE PRODUTO BANDA DE DÍMERO DE INICIADORES 1 - Negativo Positivo Forte 2a 1U - Negativo Positivo Forte 2b 1U - Negativo Positivo Forte 3a 2U Negativo Positivo Forte 3b 2U Negativo Positivo Forte 4 + Positivo Muito Fraco Positivo 5 “ 2U Negativo Positivo Forte 6a + 1U - Positivo Positivo Fraco 6b + 1U Positivo Positivo Fraco 7a + 2U Positivo Positivo Fraco 7b + 2U Positivo Positivo Fraco 8 + - 2U Positivo Forte Negativo 9a + 1U 2U Positivo Forte Negativo 9b - 1U 2U Positivo Forte Negativo 10a + 2U 2U Positivo Forte Positivo Fraco 10b + 2U 2U Positivo Forte Positivo Muito Fraco A partir dos resultados do gel pode observar-se que as Amostras #8, #9(a,b) e #10(a,b) produziram os melhores resultados para esta experiência. As amostras apenas com UNG e apenas com Exo III (#2, #3 e #5) não produziram bandas de produto detectáveis e produziram bandas de dímeros de iniciadores muito fortes, equivalentes à amostra de controlo positivo de dimeros de iniciadores (#1), enquanto que o anticorpo contra a Taq isolado (#4) produziu uma banda de produto muito fraca e uma banda positiva de dimeros de iniciadores. Estes resultados demonstram a ineficácia de cada um destes três métodos na prevenção da formação de dímeros de iniciadores, fazendo assim diminuir a eficiência de amplificação da ocquência alvo. As combinações de UNG e de anticorpos (Amostras #6 e #7), anticorpos e Exo III (Amostra #8), e todos as três juntamente (Amostras #9 e 10) produziram bandas de produto muito fortes, quando comparadas com qualquer dos métodos isoladamente, e estas mesmas combinações reduziram drasticamente 42 r a quantidade de dímeros de iniciadores formados, ao ponto de não serem detectados nalgumas amostras. A combinação de UNG ou Exo III com anticorpos contra a Taq ou uma combinação de todos os três conjuntamente, aumentou a eficiência de amplificação da reacção da PCR, bem como diminuiu a quantidade de dímeros de iniciadorco c de outros produtos colaterais formados na PCR, resultando num aumento tanto em sensibilidade como em especificidade deste potente dispositivo de diagnóstico. 43 I ,

i

EXEMPLO V

Nesta experiência foram testadas várias concentrações de UNG, Exo III e anticorpo contra a Taq, quanto ao controlo da formação de dimeros de iniciadores antes da amplificação por PCR. Foram utilizados dois sistemas do modelos de PCR, possuindo caracteristicas diferentes das do sistema de modelo de PCR JKCMV 53/55. Os dois sistemas de modelo de PCR utilizados são como se segue: (1) sistema de PCR SMA 7/SMA 20 HIV GAG; e (2) sistema de PCR SK38/BW17 HIV. O sistema de PCR SMA 7/20 possui uma sobreposição de 4 pares de bases nucleotídicas um par de bases dentro da extremidade 3' dos iniciadores. O sistema de iniciadores SK38/BW17 possui uma sobreposição de 2 pares de bases nucleotídicas em 3' , em comparação com a sobreposição de 4 pares de bases nucleotídicas em 3' do sistema de iniciadores JKCMV 53/55. Os iniciadores possuem as seguintes sequências: Iniciador SMA7: 5'-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3' (SEQ ID NO:3) Iniciador SMA20: 5'-CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC-3' (SEQ ID NO:4) Iniciador SK38: 5' -ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3' (SEQ ID NO: 5)

Iniciador BW17: 5'-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3' (SEQ ID NO:6). A mistura de PCR possui dUTP substituído por dTTP e níveis de magnésio mais baixos para utilização de UNG e foi como se segue:

Tampão de PCR a lOx com magnésio a 5 mM;

Iniciadores SMA 7/20 e SK38/BW17 a 0,8 μΜ cada; dATP, dCTP e dGTP a 0,2 mM cada; dUTP a 0,4 mM;

Polimerase Taq a 8 Unidades por 100 pL de mistura de PCR; ADN de esperma de arenque a 1 pg por 100 pL de mistura de 44 PCR; HIV alvo a 100 cópias/100 pL (obtido a partir da linha celular 8E5/LAV, contendo uma cópia única integrada do genoma de HIV-1).

As amostras foram preparadas com anticorpo contra a Taq (a uma razão molar de 50:1 sobre a polimerase Taq) e UNG isoladamente e em várias combinações como Exo III, como se segue: (1) Sem anticorpo, UNG, Exo III (controlo positivo de dimeros de iniciadores); (2) Apenas anticorpo; (3) Apenas UNG [1 Unidade/100 pL de mistura de PCR]; (4) Anticorpo e UNG [1 Unidade/100 pL de mistura de PCR]; (5) Anticorpo e UNG [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR]; (6) Anticorpo e Exo III [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR] ; (7) Anticorpo, UNG e Exo III [1 Unidade e 2 Unidades/100 pL de mistura de PCR, respectivamente]; (8) Anticorpo, UNG e Exo III [2 Unidades/100 pL de mistura de PCR cada].

Foram utilizados para esta experiência a Bolsa de PCR da Clinicai Diagnostic e o Prototype Analyzer. Todas as amostras foram deixadas à temperatura ambiente durante 4 horas antes da 45

V Γ PCR para permitir que ocorresse a formação de dímeros de iniciadores. Foram necessárias condições de pré-amplificação adicionais após a incubação de 4 horas à temperatura ambiente para a utilização de UNG e foram como se segue: (1) incubação durante 2 minutos a 50°C para a degradação dos dímeros de iniciadores pela UNG, e (2) incubação durante 10 minutos a 95°C para a desnaturação da UNG. Foram utilizados os parâmetros de ciclos de PCR convencionais para estes dois sistemas modelo, imediatamente após estas incubações adicionais (95°C durante 15 segundos para fusão e 64 °C durante 35 segundos para emparelhamento e extensão). O produto de PCR foi recolhido das bolsas imediatamente após a PCR e foi separado num gel de agarose a 2,5% corado com brometo de etídio. Os géis foram então fotografados com uma câmara Polaroid.

Os produtos da PCR e os complexos de dímeros de iniciadores foram comparados amostra a amostra e os resultados foram como se segue: 46

I AMOSTRA Ab UNG Exo 111 BANDA DE PRODUTO BANDA DE DÍMERO DE INICIADORES A. Sistema Modelo de PCR SMA 7/20 1 - - Negativo Positivo Forte 2 + - Positivo Fraco Positivo 3 - 1U - Negativo Positivo Forte 4 + 1U Positivo Fraco Positivo Forte 5 + 2U - Positivo Fraco Positivo Forte 6 + - 2U Positivo Positivo 7 + 1U 2U Positivo Forte Positivo 8 + 2U 2U Positivo Forte Positivo B. Sistema Modelo de PCR SK38/BW17 1 “ - - Negativo Positivo Forte 2 + Positivo Positivo 3 - 1U Positivo Positivo 4 + 1U - Positivo Forte Positivo Fraco 5 + 2U Positivo Forte Positivo Fraco 6 + “ 2U Positivo Forte Positivo Muito Fraco 7 + 1U 2U Positivo Forte Positivo Muito Fraco 8 + 2U 2U Positivo Fraco Positivo Muito Fraco

Dos resultados do gel pode ser observado que para ambos os sistemas de iniciadores não há bandas de produtos de PCR detectáveis e bandas fortes de dimeros de iniciadores na ausência de anticorpo, Exo III ou UNG (Amostra #1) . Os resultados do sistema de iniciadores de PCR SMA 7/20 apresentam bandas de produto de PCR fracos com anticorpo contra a Taq isolado e com UNG (Amostras #2, #4 e #5) , enquanto que foram observadas bandas de produto de PCR fortes para a combinação de anticorpo contra a Taq, UNG e Exo 111 (Amostras #7 e #8) . As bandas de dímeros de iniciadores são reduzidas em comparação também com as Amostras #1, #3, #4 e #5. Estes resultados estão em concordância com os resultados obtidos nos Exemplos III e IV com o sistema de PCR JKCMV 53/55 em que a combinação de todos os 47 r

U t três métodos em acção aumenta significativamente o controlo de dímeros de iniciadores e aumenta a eficiência de amplificação por PCR.

Os resultados do sistema de iniciadores de PCR SK38/BW17 variam ligeiramente dos resultados anteriores devido a formação de dímeros dc iniciadores menos severa com este sistema possuindo homologia 3' menos extensa. São obtidos bons resultados para o anticorpo contra a Taq isoladamente (Amostra #2) e UNG isoladamente (Amostra #3) em comparação com a Amostra #1. Contudo, é observado um aumento imediato no inicio de utilização com o anticorpo contra a Taq + UNG (Amostras #4 e #5), anticorpo contra a Taq + Exo III (Amostras #6) e combinação de todos os três métodos de acção (Amostra #7) . Desta experiência pode concluir-se que a combinação do anticorpo contra a Taq com Exonuclease III ou n-glicosilase de uracilo ou ambos aumenta a acção da PCR e aumenta assim as eficiências de amplificação por PCR. 48 Γ

EXEMPLO VI

Foi determinado nesta experiência o intervalo de concentrações da Exonuclease III que aumenta a acção positiva do anticorpo contra a Taq na amplificação do produto de PCR. Foi utilizado o conjunto de iniciadores JKCMV 53/55, que po3sui uma região de sobreposição 3' de quatro nucleótidos, que forma prontamente complexos de dimeros de iniciadores. Foram utilizados nesta experiência a bolsa de PCR da Clinicai Diagnostic e o prototype analyzer. A mistura de PCR continha os seguintes reagentes:

Tampão de PCR a lOx com magnésio a 5%;

Iniciadores JKCMV 53/55 a 0,8 μΜ; dATP, dCTP, dGTP a 0,2 mM cada; dUTP a 0,4 mM;

Polimerase Taq a 8 Unidades por 100 pL de mistura de PCR; ADN de esperma de arenque a 1 pg por 100 pL de mistura de PCR;

Alvo de CMV cultivados a uma diluição final de 100 OOOx.

Foi adicionado anticorpo contra a Taq (a uma razão molar de 50:1 sobre a polimerase Taq) a todas as amostras excepto ao controlo (Amostra 1).

Foi adicionada exonuclease III às amostras como indicado, de uma concentração de 0,001 Unidades/pL (ou 0,1 Unidades por 100 pL de mistura de PCR) para 0,2 Unidades/pL (ou 20 Unidades por 100 pL de mistura de PCR) . Foram testadas as seguintes 49

lí amostras: (1) Sem anticorpo contra a Taq ou Exo III (controlo positivo de dimeros de iniciadores) (2) Apenas anticorpo contra a Taq; (3) Anticorpo contra a Taq + Exo III [0,001 U/pL ou 0,1 U/100 pL de mistura de PCR]; (4) Anticorpo contra a Taq + Exo III [0,0025 U/pL ou 0,25 U/100 pL de mistura de PCR]; (5) Anticorpo contra a Taq + Exo III [0,005 U/pL ou 0,5 U/100 pL de mistura de PCR]; (6) Anticorpo contra a Taq + Exo III [0,0075 U/pL ou 0,75 U/100 pL de mistura de PCR]. (7) Anticorpo contra a Taq + Exo III (0,01 U/pL ou 1 U/100 pL de mistura de PCR). (8) Anticorpo contra a Taq + Exo III (0,0025 U/pL ou 2,5 U/100 pL de mistura de PCR); (9) Anticorpo contra a Taq + Exo III (0,05 U/pL ou 5 U/100 pL de mistura de PCR); (10) Anticorpo contra a Taq + Exo III (0,1 U/pL ou 10 U/100 pL de mistura de PCR); (11) Anticorpo contra a Taq + Exo III (0,15 U/pL ou 50 f 15 U/100 μΐ. de mistura de PCR); (12) Anticorpo contra a Taq + Exo III (0,2 U/μΙ, ou 20 U/100 μΙ- de mistura de PCR) .

Todas as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante duas horas antes da PCR. Não foram utilizadas incubações adicionais antes de terem sido utilizados parâmetros de PCR convencionais. Foi utilizado um pré-aquecimento das amostras a 95°C durante 180 segundos, para desnaturar por aquecimento tanto o anticorpo contra a Taq como a Exonuclease III, bem como para separar o ADN de cadeia dupla na mistura de PCR. Foram realizados quarenta ciclos de PCR (95°C durante 15 segundos para fusão e 68°C durante 35 segundos para emparelhamento e extensão). O produto de PCR foi então recolhido das bolsas de PCR e separado num gel de agarose a 2,5% corado com brometo de etidio. Os géis foram então fotografados com uma câmara

Polaroid.

Os produtos de PCR e os complexos de dímeros de iniciadores foram comparados de amostra em amostra e os resultados foram como se segue: 51 AMOSTRA BANDA DE PRODUTO BANDA DE DÍMEROS DE INICIADORES 1 Negativo Positivo Forte 2 Positivo Positivo 3 Positivo Fraco Positivo 4 Positivo Positivo 5 Positivo Positivo 6 Positivo Forte Positivo Fraco 7 Positivo Forte Positivo Muito Fraco 8 Positivo Forte Negativo 9 Positivo Negativo 10 Negativo Negativo 11 Negativo Negativo 12 Negativo Negativo

Destes resultados foi determinado que um intervalo de 0,0025 Unidades por pL até 0,05 Unidades por pL (0,25 Unidades até 5 Unidades por 100 μΐ. de mistura de PCR) de Exonuclease III foi eficaz no aumento da capacidade de iniciação do anticorpo contra a Taq com resultados óptimos obtidos a concentrações de 0,0075 Unidades até 0,025 Unidades por μΙ. (0,75 Unidades até 2,5 Unidades por 100 μι de mistura de PCR) de Exonuclease III. 52 ff— i\!

EXEMPLO VII

Foi determinado nesta experiência o intervalo da concentração de UNG que aumenta a iniciação do anticorpo contra a Taq na presença ou ausência de Exo III. Foi utilizado o conjunto de iniciadores JKCMV 53/55, que possui uma região de sobreposição 3' de 4 nucleótidos que forma prontamente complexos de dimeros de iniciadores. Foram utilizados nesta experiência a bolsa da Clinicai Diagnostic e o prototype analyzer. A mistura de PCR continha os seguintes reagentes:

Tampão de PCR a lOx com magnésio a 5 mM;

Alvo de CMV cultivados a uma diluição final de 100 OOOx.

Foi adicionada UNG às amostras, de uma concentração de 0,0001 Unidades/pL (ou 0,1 Unidades por 100 pL de mistura de PCR). Foram testadas as seguintes amostras tanto na presença (+) como na ausência (-) de Exo III a 0,02 Unidades/pL ou 2 Unidades por 100 pL de mistura de PCR. 53 (1) j~ U, ^^

Sem anticorpo contra a Taq ou UNG (controlo positivo de dimeros de iniciadores); (2) Apenas anticorpo contra a Taq; (3) Anticorpo contra a Taq + UNG (0,0001 U/pL ou 0,01 U/100 pL de mistura de PCR) ; (4) Anticorpo contra a Taq + UNG (0,0005 U/pL ou 0,05 U/100 pL de mistura de PCR) ; (5) Anticorpo contra a Taq + UNG (0,001 U/pL ou 0,1 U/100 pL de mistura de PCR) ; (6) Anticorpo contra a Taq + UNG (0,005 U/pL ou 0,5 U/100 pL de mistura de PCR) . (7) Anticorpo contra a Taq + UNG (0,01 U/pL ou 1 U/100 pL de mistura de PCR). (8) Anticorpo contra a Taq + UNG (0,02 U/pL ou 2 U/100 pL de mistura de PCR);

Todas as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas antes da PCR. Foi utilizado um pré-aquecimento das amostras a 95°C durante 10 minutos, para desnaturar por aquecimento a UNG (como requerido), o anticorpo contra a Taq e a Exonuclease III, bem como para separar o ADN de cadeia dupla na mistura de PCR. Ocorreram então 40 ciclos de PCR (95°C durante 15 segundos para fusão e 68°C durante 35 segundos para emparelhamento e extensão). O produto de PCR foi então recolhido imediatamente a partir das bolsas de PCR e separado num gel de 54 \] agarose a 2,5%, corado com brometo de etídio de modo a não permitira renaturação da UNG. Os géis foram fotografados com uma câmara Polaroid.

Os produtos de PCR e os complexos de dímeros de iniciadores foram comparados de amostra em amostra e os resultados foram como sc segue: 55 Γ AMOSTRA BANDA DE PRODUTO BANDA DE DÍMEROS DE INICIADORES 1(-Exo III) Negativo Positivo Forte 2(-Exo III) Negativo Positivo 3(-Exo III) Negativo Positivo 4(-Exo III) Negativo Positivo 5(-Exo III) Negativo Positivo 6(-Exo III) Positivo Muito Fraco Positivo Fraco 7(-Exo III) Positivo Fraco Positivo Muito Fraco 8(-Exo III) Positivo Fraco Positivo Muito Fraco M-Exo III) Negativo Positivo Forte 2(-Exo III) Positivo Negativo 3(-Exo III) Positivo Forte Negativo 4(-Exo III) Positivo Forte Negativo 5(-Exo III) Positivo Forte Positivo Muito Fraco 6(-Exo III) Positivo Forte Negativo 7(-Exo III) Positivo Forte Negativo 8(-Exo III) Positivo Forte Negativo A partir destes resultados pode ser observado que o intervalo de UNG que é eficaz no controlo da formação de dímeros de iniciadores com o anticorpo contra a Taq está dependente de a Exonuclease III estar incluída na amostra ou não. Para as amostras sem Exo III a UNG apresentou iniciação aumentada a concentrações entre 0,005 - 0,02 Unidades por pL (0,5 - 2

Unidades por 100 pL de mistura de PCR). Para as amostras com Exo III, foi observado um efeito positivo imediato com a primeira concentração de UNG testada (0,0001 Unidades por pL ou 0,01 Unidades por pL) . Este efeito positivo foi demonstrado para todas as concentrações de UNG adicionadas através de 0,2 Unidades por pL ou 2 Unidades por 100 pL de mistura de PCR. Não 56 VI ' VI '

foram testadas concentrações de UNG mais elevadas devido à concentração relativamente baixa da amostra de armazenamento (1 Unidade por μΐι) e do seu custo elevado. Isto não significa, contudo, que uma concentração mais elevada de UNG não funcione. 57

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Johnson & Johnson Clinicai Diagnostics, Inc. (B) RUA: 1 Johnson & Johnson Plaza (C) CIDADE: New Brunswick (D) ESTADO: New Jersey

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 08933 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Utilização de exonuclease e/ou glicosilase como suplementos para que o anticorpo contra a polimerase aumente a especificidade na reacção em cadeia da polimerase. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 6

(iv) FORMATO DE LEITURA EM COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1,0, Versão #1,30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 58 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l:

CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA 59 f (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4 CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 60 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC

Lisboa, 25 de Maio de 2001

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUST?'.\L

61

Claims

jf- U, ^ REIVINDICAÇÕES 1. Método para a amplificação de um ácido nucleico alvo compreendendo: a) colocar em contacto uma amostra contendo ou suspeita de conter o referido ácido nucleico alvo com reagentes para PCR, compreendendo (i) uma polimerase de ADN termoestável, (ii) pelo menos um anticorpo especifico contra a polimerase de ADN, (iii) pelo menos uma de entre uma exonuclease ou uma glicosilase, (iv) pelo menos dois oligonucleótidos iniciadores que sejam suficientemente complementares às regiões do referido ácido nucleico alvo com que hibridam; e (v) pelo menos quatro trifosfatos de nucleósidos diferentes, para formar uma mistura reaccional; b) aquecer a referida mistura de reacção para desnaturar o referido anticorpo e a referida exonuclease ou glicosilase; e (c) formar produtos de extensão dos iniciadores.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda detectar os produtos da extensão dos iniciadores.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a referida detecção é realizada medindo as alterações de fluorescência induzidas pela ligação de um composto fluorescente a um ADN de cadeia dupla.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda: (d) amplificar o referido ácido nucleico alvo.
5. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que os referidos trifosfatos de nucleósidos são trifosfatos de desoxirribonucleósidoa e 3ão prcfcrcncialmcntc quer 1 Γ L-C. t dATP, dGTP, dCTP e dTTP ou dATP, dGTP, dCTP e dUTP.
6. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o referido ácido nucleico alvo é ADN ou ARN.
7. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a referida polimerase de ADN é seleccionada do grupo consistindo em polimerase de Thermus aquaticus (Taq), polimerase de Thermus thermophilus e polimerase de Thermococcus litoralis, e que é preferencialmente polimerase Taq.
8. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal, e é preferencialmente um anticorpo monoclonal.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal que é pelo menos um de entre TP4-9,2 produzido pelo hibridoma ATCC No. HB11807 e TPl-12,2 produzido pelo hibridoma ATCC No. HB11127.
10. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o referido componente (iii) é uma exonuclease que é preferencialmente seleccionada de um grupo consistindo em exonuclease I, exonuclease III, exonuclease de λ, exonuclease de T7, ribonuclease II, fosforilase de polinucleótido e nuclease de BAL31, e que é mais preferencialmente exonuclease III.
11. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o referido componente (iii) é glicosilase, que é preferencialmente N-glicosilase de uracilo (UNG).
12. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, em 2 p U, -y que o referido aquecimento é de 85°C a 95°C.
13. "Kit" para a amplificação de um ácido nucleico compreendendo, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, um anticorpo especifico contra a polimerase de ADN a ser utilizada para a amplificação, e uma exonuclease ou uma glicosilase.
14. "Kit" de acordo com a reivindicação 13, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal e é preferencialmente um anticorpo monoclonal.
15. "Kit" de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal, que é pelo menos um de entre TP4-9,2 produzido pelo hibridoma ATCC No. HB11807 e TPl-12,2 produzido pelo hibridoma ATCC No. HB11127.
16. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 15, compreendendo ainda, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, um segundo anticorpo especifico contra a referida polimerase de ADN a ser utilizada na amplificação.
17. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 16, compreendendo ainda, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, a referida polimerase de ADN a ser utilizada na amplificação.
18. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 17, em que a referida polimerase de ADN é termoestável.
19. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 17 e 18, em que a referida polimerase de ADN é seleccionada de um grupo consistindo em polimerase Taq, polimerase de Thermus 3 Γ u

t thermophilus e polimerase de Thermococcus litoralis e é preferencialmente polimerase Taq.
20. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 19, que contém uma exonuclease e em que a referida exonuclease é seleccionada de um grupo consistindo em exonuclease I, exonuclease III, exonuclease de λ, exonuclease de T7, ribonuclease II, fosforilase de polinucleótido e nuclease de BAL31, e em que a referida exonuclease é preferencialmente exonuclease III.
21. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 20, que contém uma glicosilase e em que a referida glicosilase é preferencialmente UNG.
22. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 21, que contém, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, uma exonuclease e uma glicosilase.
23. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 22, compreendendo ainda, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, pelo menos dois oligonucleótidos iniciadores.
24. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 23, compreendendo ainda, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, pelo menos quatro trifosfatos de nucleósido diferentes.
25. Mistura para utilização em PCR compreendendo: (i) um anticorpo especifico contra a polimerase de ADN a ser utilizada para a amplificação, como definido em qualquer das reivindicações 13 a 15; (ii) uma exonuclease ou uma glicosilase, como definido em qualquer das reivindicações 20 e 21; 4 (iii) opcionalmente, a polimerase de ADN a ser utilizada para a amplificação, como definido em qualquer das reivindicações 17 a 19; (iv) opcionalmente, um segundo anticorpo especifico contra a referida polimerase de ADN a ser utilizada para a amplificação; (v) opcionalmente, uma glicosilase ou uma exonuclease, respectivamente, adicionalmente à exonuclease ou glicosilase; (vi) opcionalmente, pelo menos dois oligonucleótidos iniciadores; e (vii) opcionalmente, pelo menos quatro trifosfatos de nucleósidos diferentes. Lisboa, 25 de Maio de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

5