CN118207338A - 一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法。本发明提供的引物探针组、试剂盒和检测方法基于Deep‑Seek技术，引入了阻遏探针、非对称扩增等技术，利用核酸质谱平台优势，显著提高体细胞突变的检出率。

Description

一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法。

背景技术

体细胞突变是相对于胚系突变而言的。胚系突变指的是在有性生殖过程中，由生殖细胞携带的突变，这种突变在该个体的每个细胞当中均存在，并且可以遗传到下一代；而体细胞突变则与之相对，是在个体生长发育过程中，由于诱变因素的影响在部分体细胞中积累的突变。这种突变仅出现在身体的少数部位，并且不会被随着生殖细胞遗传到下一代。

体细胞突变检测是肿瘤基因组方面研究的重中之重。体细胞突变检测主要针对组织样本和血液样本。组织样本检测是基因检测癌症的最可靠方法，血液样本检测则是通过测定肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA来评估癌症关键基因的突变。在肿瘤体细胞突变检测中，无论是组织检测还是液体活检，对检测技术的灵敏度都要求极高，尤其是液体活检的灵敏度需至少达到0.1%。

目前体细胞突变检测技术应用较多的有探针扩增阻滞突变系统、数字PCR、二代测序等。探针扩增阻滞突变系统受限于需要特殊探针，每次仅能检测少数几种突变；数字PCR检测灵敏，然而成本高昂、通量有限、操作繁琐。二代测序的通量高，同时可通过提高测序深度提高检测灵敏度，然而仍面临分析复杂、费用昂贵、变异位点意义不明确等问题。因此肿瘤体细胞突变检测领域仍需要更适合临床应用的技术。

常规的核酸质谱基于多重扩增单碱基延伸的方法，通常用于基因分型，如SNP，病原体检测等，即PCR扩增的目标序列，进行单碱基延伸反应。单碱基延伸是紧挨着SNP位点设计单碱基延伸引物，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使得探针在SNP位点处延伸一个碱基即终止，根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，生成不同分子量的产物。然而在肿瘤体细胞突变检测领域中，由于体细胞突变含量较低，如采用常规多重扩增单碱基延伸的方法，将产生大量野生型延伸产物，将极大影响突变型产物的检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法，通过Deep-Seek技术，利用核酸质谱平台优势，创新性地开发出一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法，有效降低野生型延伸产物对检测结果的影响。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了检测体细胞突变的引物探针组，包括上游引物、下游引物、阻遏探针、单碱基延伸引物，所述上游引物的3′端序列与所述阻遏探针的5′端序列相同，其中相同的部分碱基数为8~16；或

所述下游引物5′端部分序列与所述阻遏探针的3′端部分序列相同，其中相同的部分碱基数为8~16。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组的所述上游引物和下游引物的5′端含有通用序列；

所述通用序列包括ACGTTGGATG（SEQ ID NO: 6）。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组的所述阻遏探针序列与野生型模板完全匹配，仅3′端进行化学修饰，包括但不限于磷酸化修饰。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组的所述上游引物与下游引物的摩尔比为1:(2~10)；或

所述上游引物与下游引物的摩尔比为(2~10):1。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组的所述上游引物具有：

（1）、如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；或

（2）、如（1）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（1）的相同或相似；或

（3）、与如（1）或（2）所示的核苷酸序列至少有50%同源性的核苷酸序列；

所述下游引物具有：

（4）、如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；或

（5）、如（4）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（4）的相同或相似；或

（6）、与如（4）或（5）所示的核苷酸序列至少有50%同源性的核苷酸序列；

所述阻遏探针具有：

（7）、如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；或

（8）、如（7）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（7）的相同或相似；或

（9）、与如（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有50%同源性的核苷酸序列；

所述单碱基延伸引物具有：

（10）、如SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列；或

（11）、如（10）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（10）的相同或相似；或

（12）、与如（10）或（11）所示的核苷酸序列至少有50%同源性的核苷酸序列；

所述多个为2个至3个。

本发明还提供了上述引物探针组在制备体细胞突变检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了试剂，包括上述引物探针组，以及可接受的辅料或助剂。

本发明还提供了试剂盒，包括上述试剂，以及可接受的辅料或助剂。

本发明还提供了体细胞突变的检测方法，其基于上述引物探针组、上述试剂或上述试剂盒检测。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测方法包括如下步骤：

步骤（1）：取待测核酸样品与扩增反应试剂、上述引物探针组的所述上游引物、上述引物探针组的所述下游引物、上述引物探针组的所述阻遏探针混合，进行扩增，获得扩增产物；

步骤（2）：对所述扩增产物进行SAP，获得SAP产物；

步骤（3）：取延伸反应试剂、所述SAP产物与上述引物探针组的所述单碱基延伸引物混合，进行延伸反应，获得延伸产物；

步骤（4）：取所述延伸产物进行核酸质谱，获得检测结果；

所述延伸反应试剂中仅包含与体细胞突变位点相同的ddNTP或acyNTP；所述acyNTP包括acyCTP、acyATP、acyGTP和/或acyTTP，延伸体系中终浓度为0.11~0.22 mmol/L。

本发明的体细胞突变检测方法有如下效果：

本发明所述的基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法，利用核酸质谱的优势可实现一次检测多个突变位点，具有较高性价比。同时，区别于常规的核酸质谱多重扩增单碱基延伸方法，本发明提供的Deep-Seek技术通过创新的理念，设计出适用于核酸质谱体细胞突变检测的PCR扩增体系、阻遏探针和单碱基引物以及各自的非对称扩增反应体系、特异性的单碱基延伸体系，极大地提高了体细胞突变的检出，检出限可达0.1%，部分位点甚至可达0.05%，具有极高的灵敏性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示扩增引物与阻遏探针设计原理图；

图2示延伸引物设计图；

图3示阻遏探针原理；

图4示引物浓度非对称PCR原理；

图5示BRAF V600E 1%体细胞突变检测结果；

图6示BRAF V600E 0.1%体细胞突变检测结果；

图7示BRAF V600E阴性样品检测结果；

图8示F1与野生型阻遏探针的序列的部分重叠、F2不重叠；

图9示F1/R QPCR平台实例测试数据；

图10示F2/R QPCR平台实例测试数据。

具体实施方式

本发明公开了一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明基于Deep-Seek技术，利用核酸质谱平台优势，创新性地开发出一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法，其步骤与常规核酸质谱多重扩增单碱基延伸的方法类似，但引物设计及反应体系有本质区别。主要流程步骤如下：

1.确定体细胞待测靶标，包括点突变、插入和缺失；

2.根据所述待测靶标以特定的方式设计PCR扩增引物、阻遏探针和单碱基延伸引物及优化反应体系；

3.通过所述PCR扩增引物对所述待检测基因执行扩增操作，得到PCR产物；

4.通过SAP消化反应试剂对所述PCR产物执行SAP反应操作，去除多余的dNTP，得到消化产物；

5.通过所述单碱基延伸引物对所述消化产物执行延伸反应操作，得到仅有突变型的延伸产物；

6.对所述延伸产物执行点样操作，获得点样数据；对所述点样数据进行分析，获得待检测基因突变类型。

具体地，本发明的优势在于体细胞突变检测的引物设计和反应体系构建，能显著提升体细胞突变检测的灵敏度。

其中，所述特定的方式包括：

针对体细胞点突变，PCR扩增引物和单碱基延伸引物设计采用如下原理：PCR扩增F或R引物3′端和阻遏探针5端设置成8~16 bp序列重叠；单碱基延伸引物的3′端设计在靶位置的前1个碱基处，保证单碱基延伸成靶碱基。

为进一步富集突变，减少抑制性干扰，设计阻遏探针。探针序列设计与野生型模板完全匹配，仅3′端进行化学修饰，包括但不限于磷酸化修饰，进一步减少延伸。

本发明不仅包括上述引物设计方法，还包括具体的反应体系与流程，共同组成一套体细胞突变检测体系。

具体地，体细胞点突变的PCR扩增体系采用非对称扩增体系原则，即体系中上下游引物浓度不同，遵循原则为延伸引物为正向时，上游引物浓度低于下游引物；延伸引物为反向时，下游引物浓度低于上游引物浓度。PCR扩增体系如表1所示，实际引物用量依据各位点进行调整。反应程序为：37℃ 2 min；95℃预变性10 min；95℃变性20 s，65℃退火30 s，进行55个循环；最后4℃保存。

进一步，SAP消化按照表2反应体系配制，完成配制后，从20 μL PCR反应产物中取出5 μL加入已配制的SAP反应体系中，使其达到7 μL；SAP反应程序为：37℃ 40 min；85℃ 5min；4℃保存。

进一步，单碱基延伸按照表3反应体系配制，完成配制后，将其加入至上一轮7 μL的PCR-SAP反应产物中，共9 μL，延伸反应程序为95℃预变性30s；95℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s进行40个循环；最后72℃延伸3 min。为提高反应灵敏性，根据突变位点后一位碱基类型对位点进行分组。各组只加入特异性延伸碱基，即ddATP或ddGTP或ddCTP或ddTTP或对应的acyNTP。

表1：体细胞点突变PCR扩增体系

表2：SAP消化体系

表3：单碱基延伸体系

为了更清楚地说明本发明Deep-Seek技术，对所提及的部分技术方案作简单地介绍。

Deep-Seek中采用引物设计原则是将PCR扩增F或R引物3′端和阻遏探针5端设置成8~16 bp序列重叠（见图1），由于F或者R引物与阻遏探针的序列有一定程度的重叠，在Tm值的窗口期内会进行一定程度的竞争，此时结合快速PCR扩增程序，是有利于突变丰度富集的。单碱基延伸引物的3′端设计在靶位置的前1个碱基处，保证单碱基延伸成靶碱基（见图2），由于仅加入1种特异性延伸碱基，野生型模板得不到延伸，从而起到突变丰度的富集。

阻遏探针设计与野生型模板序列完全互补，3′端末尾进行化学修饰，包括但不限于磷酸化修饰，进一步减少延伸（见图3）。另外Deep-Seek技术要求PCR扩增时的引物对浓度非等量，使得产物以目标链为主，提高后续单碱基延伸的灵敏度（见图4）。

本方法所涉及的核酸质谱法，适用于一次检测数十个已知位点的应用场景，具有通量高、成本低、组合灵活、灵敏度高等优势。通过检测核酸分子在真空腔中飞行的时间从而计算获得样品分析物的精确分子量，进而得到分析物的基因信息。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。

如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例以待测BRAF基因为例，选中的测试位点为V600E，依据Deep-Seek技术，设计的序列信息下。选取体细胞突变为1%和0.1%的阳性样本和阴性样本进行测试。

表4

注：为了避免干扰质谱结果，在扩增引物F1、R的5′端添加通用序列。

（1）PCR扩增采用表5体系，反应程序为：37℃ 2 min；95℃预变性10 min；95℃变性20 s，65℃退火30 s，进行55个循环；最后4℃保存。

表5：BRAF V600E PCR扩增

（2）SAP采用表3体系，反应程序为：37℃ 40 min；85℃ 5 min；4℃保存。

（3）单碱基延伸采用表4体系，延伸反应程序为95℃预变性30 s； 95℃ 5s， 52℃5s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃，52℃ 5s，80℃ 5s 进行40个循环；最后72℃延伸3 min。

（4）核酸质谱检测：用Agena核酸质谱仪对样本进行芯片点样和核酸质谱检测，得到相应结果，通过Typer4.0软件解读核酸质谱检测结果。结果见图5~图7，从结果可以看出，本发明的检测灵敏可达0.1%。

实施例2

本例对数字PCR和Deep-Seek技术进行对比，仍以实施例一中0.1%BRAF V600E体细胞突变样本为例。

数字PCR法借助北京新羿生物科技有限公司的数字PCR平台及配套耗材，采用北京新羿生物科技有限公司甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒，按照试剂盒说明书，对0.1%BRAFV600E体细胞突变样本进行检测，数字PCR的实际检测结果显示未检出BRAF V600E体细胞突变，根据该数字PCR试剂盒说明书所述，试剂盒检测灵敏度为0.2%，本实施例中检测的0.1%BRAF V600E体细胞突变样本已超过其检测灵敏度。

Deep-Seek法流程如下：

（1）PCR扩增采用表6体系，反应程序为：37℃ 2 min；95℃预变性10 min；95℃变性20 s，65℃退火30 s，进行55个循环；最后4℃保存。

表6

（2）SAP采用表2体系，反应程序为：37℃ 40 min；85℃ 5 min；4℃保存。

（3）单碱基延伸采用表3体系，延伸反应程序为95℃预变性30 s；95℃ 5 s，52℃ 5s，80℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃，52℃ 5 s，80℃ 5s 进行40个循环；最后72℃延伸3 min。

（4）核酸质谱检测：用Agena核酸质谱仪对样本进行芯片点样和核酸质谱检测，得到相应结果，通过Typer4.0软件解读核酸质谱检测结果。结果见图6，与数字PCR结果相比，可以看出Deep-Seek技术具有优越的低频检测性能。

对比例1：扩增阶段采用不对称PCR

F1（SEQ ID NO: 1）、R（SEQ ID NO: 2）引物用量相同和引物不对等单一因素下，延伸引物序列为SEQ ID NO: 4，单重体系检测突变信号可以提高10倍左右，数据见表7。

表7

结果分析：不对称PCR的目的是为了产生更多的ssDNA，增大某一种特异性引物与其结合的机会，在固液相芯片杂交技术、探针熔解曲线技术等领域较为常用，但是不对称PCR本身并不会起到富集突变丰度的作用，不对称PCR扩增产生的突变丰度和野生型丰度是按照所加DNA模板中突变和野生型比例同步无差别扩增。要想检测到0.1%的突变信号，必须结合富集突变丰度的方法才行。Deep-Seek技术中起到富集突变丰度的是FR引物的特殊设计、野生型阻遏探针、延伸阶段只加入对应的特异性延伸碱基；在上述富集技术共存情况下，再开展不对称PCR扩增，确实有如虎添翼的作用。

对比例2：扩增阶段添加野生型阻遏探针，且5′端不做特殊修饰

与现有技术类似，本发明在PCR扩增阶段也都设计并添加了野生型阻遏探针，但是与现有技术相比有差别。

第一个差别是所用的野生型阻遏探针的修饰不同，有的现有技术在5′端和3′端碱基都做了特殊修饰，本发明提出只需在3端做常规修饰即可，成本至少降低10倍左右，另外，设计也更容易，而真正的MGB探针需要资深的专业人员设计才能达到理想效果，相比MGB的设计，本发明的设计难度会低很多。

第二个差别是F或者R引物与野生型阻遏探针的序列需有一定程度的重叠，研究者可根据特定的基因位点进行筛选最优序列。由于F或者R引物与野生型阻遏探针的序列有一定程度的重叠，在Tm值的窗口期内会进行一定程度的竞争，此时结合快速PCR扩增程序，是有利于突变丰度富集的。

实验：R引物相同，F1引物与阻遏探针位点重叠，F2引物不与阻遏探针位点重叠（见图8），分别对体细胞点突变样品进行检测。引物探针序列见表8：

表8

结果显示F1检测突变信号可以提高2倍左右（见表9），在QPCR平台，F1相比于F2的设计，对突变丰度提高也比较明显（见图9、图10）。

表9：核酸质谱平台结果

对比例3：延伸阶段只加入对应的特异性延伸碱基

以常规F1/R引物序列，无block加入，F1/R引物用量相同，经过SAP消化后，延伸阶段设置加入1种特异性延伸碱基或4种延伸碱基，延伸引物序列为SEQ ID NO: 4，完成延伸后，对延伸产物进行核酸质谱分析。相比于加入4种延伸碱基，仅加入1种特异性延伸碱基至少可以提高5倍检测低频丰度。结果见表10。

表10

结果分析：延伸阶段只加入对应的特异性延伸碱基，主要目的就是抑制野生型模板的延伸。延伸阶段只加入对应的特异性延伸碱基，只会特异性的选择突变模板进行延伸，野生型模板由于碱基的不匹配，得不到延伸，从而很好的富集突变丰度，达到提高检测低频突变的目的，该技术还可以明显减少非特异性信号产生，也可以减少背景的干扰。延伸阶段只加入对应的特异性延伸碱基的种类可以是1种、2种或3种；从而引申出以1种突变碱基相同的进行分组的多重体系（加入1种）、以2种突变碱基相同的进行分组的多重体系（加入2种）和以野生型延伸碱基相同的进行分组的多重体系（加入3种碱基）。从灵敏度和特异性两种角度进行评价，1种突变碱基相同的进行分组的多重体系最优；其次是以2种突变碱基相同的进行分组的多重体系；以野生型延伸碱基相同的进行分组的多重体系要逊色一些。

对比例4

以IPLEX PRO检测体系为例，引物用表4的F1/R，延伸引物为非阻遏引物，配制如下反应体系：

表11

PCR扩增程序：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，42个循环；72℃后延伸5 min。

SAP酶消化处理，反应体系如下：

表12

将其加入至第一轮5 μL的反应产物中，共7 μL，进行如下反应：37℃保温40 min；85℃保温5 min；

单碱基延伸反应，配制如下反应体系：

表13

将其加入至上一轮7 μL的反应产物中，共9 μL，进行如下反应：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，52℃退火5 s，80℃延伸5 s，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。

测试的结果单重体系仅能检测到2.5%-10 ng以上的突变，多重体系只能检测到10%-10 ng以上的突变，非常适用于胚系突变或者遗传突变检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.检测体细胞突变的引物探针组，包括上游引物、下游引物、阻遏探针、单碱基延伸引物，其特征在于，所述上游引物的3′端序列与所述阻遏探针的5′端序列相同，其中相同的部分碱基数为8~16；或

所述下游引物3′端部分序列与所述阻遏探针的5′端部分序列相同，其中相同的部分碱基数为8~16。

2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的5′端含有通用序列；

所述通用序列如SEQ ID NO: 6所示。

3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述阻遏探针在序列上与野生型模板完全匹配，仅3′端进行化学修饰，所述化学修饰包括磷酸化修饰。

4.如权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述上游引物与所述下游引物的摩尔比为1:(2~10)；或

所述上游引物与所述下游引物的摩尔比为(2~10):1。

5.如权利要求4所述的引物探针组，其特征在于，所述上游引物的序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID NO: 2所示；

所述阻遏探针的序列如SEQ ID NO: 3所示；

所述单碱基延伸引物的序列如SEQ ID NO: 4所示。

6.如权利要求1至5任一项所述的引物探针组在制备体细胞突变检测试剂或试剂盒中的应用。

7.试剂，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述的引物探针组，以及可接受的辅料或助剂。

8.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7所述的试剂，以及可接受的辅料或助剂。

9.非诊断目的的体细胞突变的检测方法，其特征在于，基于如权利要求1至5任一项所述的引物探针组、如权利要求7所述的试剂或如权利要求8所述的试剂盒检测。

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1）：取待测核酸样品与扩增反应试剂、如权利要求1至5任一项所述的引物探针组的所述上游引物、如权利要求1至5任一项所述的引物探针组的所述下游引物、如权利要求1至5任一项所述的引物探针组的所述阻遏探针混合，进行扩增，获得扩增产物；

步骤（2）：对所述扩增产物进行SAP，获得SAP产物；

步骤（3）：取延伸反应试剂、所述SAP产物与如权利要求1至5任一项所述的引物探针组的单碱基延伸引物混合，进行延伸反应，获得延伸产物；

步骤（4）：取所述延伸产物进行核酸质谱，获得检测结果；

所述延伸反应试剂中仅包含与体细胞突变位点相同的ddNTP或acyNTP。