CN113658639A - 一种基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，所述方法包括以下步骤：获取待检测基因；对待检测基因执行分析操作，得到待测突变位点；根据待测突变位点设计PCR扩增引物、SAP反应试剂、单碱基延伸阻遏引物和野生型阻遏探针；对待检测基因执行扩增操作，得到PCR产物；对PCR产物执行SAP反应操作，得到消化产物；对消化产物执行延伸反应操作，得到延伸产物；对延伸产物执行点样操作，获得点样数据；对点样数据进行分析，获取待检测基因突变类型；通过上述方式，本发明成本较低，检测时间耗时较短，可以灵活设计突变位点，超高的灵敏度，较高的突变检测通量，可同时检测近百种突变类型，适用面广，可以适用于不同的样本类型。

Description

一种基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法。
背景技术
随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，肿瘤治疗的模式由经验性指导治疗逐渐走向基因导向的个体化治疗。
现有的基因检测技术主要包括：
直接测序法，其优点是成本较低，检测结果比较直观；其缺点是过程繁琐，耗时较长，并且灵敏度有限。
焦磷酸测序法，其优点是无需电泳无需对DNA片段进行荧光标记，就可以快速、准确地测定一段较短的目标片段；其缺点是测序长度较短，且容易造成污染。
探针扩增阻滞突变系统，其优点是敏感性较高，其检测结果与临床疗效的一致性更好；其缺点是需要特殊探针，每次仅能检测一种突变。
变性高效液相色谱法，其优点是简单、快速、敏感性高，不仅可用于已知突变的检测，还可以用于未知突变的扫描；其缺点是只能检测有无突变，不能检测出同源突变和突变类型，并且其检测结果判读容易出错，当有多个片段需要检测时，由于有多个解链温度，需要多步检测，增加了工作量。
高分辨率熔解曲线分析技术，其优点是灵敏度高，可用于体细胞突变的检测和测序前突变的筛选，并且无需序列特异性探针，也不受突变碱基位点与类型的局限，操作简单，无需PCR后续操作，选择性好；其缺点是只能分析纯度单一的小片段DNA，且要求有足够的模板，模板含量不少于1ng时能得到稳定可靠的结果。
聚合酶链反应-单链构象多态性分析，其优点是灵敏性更高，无需特殊仪器，还可以对未知的突变进行检测；其缺点是电泳时间较长，操作步骤比较繁琐，只能进行定性分析且需要平行的标准对照，受实验条件影响较大，容易出现假阴性。
突变体富集PCR，其优点是突变灵敏性更高，特异性更强，可检测千分之一的突变；其缺点是两次PCR，操作复杂、耗时长且容易污染.
微数字PCR，其优点是相比于组织学的结果，采用该方法检测血浆标本的敏感性和特异性分别高达92％和100％；其缺点是成本较高。
发明内容
本发明主要解决的是现有的基因检测技术检测过程复杂，耗时较长，容易造成污染，检测结果不准确以及成本较高等问题。
为解决上述问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，包括以下步骤：
获取待检测基因；
对所述待检测基因执行序列分析操作，得到待测突变位点；
根据所述待测突变位点设计PCR扩增引物、SAP反应试剂、单碱基延伸阻遏引物和野生型阻遏探针；
通过所述PCR扩增引物对所述待检测基因执行扩增操作，得到PCR产物；
通过所述SAP反应试剂对所述PCR产物执行SAP反应操作，得到消化产物；
通过所述单碱基延伸阻遏引物对所述消化产物执行延伸反应操作，得到延伸产物；
对所述延伸产物执行点样操作，获得点样数据；
对所述点样数据进行分析，获得待检测基因突变类型。
进一步，所述执行序列分析操作的步骤进一步包括：对所述待检测基因的区域DNA序列和氨基酸序列进行分析，获取待测突变位点序列信息，得到所述待测突变位点。
进一步，所述PCR扩增引物包括第一PCR扩增引物1st-PCRP和第二PCR扩增引物2nd-PCRP。
进一步，所述第一PCR扩增引物和所述第二PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的5'末端增加通用序列ACGTTGGATG。
进一步，所述执行扩增操作的步骤进一步包括：将所述待测突变位点的所述第一PCR扩增引物和所述第二PCR扩增引物进行混合，得到混合工作液，通过单一引物浓度为为0.5μM-1μM对所述待检测基因的DNA进行扩增，得到所述PCR产物。
进一步，所述执行SAP反应操作的步骤进一步包括：将执行扩增操作后的反应体系与所述SAP反应试剂进行混合，消除所述反应体系中剩余的引物和dNTP，得到所述消化产物。
进一步，所述执行延伸反应操作的步骤进一步包括：将所述消化产物与所述单碱基延伸阻遏引物进行混合，得到所述延伸产物；
进一步，所述野生型阻遏探针的5'末端用5`C3 Spacer或者5`P修饰，3'末端3`MGB修饰，熔点温度值范围65℃~72℃。
本发明的有益效果是：
本发明所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，成本较低，检测时间耗时较短，可以根据不同的待检测基因灵活设计突变位点，超高的灵敏度，可以检测出低至1至2个拷贝的突变，较高的突变检测通量，可同时检测近百种突变类型，适用面广，可以适用于不同的样本类型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法的流程图；
图2是本发明实施例所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法的PCR引物的配置表；
图3是本发明实施例所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法的SAP反应的试剂表；
图4是本发明实施例所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法的延伸反应的试剂表；
图5是本发明实施例所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法的阻遏探针和单碱基延伸阻遏引物设计示意图及工作原理图；
图6是本发明实施例1所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法检测EGFR_L858R和EGFR_T790M位点的设计序列表；
图7是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的T790M位点在突变丰度为0.005时UltraCap技术检测结果图；
图8是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的T790M位点在突变丰度为0.005时对照组检测结果图；
图9是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的T790M位点在突变丰度为0.001时UltraCap技术检测结果图；
图10是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的T790M位点在突变丰度为0.001时对照组检测结果图；
图11是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的T790M位点在突变丰度为0时UltraCap技术的野生型样本的检测结果图；
图12是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的T790M位点在突变丰度为0时对照组的野生型样本的检测结果图；
图13是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的T790M位点在突变丰度为0时UltraCap技术的空白对照的检测结果图；
图14是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的T790M位点在突变丰度为0时对照组的空白对照的检结果图；
图15是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的L858R位点在突变丰度为0.005时UltraCap技术检测结果图；
图16是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的L858R位点在突变丰度为0.005时对照组检测结果图；
图17是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的L858R位点在突变丰度为0.001时UltraCap技术检测结果图；
图18是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的L858R位点在突变丰度为0.001时对照组检测结果图；
图19是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的L858R位点在突变丰度为0时UltraCap技术的野生型样本的检测结果图；
图20是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的L858R位点在突变丰度为0时对照组的野生型样本的检测结果图；
图21是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的L858R位点在突变丰度为0时UltraCap技术的空白对照的检测结果图；
图22是本发明实施例1所述的使用本检测方法检测基因EGFR的L858R位点在突变丰度为0时对照组的空白对照的检结果图；
图23是本发明实施例2所述的使用本检测方法检测KRAS_G12D和KRAS_G13D位点的设计序列表；
图24是本发明实施例2所述的使用本检测方法检测基因KRAS的G12D位点在突变丰度为0.001时UltraCap技术检测结果图；
图25是本发明实施例2所述的使用本检测方法检测基因KRAS的G12D位点在突变丰度为0.001时对照组检测结果图；
图26是本发明实施例2所述的使用本检测方法检测基因KRAS的G12D位点在突变丰度为0时UltraCap技术的野生型样本的检测结果图；
图27是本发明实施例2所述的使用本检测方法检测基因KRAS的G12D位点在突变丰度为0时对照组的野生型样本的检测结果图；
图28是本发明实施例2所述的使用本检测方法检测基因KRAS的G12D位点在突变丰度为0时UltraCap技术的空白对照的检测结果图；
图29是本发明实施例2所述的使用本检测方法检测基因KRAS的G12D位点在突变丰度为0时对照组的空白对照的检结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，“基因”、“序列”、“引物”、“延伸引物”、“混合液”、“扩增”、“突变位点”、“反应体系”、“消除”、“产物”、“点样”、“分析”等术语应做广义理解。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
需要说明的是，在本发明的描述中，
MTB（Mycobacterium tuberculosis）是结核分支杆菌、
MTBC（Mycobacterium tuberculosis complex）是结核分枝杆菌复合群、
NTM（Non-tuberculous mycobacteria）是非结核分支杆菌、
SNP（Single Nucleotide Polymorphism）是单核苷酸多态性、
PCR（Polymerase Chain Reaction）是聚合酶链式反应、
DNA（DeoxyriboNucleic Acid）是脱氧核糖核酸、
dNTP（deoxy-ribonucleoside triphosphate）是脱氧核糖核苷三磷酸。
实施例1
本发明实施例提供一种基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，请参阅图1至图22，包括以下步骤：
需要首先说明的是，本实施例选中的待测试基因为EGFR，选中的测试位点为L858R和T790M，设计的序列信息如图6所示。
获取待检测基因EGFR，对其进行序列分析操作，即对EGFR基因的区域DNA序列和氨基酸序列进行分析，得到待测突变位点L858R和T790M。
根据EGFR基因的待测突变位点L858R和T790M设计PCR扩增引物、SAP反应试剂、单碱基延伸阻遏引物和野生型阻遏探针，PCR扩增引物的反应体系如图2所示，SAP反应试剂的反应体系如图3所述，单碱基延伸阻遏引物的反应体系如图4所示，野生型阻遏探针的设计如图5所示。
其中PCR扩增引物包括第一PCR扩增引物1st-PCRP和第二PCR扩增引物2nd-PCRP，第一PCR扩增引物和所述第二PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的5'末端增加通用序列ACGTTGGATG，增强引物特异性及扩增效率。
单碱基延伸引物及其产物按照分子量的差值大于16道尔顿的原则进行设计。
对待检测基因执行PCR扩增操作，即将第一PCR扩增引物和第二PCR扩增引物进行混合，得到混合工作液，将待检测基因与混合工作液放入PCR仪器中，通过单一引物浓度为0.5μM-1μM对所述待检测基因的DNA进行扩增，其中PCR扩增的过程为：
95℃预变性2分钟；执行循环反应操作；72℃延伸5分钟；4℃保温；
循环反应操作的过程为：95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸60秒；循环反应操作共执行45次。
通过PCR扩增后，得到所述PCR产物。
将PCR产物与SAP反应试剂混合放入PCR仪器中进行SAP反应，消除PCR扩增反应体系中剩余的引物和dNTP，其中SAP反应的过程为：
37℃时长40分钟，85℃时长5分钟。
PCR产物进行SAP反应后得到消化产物。
将消化产物与单碱基延伸阻遏引物进行混合放入PCR仪器进行延伸反应，其中延伸反应的过程为：
95℃时长30秒；执行大循环反应操作；72℃时长5分钟；4℃保温；
大循环反应操作的过程为：95℃时长5秒；执行内循环反应操作；大循环反应操作执行共40次；
内循环反应操作的过程为：52℃时长5秒，80℃时长5秒；内循环反应操作执行共5次。
消化产物进行延伸操作后得到延伸产物。
启动点样仪，将纯化延伸产物点样到芯片上，通过MassARRAY核酸检测质谱仪对芯片进行扫描，得到检测结果；
通过TYPER4.0软件对所述检测结果执行分型操作并输出，得到分型结果，通过所述分型结果的质谱峰鉴定基因类型。
需要说明的是，此处限定MassARRAY核酸检测质谱仪和TYPER4.0软件只是为了更清楚地解释本发明，这并不代表本发明所保护的范围仅限于MassARRAY核酸检测质谱仪和TYPER4.0软件。
基因EGFR的T790M位点的测试结果如图7至图14所示，基因EGFR的L858R位点的测试结果如图15至图22所示；
需要说明的是，在图7至图10和图15至图18中，每幅图片的左侧竖直虚线代表未检出突变模板或者UEP峰图位置，每幅图片的右侧竖直虚线代表检出突变型模板；在图11至图14和图19至图22中，每幅图片的虚线均代表未检出突变模板或者UEP峰图位置。
实施例2
本发明实施例提供一种基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，请参阅图1至图5和图23至图29，包括以下步骤：
需要首先说明的是，本实施例选中的待测试基因为KRAS，选中的测试位点为G12D和G13D，设计的序列信息如图23所示。
获取待检测基因KRAS，对其进行序列分析操作，即对KRAS基因的区域DNA序列和氨基酸序列进行分析，得到待测突变位点G12D和G13D。
根据KRAS基因的待测突变位点G12D和G13D设计PCR扩增引物、SAP反应试剂、单碱基延伸阻遏引物和野生型阻遏探针，PCR扩增引物的反应体系如图2所示，SAP反应试剂的反应体系如图3所述，单碱基延伸阻遏引物的反应体系如图4所示，野生型阻遏探针的设计如图5所示。
其中PCR扩增引物包括第一PCR扩增引物1st-PCRP和第二PCR扩增引物2nd-PCRP，第一PCR扩增引物和所述第二PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的5'末端增加通用序列ACGTTGGATG，增强引物特异性及扩增效率。
单碱基延伸引物及其产物按照分子量的差值大于16道尔顿的原则进行设计。
对待检测基因执行PCR扩增操作，即将第一PCR扩增引物和第二PCR扩增引物进行混合，得到混合工作液，将待检测基因与混合工作液放入PCR仪器中，通过单一引物浓度为0.5μM-1μM对所述待检测基因的DNA进行扩增，其中PCR扩增的过程为：
95℃预变性2分钟；执行循环反应操作；72℃延伸5分钟；4℃保温；
循环反应操作的过程为：95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸60秒；循环反应操作共执行45次。
通过PCR扩增后，得到所述PCR产物。
将PCR产物与SAP反应试剂混合放入PCR仪器中进行SAP反应，消除PCR扩增反应体系中剩余的引物和dNTP，其中SAP反应的过程为：
37℃时长40分钟，85℃时长5分钟。
PCR产物进行SAP反应后得到消化产物。
将消化产物与单碱基延伸阻遏引物进行混合放入PCR仪器进行延伸反应，其中延伸反应的过程为：
95℃时长30秒；执行大循环反应操作；72℃时长5分钟；4℃保温；
大循环反应操作的过程为：95℃时长5秒；执行内循环反应操作；大循环反应操作执行共40次；
内循环反应操作的过程为：52℃时长5秒，80℃时长5秒；内循环反应操作执行共5次。
消化产物进行延伸操作后得到延伸产物。
启动点样仪，将纯化延伸产物点样到芯片上，通过MassARRAY核酸检测质谱仪对芯片进行扫描，得到检测结果；
通过TYPER4.0软件对所述检测结果执行分型操作并输出，得到分型结果，通过所述分型结果的质谱峰鉴定基因类型。
需要说明的是，此处限定MassARRAY核酸检测质谱仪和TYPER4.0软件只是为了更清楚地解释本发明，这并不代表本发明所保护的范围仅限于MassARRAY核酸检测质谱仪和TYPER4.0软件。
基因KRAS的G12D位点的测试结果如图24至图29所示，需要说明的是，图24和图25中左侧竖直虚线代表未检出突变模板或者UEP峰图位置，右侧竖直虚线代表检出突变型模板；图26至图29中虚线代表未检出突变模板或者UEP峰图位置。
上述本发明实施例公开实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取待检测基因；
对所述待检测基因执行序列分析操作，得到待测突变位点；
根据所述待测突变位点设计PCR扩增引物、SAP反应试剂、单碱基延伸阻遏引物和野生型阻遏探针；
通过所述PCR扩增引物对所述待检测基因执行扩增操作，得到PCR产物；
通过所述SAP反应试剂对所述PCR产物执行SAP反应操作，得到消化产物；
通过所述单碱基延伸阻遏引物对所述消化产物执行延伸反应操作，得到延伸产物；
对所述延伸产物执行点样操作，获得点样数据；
对所述点样数据进行分析，获得待检测基因突变类型。
2.根据权利要求1所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，其特征在于：
所述执行序列分析操作的步骤进一步包括：对所述待检测基因的区域DNA序列和氨基酸序列进行分析，获取待测突变位点序列信息，得到所述待测突变位点。
3.根据权利要求1所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，其特征在于：
所述PCR扩增引物包括第一PCR扩增引物1st-PCRP和第二PCR扩增引物2nd-PCRP。
4.根据权利要求3所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，其特征在于：
所述第一PCR扩增引物和所述第二PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的5'末端增加通用序列ACGTTGGATG。
5.根据权利要求4所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，其特征在于：
所述执行扩增操作的步骤进一步包括：将所述待测突变位点的所述第一PCR扩增引物和所述第二PCR扩增引物进行混合，得到混合工作液，通过单一引物浓度为0.5μM-1μM对所述待检测基因的DNA进行扩增，得到所述PCR产物。
6.根据权利要求1所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，其特征在于：
所述执行SAP反应操作的步骤进一步包括：将执行扩增操作后的反应体系与所述SAP反应试剂进行混合，消除所述反应体系中剩余的引物和dNTP，得到所述消化产物。
7.根据权利要求1所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，其特征在于：
所述执行延伸反应操作的步骤进一步包括：将所述消化产物与所述单碱基延伸阻遏引物进行混合，得到所述延伸产物；
8.根据权利要求1所述的基于核酸质谱平台体细胞突变超敏检测方法，其特征在于：
所述野生型阻遏探针的5'末端用5`C3 Spacer或者5`P修饰，3'末端3`MGB修饰，熔点温度值范围65℃~72℃。
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