JPH08266298A

JPH08266298A - 核酸を増幅するための方法及びキット並びにｐｃｒ用組成物

Info

Publication number: JPH08266298A
Application number: JP8020082A
Authority: JP
Inventors: John W H Sutherland; ウィリアムヘンダーソンサザーランドジョン; David Robert Patterson; ロバートパターソンデビッド
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1995-02-07
Filing date: 1996-02-06
Publication date: 1996-10-15
Also published as: ATE201452T1; EP0726324B1; FI960540A; US5985619A; PT726324E; FI960540A0; DE69612885D1; DK0726324T3; EP0726324A3; EP0726324A2; CA2168712A1; DE69612885T2; NO960484L; ES2156978T3; SI0726324T1; GR3036391T3; NO960484D0; AU4339196A; AU709788B2; KR960031627A

Abstract

(57)【要約】【課題】標的核酸の増幅効率を向上させること。【解決手段】ＰＣＲ反応混合物に、重合剤に特異的な
少なくとも１種の抗体と、エキソヌクレアーゼ及びグリ
コシラーゼの少なくとも一方とを含有させることにより
標的核酸を増幅させる方法及びキット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によって少量の標的核酸の増幅、検出が可能にな
る。実際のＰＣＲを制限するものとして、非特異的副産
物、特にプライマーのダイマーやさらにプライマーのテ
トラマーといった次元の高いオリゴマーが生じて増幅さ
れることが挙げられる。本発明は、このような制限を克
服し、ＰＣＲの精度と感度を高めるための組成物及び方
法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＰＣＲの技術によって、微量の標的核酸
を増幅した後に検出することができる。ＰＣＲの詳細に
ついては、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号
（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕ
ｌｌｉｓ）及び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉ
ｓら）の記載をはじめとし、当該技術分野では周知であ
る。一般に、標的核酸の変性鎖にオリゴヌクレオチドプ
ライマーをアニールし、ポリメラーゼによってデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェートを重合させてプライマー
伸長生成物を形成させる。典型的なＰＣＲ法では、鋳型
核酸を変性させ、プライマーをアニーリングし、そして
そのアニール後のプライマーを耐熱性ポリメラーゼの作
用により伸長させるサイクルを繰り返す。この方法によ
り、標的核酸は指数的に増幅することになり、試料中に
極微量に存在する標的の検出が可能になる。

【０００３】ＰＣＲ法は、生物工学研究、臨床診断及び
法律をはじめとする様々な分野において広く用いられて
いる。しかしながら、この方法論は、最適とはならない
効率及び特異性をもたらす実際上の制限を免れることが
できない。具体的には、ＰＣＲ実験の最初のサイクルが
開始される前に（すなわち、「零サイクル」におい
て）、増幅用試薬を室温以下で混合して保存しておくこ
とが典型的である。耐熱性ポリメラーゼ、例えばサーマ
ス・アクアティクス（thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）
ポリメラーゼは、０℃においても活性が残存しているた
め、ストリンジェンシー(stringency)の低いプライミン
グ及び複製によって比較的多量の非特異的産物が生成し
うる。この非特異的産物は、零サイクルアーチファクト
として知られているが、３’末端に相同性を有するプラ
イマーの結合によって形成されるプライマー−ダイマー
（二量体）を含む。極微量である場合が多い標的の濃度
に対し、ＰＣＲで用いられるプライマーの濃度はマイク
ロモルレベルにあるため、プライマー−ダイマーの生成
が優勢となる。このため、プライマー−ダイマーは特に
一般的な零サイクルアーチファクトである。他のプライ
マー系増幅法、例えば、固相増幅法でも、同様にプライ
マー−ダイマーアーチファクトの問題がある。

【０００４】増幅の際の零サイクルアーチファクトの形
成は実際上重要な問題である。プライマーやデオキシリ
ボヌクレオシドをはじめとする試薬は消耗する恐れがあ
り、また非特異的副産物は、ポリメラーゼの標的やその
他反応の限定成分に対して競争的インヒビターとして作
用する。その結果、増幅効率は低下し、またアッセイの
精度も低下する場合がある。増幅効率の低下はアッセイ
の検出限界に悪影響を及ぼし、潜在的に偽陰性の結果を
もたらす恐れがある。本発明により例示されるように、
プライマー−ダイマーの形成によって、標的増幅の効率
が、着色ゲル上で増幅生成物が検出できなくなるほど低
下する場合もある。このような結果は、ＨＩＶのような
病原性生物の検査には明らかに望ましくないものであ
る。

【０００５】均一系のＰＣＲ反応では特異性が特に重要
である。例えば、欧州特許出願公開第４８７２１８号
（Ｍｉｔｏｍａ）及び同第５１２３３４号（Ｈｉｇｕｃ
ｈｉ）を参照されたい。均一系アッセイでは、増幅中又
は増幅後の反応混合物を、二本鎖核酸との反応により検
出可能な蛍光変化を起こす蛍光顔料と接触させることに
より、ＰＣＲの増幅と検出は組み合わせられる。例え
ば、ＰＣＲをエチジウムブロミドの存在下で実施する場
合、二本鎖ＤＮＡの生成量は、遊離のエチジウムブロミ
ドが二本鎖ＤＮＡに挿入されるにつれ増加する蛍光量と
相関する。一般に、増幅工程と検出工程は同一容器の中
で行われる。蛍光変化は分光測定法で検出されるので、
検出にはＰＣＲ生成物の分離もハイブリダイゼーション
も必要がない。検出は、一般に二本鎖ＤＮＡの形成に基
づき、また標的ＤＮＡと非特異的産物を区別することが
できないため、プライマー−ダイマーのような二本鎖ア
ーチファクトの形成は、均一系アッセイの特異性にとっ
て致命的な問題である。

【０００６】ＰＣＲの特異性を高めるための方法がいろ
いろと開発されている。理論的には、３’−相同性を含
まないプライマーを選ぶことによってプライマー−ダイ
マーのアーチファクトは回避することができる。しかし
実際には、特にプライマーの混合物を必要とする用途で
は、多少の３’−相同性は避けられないことがある。標
的対象の複数種の菌株又はアレルを同時増幅する場合
は、多数のプライマーを必要とする典型的な用途であ
る。

【０００７】特異性は、ストリンジェンシーを増大する
ことによっても、例えば、アニーリング温度を高くする
又は変性溶剤を含有させることによっても改良すること
ができる。しかしながら、ストリンジェンシーの増大
は、比較的低いストリンジェンシーで増幅された恐れの
ある標的の突然変異形を検出することができるアッセイ
の能力が低下するので、偽陰性の結果をもたらす場合が
ある。

【０００８】零サイクルアーチファクトを減少させる別
の方法、いわゆる「ホットスタート法」は、ポリメラー
ゼを高温の試薬混合物へ添加することによって反応を開
始させるものである。〔例えば、ＥｒｌｉｃｈらのＳｃ
ｉｅｎｃｅ２５２：１６４３（１９９１）を参照され
たい。〕プライマーの交差反応によって生じる反応性中
間体は熱的に不安定であるため、プライマー−ダイマー
が減少する。しかしながら、この方法では、便利な室温
で調製することができず、またポリメラーゼを多数（典
型的には９６本）のＰＣＲ用チューブに手作業で添加す
ることによる時間的誤差が原因で複雑にならざるをえな
い。ストリンジェンシーの高いプライミングに適した温
度に達するまで、一種以上のＰＣＲ成分を他の成分から
物理的に分離しておくために、パラフィンビーズやオー
バーレイなどの熱的に不安定な物理的遮蔽物が用いられ
ている〔例えば、Ｈｅｂｅｒｔら、（１９９３）Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｂｅ
ｓ、７：２４９を参照されたい〕。しかしながら、これ
らの方法は一般に不便であり、また手先の器用さがかな
り必要である。

【０００９】零サイクルアーチファクトを抑制するため
に、Ｔａｑポリメラーゼに対する熱的に不安定な抗体を
使用して低温におけるＴａｑポリメラーゼを阻害する方
法がある。〔例えば、Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９４年、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：５０６；米国特
許第５，３３８，６７１号明細書（Ｓｃａｌｉｃｅら）
を参照されたい。〕ＰＣＲの熱サイクルにおいて温度を
上昇させた時に、該抗体は熱変性を受けて、活性なポリ
メラーゼが解放される。しかしながら、アビッド(avid)
な抗体であってもポリメラーゼ活性を完全に阻害するこ
とはない。例えば、１００μｌの体積中１０ナノモルの
濃度にあるポリメラーゼに対して作用する親和力が１０
¹⁰Ｍ^-1である１マイクロモルの抗体は、平衡状態におい
て６千万個の活性ポリメラーゼ分子を遊離させるであろ
う。ＰＣＲに用いられるプライマー量は比較的多量であ
るため、依然として相当数のプライマー−ダイマー中間
体が形成されて増幅される恐れがある。その結果、さら
には本発明により例示されるように、特に、該プライマ
ーの３’相同性が実質的である場合や、その相同性が強
力なＧ−Ｃ結合から成る場合には、抗Ｔａｑ抗体単独で
はプライマー−ダイマーの形成を十分に抑制することは
できない。

【００１０】副産物を抑制するためにプライマー−ダイ
マー中間体を消化することができる酵素を使用する方法
も開示されている。Ｚｈｕら（１９９１年、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：２５１）は、「予備
ＰＣＲ滅菌」にエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩ
ＩＩ）を使用して、アンプリコン(amplicon)及びプライ
マー−ダイマーのキャリオーバーを減少させる方法につ
いて報告している。しかしながら、ＥｘｏＩＩＩは、
二本鎖ＤＮＡの３’ヒドロキシル末端からの５’モノヌ
クレオチドの逐次切断を触媒するため、標的ＤＮＡをも
攻撃することがある。さらにＺｈｕらは、ＥｘｏＩＩ
Ｉが一本鎖ＤＮＡを切断分解することはないため、一本
鎖プライマー−ダイマーはＥｘｏＩＩＩの処理を免れ
ることで、増幅を受けやすくなることが予想できると報
告している。Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒら（１９９２年、Ｇ
ｅｎｅ１１７：１０７）は、Ｔ７エキソヌクレアーゼ
を使用してキャリオーバーＰＣＲ生成物分子の増幅を減
少させる方法について報告している。汚染性のＰＣＲ分
子は、ゲノム標的分子に関して対称的な幾何形状により
選択的に不活性化される。Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒらは、
プライマー−ダイマー生成物を減少させてはおらず、そ
してプライマー−ダイマーの幾何形状については確立さ
れていないと記述している。

【００１１】さらに、酵素ウラシル−Ｎ−グリコシラー
ゼ（ＵＮＧ）を予備増幅工程で使用し、零サイクル中に
生じた産物を内部のウラシル残基で切断する方法もあ
る。〔例えば、Ｌｏｎｇｏら、１９９０年、Ｇｅｎｅ
９３：１２５；Ｅｓｐｙら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：２３６１を参照された
い。〕ＰＣＲにおいてデオキシチミジントリホスフェー
ト（ｄＴＴＰ）の代わりにデオキシウリジントリホスフ
ェート（ｄＵＴＰ）を使用すると、ＰＣＲ生成物を鋳型
ＤＮＡと区別することができる。その予備混合物に酵素
ＵＮＧを含めると、第一回目のＰＣＲサイクルの前に反
応系に存在する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡからのウラシル
の切除が触媒される。その結果生じた非塩基性(abasic)
ポリヌクレオチドは加水分解を受けやすく、ＰＣＲの際
に鋳型として機能することができない。ＵＮＧは熱変性
により不活性化されると報告されているが、残存した活
性によって、ＰＣＲで合成された増幅生成物が切断され
ることがある。さらに、Ｌｏｎｇｏらは、ＵＮＧ処理の
有無で増幅生成物の相対量を比較し、ＵＮＧ処理を含む
反応で増幅した標的の強度が低下したことを報告してい
る。このように、ＵＮＧ処理では、生成物の増幅効率の
問題を解決することは期待できないであろう。

【００１２】Ｅｐｓｙらは、増幅されたＤＮＡを不活性
化する際のＵＮＧの効率がＤＮＡの鎖長に依存すること
を報告している。具体的には、塩基対１００個未満のＰ
ＣＲアプリコンを不活性化する場合にはＵＮＧは効果的
ではなかった。従って、ＵＮＧはプライマー−ダイマー
を不活性化することがない。本発明により例示されるよ
うに、プライマー−ダイマーの抑制や増幅効率の向上に
対して、ＥｘｏＩＩＩもＵＮＧも特に効果的であるこ
とはない。さらに、上記したように、零サイクルアーチ
ファクトを抑制するための従来の方法には、実用上の欠
点がある。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】従って、当該技術分野
では、零サイクルアーチファクトを抑制することでＰＣ
Ｒの効率及び特異性を高める上で有効且つ実用的な方法
が求められている。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、標的核酸を含
むと思われる試料に、前記標的核酸の領域に対してこれ
にハイブリダイズするに十分な相補性を示す少なくとも
２種のオリゴヌクレオチドプライマーと、少なくとも４
種のヌクレオシドトリホスフェートと、耐熱性重合剤
と、前記重合剤に特異的な少なくとも１種の抗体と、エ
キソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼの少なくとも一方
とを接触させて反応混合物を形成させる工程と、前記反
応混合物を加熱して前記抗体、エキソヌクレアーゼ及び
／又はグリコシラーゼを変性させ且つ標的核酸の鎖を分
離する工程と、プライマー伸長生成物を形成させる工程
とを含む、標的核酸を増幅するための方法に関する。グ
リコシラーゼを使用する実施態様では、ヌクレオシドト
リホスフェートの１種は、ＤＮＡ中に取り込まれた場合
に該グリコシラーゼによって特異的に切断されるもので
ある。

【００１５】別の実施態様として、本発明は、被検試料
を、重合剤、前記重合剤に特異的な少なくとも１種の抗
体、並びにエキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼの少
なくとも一方を含む増幅試薬と接触させる工程と、前記
試料を加熱して前記抗体、エキソヌクレアーゼ及び／又
はグリコシラーゼを変性させ且つ標的核酸の鎖を分離す
る工程と、前記標的核酸を増幅する工程とを含む、ＰＣ
Ｒ増幅法において非特異的核酸の形成を減少させ且つ所
望の標的の増幅効率を高める方法を提供するものであ
る。

【００１６】さらに本発明は、耐熱性重合剤を含有する
のに適した第一の容器と、該重合剤に特異的な抗体を含
有するのに適した第二の容器と、エキソヌクレアーゼを
含有するのに適した第三の容器とを含む核酸増幅用のキ
ットを提供する。別の実施態様では、本発明のキットは
グリコシラーゼを含有するのに適した第四の容器をさら
に含む。所望によりさらに別の抗体及び／又はその他の
ＰＣＲ試薬を含む別の新たな容器を本発明のキットに設
けることもできる。本発明はまた、耐熱性重合剤を含有
するのに適した第一の容器と、該重合剤に特異的な抗体
を含有するのに適した第二の容器と、グリコシラーゼを
含有するのに適した第三の容器とを含む核酸増幅用のキ
ットを包含する。別の実施態様では、本発明のキットは
ヌクレオシドトリホスフェート、プライマー、緩衝剤及
びさらに別の抗体をはじめとするＰＣＲ試薬をさらに含
有する。

【００１７】本発明のさらに別の態様として、ＰＣＲ増
幅に有用な、特にＰＣＲの際に非特異的核酸の形成を減
少させるのに有用な混合組成物が提供される。この混合
物は、ＰＣＲ法に用いられる耐熱性重合剤に対する少な
くとも１種の抗体とエキソヌクレアーゼ及びグリコシラ
ーゼの少なくとも一方とを含む。この混合物はまた、少
なくも４種のヌクレオシドトリホスフェートと、重合剤
と、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー
と、緩衝剤等、その他のＰＣＲ試薬とを含むこともでき
る。発明の詳細な説明本発明は、零サイクルアーチファクトとしても知られて
いる核酸の非特異的増幅が従来のＰＣＲ法よりも少なく
なる、標的核酸の増幅方法を提供するものである。具体
的には、ＰＣＲ反応混合物中に耐熱性重合剤に特異的な
抗体とエキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼの少なく
とも一方とを含ませることによって、プライマー−ダイ
マーの形成が減少し、このため標的核酸の増幅効率が向
上する。

【００１８】ＰＣＲの原理や標的核酸の増幅及び検出の
条件については当該技術分野では周知であり、例えば、
米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、
同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第
４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）をはじめとす
る当業者には周知の数多くの文献にも記載されている。
簡単に説明すると、標的核酸を含むと思われる試料を、
増幅すべき領域の側面に並ぶ標的配列に相補的な２種の
オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で加熱して二本
鎖核酸を変性させる。プライマーは分離した標的鎖にア
ニールし、それぞれの３’末端から耐熱性ポリメラーゼ
などの重合剤によって伸長する。ＰＣＲによって二本鎖
ＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡでも増幅することができる。ま
た、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにすることにより、Ｒ
ＮＡを標的として機能させることもできる。変性工程、
プライマーアニーリング工程及びＤＮＡ合成工程を別々
の温度で行い、サイクルを繰り返すことにより標的核酸
が指数的に蓄積することになる。ＰＣＲの容器は一般に
密栓されたプラスチック製容器であるか、又は米国特許
第５，２２９，２９７号に記載されているようなキュベ
ットもしくはパウチである。ＰＣＲ増幅用の試薬は、一
般に単一容器内で混合され、プライマー、ヌクレオシド
トリホスフェート（一般にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ又はｄＵＴＰ）、耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ、マグネシウム含有緩衝剤、及び標的核酸を含
む。ＰＣＲ用の試薬及び条件は当業者には周知であり、
例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９８９年、Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２：２１７に記載されて
いる。ＲＮＡ標的を増幅するために、耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼの他に又は代わりに逆転写酵素を使用すること
ができる。逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼのように、耐熱性の逆転写酵素が特に有用であ
る。ＲＮＡ標的のＰＣＲ増幅法は当業者には周知であ
り、例えば、米国特許第５，１７６，９９５号、同第
５，３１０，６５２号及び同第５，３２２，７７０号に
記載されている。

【００１９】本発明は、標的核酸の増幅効率を改善する
ために既知のＰＣＲ法を改良するものである。具体的に
は、本発明の方法は、プライマー−ダイマーをはじめと
する零サイクルアーチファクトの形成を減少すると共に
標的ＤＮＡの増幅効率を増加させるものである。プライ
マー−ダイマーは２種のプライマーとそれらの相補的配
列から成る二本鎖ＰＣＲ生成物であることができる。プ
ライマー間にさらに別の塩基が挿入されてもよい（Ｅｒ
ｌｉｃｈら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１
６４３）。これらの種を変性させると、同様に用語「プ
ライマー−ダイマー」に包含される一本鎖アーチファク
トが得られる。プライマー−ダイマーの形成は、プライ
マーの３’末端に相同性がある場合に特に起こりやす
く、そして増幅された標的が検出できないほどの増幅効
率の低下をもたらす場合がある。当該技術分野では、プ
ライマー−ダイマーの形成を減少させ且つ増幅効率を増
大させるために様々な方法が提案されているが、本発明
によると、抗Ｔａｑ抗体又はＥｘｏＩＩＩ又はＵＮＧ
を個別に使用する従来の方法では、多くの状況において
検出可能な程度にプライマー−ダイマーを減少させるこ
と又は効率を向上させることは不可能であることが示さ
れた。

【００２０】このように、本発明の方法によると、増幅
効率が改善され、偽陰性の結果が減少し、さらにまたプ
ライマーの３’相同性を回避する必要がないために実務
者にとってはプライマー配列の選択の融通性が高くな
る。第一の場合において、本発明は、ＰＣＲ増幅に有用
な、特にＰＣＲの際の非特異的核酸の形成を減少させる
のに有用な混合物を提供する。この混合物は、ＰＣＲ法
に用いられる耐熱性重合剤に対する少なくとも１種の抗
体と、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼの少なく
とも一方とを含む。この混合物はエキソヌクレアーゼと
グリコシラーゼと少なくとも１種の抗体とを含むことが
好ましい。また、この混合物は、その他のＰＣＲ試薬、
例えばヌクレオシドトリホスフェート、重合剤、プライ
マー、緩衝剤、等をも含む。

【００２１】本発明による意外な発見は、標的核酸を含
む試料及びＰＣＲ用試薬と、ＰＣＲの重合剤に特異的な
抗体及びエキソヌクレアーゼとを、又はＰＣＲの重合剤
に特異的な抗体及びグリコシラーゼとを、又はＰＣＲの
重合剤に特異的な抗体、エキソヌクレアーゼ及びグリコ
シラーゼとを接触させることにより、非特異的核酸が減
少し、標的核酸の増幅効率が向上するということであ
る。ＰＣＲの重合剤に特異的な抗体を２種以上使用する
ことも可能である。こうして、本発明の方法によると、
増幅効率が改善され且つ偽陰性の結果が減少し、さらに
またプライマーの３’相同性を回避する必要がないため
に実務者にとってはプライマー配列の選択の融通性が高
くなる。

【００２２】本発明の方法は、均一系アッセイ又は均一
系検出システムとして当該技術分野で知られているＰＣ
Ｒ増幅法及び検出法に特に有用である。このようなシス
テムは当該技術分野では周知であり、例えば、欧州特許
出願公開第９１３１００６２．４（４８７２１８）号及
び同第９２１０６９８９．４（５１２３３４）号公報に
記載されている。均一系システムでは、増幅されたＤＮ
Ａの検出は、二本鎖ＤＮＡに蛍光性化合物が結合するこ
とによって誘発される蛍光変化に基づくものである。検
出は一般に二本鎖ＤＮＡの形成に基づき、標的ＤＮＡと
非特異的産物とを区別するものではないため、プライマ
ー−ダイマーのような二本鎖アーチファクトの形成は、
均一系アッセイの特異性を損なうことになる。本発明に
よると、プライマー−ダイマーが減少するため、均一系
検出法の特異性が向上する。

【００２３】ＰＣＲに必要な試薬は、当業者には周知で
あるが、一般には標的核酸の領域に対してこれにハイブ
リダイズするに十分な相補性を示す少なくとも２種のオ
リゴヌクレオチドプライマーと、４種のヌクレオシドト
リホスフェートと、耐熱性重合剤と、そして重合剤に必
要な補助因子とを含む。好ましいヌクレオシドトリホス
フェートは、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
トｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（総称と
してｄＮＴＰとも記載する）である。ＵＮＧを使用する
本発明の方法では、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを使用
する。ヌクレオシドトリホスフェートは市販品として入
手可能である。

【００２４】プライマーは、適当な条件下、すなわちヌ
クレオシドトリホスフェート、重合剤、好適な温度、ｐ
Ｈ及び緩衝剤の存在下、標的核酸にアニールして核酸合
成の開始点として作用することができる天然又は合成さ
れたオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、標的核
酸に対してこれにハイブリダイズするに十分な相補性を
示す配列を有し、そして重合剤の存在下で伸長生成物の
合成をプライムするに十分な鎖長、典型的にはヌクレオ
チド１０〜６０個分、を有する。プライマーは、当業者
には周知の自動合成法によって合成することができる。
プライマーを設計する上での検討事項については当該技
術分野では周知である。プライマーは、あるプライマー
から合成された伸長生成物が、その相補体から分離され
た場合に、別のプライマーの伸長生成物のための鋳型と
して役に立てるように、増幅すべき特定の核酸の鎖配列
に実質的に相補的となるように選定される。プライマー
は標的鎖に対して正確な相補性を有することが好まし
い。

【００２５】重合剤は、プライマー伸長生成物の合成を
完成させるように作用する化合物である。重合剤は耐熱
性であり、すなわちＰＣＲにおいてＤＮＡ鎖を変性する
際に典型的に用いられる温度（例、９３〜９５℃）に短
時間加熱された場合に永久的には不活性化されず、しか
も高温における活性が優先的である。好ましい実施態様
では、重合剤は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであって、例
として、サーモコッカス・リトラリス（thermococcus l
itoralis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Baci
llus stearothermophilus ）、メタノサーマス・フェル
ビドゥス（Methanothermus fervidus ）、サーマス・ア
クアティクス（thermus aquaticus ）、Ｔ．フラブス
（T. flavus ）、Ｔ．ラクテウス（T. lacteus）、Ｔ．
ルベンス（T. rubens ）、Ｔ．ルバー（T. ruber）及び
Ｔ．サーモフィルス（ T. thermophilus）といった好熱
菌、又はデスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococ
cusmobilis ）、メタノバクテリウム・サーモオートト
ロフィルクム（Methanobacterium thermoautotrophilcu
m ）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobusso
lfataricus ）、Ｓ．アシドカルダリウス（S. acidocal
darius ）及びサーモプラスマ・アシドフィルム（Therm
oplasma acidophilum）といった好熱性古細菌から得ら
れたＤＮＡポリメラーゼを含む。最も好ましい実施態様
では、重合剤はサーマス・アクアティクス（thermus aq
uaticus ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼ、サーマス・サーモ
フィルス（thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）ポリメラ
ーゼ又はサーモコッカス・リトラリス（thermococcus l
itoralis）ポリメラーゼである。また、耐熱性逆転写酵
素や逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼも重合剤と
して包含されるものである。

【００２６】耐熱性ポリメラーゼは、市販品として入手
すること、或いは当該技術分野で周知の方法によって得
ることができる。具体的には、Ｔａｑポリメラーゼは、
組換え形や天然形（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−Ｃｅｔ
ｕｓ）のものが市販されているか、或いはＬａｗｙｅｒ
ら、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：
６４２７又は米国特許第４，８８９，８１８号に記載さ
れている方法によって製造することができる。Ｔｔｈポ
リメラーゼは、Ｆｉｎｎｚｙｍｅ社（フィンランド）や
株式会社東洋紡より市販されている。サーモコッカス・
リトラリス（thermococcus litoralis）ポリメラーゼ
は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから市販
されており、また米国特許第５，３２２，７８５号に記
載された方法で製造することもできる。耐熱性重合剤に
特異的な抗体は、当業者には周知の方法によって製造す
ることができる。本発明によると、用語「抗体」には、
常套手法によって製造されたモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体、組換え法で製造された抗体、化学的
又は組換え法で製造された抗体フラグメント、例えばＦ
ａｂフラグメント、が包含される。好ましい実施態様で
は、抗体はモノクローナル抗体である。

【００２７】抗体は、当業者には周知の方法によって得
ることができ、例えば、Ｈａｒｌｏｗｅら、１９８８
年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ，ＮＹに記載されている。例えば、ＤＮＡポリメ
ラーゼのような重合剤と適当なアジュバント（例、フロ
インド完全アジュバント）とで適当なホスト動物を免疫
化することによってポリクローナル抗体を製造すること
ができる。力価を高めるために各種間隔において促進剤
を注入してもよい。一般に、血清試料を特定の時間間隔
で集めて、関心のあるＤＮＡ重合剤の特異性を、例えば
ＥＬＩＳＡやイムノブロッティング法で検査する。十分
な力価を示す所望の血清は、一般にイオン交換法やアフ
ィニティークロマトグラフィー（例、プロテインＡやプ
ロテインＧマトリックスを使用して）のような常套手段
によって精製される。

【００２８】モノクローナル抗体は、常用の方法により
重合剤で免疫化したマウス又はラットの免疫細胞から調
製される。例えば、ホスト動物の抗体産生細胞をリンパ
様組織（例、脾臓）から単離し、そしてポリエチレング
リコールの存在下でミエローマ細胞（例、ＳＰ２／０−
Ａｇ１４ネズミミエローマ細胞）と融合させ、選択培地
に希釈し、マルチウェル組織培養皿にプレーティングす
る。７〜１４日後、所望の抗体を分泌するハイブリドー
マ細胞を収穫し、使用に供するか又は凍結保存する。培
養上清についても所望の抗体の存在を検査することがで
きる。十分量の抗体を得るため、ハイブリドーマ細胞を
静置培養、中空繊維バイオリアクターで成長させること
や、これを使用してマウスで腹水腫瘍を製造させること
ができる。ポリクローナル抗体について記載したように
精製を実施することができる。同様に、米国特許第５，
３３８，６７１号明細書に記載されているように、Ｔａ
ｑポリメラーゼに対するモノクローナル抗体を得ること
ができる。

【００２９】本発明の好ましい実施態様では、抗体はＴ
ａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ又はサーモコッ
カス・リトラリス（thermococcus litoralis）ポリメラ
ーゼに対するモノクローナル抗体である。より好ましい
実施態様では、抗体はＴａｑポリメラーゼに対するモノ
クローナル抗体である。Ｔａｑポリメラーゼに対するモ
ノクローナル抗体は当該技術分野では周知であり、例え
ば、米国特許第５，３３８，６７１号明細書に記載され
ている。好ましい実施態様では、Ｔａｑポリメラーゼに
対するモノクローナル抗体は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション(American Type Culture Colle
ction; ATCC)〔所在地；12301 ParklawnDrive, Rockvil
le, MD, 20853〕に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番
号がＨＢ１１８０７及びＨＢ１１１２７であるハイブリ
ドーマから得られるＴＰ４−９．２及びＴＰ１−１２．
２である。好ましい抗体が示すポリメラーゼに対する会
合定数は約１×１０⁷Ｍ^-1以上である。本発明による
と、重合剤に対して特異的であると定義される抗体は、
約２０〜４０℃の温度において重合剤の酵素活性を阻害
することができる抗体である。本発明の抗体は、ＰＣＲ
の熱的サイクルにおいて用いられる高温によって不活性
化される。ポリメラーゼの酵素活性を阻害できる抗体の
能力は、Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ１２：５０６に記載されているように、
当業者には周知のアッセイによって測定することができ
る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性の標準的な
アッセイは、ＤＮＡにおいて形成される一本鎖のギャッ
プに³Ｈ−ｄＮＴＰを取り込むことができるポリメラー
ゼの能力に基づくことができる。ポリメラーゼ活性を阻
害することができる抗体の能力は、抗体をポリメラーゼ
と共に予備インキュベートした後、標準的なポリメラー
ゼアッセイを行うことによって測定される。このような
アッセイにおいてポリメラーゼ活性を有意に低下させる
ことができる抗体は本発明において有用である。同様な
アッセイを用いて、所望の抗体が熱で不活性化されるこ
とを測定することもできる。簡単に説明すると、ポリメ
ラーゼを阻害することができる抗体の能力についてのア
ッセイに、所望の温度に上昇させた後、冷却してポリメ
ラーゼ活性についてアッセイすることによる変更を加え
る。本発明による所望の抗体は、約８５〜約９５℃の温
度で不活性化されて、活性なポリメラーゼを解放する。

【００３０】本発明により用いられるエキソヌクレアー
ゼは、市販品を利用すること、或いは当該技術分野で周
知の方法で得ることが可能であり、例えば、エキソヌク
レアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）、エキソヌクレアー
ゼＩ、λエキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアー
ゼ、リボヌクレアーゼＩＩ、ポリヌクレオチドホスホリ
ラーゼ及びＢＡＬ３１ヌクレアーゼが挙げられる。エキ
ソヌクレアーゼは当業者には周知であり、また、例え
ば、Ｆａｓｍａｎ編、１９８９年、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＣＲ
ＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ．に記載さ
れている。本発明によると、５’エキソヌクレアーゼと
３’エキソヌクレアーゼのどちらも考えられ、一本鎖Ｄ
ＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又はその両方を消化するエキソヌク
レアーゼについても同様である。二本鎖ＤＮＡを優先的
に攻撃するエキソヌクレアーゼが特に好ましい。好まし
い実施態様では、エキソヌクレアーゼはＥｘｏＩＩ
Ｉ、λエキソヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼＩで
ある。ＥｘｏＩＩＩが特に好ましい。９５℃における
エキソヌクレアーゼの不活性化は、熱的サイクルにおけ
るエキソヌクレアーゼ活性をさらに防止する。従って、
エキソヌクレアーゼは９５℃において不活性でなければ
ならない。

【００３１】本発明において有用なグリコシラーゼは、
常用されない塩基、すなわち、ＤＮＡにおいてはＡ、
Ｇ、Ｃ又はＴ以外の塩基、またＲＮＡにおいてはＡ、
Ｇ、Ｃ又はＵ以外の塩基、を特異的に切断する酵素であ
る。グリコシラーゼを使用する本発明の実施態様では、
そのグリコシラーゼが特異的である適当なデオキシリボ
ヌクレオシドトリホスフェートを、対応する常用のｄＮ
ＴＰの代わりに使用する。Ｎ−７メチルグアニン、３−
メチルアデノシン、ウラシル及びヒポキサンチンのよう
な異例の塩基を特異的に切断するグリコシラーゼは、当
該技術分野では周知であり、また例えば、Ｓｈｉｎｓｋ
ｙらの国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５２１０号
に記載されている。好ましいグリコシラーゼとしてウラ
シルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ヒポキサンチン−
ＤＮＡグリコシラーゼ並びに３−メチルアデニン−ＤＮ
ＡグリコシラーゼＩ及びＩＩが挙げられる。本発明によ
る最も好ましいグリコシラーゼはＵＮＧである。ＵＮＧ
は市販されている（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。ＵＮ
Ｇは、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡからウラシルを切
除する反応を触媒する酵素である。ＵＮＧを利用する本
発明の実施態様では、ｄＴＴＰの代わりにデオキシリボ
ヌクレオシドトリホスフェートｄＵＴＰを使用し、これ
を増幅生成物に取り込ませる。ＵＮＧは熱サイクルで用
いられる温度によって不活性化されるので、ＵＮＧは、
熱サイクルの開始前、すなわち零サイクル時に生成した
ウラシル含有ＤＮＡだけを攻撃する。ＵＮＧの切断によ
り生じた非塩基性ポリヌクレオチドはＰＣＲ鋳型として
機能することができない（Ｌｏｎｇｏら、１９９０年、
Ｇｅｎｅ９３：１２５）。

【００３２】本発明は、標的核酸を含むと思われる試料
において、標的核酸を増幅し、またその後必要に応じて
該核酸を検出するための方法を提供するものである。試
料としては、標的核酸を含むと思われるいずれの試料で
あってもよく、例えば、組織試料、血液、毛髪、体液、
細菌、ウイルス、菌類、細菌感染細胞、ウイルス感染細
胞、等が挙げられる。標的核酸はＤＮＡであってもＲＮ
Ａであってもよい。ＰＣＲ増幅に適した位置において標
的核酸の様々な鎖にハイブリダイズすることができるプ
ライマーを設計するためには、増幅すべき配列の両端に
位置する相当数の塩基が既知でなければならない。標的
核酸は、例えば、試料からタンパク質や細胞物質を除去
することによって、ＰＣＲに先立ち組織試料から抽出又
は部分抽出することができる。試料から核酸を抽出する
方法については周知であり、また、例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、１９８９年、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ及びＳａｉｋｉら、１９８５年、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ３：１００８に記載されている。

【００３３】本発明の増幅方法では、試料又は試料から
抽出された核酸調製物を、２種以上のオリゴヌクレオチ
ドプライマー、４種のヌクレオシドトリホスフェート、
耐熱性重合剤及び適当な緩衝剤をはじめとする典型的な
ＰＣＲ用試薬と接触させると共に、さらに該重合剤に特
異的な少なくとも１種の抗体並びにエキソヌクレアーゼ
及びグリコシラーゼの少なくとも一方と接触させること
によりＰＣＲ反応混合物を準備する。好ましい実施態様
では、エキソヌクレアーゼとグリコシラーゼの両方を含
ませる。

【００３４】プライマー、ヌクレオシドトリホスフェー
ト、重合剤及び適当な緩衝剤をはじめとする常用のＰＣ
Ｒ試薬は、ＰＣＲに一般に適した濃度で用いられ、当業
者であれば周知である。好ましい実施態様では、ヌクレ
オシドトリホスフェートはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰである。グリコシラーゼを使用する方法
では、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを使用し、緩衝液中
のマグネシウム濃度を、例えば、１０倍のＰＣＲ緩衝液
において約５ｍＭに低下させる。好ましい実施態様で
は、重合剤は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。好まし
いＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポ
リメラーゼ及びサーモコッカス・リトラリス（thermoco
ccus litoralis）ポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラ
ーゼが特に好ましい。

【００３５】重合剤に特異的な抗体は、該重合剤を室温
において阻害する上で有効な濃度において用いられる。
この抗体は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ルであること、又は抗体フラグメントであることができ
る。好ましい実施態様では、抗体はモノクローナル抗体
であって、重合剤に対して約５〜約５００のモル比率で
用いられる。最も好ましい実施態様では、重合剤はＴａ
ｑポリメラーゼであり、抗体はＴａｑポリメラーゼに特
異的なモノクローナル抗体であり、そして抗体対Ｔａｑ
ポリメラーゼのモル比率は約５０：１である。エキソヌ
クレアーゼは、約０．００１ユニット／μＬ〜０．２ユ
ニット／μＬの濃度範囲で使用することができる。好ま
しい実施態様では、エキソヌクレアーゼはＥｘｏＩＩ
Ｉであって、約０．００２５ユニット／μＬ〜０．０５
ユニット／μＬの濃度範囲で使用される。別の好ましい
実施態様では、グリコシラーゼはＵＮＧである。当業者
であれば、抗体、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラー
ゼの適当な濃度を決めることができるが、これらは標的
濃度やその他の実験条件によって変動しうる。例えば、
実施例６及び７に教示したように各種濃度範囲について
試験することにより、最も効果的な濃度を求めることが
できる。

【００３６】本発明によると、特定のＰＣＲ条件下で
は、特にオリゴヌクレオチドプライマーがプライマー−
ダイマーを容易に形成しうる重複領域を有する場合に
は、生成物が検出できなくなるほど標的の増幅が妨害さ
れることがわかった。当該技術分野で主張されている零
サイクルアーチファクト減少剤、例えば抗Ｔａｑ抗体や
ＥｘｏＩＩＩは、個別には、生成物が目視検出可能に
なる程度にまでアーチファクトを除去することはできな
い。本発明の方法では、エキソヌクレアーゼと重合剤に
対する抗体、又はグリコシラーゼと該抗体、又はエキソ
ヌクレアーゼとグリコシラーゼと該抗体の組合せによっ
て、プライマー−ダイマーの形成が検出可能なほど減少
し、且つ、標的の増幅効率が検出可能なほど向上する。
本発明によると、検出可能な増加又は減少は、当業者で
あればエチジウムブロミド着色ゲル上で定性的に可視化
されるものである。従って、本発明は、ＰＣＲ反応にお
いて、非特異的核酸の形成を減少させ且つ所望の標的の
増幅効率を向上させる方法を提供するものである。本発
明は、プライマー−ダイマーを形成しやすいプライマー
を使用するＰＣＲアッセイに特に有用であって、ＰＣＲ
に利用できるプライマーの選択肢の幅を広げるものであ
る。

【００３７】試料をＰＣＲ試薬、抗体、並びにエキソヌ
クレアーゼ及びグリコシラーゼの少なくとも一方と接触
させた後、熱サイクルに先立ち、その反応混合物を加熱
して抗体、エキソヌクレアーゼ及び／又はグリコシラー
ゼ並びに二本鎖ＤＮＡを変性させる。好ましい実施態様
では、混合物を約８５〜９５℃に約１０分間加熱する。
グリコシラーゼ、特にＵＮＧを使用する方法では、例え
ば２〜５分といった短時間のインキュベーションを約５
０℃において実施することにより、プライマー−ダイマ
ーを劣化させることができる。このインキュベーション
を実施してから熱変性を行う。

【００３８】熱変性に続いて、アニーリング、伸長及び
変性から成る標準的なＰＣＲサイクルを実施する。サイ
クル変数は、当業者には周知であり、特定の条件に容易
に適合させることができる。この増幅法は自動化された
連続法で行うことが好ましい。自動化ＰＣＲに適した装
置は、当業者には周知であり、例えば、米国特許第４，
９６５，１８８号、同第５，０８９，２３３号及び同第
５，２２９，２９７号に記載されている。さらに当業者
であれば、例えば、ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気
泳動法で分離してエチジウムブロミド着色により可視化
する方法で、又は増幅された核酸とハイブリダイズ可能
な標識プローブによるハイブリダイゼーション検出法
で、又はその他当業者には周知の各種検出方法で、増幅
生成物を容易に検出することもできる。

【００３９】さらに本発明は、重合剤を含有するのに適
した第一の容器と、該重合剤に特異的な抗体を含有する
のに適した第二の容器と、エキソヌクレアーゼを含有す
るのに適した第三の容器とを含むＰＣＲ用キットを提供
する。別の実施態様では、このキットはさらにグリコシ
ラーゼを含有するのに適した第四の容器を含む。本発明
はまた、重合剤を含有するのに適した第一の容器と、該
重合剤に特異的な抗体を含有するのに適した第二の容器
と、グリコシラーゼを含有するのに適した第三の容器と
を含むＰＣＲ用キットを提供する。さらにまた、例え
ば、ＰＣＲ重合剤に特異的なさらに別の抗体を含めるた
めの別の新たな容器を設けることもできる。本発明のキ
ットはまた、ヌクレオシドトリホスフェート、プライマ
ー及び緩衝剤をはじめとするＰＣＲ用試薬を含むことも
できる。

【００４０】好ましい実施態様では、重合剤はＤＮＡポ
リメラーゼである。より好ましい実施態様では、該ポリ
メラーゼはＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ又
はサーモコッカス・リトラリス（thermococcus litoral
is）ポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼが特に好
ましい。好ましい抗体は、Ｔａｑポリメラーゼに対して
特異的なモノクローナル抗体である。グリコシラーゼは
ＵＮＧであることが好ましい。別の好ましい実施態様で
は、エキソヌクレアーゼはＥｘｏＩＩＩ、λエキソヌ
クレアーゼ又はエキソヌクレアーゼＩである。Ｅｘｏ
ＩＩＩが特に好ましい。本発明のキットは、ＰＣＲアッ
セイにおいて標的核酸の増幅効率を向上させる上で有用
である。以下の実施例により本発明をさらに説明する。

【００４１】

【実施例】実施例１エキソヌクレアーゼ IIIおよびTaq-抗体によるプライマ
ー−ダイマー形成の制御本例は、標的サイトメガロウイルスＤＮＡの増幅の効率
が極めて低くなるように、そしてプライマー−ダイマー
のバンドが顕著であるようにプライマーが設計されてい
る、プライマー−ダイマー形成のモデル系を利用する。
生成物のバンドが臭化エチジウム染色ゲルでは目視可能
にできないので、より高感度な方法、例えば、ハイブリ
ダイゼーション捕捉に続くトリアリールイミダゾール・
ロイコ色素の西洋ワサビペルオキシダーゼ−媒介酸化
は、少量の生成物が前記モデル系で生成されることを示
す。

【００４２】Perkin-Elmer/Applied Biosystems Divisi
on Model 380B スリー・カラムＤＮＡ合成装置を利用し
て、固相ホスホルアミダイト化学によりオリゴヌクレオ
チド・プライマーを調製した。プライマーの５′末端
を、非放射性検出のためにビオチニル化した。使用した
プライマーは、以下のものであった。プライマーＪＫＣＭＶ５３：５′−CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT −３′（配列番
号：１）プライマーＪＫＣＭＶ５５：５′−TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT−３′（配列番号：
２）ＪＫＣＭＶプライマー・セットは、容易にプライマー−
ダイマー複合体を形成する、４つのヌクレオチドの３′
重複領域を有する。使用したＪＫＣＭＶプライマー濃度
（０．８μｍ）は、プライマー−ダイマー形成をさらに
促進するためにＰＣＲに典型的に用いられる濃度の２倍
とした。

【００４３】プライマー−ダイマー形成を制御する能力
について、エキソヌクレアーゼ III（Exo III, Promega
市販）を、２種の異なる濃度（ＰＣＲ混合物１００μＬ
当たり２および６単位）で単独で、またTaq-抗体と組み
合わせて試験した。Taq 抗体（Ab）を、Taq ポリメラー
ゼに対してモル比５０：１で使用した。EP-A 0 482 714
に記載されたように組換え法でTaq ポリメラーゼを調製
した。Taq ポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体
（ＴＰ４−９．２）を米国特許第 5,338,671号明細書に
記載されたように調製し、そして特に断らない限りすべ
ての実施例で使用した。

【００４４】ＰＣＲ混合物は、以下の試薬を含むものと
した。１０× ＰＣＲ緩衝剤（１０ｍＭＴｒｉ・ＨＣ
ｌ，pH８．０と５０ｍＭＫＣｌおよび１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂）；ＪＫＣＭＶ５３／５５プライマー，０．８μ
Ｍ；ｄＮＴＰ（Sigma)，ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
およびｄＴＴＰの各々につき１．５ｍＭ；Taq ポリメラ
ーゼ，ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり１６単位；１単位
は、７４℃で３０分間に１０ナノモルの全ヌクレオチド
を伸長核酸鎖に導入するのに必要とされる酵素活性量と
して定義される；ニシン精子ＤＮＡ，ＰＣＲ混合物１０
０μＬ当たり１μｇ；ならびにＣＭＶ培養標的，１０
０，０００×最終希釈（対照ｈＣＭＶ株ＡＤ１６９（Ａ
ＴＣＣＶＲ５３８）を、ＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ１７１）で特有の細胞変性効果が単層の９０％を
越えて明瞭になるまで増殖させた）。

【００４５】試料調製の後、すべての試料を室温で２時
間おいてプライマー−ダイマー形成を行った。グループ
Ａの試料は、２時間インキュベーションの直後にＰＣＲ
を行った。グループＢの試料は、ＰＣＲの前にさらに４
０℃で２０分間インキュベーションを行った。グループ
Ｃでは、２時間室温でインキュベーションした後かつ４
０℃で２０分間インキュベーションする前にTaq 抗体お
よびExo III を添加した。以下の試料の二重反復試験を
行った。

【００４６】Ａ．２時間後かつＰＣＲ前に追加インキュ
ベーションなし。（１）Taq 抗体もExo III もなし（プライマー−ダイマ
ー陽性対照）；（２）Taq 抗体のみ（Exo III なし）；（３）Exo III のみ〔０．０２単位／μＬもしくは２単
位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（４）Exo III のみ〔０．０６単位／μＬもしくは６単
位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（５）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０２単位／μＬもしく
は２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（６）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０６単位／μＬもしく
は６単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；

【００４７】Ｂ．Exo III のためにＰＣＲ前に４０℃で
２０分間インキュベーション追加（７）Taq 抗体もExo III もなし（プライマー−ダイマ
ー陽性対照）；（８）Taq 抗体のみ（Exo III なし）；（９）Exo III のみ〔０．０２単位／μＬもしくは２単
位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１０）Exo III のみ〔０．０６単位／μＬもしくは６
単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１１）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０２単位／μＬもし
くは２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１２）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０６単位／μＬもし
くは６単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；

【００４８】Ｃ．２時間ＲＴ（室温）インキュベーショ
ン後、さらに４０℃で２０分間インキュベーションする
前にTaq 抗体／Exo III を添加（１３）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０２単位／μＬもし
くは２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１４）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０６単位／μＬもし
くは６単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；

【００４９】ＰＣＲ増幅を、米国特許第 5,229,297号明
細書に記載されるClinical DiagnosticsのＰＣＲパウチ
において、米国特許第 5,089,233号明細書に記載される
原型分析器を利用して行った。２時間インキュベーショ
ンもしくは20分間インキュベーション追加に続いて標準
ＰＣＲパラメーターを使用した。Taq 抗体およびExo II
I を加熱変性し、同様にＰＣＲ混合物中の二本鎖ＤＮＡ
を分離するために、９５℃で試料を予備加熱した。次い
でＰＣＲを４０サイクル行った（９５℃で１５秒間融解
し、そして６８℃で３５秒間アニーリングおよび伸長さ
せた）。次いでＰＣＲ生成物をＰＣＲパウチから採取
し、そして２．５％アガロースゲルに流して臭化エチジ
ウムで染色した。次いでポラロイドカメラ（Polaroid c
amera)でゲルの写真を撮った。ＰＣＲ生成物およびプラ
イマー−ダイマー複合体について試料間で比較を行い、
結果を以下に示した。

【００５０】

【表１】

【００５１】

【表２】

【００５２】ゲルの結果より、Taq 抗体およびExo III
の組合せ〔０．０２単位／μＬもしくは２単位／１００
μＬＰＣＲ混合物〕であり追加インキュベーションな
しの試料＃５が、最も有効なＰＣＲ増幅効率およびプラ
イマー−ダイマー制御を示していたことがわかる。わず
かに低い信号のＰＣＲ生成物のバンドおよび同等のプラ
イマー−ダイマー制御が、Taq 抗体およびExo III の組
合せ〔０．０６単位／μＬもしくは６単位／１００μＬ
ＰＣＲ混合物〕であり追加インキュベーションなしの
試料＃６により得られた。弱いＰＣＲ生成物のバンド
は、Taq 抗体およびExo III の組合せ〔両方の濃度〕で
あり追加インキュベーションを行った試料＃１１および
＃１２で得られた。試料＃１３および＃１４は、Taq 抗
体およびExo III をＰＣＲ混合物中に含まない試料を室
温で２時間放置したので、プライマー−ダイマー形成を
抑制するエキソヌクレアーゼIII の能力についての最も
厳しい試験であった。次いで２時間後、Taq 抗体および
Exo III の両者を添加し、そして試料を４０℃で２０分
間おいてExo III により先に形成されたプライマー−ダ
イマーを分解させた。わずかなＰＣＲのバンドが、別の
試料と比較して弱いプライマー−ダイマーのバンドと共
に生成された。陽性は、Exo III が、プライマー−ダイ
マー形成を制御することによりＰＣＲ増幅効率に効果を
与えることを示す。この実施例は、Exo III を単独でま
たはTaq 抗体を単独で使用しても、プライマー−ダイマ
ー形成を抑制しないまたは効率を増強しないが、それに
対してExoIII およびTaq 抗体の組合せは、最も挑戦的
な（グループＣ）条件下でさえもＰＣＲ増幅効率を増強
しかつプライマー−ダイマー形成を制御したことを具体
的に示している。

【００５３】実施例２本例は、３〜４時間インキュベーションする間プライマ
ー−ダイマー形成を制御するExo III およびTaq 抗体の
能力を、いずれかの薬剤単独に関して比較する。さら
に、臨床試料のバックグラウンドＤＮＡのレベルは変化
するので、プライマー−ダイマー形成を制御するExo II
I およびTaq 抗体の能力におけるバックグラウンドＤＮ
Ａの効果も評価した。ＰＣＲ試料混合物は、以下の試薬
を含むものとした。１０× ＰＣＲ緩衝剤（１０ｍＭ
マグネシウム）；ＪＫＣＭＶ５３／５５プライマー，
０．８μＭ；ｄＮＴＰ（Sigma)，各々１．５ｍＭ；Taq
ポリメラーゼ，ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり１６単
位；ＣＭＶ培養標的，１００，０００×最終希釈。グル
ープＢの試料（試料７〜１２）には、さらにニシン精子
ＤＮＡをＰＣＲ混合物１００μＬ当たり１μｇ含めた。
Taq 抗体（Taq ポリメラーゼに対してモル比５０：１）
およびExo III （２もしくは６単位／１００μＬＰＣ
Ｒ混合物）を単独でおよび組み合わせて、グループＡお
よびグループＢの両方の試料について試験した。

【００５４】以下の試料を調製した。Ａ．バックグラウンドＤＮＡなし（１）Taq 抗体もExo III もなし（プライマー−ダイマ
ー陽性対照）；（２）Taq 抗体のみ（Exo III なし）；（３）Exo III のみ〔０．０２単位／μＬもしくは２単
位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（４）Exo III のみ〔０．０６単位／μＬもしくは６単
位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（５）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０２単位／μＬもしく
は２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；ならびに（６）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０６単位／μＬもしく
は６単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；

【００５５】Ｂ．バックグラウンドＤＮＡを包含（７）Taq 抗体もExo III もなし（プライマー−ダイマ
ー陽性対照）；（８）Taq 抗体のみ（Exo III なし）；（９）Exo III のみ〔０．０２単位／μＬもしくは２単
位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１０）Exo III のみ〔０．０６単位／μＬもしくは６
単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１１）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０２単位／μＬもし
くは２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１２）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０６単位／μＬもし
くは６単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；

【００５６】試料を室温で３時間または４時間おいて、
ＰＣＲ増幅の前にプライマー−ダイマーを形成させた。
ＰＣＲ増幅を、Clinical Diagnosticsのパウチにおい
て、原型分析器を利用して行った。Taq 抗体およびExo
III を加熱変性し、同様にＰＣＲ混合物中の二本鎖ＤＮ
Ａを分離するために、９５℃で試料を予備加熱した。次
いでＰＣＲを４０サイクル行った（９５℃で１５秒間融
解し、そして６８℃で３５秒間アニーリングおよび伸長
させた）。次いでＰＣＲ生成物をＰＣＲパウチから採取
し、そして２．５％アガロースゲルに流して臭化エチジ
ウムで染色した。次いでポラロイドカメラ（Polaroid c
amera)でゲルの写真を撮った。ＰＣＲ生成物およびプラ
イマー−ダイマー複合体について試料と試料を比較し、
結果を以下に示した。

【００５７】

【表３】

【００５８】

【表４】

【００５９】ゲルの結果は、ＰＣＲの前に室温で３時間
インキュベートした試料について、そしてTaq 抗体およ
びExo III の組合せ〔０．０２単位／μＬ〕を含みかつ
バックグラウンドＤＮＡの不存在下および存在下のそれ
ぞれの試料＃５および＃１１について、増幅効率が増大
しかつプライマー−ダイマー形成が減少したことを示し
た。４時間インキュベートした試料について、試料＃５
（Taq Ab，Exo III ０．０２単位／μＬ，バックグラウ
ンドＤＮＡなし）、試料＃６（Taq Ab，Exo III ０．０
６単位／μＬ，バックグラウンドＤＮＡなし）、試料＃
１１（Taq Ab，Exo III ０．０２単位／μＬ，バックグ
ラウンドＤＮＡ）、および試料＃１２（Taq Ab，Exo II
I ０．０６単位／μＬ，バックグラウンドＤＮＡ）は、
増幅効率の増大およびプライマー−ダイマー形成の減少
を示した。これらの結果は、実施例１がTaq 抗体および
エキソヌクレアーゼIII の組合せがＰＣＲ増幅効率およ
びプライマー−ダイマー制御を増強する結果を得ること
を確認し、そしてTaq 抗体およびエキソヌクレアーゼII
I の組合せが、バックグラウンドＤＮＡの存在下または
不存在下、ＰＣＲの前に長期間室温でインキュベーショ
ンする際に有効であることを具体的に示す。そのような
強さは、臨床的使用のための実施系には不可欠でありそ
して前記要素の組合せの使用を通してのみ達成される。

【００６０】実施例３ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびTaq 抗体
を単独でおよびExo III と組み合わせて、プライマー−
ダイマー形成の制御およびＰＣＲの増幅効率における効
果について試験した。Clinical DiagnosticsのＰＣＲパ
ウチおよび原型分析器を、本発明の実験に使用した。Ｐ
ＣＲ混合物は、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを有し、Ｕ
ＮＧを使用するためにマグネシウムレベルを低くし、そ
して以下の通りであった。１０× ＰＣＲ緩衝剤（５ｍ
Ｍマグネシウム）；ＪＫＣＭＶ５３／５５プライマ
ー，各々０．８μＭ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴ
Ｐ，各々０．２ｍＭ；ｄＵＴＰ，０．４ｍＭ；Taq ポリ
メラーゼ，ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり８単位；ニシ
ン精子ＤＮＡ，ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり１μｇ；
ＣＭＶ培養標的，１００，０００×最終希釈。

【００６１】ＵＮＧおよびTaq 抗体を単独でまたはExo
III と組み合わせて下記濃度で含む試料を調製した。抗
体は、Taq ポリメラーゼに対してモル比５０：１で使用
した。ＵＮＧはPerkin-Elmerより入手した。以下の試料
を調製した。（１）抗体もＵＮＧもExo III もなし（プライマー−ダ
イマー陽性対照）；（２）抗体のみ；（３）ＵＮＧのみ〔１単位／１００μＬＰＣＲ混合
物〕；（４）抗体およびＵＮＧ〔１単位／１００μＬＰＣＲ
混合物〕；（５）抗体およびＵＮＧ〔２単位／１００μＬＰＣＲ
混合物〕；（６）抗体およびExo III 〔２単位／１００μＬＰＣ
Ｒ混合物〕；（７）抗体、ＵＮＧおよびExo III 〔それぞれ１単位お
よび２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（８）抗体、ＵＮＧおよびExo III 〔各々２単位／１０
０μＬＰＣＲ混合物〕。

【００６２】すべての試料をＰＣＲ増幅の前に室温で２
〜３時間おいて、プライマー−ダイマーを形成させた。
２時間経過後に片方の試料を試験し、そして３時間経過
後に二重反復試験用試料を試験した。さらにＵＮＧを使
用するために２または３時間室温でインキュベーション
後に予備増幅条件を必要とし、それは以下の通りであっ
た：（１）ＵＮＧプライマー−ダイマー分解のため２分
間５０℃でインキュベーション、および（２）ＵＮＧ変
性のため１０分間９５℃でインキュベーション。標準Ｐ
ＣＲサイクル・パラメーターをこれらの追加インキュベ
ーション直後に用いた（９５℃で１５秒間融解し、そし
て６８℃で３５秒間アニーリングおよび伸長させた）。
ＰＣＲ直後にＰＣＲ生成物をパウチから採取し、そして
２．５％アガロースゲルに流して臭化エチジウムで染色
した。次いでポラロイドカメラ（Polaroid camera)でゲ
ルの写真を撮った。ＰＣＲ生成物およびプライマー−ダ
イマー複合体について試料と試料を比較し、結果を以下
に示した。

【００６３】

【表５】

【００６４】

【表６】

【００６５】ゲルの結果より、試料＃６、＃７および＃
８では、２および３時間室温でインキュベーションした
ものの両方について最高の結果が得られたことがわか
る。試料＃６（抗体およびExo III ，０．２単位／１０
０μＬＰＣＲ混合物）は、実施例１および２で先に得
られた結果を確認するものである。試料＃７および＃８
（抗体、ＵＮＧ，それぞれ１および２単位／１００μＬ
ＰＣＲ混合物、ならびにExo III ，両試料中２単位／
１００μＬＰＣＲ混合物）は、抗体、ＵＮＧおよびEx
o III の組合せが、いずれかの薬剤単独のものまたは３
種の薬剤のうち２種を組み合わせたものと比較して、プ
ライマー−ダイマー形成をさらに低減することによりＰ
ＣＲ増幅効率を改良することを示す。抗体またはＵＮＧ
単独では、たとえあるとしても非常に弱い生成物のバン
ドおよび非常につよいプライマー−ダイマーのバンドが
得られた。抗体およびExo III により、生成物のバンド
が強いという良好な結果が得られたが、しかし３種の手
段すべての組合せによりさらに弱いプライマー−ダイマ
ーのバンドおよび強い生成物のバンドが得られた。

【００６６】実施例４ウラシルＮ−グリコシラーゼ、Exo III および２種のTa
q 抗体の組合せを、単独でおよび組み合わせて、プライ
マー−ダイマー形成の制御およびＰＣＲの増幅効率にお
けるそれらの効果について試験した。Clinical Diagnos
ticsのＰＣＲパウチおよび原型分析器を、この実験に使
用した。ＰＣＲ混合物は、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ
を有し、ＵＮＧを使用するためにマグネシウムレベルを
低くし、そして以下の通りであった。１０× ＰＣＲ緩
衝剤（５ｍＭマグネシウム）；ＪＫＣＭＶ５３／５５
プライマー，各々０．８μＭ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよ
びｄＧＴＰ，各々０．２ｍＭ；ｄＵＴＰ，０．４ｍＭ；
Taq ポリメラーゼ，ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり８単
位；ニシン精子ＤＮＡ，ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり
１μｇ；ＣＭＶ培養標的，１００，０００×最終希釈。

【００６７】ＵＮＧおよびTaq 抗体を単独でまたはExo
III と組み合わせて下記濃度で含む試料を調製した。使
用したTaq 抗体の組合せは、ＴＰ４−９．２，Taq ポリ
メラーゼに対してモル比５：１およびTaq 抗体ＴＰ１−
１２．２，Taq ポリメラーゼに対してモル比５０：１か
らなるものであった。ＵＮＧはPerkin-Elmerより入手し
た。以下の試料を調製した。（１）抗体もＵＮＧもExo III もなし（プライマー−ダ
イマー陽性対照）；（２ａ，ｂ）ＵＮＧのみ〔１単位／１００μＬＰＣＲ
混合物〕；（３ａ，ｂ）ＵＮＧのみ〔２単位／１００μＬＰＣＲ
混合物〕；（４）抗体のみ；（５）Exo III のみ〔２単位／１００μＬＰＣＲ混合
物〕；（６ａ，ｂ）抗体およびＵＮＧ〔１単位／１００μＬ
ＰＣＲ混合物〕；（７ａ，ｂ）抗体およびＵＮＧ〔２単位／１００μＬ
ＰＣＲ混合物〕；（８）抗体およびExo III 〔２単位／１００μＬＰＣ
Ｒ混合物〕；（９ａ，ｂ）抗体、ＵＮＧおよびExo III 〔それぞれ１
単位および２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１０ａ，ｂ）抗体、ＵＮＧおよびExo III 〔各々２単
位／１００μＬＰＣＲ混合物〕。

【００６８】すべての試料をＰＣＲの前に室温で２時間
おいて、プライマー−ダイマーを形成させた。さらにＵ
ＮＧを使用するために２時間インキュベーション後に予
備増幅条件を必要とし、それは以下の通りであった。
（１）ＵＮＧプライマー−ダイマー分解のため２分間５
０℃でインキュベーション、および（２）ＵＮＧ変性の
ため１０分間９５℃でインキュベーション。標準ＰＣＲ
サイクル・パラメーターをこれらの追加インキュベーシ
ョン直後に用いた（９５℃で１５秒間融解し、そして６
８℃で３５秒間アニーリングおよび伸長させた）。ＰＣ
Ｒ直後にＰＣＲ生成物を採取し、そして２．５％アガロ
ースゲルに流して臭化エチジウムで染色した。次いでポ
ラロイドカメラ（Polaroid camera)でゲルの写真を撮っ
た。ＰＣＲ生成物およびプライマー−ダイマー複合体に
ついて試料と試料を比較し、結果を以下に示した。

【００６９】

【表７】

【００７０】ゲルの結果より、試料＃８、＃９（ａ，
ｂ）および＃１０（ａ，ｂ）では、この実験について最
高の結果が得られたことがわかる。ＵＮＧのみおよびEx
o IIIのみの試料（＃２、＃３および＃５）では、検出
可能な生成物のバンドが全く得られず、そしてプライマ
ー−ダイマー陽性対照試料（＃１）と同等の非常に強い
プライマー−ダイマーのバンドが得られたが、一方Taq
抗体のみ（＃４）では非常に弱い生成物のバンドおよび
陽性のプライマー−ダイマーのバンドが得られた。これ
らの結果は、これら３種の手段の各々がプライマー−ダ
イマー形成を抑制するのに有効ではないこと、従って標
的配列の増幅効率を低減することを示している。ＵＮＧ
および抗体の組合せ（試料＃６および試料＃７）、抗体
およびExoIII の組合せ（試料＃８）、ならびに３種す
べて一緒のもの（試料＃９および試料＃１０）では、い
ずれかの手段単独の場合と比較して、非常に強い生成物
のバンドが得られ、そしてこれらの同じ組合せでは、形
成されるプライマー−ダイマーの量が激しく低減され、
幾つかの試料ではそれが検出不可能であった。ＵＮＧも
しくはExo III とTaq 抗体との組合せまたは３種すべて
一緒の組合せでは、ＰＣＲ反応の増幅効率が増大し、同
様にプライマー−ダイマーおよびＰＣＲで生成される生
成される別の副生成物の量を減少した結果、この強力な
診断装置の感度および特異性の両方が増強される。

【００７１】実施例５この実験では、ＵＮＧ、Exo III およびTaq 抗体の種々
の組合せを、ＰＣＲ増幅の前のプライマー−ダイマー形
成の制御について試験した。ＪＫＣＭＶ５３／５５ＰＣ
Ｒモデル系とは異なる特徴を有する２つのＰＣＲモデル
系を用いた。使用した２つのＰＣＲモデル系は以下の通
りであった：（１）ＳＭＡ７／ＳＭＡ２０ＨＩＶ
ＧＡＧＰＣＲ系および（２）ＳＫ３８／ＢＷ１７Ｈ
ＩＶＰＣＲ系。ＳＭＡ７／２０ＰＣＲ系は、プライ
マーの３′末端内部に１つの塩基対がある４つのヌクレ
オチド塩基対重複部分を有する。ＳＫ３８／ＢＷ１７プ
ライマー系は、ＪＫＣＭＶ５３／５５プライマー系の
３′の４つのヌクレオチド塩基対重複部分と比較して、
３′に２つのヌクレオチド塩基対重複部分を有する。プ
ライマーは、以下の配列を有する。プライマーＳＭＡ７：５′−AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CC
ATGCAA−３′（配列番号：３）プライマーＳＭＡ２０：５′−CCTGCTATGT CACTTCCCCT
TGGTTCTCTC−３′（配列番号：４）プライマーＳＫ３８：５′−ATAATCCACC TATCCCAGTA GG
AGAAAT−３′（配列番号：５）プライマーＢＷ１７：５′−TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CA
GAATGC−３′（配列番号：６）

【００７２】ＰＣＲ混合物は、ｄＴＴＰの代わりにｄＵ
ＴＰを有し、ＵＮＧを使用するためにマグネシウムレベ
ルを低くし、そして以下の通りであった。１０ＸＰＣ
Ｒ緩衝剤（５ｍＭマグネシウム）；ＳＭＡ７／２０
およびＳＫ３８／ＢＷ１７プライマー，各々０．８μＭ
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ，各々０．２ｍＭ；
ｄＵＴＰ，０．４ｍＭ；Taq ポリメラーゼ，ＰＣＲ混合
物１００μＬ当たり８単位；ニシン精子ＤＮＡ，ＰＣＲ
混合物１００μＬ当たり１μｇ；ＨＩＶ標的，１００コ
ピー／１００μＬ（ＨＩＶ−１ゲノムの単純完全コピー
を含有する８Ｅ５／ＬＡＶセルラインより入手した）。

【００７３】Taq 抗体（Taq ポリメラーゼに対してモル
比５０：１）およびＵＮＧを単独でそしてExo III との
種々の組合わせで、以下のように試料を調製した：（１）抗体もＵＮＧもExo III もなし（プライマー−ダ
イマー陽性対照）；（２）抗体のみ；（３）ＵＮＧのみ〔１単位／１００μＬＰＣＲ混合
物〕；（４）抗体およびＵＮＧ〔１単位／１００μＬＰＣＲ
混合物〕；（５）抗体およびＵＮＧ〔２単位／１００μＬＰＣＲ
混合物〕；（６）抗体およびExo III 〔２単位／１００μＬＰＣ
Ｒ混合物〕；（７）抗体、ＵＮＧおよびExo III 〔それぞれ１単位お
よび２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（８）抗体、ＵＮＧおよびExo III 〔各々２単位／１０
０μＬＰＣＲ混合物〕。

【００７４】Clinical DiagnosticsのＰＣＲパウチおよ
び原型分析器を、この実験に使用した。すべての試料を
ＰＣＲの前に室温で４時間おいて、プライマー−ダイマ
ーを形成させた。ＵＮＧを使用するために４時間室温で
インキュベーション後にさらに予備増幅条件を必要と
し、それは以下の通りであった。（１）ＵＮＧプライマ
ー−ダイマー分解のため２分間５０℃でインキュベーシ
ョン、および（２）ＵＮＧ変性のため１０分間９５℃で
インキュベーション。これらの２種のモデル系用の標準
ＰＣＲサイクル・パラメーターを、これらの追加インキ
ュベーション直後に用いた（９５℃で１５秒間融解し、
そして６８℃で３５秒間アニーリングおよび伸長させ
た）。ＰＣＲ直後にＰＣＲ生成物をパウチから採取し、
そして２．５％アガロースゲルに流して臭化エチジウム
で染色した。次いでポラロイドカメラ（Polaroid camer
a)でゲルの写真を撮った。ＰＣＲ生成物およびプライマ
ー−ダイマー複合体について試料と試料を比較し、結果
を以下に示した。

【００７５】

【表８】

【００７６】ゲルの結果より、両プライマー系につい
て、抗体、Exo III およびＵＮＧの不存在下では、検出
可能なＰＣＲ生成物のバンドが存在せず、かつ強いプラ
イマー−ダイマーのバンドが存在することがわかる（試
料＃１）。ＳＭＡ７／２０ＰＣＲプライマー系の結果
は、Taq 抗体単独およびＵＮＧとの組合せ（試料＃２、
＃４および＃５）については弱いＰＣＲ生成物のバンド
を示し、一方強いＰＣＲ生成物のバンドは、Taq 抗体、
ＵＮＧおよびExo III の組合せ（試料＃７および＃８）
について認められる。プライマー−ダイマーのバンド
は、試料＃１、＃３、＃４および＃５と比較してさらに
低減される。これらの結果は、３種の誘発手段（trigge
ring method)すべての組合せが、プライマー−ダイマー
の制御を充分に増強しかつＰＣＲ増幅効率を増大する、
ＪＫＣＭＶ５３／５５ＰＣＲ系を用いた実施例３およ
び４で得られた結果と一致する。ＳＫ３８／ＢＷ１７
ＰＣＲプライマー系の結果は、３′相同性があまり広く
ないためにこの系でのプライマー−ダイマー形成があま
り過酷ではないことにより、先の結果とはわずかに異な
る。試料＃１と比較したとき、Taq 抗体単独（試料＃
２）およびＵＮＧ単独（試料＃３）について良好な結果
が得られる。しかしながら、誘発における直接の増強
が、Taq 抗体＋ＵＮＧ（試料＃４および＃５）、Taq 抗
体＋Exo III （試料＃６）ならびに３種の誘発手段すべ
ての組合せ（試料＃７）で認められる。この実験から、
Taq 抗体をエキソヌクレアーゼIII ともしくはウラシル
ｎ−グリコシラーゼとまたは両方と組み合わせること
は、ＰＣＲ誘発を増強し、従ってＰＣＲ増幅効率を増大
するという結論を下すことができる。

【００７７】実施例６ＰＣＲ生成物増幅のTaq 抗体誘発性を増強するエキソヌ
クレアーゼIII の濃度範囲を、この実験で求めた。プラ
イマー−ダイマー複合体を容易に形成する４つのヌクレ
オチドの３′重複領域を有する、ＪＫＣＭＶ５３／５
５プライマー・セットを用いた。Clinical Diagnostics
のＰＣＲパウチおよび原型分析器を、この実験に使用し
た。ＰＣＲ混合物は、以下の試薬を含むものであった。
１０× ＰＣＲ緩衝剤（５ｍＭマグネシウム）；ＪＫ
ＣＭＶ５３／５５プライマー，０．８μＭ；ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ，各々０．２ｍＭ；ｄＵＴＰ，
０．４ｍＭ；Taq ポリメラーゼ，ＰＣＲ混合物１００μ
Ｌ当たり８単位；ニシン精子ＤＮＡ，ＰＣＲ混合物１０
０μＬ当たり１μｇ；ＣＭＶ培養標的，１００，０００
×最終希釈。

【００７８】Taq 抗体（Taq ポリメラーゼに対してモル
比５０：１）を、対照（試料１）を除くすべての試料に
添加した。エキソヌクレアーゼIII を、０．００１単位
／μＬ（もしくは０．１単位／１００μＬＰＣＲ混合
物）〜０．２単位／μＬ（もしくは２０単位／１００μ
ＬＰＣＲ混合物）の示された濃度で試料に添加した。以
下の試料を試験した：（１）Taq 抗体もExo III もなし（プライマー−ダイマ
ー陽性対照）；（２）Taq 抗体のみ；（３）Taq 抗体＋Exo III 〔０．００１単位／μＬもし
くは０．１単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（４）Taq 抗体＋Exo III 〔０．００２５単位／μＬも
しくは０．２５単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（５）Taq 抗体＋Exo III 〔０．００５単位／μＬもし
くは０．５単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（６）Taq 抗体＋Exo III 〔０．００７５単位／μＬも
しくは０．７５単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（７）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０１単位／μＬもしく
は１単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（８）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０２５単位／μＬもし
くは２．５単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（９）Taq 抗体＋Exo III 〔０．０５単位／μＬもしく
は５単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１０）Taq 抗体＋Exo III 〔０．１単位／μＬもしく
は１０単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１１）Taq 抗体＋Exo III 〔０．１５単位／μＬもし
くは１５単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（１２）Taq 抗体＋Exo III 〔０．２単位／μＬもしく
は２０単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；

【００７９】すべての試料をＰＣＲ前に室温で２時間イ
ンキュベートした。標準ＰＣＲパラメーターを使用する
前に、追加のインキュベーションは全く行わなかった。
Taq抗体およびエキソヌクレアーゼIII の両方を加熱変
性するために、同様にＰＣＲ混合物中の二本鎖ＤＮＡを
分離するために、９５℃で１８０秒間試料の予備加熱を
行った。ＰＣＲを４０サイクル行った（９５℃で１５秒
間融解し、そして６８℃で３５秒間アニーリングおよび
伸長させた）。次いでＰＣＲ生成物をＰＣＲパウチから
採取し、そして２．５％アガロースゲルに流して臭化エ
チジウムで染色した。次いでポラロイドカメラ（Polaro
id camera)でゲルの写真を撮った。ＰＣＲ生成物および
プライマー−ダイマー複合体について試料と試料を比較
し、結果を以下に示した。

【００８０】

【表９】

【００８１】これらのデータから、０．００２５単位／
μＬ〜０．０５単位／μＬ（０．２５単位〜５単位／１
００μＬＰＣＲ混合物）の範囲のエキソヌクレアーゼ
IIIが効果的にTaq 抗体誘発性を増強することが決定
し、エキソヌクレアーゼIII の濃度が０．００７５単位
〜０．０２５単位／μＬ（０．７５単位〜２．５単位／
１００μＬＰＣＲ混合物）のとき最良の結果が得られ
た。

【００８２】実施例７ Exo III の存在下または不存在下でTaq 抗体誘発性を増
強するＵＮＧの濃度範囲を、この実験で求めた。プライ
マー−ダイマー複合体を容易に形成する４つのヌクレオ
チドの３′重複領域を有する、ＪＫＣＭＶ５３／５５
プライマー・セットを用いた。Clinical Diagnosticsの
ＰＣＲパウチおよび原型分析器を、この実験に使用し
た。ＰＣＲ混合物は、以下の試薬を含むものであった。
１０ＸＰＣＲ緩衝剤（５ｍＭマグネシウム）；ＪＫ
ＣＭＶ５３／５５プライマー，０．８μＭ；ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ，各々０．２ｍＭ；ｄＵＴＰ，
０．４ｍＭ；Taq ポリメラーゼ，ＰＣＲ混合物１００μ
Ｌ当たり８単位；ニシン精子ＤＮＡ，ＰＣＲ混合物１０
０μＬ当たり１μｇ；ＣＭＶ培養標的，１００，０００
×最終希釈。

【００８３】Taq 抗体（Taq ポリメラーゼに対してモル
比５０：１）を、対照（試料１）を除くすべての試料に
添加した。ＵＮＧを、０．０００１単位／μＬ（もしく
は０．０１単位／１００μＬＰＣＲ混合物）の濃度で
試料に添加した。Exo III ，０．０２単位／μＬもしく
は２単位／１００μＬＰＣＲ混合物の存在下（＋）ま
たは不存在下（−）の両方について、以下の試料を試験
した。（１）Taq 抗体もＵＮＧもなし（プライマー−ダイマー
陽性対照）；（２）Taq 抗体のみ；（３）Taq 抗体＋ＵＮＧ〔０．０００１単位／μＬもし
くは０．０１単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（４）Taq 抗体＋ＵＮＧ〔０．０００５単位／μＬもし
くは０．０５単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（５）Taq 抗体＋ＵＮＧ〔０．００１単位／μＬもしく
は０．１単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（６）Taq 抗体＋ＵＮＧ〔０．００５単位／μＬもしく
は０．５単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（７）Taq 抗体＋ＵＮＧ〔０．０１単位／μＬもしくは
１単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；（８）Taq 抗体＋ＵＮＧ〔０．０２単位／μＬもしくは
２単位／１００μＬＰＣＲ混合物〕；

【００８４】すべての試料をＰＣＲ前に室温で２時間イ
ンキュベートした。ＵＮＧ（必要とされるとき）、Taq
抗体およびエキソヌクレアーゼIII を加熱変性するため
に、同様にＰＣＲ混合物中の二本鎖ＤＮＡを分離するた
めに、９５℃で１０分間試料の予備加熱を行った。ＰＣ
Ｒを４０サイクル行った（９５℃で１５秒間融解し、そ
して６８℃で３５秒間アニーリングおよび伸長させ
た）。次いでＰＣＲ生成物をＰＣＲパウチから採取し、
そして２．５％アガロースゲルに流して臭化エチジウム
で染色した。次いでポラロイドカメラ（Polaroid camer
a)でゲルの写真を撮った。ＰＣＲ生成物およびプライマ
ー−ダイマー複合体について試料と試料を比較し、結果
を以下に示した。

【００８５】

【表１０】

【００８６】これらのデータから、Taq 抗体を併用して
プライマー−ダイマー形成を制御するのに有効であるＵ
ＮＧの範囲は、エキソヌクレアーゼIII が試料に含まれ
ているかどうかに依存することが認められる。Exo III
を含まない試料について、０．００５〜０．０２単位／
μＬ（０．５〜２単位／１００μＬＰＣＲ混合物）間
の濃度で、誘発性増強を示した。Exo III を含む試料に
ついて、試験された第１濃度（０．０００１単位／μＬ
もしくは０．０１単位／１００μＬ）で、直接の陽性効
果が認められた。この陽性効果は、添加されたＵＮＧの
０．０２単位／μＬもしくは２単位／１００μＬＰＣ
Ｒ混合物までのすべての濃度について具体的に示され
る。保存試料が比較的低い濃度（１単位／μＬ）であり
かつそのコストが高いため、より高濃度のＵＮＧについ
ては試験しなかった。これは平均ではないが、しかしな
がらより高濃度のＵＮＧについては実施されないだろ
う。

【００８７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列 CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT 27

【００８８】配列番号：２配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列 TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT 24

【００８９】配列番号：３配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列 AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA 28

【００９０】配列番号：４配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列 CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC 30

【００９１】配列番号：５配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28

【００９２】配列番号：６配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 16/40 8517−4ＨＣ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/34 6807−4ＢＣ１２Ｑ 1/34 1/44 6807−4Ｂ 1/44 1/48 6807−4Ｂ 1/48 Ｚ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者デビッドロバートパターソンアメリカ合衆国，ニューヨーク 14607, ロチェスター，ザイヤーストリート 33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）標的核酸を含むと思われる試料
に、（１）前記標的核酸の領域に対してこれにハイブリ
ダイズするに十分な相補性を示す少なくとも２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、（２）少なくとも４種のヌ
クレオシドトリホスフェート、（３）耐熱性重合剤、
（４）前記重合剤に特異的な少なくとも１種の抗体、並
びにエキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼの少なくと
も一方、を接触させて反応混合物を形成させる工程と、（ｂ）前記反応混合物を加熱して前記抗体、エキソヌク
レアーゼ及び／又はグリコシラーゼを変性させる工程
と、（ｃ）プライマー伸長生成物を形成させる工程とを含
む、標的核酸を増幅するための方法。
【請求項２】前記標的核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記ヌクレオシドトリホスフェートがデ
オキシリボヌクレオシドトリホスフェートである、請求
項１に記載の方法。
【請求項４】前記デオキシリボヌクレオシドトリホス
フェートがｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ
である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記デオキシリボヌクレオシドトリホス
フェートがｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＵＴＰ
である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】前記重合剤がＤＮＡポリメラーゼであ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・
アクアティクス（thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）ポリ
メラーゼ、サーマス・サーモフィルス（thermus thermo
philus）ポリメラーゼ及びサーモコッカス・リトラリス
（thermococcus litoralis）ポリメラーゼから成る群よ
り選ばれた、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記抗体がモノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌク
レアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、λエキソヌク
レアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ
ＩＩ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ及びＢＡＬ３１
ヌクレアーゼから成る群より選ばれた、請求項１に記載
の方法。
【請求項１０】前記エキソヌクレアーゼがエキソヌク
レアーゼＩＩＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記グリコシラーゼがウラシル−Ｎ−
グリコシラーゼ（ＵＮＧ）である、請求項１に記載の方
法。
【請求項１２】前記加熱の温度が８５℃〜９５℃であ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記耐熱性重合剤がＴａｑポリメラー
ゼであり、前記抗体がＴａｑポリメラーゼに対するモノ
クローナル抗体であり、前記エキソヌクレアーゼがエキ
ソヌクレアーゼＩＩＩであり、そして前記グリコシラー
ゼがウラシル−Ｎ−グリコシラーゼである、請求項１に
記載の方法。
【請求項１４】前記モノクローナル抗体が、ハイブリ
ドーマ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１８０７）より生産さ
れたＴＰ４−９．２及びハイブリドーマ（ＡＴＣＣ寄託
番号ＨＢ１１１２７）より生産されたＴＰ１−１２．２
の少なくとも一方である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】プライマー伸長生成物を検出する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記検出を、蛍光性化合物が二本鎖Ｄ
ＮＡに結合した際に誘発される蛍光変化を測定する方法
で実施する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】ＰＣＲ法において非特異的核酸の形成
を減少させ且つ標的核酸の増幅効率を高める方法であっ
て、（ａ）標的核酸を含む試料を、耐熱性重合剤、前記重合
剤に特異的な少なくとも１種の抗体、並びにエキソヌク
レアーゼ及びグリコシラーゼの少なくとも一方を含むＰ
ＣＲ用試薬と接触させる工程と、（ｂ）前記試料を加熱して前記抗体、エキソヌクレアー
ゼ及びグリコシラーゼを変性させる工程と、（ｃ）前記標的核酸を増幅する工程とを含む方法。
【請求項１８】前記標的核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであ
る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】前記ヌクレオシドトリホスフェートが
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートである、請
求項１７に記載の方法。
【請求項２０】前記デオキシリボヌクレオシドトリホ
スフェートがｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴ
Ｐである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記デオキシリボヌクレオシドトリホ
スフェートがｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＵＴ
Ｐである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】前記重合剤がＤＮＡポリメラーゼであ
る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】前記ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス
・アクアティクス（thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）ポ
リメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（thermus ther
mophilus）ポリメラーゼ及びサーモコッカス・リトラリ
ス（thermococcus litoralis）ポリメラーゼから成る群
より選ばれた、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記抗体がモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌ
クレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及びλエキソ
ヌクレアーゼから成る群より選ばれた、請求項１７に記
載の方法。
【請求項２６】前記エキソヌクレアーゼがエキソヌク
レアーゼＩＩＩである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】前記グリコシラーゼがウラシル−Ｎ−
グリコシラーゼ（ＵＮＧ）である、請求項１７に記載の
方法。
【請求項２８】前記加熱の温度が８５℃〜９５℃であ
る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】前記耐熱性重合剤がＴａｑポリメラー
ゼであり、前記抗体がＴａｑポリメラーゼに対するモノ
クローナル抗体であり、前記エキソヌクレアーゼがエキ
ソヌクレアーゼＩＩＩであり、そして前記グリコシラー
ゼがウラシル−Ｎ−グリコシラーゼである、請求項１７
に記載の方法。
【請求項３０】前記モノクローナル抗体が、ハイブリ
ドーマ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１８０７）より生産さ
れたＴＰ４−９．２及びハイブリドーマ（ＡＴＣＣ寄託
番号ＨＢ１１１２７）より生産されたＴＰ１−１２．２
の少なくとも一方である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】核酸を増幅するためのキットであっ
て、同じ容器又は別個の容器に、耐熱性重合剤と、前記
重合剤に特異的な抗体と、エキソヌクレアーゼとを含
む、核酸を増幅するためのキット。
【請求項３２】同じ容器又は別個の容器に、前記重合
剤に特異的な第二の抗体をさらに含む、請求項３１に記
載のキット。
【請求項３３】同じ容器又は別個の容器に、前記重合
剤に特異的な第二の抗体をさらに含む、請求項３１又は
３２に記載のキット。
【請求項３４】標的核酸を増幅するためのキットであ
って、同じ容器又は別個の容器に、耐熱性重合剤と、前
記重合剤に特異的な抗体と、グリコシラーゼとを含む、
核酸を増幅するためのキット。
【請求項３５】前記重合剤が、サーマス・アクアティ
クス（thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼ、
サーマス・サーモフィルス（thermus thermophilus）ポ
リメラーゼ及びサーモコッカス・リトラリス（thermoco
ccus litoralis）ポリメラーゼから成る群より選ばれ
た、請求項３１、３２又は３４に記載のキット。
【請求項３６】前記重合剤がサーマス・アクアティク
ス（thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼであ
る、請求項３１、３２又は３４に記載のキット。
【請求項３７】前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌ
クレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌク
レアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ
ＩＩ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ及びＢＡＬ３１
ヌクレアーゼから成る群より選ばれた、請求項３１又は
３２に記載のキット。
【請求項３８】前記エキソヌクレアーゼがエキソヌク
レアーゼＩＩＩである、請求項３１又は３２に記載のキ
ット。
【請求項３９】前記グリコシラーゼがウラシル−Ｎ−
グリコシラーゼである、請求項３１又は３２に記載のキ
ット。
【請求項４０】同じ容器又は別個の容器に、特定のＰ
ＣＲ重合剤に特異的な抗体と、エキソヌクレアーゼとを
含む、核酸を増幅するためのキット。
【請求項４１】同じ容器又は別個の容器に、特定のＰ
ＣＲ重合剤に特異的な抗体と、グリコシラーゼとを含
む、核酸を増幅するためのキット。
【請求項４２】前記グリコシラーゼがウラシル−Ｎ−
グリコシラーゼである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌ
クレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及びλエキソ
ヌクレアーゼから成る群より選ばれた、請求項４０に記
載のキット。
【請求項４４】前記エキソヌクレアーゼがエキソヌク
レアーゼＩＩＩである、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】同じ容器又は別個の容器にグリコシラ
ーゼをさらに含む、請求項４０又は４１に記載のキッ
ト。
【請求項４６】同じ容器又は別個の容器に前記重合剤
に特異的な第二の抗体を含む、請求項４０又は４１に記
載のキット。
【請求項４７】同じ容器又は別個の容器に前記重合剤
に特異的な第二の抗体をさらに含む、請求項４５に記載
のキット。
【請求項４８】重合剤を使用するＰＣＲ用組成物であ
って、前記重合剤に特異的な少なくとも１種の抗体並び
にエキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼの少なくとも
一方を含むＰＣＲ用組成物。
【請求項４９】少なくとも２種のオリゴヌクレオチド
プライマーをさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】少なくとも４種のヌクレオシドトリホ
スフェートをさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】耐熱性である前記重合剤をさらに含
む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】前記重合剤がＤＮＡポリメラーゼであ
る、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】前記ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス
・アクアティクス（thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）ポ
リメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（thermus ther
mophilus）ポリメラーゼ及びサーモコッカス・リトラリ
ス（thermococcus litoralis）ポリメラーゼから成る群
より選ばれた、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】前記抗体がモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５５】前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌ
クレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及びλエキソ
ヌクレアーゼから成る群より選ばれた、請求項４８に記
載の組成物。
【請求項５６】前記エキソヌクレアーゼがエキソヌク
レアーゼＩＩＩである、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】前記グリコシラーゼがウラシル−Ｎ−
グリコシラーゼである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５８】前記モノクローナル抗体が、ハイブリ
ドーマ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１８０７）より生産さ
れたＴＰ４−９．２及びハイブリドーマ（ＡＴＣＣ寄託
番号ＨＢ１１１２７）より生産されたＴＰ１−１２．２
の少なくとも一方である、請求項５４に記載の組成物。