CN116773291B - 一种石蜡切片dna预处理试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种石蜡切片DNA预处理试剂及方法可以显著改善在数字PCR检测时由于石蜡切片DNA存在的多种状态与探针非特异性结合而产生的“雨幕”现象。石蜡切片DNA预处理试剂使用了尿嘧啶DNA糖苷酶、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ，分别对石蜡切片制作以及后续DNA提取过程中由于紫外线照射、pH值、缺氧和加热过程导致石蜡切片中DNA脱氨化反应使胞嘧啶(C)脱氨后变成尿嘧啶(U)带来的单碱基突变、DNA单链、DNA双链碎片发挥作用。其中，UDG酶可以消化C变异产生的U带来的单碱基突变，核酸外切酶I(EXOI)可以从3’端降解单链DNA的3～5个碱基，核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)可以从3’端降解存在缺刻的双链DNA的3～5个碱基，同时对三种酶的组合以及预处理的温度和时间进行摸索和确定以改善或消除石蜡切片DNA在数字PCR检测过程中的“雨幕”现象并利于DNA拷贝数的判定。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于数字PCR的石蜡切片DNA预处理试剂及方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
数字PCR技术是将一个样本分成几万份，分配到不同的反应单元(微滴)中并在每个微滴中经过PCR扩增得到荧光信号，再通过泊松分布计算出核酸分子的浓度，因此具有更高的灵敏度和准确性，可以直接精准计数得出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。使用数字PCR技术对样本进行检测结果的判定时，一般都需要将阴性微滴中的荧光信号和阳性微滴中的荧光信号加以区分并划定阈值线来完成DNA拷贝数的判读，但是有部分具有突变的DNA、DNA单链和DNA双链碎片由于和探针存在非特异性的结合产生带有微弱荧光信号的微滴会均匀分布于阴性微滴荧光信号和阳性微滴荧光信号之间，因此就会产生严重的“雨幕”现象使得无法获得阈值线的位置而严重影响DNA拷贝数的确定。组织样本在制作石蜡切片以及在后续石蜡切片DNA提取的过程中，需要经过如甲醛、pH值、缺氧和加热等处理过程，这些处理过程都会导致石蜡切片中的DNA发生很多变化，主要包括pH值变化导致的脱氨化反应使C变成U的单碱基突变、加热以及交联处理过程导致的DNA单链、DNA双链碎片的产生。少量相关报道也显示在使用石蜡切片DNA进行基因组测序分析时出现的C:G>T:A的核苷酸变化并指出为了减少这种现象的产生，可以通过使用尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil-DNAGlycosylase,UDG)切断DNA中的尿嘧啶(U)碱基与脱氧核糖间的N-糖苷键，移去尿嘧啶去除该突变。但是我们发现在使用石蜡切片DNA加入UDG处理后的数字PCR检测并不能消除微滴的“雨幕”现象。因此，目前急需找到一种方法可以消除或改善石蜡切片DNA在数字PCR检测过程中由于探针和多类型DNA模板非特异性结合导致的“雨幕”现象。迄今为止此类方法还未见相关报道，因此本发明具有极高的创新性和应用价值。
发明内容
本发明旨在提供用于PCR检测的石蜡切片DNA预处理试剂及方法，以解决在使用数字PCR方法检测石蜡切片DNA时，由于探针与石蜡切片的多类型DNA模板非特异性结合导致的“雨幕”现象、无法划定阴性微滴和阳性微滴之间的阈值线而影响石蜡切片中DNA拷贝数的判定等技术问题。
第一方面，本发明保护一种用于数字PCR的石蜡切片DNA预处理试剂，由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种。
上述的石蜡切片DNA预处理试剂中，所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述预处理试剂中的活性范围可为1U～2.8U。
上述的石蜡切片DNA预处理试剂中，所述核酸外切酶I在所述预处理试剂中的活性范围可为20U～36U。
上述的石蜡切片DNA预处理试剂中，所述核酸外切酶Ⅲ在所述预处理试剂中的活性范围可为200U～560U。
所述的石蜡切片DNA预处理试剂具体可为下述1)—12)中的任一种：
1)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1U～2.8U；
所述核酸外切酶I在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为20U～36U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为200U～560U；
2)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为200U；
3)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为560U；
4)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1.5U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为300U；
5)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为2.8U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为200U；
6)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为2.8U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为360U；
7)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1U；
所述核酸外切酶I在所述石蜡切片DNA预处理试剂中得到活性范围为20U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中得到活性范围为200U；
8)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1U；
所述核酸外切酶I在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为26U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为300U；
9)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1U；
所述核酸外切酶I在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为30U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为260U；
10)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1U；
所述核酸外切酶I在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为36U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为200U；
11)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中的活性范围为1.5U；
所述核酸外切酶I在所述石蜡切片DNA预处理试剂中得到活性范围为26U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中得到活性范围为200U；
12)由尿嘧啶DNA糖苷酶和核酸外切酶组成；
所述核酸外切酶为核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ中的任一种或两种；
所述尿嘧啶DNA糖苷酶在所述石蜡切片DNA预处理试剂中得到活性范围为1.5U；
所述核酸外切酶I在所述石蜡切片DNA预处理试剂中得到活性范围为20U；
所述核酸外切酶Ⅲ在所述石蜡切片DNA预处理试剂中得到活性范围为260U；
第二方面，本发明保护一种用于数字PCR的石蜡切片DNA的预处理方法，包括如下步骤：
a.在反应管中加入石蜡切片DNA样本以及权利要求1至4中任一项所述的预处理试剂并进行预处理过程；
b.预处理过程为在加入预处理试剂的石蜡样本DNA的反应管中再加入数字PCR反应试剂并混合后放置于数字PCR仪内设置37℃处理10分钟至60分钟，80℃处理10分钟的运行程序后继续运行数字PCR的扩增程序；
c.或将加入预处理试剂的石蜡样本DNA的反应管置于37℃处理10分钟至60分钟后，80℃处理10分钟后冷却至室温，在反应管内再加入数字PCR反应试剂后放置于数字PCR仪内运行数字PCR的扩增程序。
本发明一种石蜡切片DNA预处理试剂及方法可以显著改善在数字PCR检测时由于石蜡切片DNA存在的多种状态与探针非特异性结合而产生的“雨幕”现象。石蜡切片DNA预处理试剂使用了尿嘧啶DNA糖苷酶、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ，分别对石蜡切片制作以及后续DNA提取过程中由于紫外线照射、pH值、缺氧和加热过程导致石蜡切片中DNA脱氨化反应使胞嘧啶(C)脱氨后变成尿嘧啶(U)带来的单碱基突变、DNA单链、DNA双链碎片发挥作用。其中，UDG酶可以消化C变异产生的U带来的单碱基突变，核酸外切酶I(EXOI)可以从3’端降解单链DNA的3～5个碱基，核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)可以从3’端降解存在缺刻的双链DNA的3～5个碱基，同时对三种酶的组合以及预处理的温度和时间进行摸索和确定以改善或消除石蜡切片DNA在数字PCR检测过程中的“雨幕”现象并利于DNA拷贝数的判定。
附图说明
说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为实施例1使用低浓度UDG酶、EcoRI、EXOIII酶单一一种酶对石蜡切片DNA直接进行预处理及数字PCR检测时形成的正常计数微滴图。
图2为实施例1使用高浓度UDG酶、EcoRI、EXOIII酶单一一种酶对石蜡切片DNA直接进行预处理及数字PCR检测时形成的不正常计数微滴图。
图3为实施例1使用UDG酶、EcoRI、EXOIII酶单一一种酶对石蜡切片DNA直接进行预处理及数字PCR检测结果一维图。
图4为实施例2使用高活性的UDG酶、EcoRI、EXOIII酶单一一种酶对石蜡切片DNA直接进行预处理及数字PCR检测结果一维图。
图5为实施例3使用UDG酶、EcoRI、EXOIII酶两两组合对石蜡切片DNA直接进行预处理及数字PCR检测结果一维图。
图6为实施例4使用UDG酶、EXOIII酶组合对石蜡切片DNA进行不同温度的预处理及数字PCR检测结果一维图。
图7为实施例5使用UDG酶、EXOIII酶组合对石蜡切片DNA在37℃条件下进行不同时间的预处理及数字PCR检测结果一维图。
图8为实施例6使用UDG酶、EcoRI、EXOI酶、EXOIII酶单一一种酶对石蜡切片DNA进行预处理后的数字PCR检测结果一维图。
图9为实施例7使用UDG酶、EcoRI、EXOI酶、EXOIII酶两两组合对石蜡切片DNA进行预处理后的数字PCR检测结果一维图。
图10为实施例8使用UDG酶、EXOI酶、EXOIII酶三种酶组合对石蜡切片DNA进行预处理后的数字PCR检测结果一维图。
图11为实施例9使用UDG酶、EXOI酶、EXOIII酶三种酶组合在不同温度条件下对石蜡切片DNA进行预处理后的数字PCR检测结果一维图。
图12为实施例10中UDG酶、EXOI酶、EXOIII酶三种酶组合在37℃条件下对石蜡切片DNA进行不同时间的预处理后的数字PCR检测结果一维图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐述本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
实施例1：石蜡切片DNA单酶梯度活性预处理方法及数字PCR检测
1、试剂准备：鉴于石蜡切片DNA的复杂状态，本实施例是在数字PCR反应体系中直接加入不同种类的DNA消化酶并使用Opal芯片在数字PCR仪上完成预处理过程及数字PCR反应过程。其中，由于合成的引物和探针为单链，因此使用的DNA消化酶的种类为UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)三种具有代表性的DNA消化酶。其中数字PCR仪使用的Opal芯片每个上样孔的反应体系如表1所示。
表1、数字PCR仪使用的Opal芯片的反应体系表
| 组分名称 | 使用体积(μL) |
| PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix | 1.6 |
| 荧光素钠盐(2.5μM) | 0.3 |
| 引探混合物(25×) | 0.3 |
| 石蜡切片DNA(10～20cp/μL) | 1 |
| 无核酸酶水 | 4.8 |
| 总体积 | 8 |
表1中只有所示的无核酸酶水是可以替换成酶直接加入数字PCR的反应体系中，如果对石蜡切片DNA直接进行酶消化的预处理方法，在这个反应体系中可以加入的DNA消化酶最大体积为4.8μL。因此实施例1是在数字PCR反应体系中直接加入不同体积直至4.8μL的UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)对石蜡切片DNA进行预处理及数字PCR检测。
2、石蜡切片DNA预处理方法及Opal芯片数字PCR反应体系
(1)本发明中使用到的石蜡切片DNA样本浓度约为10～30cp/μL。加入单一DNA消化酶的数字PCR反应体系如表2所示。
表2、加入DNA消化酶的数字PCR反应体系
(2)将表2中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(3)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序如表3所示。
表3、数字PCR反应程序
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal芯片放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal芯片时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal芯片底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称、Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线，并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图1至图3和表4所示。
表4、数字PCR检测结果表
| 通道编号 | 预处理编号 | 总微滴数 | Blue_拷贝数(cp/μL) | Blue_阳性微滴数 |
| 1 | / | 16923 | 8.58 | 28 |
| 2 | 01 | 17355 | 18.8 | 63 |
| 3 | 02 | 17233 | 12.6 | 42 |
| 4 | 03 | 8300 | 21.9 | 35 |
| 5 | 04 | 502 | 0 | 0 |
| 6 | 05 | 17166 | 15.7 | 52 |
| 7 | 06 | 17463 | 29.5 | 99 |
| 8 | 07 | 2874 | 3.61 | 2 |
| 9 | 08 | 2676 | 0 | 0 |
| 10 | 09 | 16532 | 24.8 | 79 |
| 11 | 10 | 17083 | 7.28 | 24 |
| 12 | 11 | 8856 | 0.59 | 1 |
| 13 | 12 | 1470 | 0 | 0 |
6、结果分析：数字PCR检测要求为单个反应孔总微滴数＞10000，本次检测结果才有效并可继续进行分析。实施例1的检测结果如图1、图2、图3和表4所示，表4中的通道编号2至通道编号13显示出在使用不同种类不同体积的DNA消化酶在数字PCR反应体系中直接对石蜡切片DNA进行预处理并检测，检测结果显示UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)只有低于4μL酶使用量才能形成正常计数微滴，图1所示为形成正常计数微滴时的微滴状态，图2所示为形成计数微滴数显著低于10000的微滴状态，此种微滴状态及数量无法继续进行后续数据分析，图3为所有通道检测结果的一维图并显示出石蜡切片DNA在使用数字PCR仪直接进行预处理后虽然低于4μL酶使用量可以形成正常的计数微滴，但是单一一种酶的预处理过程并没有改善微滴形成的“雨幕”现象。数字PCR检测结果需要在阴性微滴和阳性微滴之间划定阈值线以判定DNA的拷贝数，但是由于石蜡切片DNA多种状态模板的存在使得探针非特异性结现象增加导致阴性微滴和阳性微滴之间存在多种荧光强度不同的弱阳性微滴，类似于“雨幕”，并很大程度地影响了检测结果阈值线的划分以及对阳性微滴数和DNA拷贝数的判读。因此需要研究、摸索、调整模板的状态以增强探针和模板DNA的特异性结合。
实施例2：石蜡切片DNA单酶高活性预处理方法及数字PCR检测
1、试剂准备：实施例1的检测结果显示，UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)只有低于4μL的酶使用量才能形成正常计数微滴。为了进一步确认不同酶的使用量，在实施例1的基础上，本实施例进一步在数字PCR反应体系中直接加入不同种类的DNA消化酶，分别加入量为3.3μL、3.5μL、3.8μL、3.9μL并使用Opal芯片在数字PCR仪上完成预处理过程及数字PCR反应过程，数字PCR仪使用的Opal芯片每个上样孔的反应体系如表5所示。
2、石蜡切片DNA预处理方法及Opal芯片数字PCR反应体系
(1)加入DNA消化酶的Opal芯片数字PCR反应体系如表5所示。
表5、加入DNA消化酶的Opal芯片数字PCR反应体系
(2)将表5中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(3)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序如表6所示。
表6、数字PCR反应程序
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal芯片放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal芯片时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal芯片底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称、Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线，并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图4和表7所示。
表7、数字PCR检测结果表
| 通道编号 | 预处理编号 | 总微滴数 | Blue_拷贝数(cp/μL) | Blue_阳性微滴数 |
| 1 | 13 | 11850 | 42.6 | 100 |
| 2 | 14 | 12121 | 28.3 | 68 |
| 3 | 15 | 13990 | 13.7 | 38 |
| 4 | 16 | 174 | 29 | 1 |
| 5 | 17 | 13861 | 7.99 | 22 |
| 6 | 18 | 13764 | 30.4 | 83 |
| 7 | 19 | 12865 | 26.3 | 67 |
| 8 | 20 | 3 | 0 | 0 |
| 9 | 21 | 14493 | 8.34 | 24 |
| 10 | 22 | 14205 | 9.22 | 26 |
| 11 | 23 | 10207 | 13.8 | 28 |
| 12 | 24 | 16 | 324.8 | 1 |
6、结果分析：数字PCR检测要求单个反应孔总微滴数＞10000，本次检测结果才有效并可继续进行分析。实施例2的检测结果如图4和表7所示，表7中的通道编号1至通道编号12显示出在使用不同种类DNA消化酶分别加入的体积为3.3μL、3.5μL、3.8μL、3.9μL以及在数字PCR的反应体系中直接对石蜡切片DNA进行预处理并检测，检测结果显示UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)进一步可以使用的酶体积量为≤3.8μL才能形成正常计数微滴，而且单一一种酶的预处理无法改善“雨幕”现象。因此后续的研究需要注意酶的使用量，只有在可以形成正常计数微滴的基础上才能得到正确的DNA拷贝数。
实施例3：石蜡切片DNA双酶预处理方法及数字PCR检测
1、试剂准备：实施例1和实施例2的检测结果显示当使用UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)单一一种酶在数字PCR反应体系中对石蜡切片提取的DNA进行预处理并进行数字PCR检测并不能改善雨幕状态。因此在实施例3中使用UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)进行酶的两两组合并在数字PCR的反应体系中对石蜡切片DNA进行预处理以及数字PCR检测，因为实施例2检测结果显示单一一种酶进行预处理时使用的最大体积为3.8μL，因此将两种酶按照表8所示进行两两组合并对石蜡切片DNA进行预处理以筛选可以使用的预处理方法。
2、石蜡切片DNA预处理方法及Opal芯片数字PCR反应体系
(1)加入DNA消化酶的Opal芯片数字PCR反应体系如表8所示。
表8、加入DNA消化酶的Opal芯片数字PCR反应体系
(2)将表8中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(3)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果，同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序，如表9所示。
表9、数字PCR反应程序表
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件，确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal chip放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal芯片时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal芯片底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。必须先打开分析文件，再对应加载“4.信息采集”中保存的数据文件。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图5和表10所示。
表10、数字PCR检测结果表
| 通道编号 | 预处理编号 | 总微滴数 | Blue_拷贝数(cp/μL) | Blue_阳性微滴数 |
| 1 | / | 13805 | 38.1 | 104 |
| 2 | 25 | 17953 | 40.5 | 144 |
| 3 | 26 | 13990 | 36.8 | 102 |
| 4 | 27 | 2163 | 14 | 6 |
| 5 | 28 | 15923 | 20.3 | 64 |
| 6 | 29 | 15105 | 19.7 | 59 |
| 7 | 30 | 375 | 67.6 | 5 |
| 8 | 31 | 16477 | 28.5 | 93 |
| 9 | 32 | 14355 | 26.7 | 76 |
| 10 | 33 | 459 | 22 | 2 |
6、结果分析：实施例3的检测结果如图5和表10所示，在数字PCR的反应体系中直接使用UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)两两组合直接对石蜡切片DNA进行预处理并检测，结果显示预处理编号为27、30、33由于酶的总使用量达到了4μL所以产生计数微滴不足的现象。而UDG酶(1U/μL)和核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)的组合，即预处理编号为28和29的方法可以改善微滴形成的“雨幕”现象。限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)和其他两种酶的任何一种组合都无法改善“雨幕”现象，因此后续研究仅采用UDG酶(1U/μL)和核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)的组合对石蜡切片DNA进行预处理。
实施例4、石蜡切片DNA双酶不同温度预处理方法及数字PCR检测
1、试剂准备：依据实施例3的检测结果，在数字PCR的反应体系中使用UDG酶(1U/μL)和核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)组合对石蜡切片DNA直接进行预处理并进行后续的数字PCR检测过程可以改善“雨幕”现象。因此在实施例4中在数字PCR的反应体系中使用预处理编号为28的方法并在不同温度条件下直接对石蜡切片DNA进行预处理及数字PCR检测。
2、石蜡切片DNA预处理及Opal芯片数字PCR反应体系
(1)加入DNA消化酶的Opal芯片数字PCR反应体系如表11所示。
表11、加入DNA消化酶的Opal芯片数字PCR反应体系
(2)将表11中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(3)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序，如表12至表14所示。
表12、数字PCR反应程序表
表13、数字PCR反应程序表
表14、数字PCR反应程序表
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件，确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal芯片放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal芯片时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal芯片底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。必须先打开分析文件，再对应加载“4.信息采集”中保存的数据文件。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图6和表15所示。
表15、数字PCR检测结果表
6、结果分析：实施例4的检测结果如图6和表15所示，在数字PCR的反应体系中使用UDG酶(1U/μL)和核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)预处理编号为28的方法直接对石蜡切片DNA进行不同温度条件下的预处理并进行数字PCR检测，结果显示在数字PCR的反应体系中使用预处理编号为28的方法在37℃条件下对石蜡切片DNA进行预处理时可以有效改善微滴形成的“雨幕”现象。
实施例5：石蜡切片DNA双酶不同时间预处理方法及数字PCR检测
1、试剂准备：依据实施例4的检测结果，在数字PCR的反应体系中直接使用UDG酶(1U/μL)和核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)预处理编号为28的方法直接对石蜡切片提取的DNA进行37℃预处理并在数字PCR检测过程中可以改善“雨幕”现象。因此实施例5在数字PCR的反应体系中直接使用UDG酶(1U/μL)和核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)预处理编号为28的方法直接对石蜡切片DNA在37℃条件下预处理不同时间并进行数字PCR检测。
2、石蜡切片DNA预处理及Opal芯片数字PCR反应体系：
(1)加入DNA消化酶的Opal芯片数字PCR反应体系如表16所示。
表16、加入DNA消化酶的Opal芯片数字PCR反应体系
(2)将表16中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(3)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序，如表17至表19所示。
表17、数字PCR反应程序表
表18、数字PCR反应程序表
表19、数字PCR反应程序表
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件，确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal chip放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal芯片时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal芯片底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。必须先打开分析文件，再对应加载“4.信息采集”中保存的数据文件。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图7和表20所示。
表20、数字PCR检测结果表
6、结果分析：实施例5的检测结果如图7和表20所示，在数字PCR的反应体系中直接使用UDG酶(1U/μL)和核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)预处理编号为28的方法对石蜡切片DNA进行37℃不同时间的预处理并进行数字PCR检测，结果显示预处理编号为28的方法在37℃条件下对石蜡切片DNA进行10分钟至60分钟的预处理都可以有效改善微滴形成的“雨幕”现象。
综合实施例1至实施例5的检测结果显示，在数字PCR的反应体系中直接使用1.5μL～2μLUDG酶(1U/μL)，即1.5U～2U UDG酶，结合1.5μL～1.8μL核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)，即300U～360U EXOⅢ于37℃对石蜡切片DNA预处理10分钟至60分钟可以有效改善数字PCR反应过程中的“雨幕”现象。
实施例6：石蜡切片DNA单酶梯度活性预处理后的数字PCR检测
1、试剂准备：实施例1至实施例5是在数字PCR反应体系中直接加入不同组合的DNA消化酶对石蜡切片DNA进行数字PCR反应体系内的预处理及数字PCR检测的结果。由于引物和探针属于DNA单链的特点，预处理使用的酶的种类比较少，因此在实施例6中使用对石蜡切片DNA先进行DNA消化酶的预处理后再进行数字PCR检测的方法。使用的DNA消化酶的种类为UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)并先使用单一一种酶加入不同体积对石蜡切片DNA进行预处理后再进行数字PCR检测。
2、样品准备：
(1)石蜡切片DNA中加入DNA消化酶的种类及预处理方法如表21所示。
表21、石蜡切片DNA进行预处理时加入单一一种DNA消化酶的反应体系
(2)将按照表21配制好的石蜡切片DNA的预处理反应体系放置于37℃反应30分钟后取出，于80℃加热10分钟进行酶失活反应并将反应溶液的温度降至室温后，在原反应体系的反应管中继续加入后续的数字PCR反应试剂配制成数字PCR反应体系，其数字PCR反应体系如表22所示。
表22、石蜡切片DNA进行预处理后的Opal芯片数字PCR反应体系
(3)将表22中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(4)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序,如表23所示。
表23、数字PCR反应程序表
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件，确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal芯片放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal芯片时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal芯片底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。必须先打开分析文件，再对应加载“4.信息采集”中保存的数据文件。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图8和表24所示。
表24、数字PCR检测结果表
| 数字PCR通道编号 | 预处理编号 | 总微滴数 | Blue_拷贝数(cp/μL) | Blue_阳性微滴数 |
| 1 | / | 13805 | 16.4 | 45 |
| 2 | 34 | 15998 | 33.8 | 107 |
| 3 | 35 | 2163 | 9.32 | 4 |
| 4 | 36 | 375 | 40.4 | 3 |
| 5 | 37 | 15180 | 35.6 | 107 |
| 6 | 38 | 13024 | 31.8 | 82 |
| 7 | 39 | 14392 | 28.4 | 81 |
| 8 | 40 | 0 | 0 | 0 |
| 9 | 41 | 17953 | 12.6 | 45 |
| 10 | 42 | 13990 | 18 | 50 |
| 11 | 43 | 0 | 0 | 0 |
| 12 | 44 | 0 | 0 | 0 |
| 13 | 45 | 17066 | 33.7 | 114 |
| 14 | 46 | 16527 | 29.3 | 96 |
| 15 | 47 | 459 | 11 | 1 |
| 16 | 48 | 0 | 0 | 0 |
| 17 | 49 | 0 | 0 | 0 |
6、结果分析：数字PCR检测要求只有反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果才有效，可继续进行分析。实施例6的检测结果如图8以及表24所示，将石蜡切片DNA进行预处理时，当UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)的加入体积为4μL开始出现不能形成正常计数微滴的现象。因此对于UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)在本发明中对于石蜡切片DNA进行预处理时加入的最大体积为4μL，并参考实施例2的检测结果，后续研究中酶的使用量总体积≤3.8μL。其它预处理方法虽然可以形成正常的计数微滴，但是单一一种酶的预处理方法并没有改善微滴形成的“雨幕”现象。
实施例7：石蜡切片DNA双酶预处理后的数字PCR检测
1、试剂准备：依据实施例6的检测结果，在使用UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)单一一种酶对于石蜡切片提取的DNA进行预处理后再进行数字PCR检测是无法改善“雨幕”现象的。因此在实施例7中使用UDG酶(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)进行两两组合对石蜡切片DNA进行预处理后再进行数字PCR检测。并参考实施例2的检测结果，后续研究中酶的使用量总体积≤3.8μL。因此将其中两种酶按照表25所示进行两两组合并对石蜡切片DNA进行预处理以筛选可以使用的预处理方法。
2、石蜡切片DNA预处理方法
(1)石蜡切片DNA预处理方法如表25所示。
表25、石蜡切片DNA预处理时加入DNA消化酶的反应体系
(2)将按照表25中配制好的石蜡切片DNA的预处理反应体系放置于37℃反应30分钟后取出，于80℃加热10分钟进行酶失活反应并将反应溶液的温度将至室温后，在原反应体系的管中继续加入后续的数字PCR反应试剂配制成数字PCR反应体系，数字PCR反应体系如表26所示。
表26、石蜡切片DNA进行预处理后的Opal芯片数字PCR反应体系
(3)将表26中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(4)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序如表27所示。
表27、数字PCR反应程序表
(2)将Opal chip放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件，确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal chip放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal芯片时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal芯片底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。必须先打开分析文件，再对应加载“4.信息采集”中保存的数据文件。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图9和表28所示。
表28、数字PCR检测结果表
| 通道编号 | 预处理编号 | 总微滴数 | Blue_拷贝数(cp/μL) | Blue_阳性微滴数 |
| 1 | / | 17816 | 17.5 | 60 |
| 2 | 50 | 18959 | 18.6 | 68 |
| 3 | 51 | 17834 | 29.1 | 100 |
| 4 | 52 | 1265 | 158 | 38 |
| 5 | 53 | 16524 | 18.5 | 59 |
| 6 | 54 | 15672 | 17.2 | 52 |
| 7 | 55 | 192 | 848.4 | 29 |
| 8 | 56 | 15160 | 12.3 | 36 |
| 9 | 57 | 16498 | 10.4 | 33 |
| 10 | 58 | 1383 | 13559 | 1282 |
| 11 | 59 | 16532 | 3012 | 7288 |
| 12 | 60 | 17083 | 157 | 510 |
| 13 | 61 | 2511 | 13402 | 2322 |
| 14 | 62 | 16013 | 23.3 | 72 |
| 15 | 63 | 17581 | 69.7 | 235 |
| 16 | 64 | 2204 | 11532 | 1966 |
| 17 | 65 | 15823 | 8.19 | 25 |
| 18 | 66 | 15296 | 11.2 | 33 |
| 19 | 67 | 16936 | 95.4 | 309 |
6、结果分析：如图9和表28的结果所示，在实施例7中使用了UDG(1U/μL)、限制性核酸内切酶EcoRI(10U/μL)、核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)几种酶的两两组合对提取的石蜡切片DNA进行了预处理后再进行数字PCR检测过程，检测结果中第1通道为不加任何酶的检测结果、第2、3、4通道为使用UDG酶和EcoRI共同处理后的检测结果、第5、6、7通道为使用UDG酶和EXOI共同处理后的检测结果、第8、9、10通道为使用UDG酶和EXOⅢ共同处理后的检测结果、第11、12、13通道为使用EcoRI和EXOI共同处理后的检测结果、第14、15、16通道为使用EcoRI和EXOⅢ共同处理后的检测结果、第17、18、19通道为使用EXOI和EXOⅢ共同处理后的检测结果。图9显示出第4、7、10、13、16、19通道的计数微滴数量没有达到要求，这些通道的酶使用量的总体积为4μL，因此不能用于对石蜡切片DNA的预处理。而第5、6、8、9、17、18通道，即预处理编号为53、54、56、57、65、66使用的UDG酶、EXOI酶、EXOⅢ酶的两两组合对石蜡切片DNA进行预处理的方法可以改善“雨幕”现象并对后续数字PCR检测没有影响。
实施例8：石蜡切片DNA三种酶预处理后的数字PCR检测
1、试剂准备：依据实施例7的检测结果，由于UDG(1U/μL)、核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)的两两组合对于改善雨幕现象均有作用，因此实施例8进一步确定UDG(1U/μL)、核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)三种酶共同对石蜡切片DNA进行预处理时的浓度使用范围。由于酶的使用量总体积为≤3.8μL，因此需要将该三种酶进行浓度排列组合并测试。
2、样品准备：
(1)使用UDG酶、EXOI酶、EXOⅢ三种酶对石蜡切片DNA进行预处理的反应体系如表29所示。
表29、使用UDG酶、EXOI酶、EXOⅢ三种酶对石蜡切片DNA预处理时的反应体系
(2)将表29中配制好的石蜡切片DNA的酶切反应体系放置于37℃反应30分钟后取出，于80℃加热10分钟进行酶失活反应并将反应溶液的温度降至室温后，在原反应体系的反应管中继续加入后续的数字PCR反应试剂配制成数字PCR反应体系，数字PCR反应体系如表30所示。
表30、石蜡切片DNA进行三种酶的预处理后的Opal芯片数字PCR反应体系
(3)将表30中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(4)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序,如表31所示。
表31、数字PCR反应程序表
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件，确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal chip放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal芯片时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal芯片底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。必须先打开分析文件，再对应加载“4.信息采集”中保存的数据文件。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图10和表32所示。
表32、数字PCR检测结果表
| 通道编号 | 预处理编号 | 总微滴数 | Blue_拷贝数(cp/μL) | Blue_阳性微滴数 |
| 1 | 68 | 15321 | 17.3 | 51 |
| 2 | 69 | 16878 | 17.2 | 56 |
| 3 | 70 | 15784 | 18.1 | 55 |
| 4 | 71 | 17200 | 14.5 | 48 |
| 5 | 72 | 17141 | 18.5 | 61 |
| 6 | 73 | 16622 | 19 | 61 |
| 7 | 74 | 18056 | 8.62 | 30 |
| 8 | 75 | 17684 | 10.6 | 36 |
| 9 | 76 | 8856 | 19.9 | 34 |
| 10 | 77 | 17531 | 14.5 | 49 |
| 11 | 78 | 16492 | 15.1 | 48 |
| 12 | 79 | 15022 | 15.5 | 45 |
| 13 | 80 | 16587 | 18.1 | 58 |
| 14 | 81 | 18380 | 14.4 | 51 |
| 15 | 82 | 1470 | 92.5 | 26 |
| 16 | 83 | 2874 | 87.3 | 48 |
| 17 | 84 | 2676 | 125.4 | 64 |
| 18 | 85 | 2716 | 135.3 | 70 |
| 19 | 86 | 12932 | 14.4 | 36 |
| 20 | 87 | 12644 | 19.3 | 47 |
| 21 | 88 | 1544 | 101.7 | 30 |
| 22 | 89 | 11165 | 15.3 | 33 |
| 23 | 90 | 324 | 313.1 | 19 |
| 24 | 91 | 1916 | 12341 | 1739 |
| 25 | 92 | 3016 | 13471 | 2792 |
| 26 | 93 | 2788 | 11726 | 2498 |
| 27 | 94 | 2631 | 4485 | 1524 |
6、结果分析：如图10和表32的结果所示，在实施例8中进一步使用了不同浓度的UDG(1U/μL)、不同浓度的核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、不同浓度的核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)三种酶进行组合并对提取的石蜡切片DNA进行预处理后再进行数字PCR检测过程，三种酶组合的预处理方法均可以不同程度地改善“雨幕”现象，第8、19、20通道的“雨幕”现象有更高程度的改善，预处理方法如表29所示。表33中所示使用1～1.5μL UDG(1U/μL)、1～1.5μL核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、1～1.3μL核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)可以更大程度地改善石蜡切片DNA在数字PCR检测过程中的“雨幕”现象。
表33、石蜡切片DNA使用三种酶的预处理方法
将使用的酶转换为酶的活性时为1～1.5U UDG(1U/μL)、20～30U核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、200～260U核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)可以更高程度的改善石蜡切片DNA在数字PCR检测过程中的“雨幕”现象。
实施例9：石蜡切片DNA三种酶不同温度预处理后的数字PCR检测
1、试剂准备：依据实施例8的检测结果，通过实施例9进一步确定1～1.5U UDG(1U/μL)、20～30U核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、200～260U核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)可以改善石蜡切片DNA在数字PCR检测中雨幕现象的预处理方法的温度，预处理方法温度的设置如表34所示。
表34、使用UDG酶、EXOI酶、EXOⅢ三种酶对石蜡切片DNA进行预处理的温度设置表
2、样品准备：
(1)使用UDG酶、EXOI酶、EXOⅢ三种酶组合对石蜡切片DNA进行预处理的不同温度反应体系如表35所示。
表35、使用UDG酶、EXOI酶、EXOⅢ三种酶组合对石蜡切片DNA进行预处理的不同温度反应体系表
(2)将按照表35配制好的石蜡切片DNA预处理的反应体系分别放置于25℃、37℃、46℃反应30分钟后取出，于80℃加热10分钟进行酶失活反应并将反应溶液的温度将至室温后，在原反应体系的管中继续加入后续的数字PCR反应试剂配制成数字PCR反应体系，数字PCR反应体系如表36所示。
表36、数字PCR反应体系的配制表
(3)将表36中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(4)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序，如表37所示。
表37、数字PCR反应程序表
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件，确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal chip放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal chip时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal chip底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。必须先打开分析文件，再对应加载“4.信息采集”中保存的数据文件。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图11和表38所示。
表38、数字PCR检测结果表
(4)如图11和表38的结果所示，在8μL的数字PCR反应体系中使用1U的UDG、10～20U的核酸外切酶I(EXOI)、20～40U的核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)进行组合并分别于25℃、37℃、46℃对提取的石蜡切片DNA进行预处理后再进行数字PCR检测过程，检测结果中显示第2、5、8通道的“雨幕”现象有显著的改善，因此可以确定1～1.5U的UDG、20～30U的核酸外切酶I(EXOI)、200～260U的核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)于37℃对石蜡切片DNA进行预处理可以显著改善“雨幕”现象。
实施例10：石蜡切片DNA三种酶在37℃条件下进行不同时间预处理后的数字PCR检测
1、试剂准备：依据实施例9的检测结果，通过实施例10进一步确定在数字PCR检测中使用1～1.5U UDG(1U/μL)、20～～U核酸外切酶I(EXOI)(20U/μL)、200～260U核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)(200U/μL)在37℃条件下可以改善石蜡切片DNA“雨幕”现象的预处理时间，预处理时间的设置如表39所示。
表39、使用UDG酶、EXOI酶、EXOⅢ三种酶对石蜡切片DNA在37℃条件下进行预处理时间的设置表
2、样品准备：
(1)使用UDG酶和EXOI酶、EXOⅢ三种酶对石蜡切片DNA在37℃预处理条件下预处理时间如表40所示。
表40、使用UDG酶和EXOI酶、EXOⅢ三种酶对石蜡切片DNA在37℃预处理条件下预处理时间表
(2)将表40中配制好的石蜡切片DNA的酶切反应体系放置于37℃分别处理10分钟、30分钟、60分钟后，于80℃加热10分钟进行酶失活反应并将反应溶液的温度将至室温后，在原反应体系的管中继续加入后续的数字PCR反应试剂配制成数字PCR反应体系，数字PCR反应体系如表41所示。
表41、数字PCR反应体系的配制表
(3)将表41中的混合物充分混匀并于1000rpm快速离心15秒，避免产生气泡。
(4)移取7μL反应液加载到Opal芯片(Catalog#C15001,Stilla Technologies)的孔井上方。PCR反应液加载到Opal芯片后，30分钟内进行实验，以免影响实验效果,同时避免加入气泡，避免加入两个或多个液滴。
3、微滴生成和数字PCR扩增
(1)打开Naica Geode微滴生成扩增系统和气压泵，设置数字PCR反应程序，如表42所示。
表42、数字PCR反应程序表
(2)将Opal芯片放置于Naica Geode加热模块上，确认程序无误后，运行生成微滴和PCR反应程序。
4、信息采集
(1)待数字PCR反应结束后，打开NaicaTM prism3微滴阅读分析系统和“Crystalreader”软件，确保仪器能够正常链接和运行。
(2)点击“Crystal reader”软件界面中“open tray”按钮，将Opal chip放置在托盘上，然后点击“close tray”按钮。放置Opal chip时，需用无尘纸或不掉毛的纸巾轻轻擦拭Opal chip底部，以便清除底部的微尘。
(3)点击“Crystal reader”软件界面中“New experiment”按钮，进入扫描参数设置界面：按照数字PCR芯片样品孔布局表的顺序，在软件设置界面下依次输入反应液名称Chip ID号、样本名称等信息。严格检查输入信息与芯片加样顺序间的对应关系，确保信息一致。
(4)点击“Crystal reader”软件界面中“Scanning Parameters”按钮，设置LED曝光时间：Blue(65ms)，Green(250ms)，Red(50ms)。
(5)点击“Crystal reader”软件界面中“SCAN”按钮，运行采集程序。
5、结果分析方法
(1)使用“Crystal Miner”软件分别打开上述分析文件，点击软件界面右上的“SETUP”按钮，选择“Edit Experiment”，点击左边“+”按钮，加载“4、信息采集”中保存的数据文件，并点击“Yes”，确认加载。必须先打开分析文件，再对应加载“4.信息采集”中保存的数据文件。
(2)点击“ANALYZE DATA”进入“Plots&Populations”的“2D dot plot”界面，根据微滴分布情况微调阈值线并保存分析数据。推荐使用“分析文件”中默认的阈值线，可根据具体实验结果进行微调。若反应孔的总微滴数＞10000，本次检测结果有效，可继续分析。
(3)数字PCR检测结果如图12和表43所示。
表43、数字PCR检测结果表
(4)如图12和表43的结果所示，8μL的数字PCR反应体系中在使用1U的UDG、10～20U的核酸外切酶I(EXOI)、100～200U的核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)进行组合并于37℃分别对提取的石蜡切片DNA进行10分钟、30分钟、60分钟的酶切处理后再进行数字PCR检测过程，检测结果中显示1U的UDG、10～20U的核酸外切酶I(EXOI)、100～200U的核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)三种酶组合在一起在37℃的条件下酶切10分钟至60分钟对“雨幕”现象均有改善，但是三种时间处理对“雨幕”现象的改善结果未存在明显的差别。
因此，通过实施例6至实施例10对石蜡DNA切片使用三种酶在37℃条件下预处理后再进行数字PCR检测的研究显示，使用1～1.5U的UDG、20～30U的核酸外切酶I(EXOI)、200～260U的核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)三种酶进行组合后对石蜡切片DNA于37℃的条件下进行10分钟至60分钟的预处理后再进行数字PCR检测也可以显著改善“雨幕”现象。
综上所述研究结果显示，当石蜡切片DNA不进行预处理时存在严重的“雨幕”现象在很大程度上影响了阴性微滴和阳性微滴之间阈值线的划分，进而影响石蜡切片DNA拷贝数的判读。本发明通过使用UDG、核酸外切酶I(EXOI)、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)对石蜡切片DNA进行多种方法的预处理后，微滴的“雨幕”现象会有逐步改善，但是由于不同的预处理方法对“雨幕”现象的改善程度不同，使得阈值线的划分后阴性微滴和阳性微滴的数量产生差异导致石蜡切片DNA的拷贝数也会出现不同程度的差异，虽然存在差异，但只有阈值线的清晰划分才能使数字PCR在检测石蜡切片DNA时的拷贝数更趋近于拷贝数的真实状态，如果由于“雨幕”现象的存在无法清晰划分阈值线，那数字PCR检测出的DNA拷贝数准确性也会较低。
Claims (2)
1.一种用于数字PCR的石蜡切片DNA的预处理方法，其特征在于，包括如下步骤：在反应管中加入石蜡切片DNA样本以及预处理试剂并进行预处理过程；
其中，预处理试剂由1U/μL的尿嘧啶DNA糖苷酶和200U/μL的核酸外切酶Ⅲ组成；
其中，尿嘧啶DNA糖苷酶在所述的预处理试剂中的体积为1.5～2μL；
其中，核酸外切酶Ⅲ在所述的预处理试剂中的体积为1.5～1.8μL；
其中，预处理过程为在加入预处理试剂的石蜡样本DNA的反应管中再加入数字PCR反应试剂并混合后放置于数字PCR仪内设置37℃处理10分钟至60分钟，80℃处理10分钟的运行程序后继续运行数字PCR的扩增程序。
2.一种用于数字PCR的石蜡切片DNA的预处理方法，其特征在于，包括如下步骤：在反应管中加入石蜡切片DNA样本以及预处理试剂并进行预处理过程；
其中，预处理试剂由1U/μL的尿嘧啶DNA糖苷酶、20U/μL的核酸外切酶Ⅰ和200U/μL的核酸外切酶Ⅲ组成；
其中，尿嘧啶DNA糖苷酶在所述的预处理试剂中的体积为1～1.5μL；
其中，核酸外切酶Ⅰ在所述的预处理试剂中的体积为1～1.5μL；
其中，核酸外切酶Ⅲ在所述的预处理试剂中的体积为1～1.3μL；
其中，预处理过程为将加入预处理试剂的石蜡样本DNA的反应管置于37℃处理10分钟至60分钟后，80℃处理10分钟后冷却至室温，在反应管内再加入数字PCR反应试剂后放置于数字PCR仪内运行数字PCR的扩增程序。
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