FR2803601A1 - Utilisation de l'exonuclease iii dans des reactions d'amplification par polymerase de fragments d'adn - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne l'utilisation de l'exonucléase III (de E. coli) dans la mise en oeuvre d'une réaction par polymérase visant à amplifier des fragments d'ADN, de préférence d'au moins 1 millier de bases environ, ainsi que l'application de cette nouvelle utilisation pour détecter des lésions, de type lésions oxydatives dans l'ADN.

Description

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La présente invention a trait à un perfectionnement des méthodes d'amplification par polymérase de fragments d'ADN.

L'utilisation de la réaction de PCR (réaction en chaîne par polymérase), pour amplifier des séquences d'ADN est maintenant très répandue dans le domaine de la génétique moléculaire.

Les réactions de PCR visant à amplifier des fragments d'ADN de plusieurs milliers de paires de bases, désignées PCR longues , posent néanmoins des problèmes, l'intégrité de la matrice d'ADN se révélant critique (Cheng et al, 1994a et 1995). En effet cette matrice d'ADN peut être de mauvaise qualité, et présenter en particulier des cassures de brins ou des lésions (dépurination...) qui bloquent la progression des ADN polymérases (Fromenty et al, 1997). Ces altérations peuvent notamment avoir lieu lors des procédures d'extraction de l'ADN, ou lors de la congélation et décongélation des échantillons d'ADN.

Grâce à Barnes (1994), le problème de l'amplification des longs fragments d'ADN a été partiellement résolu par l'utilisation d'une combinaison d'une grande quantité d'un mutant de Taq polymérase dénuée d'activité exonucléase (Klentaql), avec une très faible quantité d'une ADN polymérase thermostable présentant une activité exonucléasique 3'#5', ou activité de relecture ( proofreading ), polymérase choisie parmi les enzymes Pfu, Vent, ou Deep Vent.

Cheng et al (1994b) ont aussi testé la combinaison des polymérases Vent, Deep Vent, Pfu et rTma avec la rTth polymérase, et se sont aperçus que la combinaison rTth et Vent était la meilleure.

Malgré ces améliorations, les réactions d'amplification par polymérase de longs fragments d'ADN ne donnent pas toujours de bons résultats, en particulier avec des échantillons d'ADN endommagés.

Les auteurs de la présente invention ont maintenant trouvé de manière surprenante que l'exonucléase III avait un effet bénéfique sur ce type d'amplifications.

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L'exonucléase III d'Escherichia coli est surtout connue pour catalyser l'élimination progressive de mononucléotides à partir de l'extrémité 3'OH d'un ADN double brin (activité 3'#5' exonucléase) (Richardson et al, 1964). Cette enzyme possède également des activités de RNase H, 3'-phosphatase, et d'AP-endonucléase (AP, pour Apurinique et Apyrimidinique), décrites notamment dans les articles de Kow, 1989 et Shida et al, 1996.

Conformément à l'invention, on peut utiliser n'importe quelle exonucléase III, purifiée à partir d'Escherichia coli, (telle que par exemple celle fournie par New England Biolabs) ou un homologue de celle-ci. Les homologues de l'exonucléase III de E. coli sont des enzymes qui présentent une certaine identité (certains acides aminés sont les mêmes) ou une similarité de structure (certains acides aminés sont les mêmes ou présentent des analogies physico-chimiques. On parle alors d'acides aminés conservés).

Parmi ces homologues, on peut notamment utiliser une forme modifiée de l'exonucléase III, par exemple une forme modifiée ne présentant plus l'activité exonucléasique 3'#5'. Une telle modification, visant une ou plusieurs bases, peut en particulier être obtenue par mutagénèse dirigée.

De préférence, les homologues utilisables présentent un pourcentage d'identité d'au moins 20 %, et/ou un pourcentage de similarité d'au moins 50 %.

Parmi les homologues d'intérêt, on peut notamment citer les homologues de l'exonucléase III chez d'autres organismes, tels que bactéries, insectes, plante, ou mammifères par exemple.

Sont entre autres connues comme enzymes homologues l'Exo A de Streptococcus pneumoniae, la Rrp1 de Drosophila melanogaster, l'Arp d'Arabidopsis thaliana. On peut encore citer les enzymes homologues de la souris (APEX murine), du rat, du b#uf (BAP1 ou APEX bovine) ou de l'homme (HAP1 ou APEX humaine). Ces enzymes homologues sont répertoriées dans Barzilay et Hickson, 1995 et Reardon et al, 1998.

La présente invention a donc pour objet l'utilisation de l'exonucléase III dans la mise en #uvre d'une réaction d'amplification par polymérase de fragments d'ADN, de préférence d'au moins 1 millier de bases environ.

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L'utilisation de l'exonucléase III s'est avérée particulièrement efficace pour des réactions d'amplification sur des fragments de plus de 5 kb (kilobases).

Les réactions d'amplification par polymérase visées sont de préférence les réactions de PCR, RT-PCR, ou de séquençage.

L'exonucléase III peut être utilisée dans les réactions d'amplification des fragments d'ADN en supplément des polymérases habituelles. Elle peut ainsi être utilisée par exemple en association avec une seule ADN polymérase, telle que la rTth ADN polymérase (Perkin-Elmer), ou avec différentes combinaisons d'ADN polymérases, telles qu'une combinaison des polymérases rTth et Vent (Perkin-Elmer), ou une combinaison des polymérases Taq et Pwo (Roche Molecular Biochemicals).

L'invention a donc également pour objet une méthode d'amplification d'une matrice d'ADN à l'aide d'au moins une polymérase, dans laquelle ladite matrice d'ADN est mise en contact avec une exonucléase III.

De 1 à 75 unités d'exonucléase III peuvent par exemple être utilisées, de préférence au moins 5 unités, de préférence encore de 20 à 50 unités.

Une unité d'exonucléase III est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour produire, en 30 minutes et à 37 C, 1 nmole de mononucléotides à partir d'ADN soniqué. Cette définition est reprise par les différents fournisseurs d'exonucléase III.

Il convient de veiller à utiliser pour l'amplification une quantité suffisamment élevée d'amorces oligonucléotidiques, pour contrebalancer la destruction éventuelle de ces amorces par l'activité exonucléasique 3'-5' de l'exonucléase. Si la concentration en amorces ne peut être augmentée, il est alors avantageux de chauffer préalablement l'enzyme, par exemple pendant une durée de 10 à 30 minutes à une température d'au moins 70 C, par exemple jusqu'à environ 99 C, et/ou de diminuer la quantité d'enzyme utilisée (jusqu'à 1 à 5 unités).

L'effet de l'exonucléase III sur l'amplification des longs fragments d'ADN peut également être mis à profit dans un procédé pour déterminer la

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présence de lésions de l'ADN, par comparaison des produits d'amplification avec ou sans exonucléase III. Il s'agit de détecter et éventuellement de quantifier diverses modifications de structure de l'ADN, telles que des pertes de bases (sites abasiques) des oxydations de bases (hydroxylation par exemple), des pertes de fonction amine (désamination), des alkylations (méthylations), comme décrit dans Lindahl, 1993.

L'invention a donc également pour objet une méthode de détection de lésions sur un fragment d'ADN, de préférence de plus d'un millier de bases, comprenant les étapes consistant à : i) amplifier ledit fragment d'ADN au moyen d'une réaction en chaîne par polymérase (PCR) sans exonucléase III ; ii) amplifier ledit fragment d'ADN au moyen d'une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en présence d'exonucléase III ; iii) comparer par quantification les produits d'amplification obtenus à l'étape (i) et à l'étape (ii), toute différence étant indicatrice de lésions dans le fragment d'ADN.

Cette comparaison peut être mise en #uvre en mesurant grâce à un scanner l'intensité des produits d'amplification obtenus à l'étape (i) et à l'étape (ii). Le nombre de lésions sur le fragment d'ADN étudié peut être évalué alors grâce par exemple à l'équation de Poisson dans laquelle seront introduites les valeurs des intensités des produits PCR obtenus en présence et en absence d'exonucléase III. Cette équation est classiquement utilisée pour évaluer le nombre de lésions sur des fragments d'ADN endommagé (Kalinowski et al, 1992 ; Mansouri et al, 1999).

Selon un mode particulier de réalisation de ce procédé, on peut préalablement mettre en contact l'ADN avec une ADN glycosylase, avant de le soumettre aux étapes d'amplification précitées.

Cette ADN glycosylase, qui reconnaît spécifiquement une ou plusieurs sortes de bases modifiées (Lindahl et Wood, 1999), crée à ces endroits des sites abasiques qui peuvent être ensuite détectés par l'amplification en présence d'exonucléase III.

On peut utiliser une ADN glycosylase d'E. coli telle que l'uracil-ADN glycosylase, commercialisée par Boehringer Mannheim. Celle-ci reconnaît

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spécifiquement au niveau de l'ADN l'uracil provenant de la désamination de la cytosine.

Un tel procédé (avec ou sans intervention d'une ADN glycosylase) peut être particulièrement utile pour évaluer l'effet mutagène de divers agents in vivo ou in vitro.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.

EXEMPLES :
Les exemples décrits plus loin mettent en #uvre les matériels et méthodes suivants :
Matériels et méthodes - Origine et conditions d'utilisation de l'exonucléase III de E. coli :
Dans la plupart des expériences, on a utilisé l'exonucléase III de New England Biolabs, mais certaines expériences étaient menées avec l'exonucléase III de Life Technologies. L'exonucléase III (par exemple entre 25 et 50 unités) a été ajoutée directement au mélange de PCR avec les ADN polymérases. Dans certaines expériences, l'exonucléase III a été chauffée pendant 10 ou 30 minutes à 99 C, ou traitée avec 1 ou 25 mM de CoCI2 pendant 30 minutes à 99 C, avant son addition à la réaction de PCR.

- Isolement de l'ADN total ou de l'ADN mitochondrial (ADNmt) :
L'ADN total a été isolé avec des colonnes Qiagen Genomic-tip 100/G (Qiagen, Hilden Germany) comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1999) ou par une extraction phénol/chloroforme. La résine échangeuse d'anions de Qiagen permet habituellement d'obtenir de plus longs fragments d'ADN (50-100 kb) qu'une extraction phénol/chloroforme (Cheng et al, 1995).

Les échantillons d'ADN extraits par des colonnes Qiagen genomic-tip 100/G sont donc particulièrement appropriés pour des PCR longues (Cheng et al,

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1995 ; Mansouri et al, 1999). Les colonnes Qiagen sont utilisées pour isoler l'ADN total à partir de foie de souris ou l'ADN mitochondrial à partir de mitochondries isolées de foie de rat. Des échantillons d'ADN murin ou humain, isolé par le procédé de phénol/chloroforme sont préparés à partir de foie de souris ou de sang humain (Fromenty et al, 1996b), et stockés à -20 C ou - 80 C pendant plusieurs années. Les échantillons d'ADN de rat extraits par le procédé de phénol/chloroforme ont été récemment préparés pour les expériences présentées ici. Les concentrations d'ADN sont évaluées par une absorption à 260 nm.

- Préparation des échantillons d'ADN abîmés :
Des échantillons d'ADN isolé avec des colonnes Qiagen ont été soumis à des traitements visant à altérer l'ADN. Pour créer des sites AP (Ide et al, 1993), les échantillons d'ADN ont été traités par un tampon de dépurination (100 mM NaCI ; 10 mM sodium citrate, pH 5,0) à 70 C pendant 0, 20,40 ou 60 minutes (préparation d'ADN APO, AP20, AP 40 et AP60 respectivement). Le nombre des sites AP créés augmente linéairement avec le temps (Ide et al, 1993). D'autres échantillons d'ADN ont été soumis à une température élevée (99 C) pendant 30,60, 90,120 ou 150 secondes, ce qui induit des sites AP, des cassures des brins d'ADN et éventuellement d'autres lésions de l'ADN (Barnes, 1994 ; et al, 1995). Dans d'autres expériences, des échantillons d'ADN ont été dénaturés à 99 C pendant 10,15, 20 et 30 minutes. Finalement, certains échantillons d'ADN ont été soumis à des radiations UV (365 nm) pendant 4,5 ou 6 heures, radiations générées par une lampe UV "Rad-Free" (6W, Schleicher et Schuell). Pour éviter l'évaporation, les échantillons d'ADN ont été maintenus dans de la glace. Des radiations en proche UV (300 à 400 nm) produisent des cassures des brins d'ADN, des réticulations ADN-protéine et éventuellement des sites AP (Rosenstein et Ducore, 1983 ; Sammartano et Tuveson, 1983 ; Tyrrell, 1991).

- Expériences de PCR longue :
Les PCR longues sont réalisées avec le système GeneAmp XL PCR (Perkin-Elmer) qui utilisent les ADN polymérases rTth et Vent. Sauf

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indications contraires, ces expériences ont été menées comme précédemment décrit dans Mansouri et al, 1999. D'autres expériences ont été réalisées avec le système ExpandTM Long Template PCR (Roche Molecular Biochemicals) qui utilise les ADN polymérases Taq et Pwo. Ces expériences ont été menées comme précédemment décrits dans Fromenty et al, 1996a et Fromenty et al, 1997, à l'exception de l'albumine de sérum bovin purifiée qui a été omis dans les réactions de PCR. Le tampon 3 contenant des détergents et 2,25 mM de MgCl2 a toujours été utilisé dans les expériences réalisées avec le système ExpandTM Long Template. Certaines expériences de PCR longue ont également été réalisées avec l'ADN polymérase rTth (Perkin Elmer) seule, en utilisant le même mélange de réaction de PCR que pour l'association des ADN polymérases rTth plus Vent.

Toutes les réactions de PCR ont été réalisées dans un volume de 50 l chargé avec de l'huile minérale, en utilisant des tubes de réaction PCR MicroAmp (Perkin-Elmer) et un appareil RoboCycler Gradient 96 PCR (Stratagene). Cet appareil permet d'obtenir des conditions de cycles optimales pour l'amplification par PCR longue (Barnes, 1994).

Quatre protocoles de PCR longue différents ont été mis en #uvre. Le protocole 1a vise à coamplifier un fragment d'ADN court et un fragment d'ADN long à partir du génome mitochondrial de souris pendant la même réaction de PCR, comme précédemment décrit (Mansouri et al, 1999).

Une amorce sens A 5'-CGACAGCTAAGACCCAAACTGGG-3' (nucléotides 470-492 de la séquence d'ADN mitonchondrial de souris (SEQ ID n 1)) (Bibb et al, 1981) et une amorce anti-sens B 5'-CCCATTTCTTCCCATTTCATTGGC- 3' (nucléotides 785-762 (SEQ ID n 2)) ont permis d'amplifier un fragment d'ADN mitochondrial de 316 paires de bases, tandis que l'amorce sens C 5'- TACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAGC-3' (nucléotides 4964-4987 (SEQ ID n 3)) et l'amorce anti-sens D 5'-GGGTGATCTTTGTTTGCGGGT-3' (nucléotides 13599-13579 (SEQ ID n 4)) ont permis d'amplifier un fragment d'ADN mitochondrial de 8636 paires de bases. Ce protocole de PCR longue à quatre amorces était à l'origine destiné à évaluer le nombre de lésions capables de bloquer la progression des ADN polymérase sur une séquence cible d'ADN de mitochondrie de 8636 paires de bases (Mansouri et al ,1999). En effet, des

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lésions aléatoires dans l'ADN sont bien plus susceptibles d'empêcher la progression des ADN polymérases et de décroître l'amplification de la PCR pour des longs fragments d'ADN que pour des courts fragments d'ADN (Mansouri et al, 1999). Dans cette technique, la coamplification des longs fragments et des courts fragments d'ADN mitochondrial est réalisée grâce au déséquilibre dans les quantités d'amorces (c'est-à-dire 14 pmoles pour les amorces A et B, amplifiant le court fragment contre 40 pmoles pour les amorces C et D, amplifiant le long fragment PCR).

Le protocole 1 b diffère du protocole 1a par l'omission des amorces A et B de la réaction de PCR. Dans les deux protocoles (1 a et 1 b) la concentration en Mg2+ est de 1,75 mM et le profil du thermocycleur est une dénaturation initiale à 95 C pendant 2 minutes, 26 cycles à 95 C pendant 45 secondes, 57 C pendant 45 secondes et 68 C pendant 7,5 minutes et une extension finale à 68 C pendant 7 minutes. Lorsque le système ExpandTM Long Template PCR a été utilisé pour amplifier le fragment d'ADN mitochondrial de 8636 paires de bases, l'étape d'extension était de 12 minutes au lieu de 7,5 minutes.

Dans le protocole 1c, des réactions de PCR ont été réalisées avec les amorces A et B seulement, pour amplifier exclusivement le fragment court de 316 paires de bases d'ADN mitochondrial (ADNmt) avec soit l'ADN polymérase rTth seule soit la combinaison des ADN polymérases rTth et Vent.

Les conditions générales des réactions de PCR étaient les mêmes que pour le protocole 1a à l'exception de la quantité des amorces A et B (30-40 pmoles au lieu de 14 pmoles) et la durée de l'étape d'extension à 68 C était en outre de 1 minute au lieu de 7,5 minutes. Toutes les expériences de courte PCR ont été effectuées avec l'exonucléase III préchauffée 10 minutes à 99 C avant son addition dans la réaction de PCR.

Le protocole 2 a été établi pour amplifier le génome mitochondrial de rat pratiquement dans son entier. L'amorce sens 5'- CACGATAGCTAAGACCCAAACTGG-3' (nucléotides 469-492 de la séquence d'ADNmt de rat (SEQ ID n 5)) (Gadaleta et al, 1989) et l'amorce anti-sens 5'- CACCACAGTTATGTTGGTCATGGG-3' (nucléotides 15879-15856 (SEQ ID n 6)) ont été utilisées pour amplifier un fragment d'ADNmt de 15411 paires de

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bases (c'est-à-dire 15,4 kb). Sauf indications contraires, la quantité des amorces était de 20 pmoles et la concentration en Mg2+ était de 1,5 mM. Le profil du thermocycleur pour le protocole 2 inclut une dénaturation initiale à 95 C pendant 2 minutes, 26 cycles à 95 C pendant 45 secondes, 58 C pendant 45 secondes et 68 C pendant 20 minutes, et une extension finale à 68 C pendant 7 minutes.

Le protocole 3 était destiné à amplifier un fragment de 5 kb à partir du gène nucléaire humain CYP2D6 comme décrit précédemment (Johansson et al, 1996). L'amorce sens était 5'- CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3' (SEQ ID n 7) et l'amorce antisens était 5'-ACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA-3 (SEQ ID n 8). La quantité d'amorces était de 40 pmoles et la concentration en Mg2+ était de 1,5 mM, sauf pour certaines expériences réalisées avec une concentration de 1,0 mM de Mg2+, Le profil de thermocycleur du protocole 3 inclut une dénaturation initiale à 95 C pendant 2 minutes, 35 cycles à 95 C pendant 45 secondes, 63 C pendant 45 secondes et 68 C pendant 7,5 minutes, et une extension finale à 68 C pendant 7 minutes. Ces conditions de cycles thermiques ont été maintenues lorsque un système ExpandTM Long Template PCR a été utilisé à la place du système GeneAmp XL PCR.

Les produits PCR (22 NI) ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose (0,7-1,2 %) coloré avec du bromure d'éthidium. La quantité de produits PCR a été déterminée comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1999).

- Hybridation Southern Blot :
Pour évaluer la dégradation de l'ADN, des échantillons d'ADN total de souris ont été chauffés à 99 C pendant 30 secondes à 5 minutes et l'hybridation Southern Blot a été réalisée comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1999). Brièvement, des échantillons d'ADN chauffés et non chauffés (2 à 5 g) ont été déposés sur des gels d'agarose à 0,7 % sans bromure d'éthidium. L'ADN a été soumis à une électrophorèse toute une nuit à un voltage de 2,5 V/cm, transféré sur une membrane de nylon Hybond-N+, et hybridé avec une sonde d'ADNmt de souris de 8,6 kb synthétisée par PCR

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longue. Les différentes formes du génome mitochondrial de souris (superenroulé, circulaire ou linéaire de pleine longueur) ont été quantifiées par une densitométrie des autoradiographies comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1999). Les membranes ont été déshybridées et réhybridées avec une sonde d'ADN nucléaire de souris Cot-1 (Life Technologies). L'ADN de haut poids moléculaire détecté avec cette sonde a été quantifié par densitométrie des autoradiographies comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1999).

- Séquençage de l'ADN et analyse RFLP des produits de PCR :
Le séquençage de l'ADN des produits de PCR a été effectué par le système Big Dye Terminators (Applied Biosystems), comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1997). Le fragment d'ADNmt de 8636 paires de bases amplifié avec le protocole 1b a été soumis à un séquençage d'ADN avec les amorces C ou D, ou des amorces sens et antisens (nucléotides 7241-7261 ou nucléotides 13179-13159 respectivement, sur la séquence ADNmt de souris).

Pour une analyse RFLP, les produits de PCR obtenus avec le protocole 1a ont été digérés avec des enzymes de restriction EcoRV et BspMI, et les produits ont été visualisés sur un gel d'agarose à 3 % MetaPhore@ (FMC BioProducts). Les enzymes EcoRV et BspMl qui ont des sites de restriction en positions nucléotidiques 5376 et 12936 sur la séquence d'ADNmt de souris, respectivement (Bibb et al, 1981) coupent le produit de PCR longue d'ADNmt de 8636 paires de bases à proximité de chaque extrémité, générant ainsi de courts fragments de 404 paires de bases et de 664 paires de bases, respectivement, avec les fragments plus larges associés.

EXEMPLE 1 : L'exonucléase III favorise l'amplification par PCR longue d'échantillons d'ADN dénaturés à la chaleur : * La chaleur induit de sites AP et des cassures dans les brins d'ADN (Barnes, 1994 ; et al, 1995). Pour évaluer l'effet de la chaleur sur l'ADN, de l'ADN total de foie de souris a été chauffé à 99 C pendant des

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durées variées, et des expériences de Southern Blot ont été réalisées d'abord avec une sonde d'ADNmt puis avec une sonde d'ADN nucléaire (ADN de souris Cot-1). La quantification des formes non altérées du génome mitochondrial et de l'ADN nucléaire à haut poids moléculaire a permis aux auteurs de la présente invention d'évaluer la perte d'ADN mitochondrial ou d'ADN nucléaire. Après 30 secondes, 60 secondes, 90 secondes et 150 secondes d'altération de l'ADN induite par le chauffage, 11,32, 64 et 96 % de l'ADN mitochondrial était perdu, tandis que la perte de l'ADN nucléaire à haut poids moléculaire était de 23,82, 95 et 99 % respectivement.

Des échantillons d'ADN dénaturés à la chaleur ont donc été utilisés pour évaluer l'effet de l'exonucléase III sur l'amplification par PCR longue de matrice d'ADN altérée de manière croissante. Des échantillons d'ADN de foie de souris ont été chauffés à 99 C pendant 30 à 120 secondes et soumis au protocole 1a de PCR longue pour coamplifier un fragment d'ADN mitochondrial de 8636 paires de bases et un fragment d'ADN mitochondrial de 316 paires de bases. En l'absence d'exonucléase III, l'amplification du produit de 8636 paires de bases a progressivement décru avec les matrices d'ADN chauffées à 30,60, 90 ou 120 secondes. En revanche, lorsque l'exonucléase III (25 unités) a été ajoutée au mélange de PCR, on a observé une augmentation frappante du rendement des produits de PCR longue. A noter qu'avec l'échantillon d'ADN chauffé à 99 C pendant 120 secondes, l'exonucléase III a restauré une amplification significative du produit de PCR de 8636 paires de bases, tandis que cet échantillon d'ADN n'était pas amplifié de manière détectable en l'absence d'exonucléase III. Toutefois, tandis que le rendement de fragment long de PCR a été augmenté par l'exonucléase III, les auteurs de l'invention ont noté la disparition du fragment d'ADN court (316 paires de bases) dans les produits de PCR lorsque 25 unités d'exonucléase III ont été utilisées. Puisque l'exonucléase III est capable d'éliminer les mononucléotides à partir de l'extrémité 3' (activité exonucléase 3'->5'), l'hypothèse a été émise que cette enzyme pouvait détruire une quantité significative des amorces A et B expliquant ainsi la disparition du fragment court. En effet, les amorces A et B sont utilisées en quantités environ trois fois

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moindres que les amorces C et D dans ce protocole de coamplification (cf Matériels et méthodes et article de Mansouri et al, 1999).

Les auteurs de la présente invention ont donc tenté de diminuer ou d'inhiber l'activité exonucléasique 3' -5' de l'exonucléase III, en diminuant la concentration d'exonucléase (Henner et al, 1983 ; Shida et al, 1996) ou en préchauffant l'enzyme (Richardson et al, 1964 ; Weiss, 1981) avant l'expérience de longue PCR. La diminution de la concentration en exonucléase III jusqu'à 5 unités a restauré l'amplification du fragment d'ADN de 316 paires de bases tout en maintenant l'effet d'augmentation du rendement du produit de PCR de 8636 paires de bases. Toutefois, le rendement en fragment d'ADNmt de 8636 paires de bases était légèrement moindre avec seulement une unité d'exonucléase III ou avec l'exonucléase III préchauffé (99 C pendant 10 minutes) par rapport aux résultats obtenus avec 5 ou 25 unités d'exonucléase III.

Des expériences complémentaires avec les protocoles 1b, 2 et 3 de PCR longue ont confirmé que la quantité d'amorces oligonucléotidiques doit être suffisamment élevée pour contrebalancer la destruction éventuelle des amorces par l'activité exonucléasique 3'-5' de l'exonucléase III. Dans le cas présent, un minimum de 20 pmoles d'amorces dans la réaction de PCR longue a été nécessaire pour bénéficier de l'effet de l'exonucléase III sur l'amplification en PCR longue des matrices altérées, et cette concentration en amorces pourra être modifiée pour d'autres protocoles.

A noter que pour des protocoles de PCR pour lesquels la concentration en amorces ne pourra être augmentée (par exemple amorces A et B dans le protocole la) une solution satisfaisante est de préchauffer l'exonucléase III avant son addition dans la réaction de PCR longue.

Afin d'évaluer quantitativement l'effet bénéfique de l'effet exonucléase II sur l'amplification de longue PCR en relation avec l'intensité de l'altération de l'ADNmt, des fractions aliquotes d'échantillons d'ADN de foie de souris ont été chauffées à 99 C pendant 0,30, 60 et 90 secondes et utilisées pour quantifier l'ADN mitochondrial résiduel par hybridation de Southem Blot et pour amplifier le fragment d'ADNmt de 8636 paires de bases en utilisant le protocole 1 b avec ou sans 25 unités d'exonucléase III. L'exonucléase III a

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augmenté le rendement du produit de PCR de 8636 paires de bases de 2,4 ; 4,2 ; et 5,5 fois, lorsque le pourcentage de perte d'ADN mitochondrial était de 11,32 et 64 % respectivement. L'exonucléase III a également permis une augmentation de 1,4 fois du rendement du produit de PCR longue à partir d'échantillon d'ADN de foie de souris non chauffé, reflétant la présence inévitable d'une certaine altération de l'ADN même dans les échantillons d'ADN les plus soigneusement préparés.

# Afin d'étendre ces observations à d'autres amorces oligonucléotidiques, ou à de l'ADN mitochondrial d'autres espèces animales et à de l'ADN nucléaire, des expériences complémentaires ont été réalisées.

Les auteurs de la présente invention ont d'abord évalué l'effet de l'exonucléase III sur l'amplification d'un fragment d'ADNmt de 15,4 kb en utilisant le protocole 2 et des échantillons d'ADNmt de foie de rat dénaturés à la chaleur, comme matrices altérées.

L'exonucléase III (25 unités) augmente significativement l'amplification du fragment de 15,4 kb pour l'échantillon d'ADNmt chauffé à 99 C pendant 30 secondes et de manière encore plus frappante a permis une amplification de ce fragment pour les échantillons d'ADN chauffés pendant 60 secondes ou pendant 90 secondes.

Structurellement, l'ADNmt de mammifère est un ADN particulier puisqu'il s'agit d'un petit ADN circulaire (environ 16 kb chez les mammifères).

Les auteurs de l'invention se sont donc demandés si l'effet bénéfique de l'exonucléase III pouvait également être observé pour une amplification par PCR longue sur des cibles altérées localisées sur le génome nucléaire. Avec des échantillons d'ADN de sang humain dénaturés à la chaleur pendant 30 secondes ou 60 secondes, l'exonucléase III (50 unités) a augmenté le rendement en produit de PCR (5kb) obtenu à partir du gène nucléaire humain CYP2D6.

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EXEMPLE 2 : L'exonucléase III de E. coli favorise l'amplification par PCR longue de matrices d'ADN dépurinées
Puisque l'exonucléase III de E. coli est une AP endonucléase (Weiss, 1981 ; Shida et al, 1996), les auteurs de l'invention ont évalué sa capacité à augmenter l'amplification de PCR longue avec des échantillons d'ADN de foie de souris dépuriné. Les sites AP ont été créés comme décrit dans la partie "Matériels et méthodes" ci-dessus, et le protocole 1 b de PCR longue a été utilisé pour amplifier le fragment d'ADNmt de 8636 paires de bases. Tandis qu'en l'absence de l'exonucléase III, l'amplification a progressivement décru en fonction des échantillons d'ADN de plus en plus dépurinés, l'exonucléase III (25 unités) a restauré une amplification normale ou satisfaisante, même avec l'échantillon d'ADN le plus dépuriné (AP 60). Cet effet bénéfique a été reproduit dans sept séries d'expérience, et en moyenne, l'exonucléase III a augmenté de 25,30, 66 et 88 % le rendement du produit de 8636 paires de bases avec les préparations dépurinées APO, AP20, AP40 et AP60, respectivement.

Pour vérifier la nature des produits de PCR de 8636 paires de bases amplifiés en présence d'exonucléase III, certains produits de PCR obtenus à partir de l'amplification d'échantillons d'ADN dépurinés (à savoir AP 40) ont été séquences. Les résultats indiquent que les séquences de quatre régions différentes de ces produits de PCR (représentant un total de 2053 paires de bases séquencées) s'apparient avec la séquence d'ADNmt de souris rapportée par Bibb et al, 1981, à l'exception de quelques bases. Cependant, le nombre de bases ne correspondant pas à la séquence de référence n'est pas plus élevé que le nombre d'erreurs trouvées dans les séquences obtenues à partir des échantillons d'ADN dépuriné (AP40) amplifié sans exonucléase III (représentant un total de 1449 paires de bases séquencées). En effet, lorsque les amplifications de PCR longue ont été effectuées avec ou sans exonucléase III, les fréquences d'erreurs étaient d'une erreur pour 205 bases et d'une erreur pour 145 bases respectivement. Finalement, la fréquence d'erreur est de 1 erreur pour 134 bases lorsque l'amplification de PCR longue est réalisée sans exonucléase III et avec un échantillon d'ADN non altéré. Les différences entre les séquences d'ADNmt obtenues entre cette expérience et la référence de

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cette séquence d'ADNmt de souris (Bibb et al, 1981) sont vraisemblablement dues à des erreurs introduites lors du séquençage de l'ADN.

Les auteurs de l'invention ont également réalisé une analyse RFLP sur les produits de l'ADNmt de 8636 paires de bases après amplification des échantillons d'ADN dépuriné (AP40) avec ou sans exonucléase III. Deux enzymes de restriction, à savoir EcoRV et BspMl, coupaient le produit de PCR de 8636 paires de bases à proximité de chaque extrémité, générant de petits fragments d'ADN de 404 paires de bases et 664 paires de bases respectivement. Ces fragments n'étaient pas raccourcis de manière détectable par l'exonucléase III indiquant que son activité exonucléasique 3'-5' ne coupe pas de façon détectable les extrémités du produit de PCR longue.

EXEMPLE 3 : L'exonucléase III augmente l'amplification par PCR longue d'échantillons d'ADN extraits au phénol
Les auteurs de l'invention ont également évalué si l'exonucléase III pouvait augmenter l'amplification de PCR longue avec des matrices d'ADN qui ont été involontairement endommagées lors de l'isolement et/ou du stockage. Il a été utilisé des échantillons d'ADN humain, de rat ou de souris extraits au phénol/chloroforme et, soit conservés à -20 C ou -80 C pendant plusieurs années (ADN humain ou murin), soit récemment préparés (ADN de rat). L'ADN de foie de souris, l'ADN de foie de rat ou l'ADN de sang humain ont été soumis aux protocoles 1 a. 2 ou 3 respectivement sans exonucléase III et les échantillons d'ADN qui donnaient peu ou pas de produits de PCR longue ont été sélectionnés (échantillons d'ADN présupposés altérés). L'exonucléase III a augmenté de manière frappante, l'amplification du fragment de l'ADNmt de 8636 paires de bases, des échantillons d'ADN de souris, l'amplification du génome mitochondrial de rat pratiquement dans son entier (15,4 kb) et le produit CYP2D6 nucléaire de 5 kb d'ADN humain. Il est à noter qu'une amélioration de l'amplification par PCR longue de ce dernier produit a également été observée lorsque la concentration en Mg2+ a été diminuée de 1,5 mM à 1 mM, indiquant que l'effet bénéfique de l'exonucléase III apparaît sur une large gamme de concentrations en Mg2+.

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EXEMPLE 4 : L'exonucléase III améliore l'amplification par PCR longue d'échantillons d'ADN irradiés aux rayonnements UV
Puisque l'exonucléase III peut réparer les lésions de l'ADN induites par les proches UV (Sammartano et Tuveson, 1983), les auteurs de l'invention ont évalué l'effet de l'exonucléase III sur l'amplification de PCR longue des fragments d'ADNmt de 8636 paire de bases avec des échantillons d'ADN de foie de souris soumis à des radiations de proche UV (365 nm). Là encore, l'exonucléase III a augmenté le rendement en produit de 8636 paires de bases alors qu'il n'y avait peu ou pas d'amplification en son absence.

EXEMPLE 5 : L'amélioration de l'amplification par PCR longue exercée par l'exonucléase III est largement résistante à une dénaturation de l'enzyme induite par la chaleur mais est détruite par 25 mM de CoCl2:
Dans une série d'expériences, les auteurs de l'invention ont cherché à inhiber l'effet bénéfique de l'exonucléase III sur l'amplification de la PCR longue des matrices d'ADN dépurinées (AP40). Préchauffer l'enzyme à 99 C pendant 30 minutes avant son addition à la réaction de PCR a échoué, indiquant que l'activité impliquée est thermostable. Une étude précédente indiquait que l'activité de réparation thermostable de l'exonucléase III était spécifiquement inhibée par une incubation prolongée de l'enzyme avec du CoCl2 (Bernelot-Moens et Demple, 1989). Les auteurs de l'invention ont donc préchauffé l'enzyme à 99 C pendant 30 minutes en présence de 1 ou 25 mM de CoCl2. Tandis que 1 mM de CoCl2 ont diminué légèrement l'amélioration de PCR longue exercée par l'exonucléase III, 25 mM de CoCl2 ont supprimé totalement celle-ci et l'amplification devenait alors similaire à celle observée sans exonucléase III.

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EXEMPLE 6 : L'exonucléase III améliore également l'amplification par PCR longue avec la polymérase rTth comme ADN polymérase unique
Le système PCR GeneAmp XL (Perkin-Elmer) qui a été utilisé dans les expériences décrites précédemment est basé sur la combinaison de deux ADN polymérases, à savoir les ADN polymérases rTth et Vent. L'ADN polymérase Vent a une activité exonucléase 3'-5' (de relecture ou "proofreading"), qui apparaît essentielle pour une amplification efficace des cibles d'ADN longue. Les auteurs de la présente invention se sont demandés si l'exonucléase III pouvait améliorer la PCR effectuée avec l'ADN polymérase rTth seule, sans l'ADN polymérase Vent. Une amélioration croissante du rendement d'amplification du fragment de 8 636 paires de bases de l'ADNmt de souris a été observée lorsque l'on utilise (1) la rTth polymérase, (2) la rTth polymérase et l'exonucléase III, (3) la rTth polymérase et la Vent polymérase et enfin (4) ces deux ADN polymérase et l'exonucléase III.

EXEMPLE 7 : L'effet bénéfique de l'exonucléase III sur la PCR longue a été observé avec une autre combinaison d'ADN polymérase et cet effet est similaire lorsque l'exonucléase III provient de deux fournisseurs différents :
Des systèmes de PCR longue autres que le système PCR GeneAmp XL (Perkin-Elmer) sont disponibles. L'effet de l'exonucléase III sur l'amplification de la PCR longue réalisée par le système ExpandTM Long Template PCR (Roche Molecular Biochemicals), qui combine les polymérases Taq et Pwo a été évalué. Le protocole 1 b a été mis en #uvre avec différents types de matrices d'ADN de foie de souris altéré. L'exonucléase III (25 unités) a augmenté l'amplification à la fois des matrices d'ADN dépurinées (AP40) et des échantillons d'ADN extraits au phénol et conservés depuis plusieurs années. Les résultats obtenus sont similaires avec l'exonucléase III de New England Biolabs et de Life Technologies. Finalement, avec le système Expand Long Template PCR et le protocole 3 de PCR longue, l'exonucléase III a

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également permis l'amplification d'un fragment de PCR de 5 kb obtenu à partir du gène nucléaire CYP2D6 humain lorsqu'il était utilisé soit des échantillons d'ADN sanguin dénaturé à la chaleur, soit des échantillons d'ADN extraits au phénol et conservés depuis plusieurs années.

EXEMPLE 8 : Une autre AP-endonucléase de E. coli, l'endonucléase IV a peu d'effet sur l'amplification par PCR longue de matrices d'ADN altérées
Enfin, les auteurs de la présente invention ont également évalué l'effet de l'endonucléase IV, une autre AP-endonucléase majeure de E. coli, sur amplification par PCR longue de matrices d'ADN altérées. Dans ces expériences, l'endonucléase IV a été soit préincubée avec des échantillons d'ADN pendant 30 minutes à 37 C dans un tampon approprié, soit directement ajoutée à la réaction de PCR. Contrairement aux résultats obtenus avec l'exonucléase III, aucun effet bénéfique reproductible de l'endonucléase IV sur la PCR longue n'a pu être observé pour un échantillon donné d'ADN.

CONCLUSION :
Les expériences ci-dessus montrent que l'exonucléase III de E. coli améliorent de manière surprenante l'amplification par PCR de longs fragments d'ADN plus ou moins endommagés. Cet effet bénéfique semble augmenter de manière proportionnelle à l'altération de l'ADN. Cet effet peut être observé soit avec des échantillons d'ADN soumis à différents traitements connus pour induire des sites AP et/ou des cassures des brins d'ADN (pH bas, chaleur, radiation dans le proche UV) soit avec des échantillons d'ADN conservés sur une longue durée. L'exonucléase III augmente l'amplification par PCR de séquences d'ADN de longueurs variables (5 à 15,4 kb) localisées dans le génome mitochondrial ou le génome nucléaire de différentes espèces animales. En outre, l'exonucléase III est efficace soit en association avec une ADN polymérase unique (à savoir l'ADN polymérase rTth) soit avec différentes combinaisons d'ADN polymérases (à savoir rTth +

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Vent ou Taq + Pwo). II est aussi intéressant de noter que l'exonucléase III est efficace dans une large gamme de concentrations de Mg2+ (c'est-à-dire de 1,0 à 1,75 mM avec le système PCR GeneAmp XL et 2,25 mM avec le système PCR ExpandTM Long Template). L'ensemble de ces données montre que l'exonucléase III peut être utilisée dans diverses conditions d'amplification par PCR de longs fragments d'ADN.

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REFERENCES
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Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'une exonucléase III dans la mise en #uvre d'une réaction d'amplification par polymérase de fragments d'ADN, de préférence d'au moins 1 millier de bases environ.

2. Méthode d'amplification d'une matrice d'ADN à l'aide d'au moins une polymérase, dans laquelle ladite matrice d'ADN est mise en contact avec une exonucléase III.

3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle l'amplification est une réaction en chaîne par polymérase (PCR).

4. Méthode selon l'une des revendications 2 ou 3, dans laquelle la matrice d'ADN contient au moins un millier de bases environ à amplifier.

5. Méthode selon l'une des revendications 2 à 4, dans laquelle l'exonucléase III est préchauffée à au moins 70 C avant d'être mise en contact avec la matrice d'ADN.

6. Méthode selon l'une des revendications 2 à 5, dans laquelle l'exonucléase III est associée avec une seule ADN polymérase, telle que la rTth ADN polymérase.

7. Méthode selon l'une des revendications 2 à 5, dans laquelle l'exonucléase III est associée avec une combinaison de différentes

ADN polymérases, telles qu'une combinaison des polymérases rTth et

Vent, ou une combinaison des polymérases Taq et Pwo.

8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle de 1 à 75 unités d'exonucléase III sont utilisées.

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9. Méthode de détection de lésions sur un fragment d'ADN, de préférence de plus d'un millier de bases environ, comprenant les étapes consistant à : i) amplifier ledit fragment d'ADN au moyen d'une réaction en chaîne par polymérase (PCR) sans exonucléase III ; ii) amplifier ledit fragment d'ADN au moyen d'une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en présence d'exonucléase ]Il ; iii) comparer par quantification les produits d'amplification obtenus à l'étape (i) et à l'étape (ii), toute différence étant indicatrice de lésions dans le fragment d'ADN.

10. Méthode selon la revendication 9, comprenant préalablement aux étapes (i) à (iii), la mise en contact du fragment d'ADN avec une ADN glycosylase.