WO2021120095A1 - 抗聚合酶的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗聚合酶的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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郭苗苗
席凤
董宇亮
徐崇钧
章文蔚
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Abstract

提供了一种抗高保真聚合酶的单克隆抗体及其应用。所提供的单克隆抗体包括重链高变区和轻链高变区，所述重链高变区和所述轻链高变区包括下列至少之一：(1)所述重链高变区包括选自ASGYPFSTY、DKSSST和EGITTLVAPMDY中的至少一种，所述轻链高变区包括选自SSVTYMHWY、RVEAED和KLELKRADAAPT中的至少一种；(2)与(1)相比，所述重链高变区至少具有一个保守氨基酸取代，和/或所述轻链高变区至少具有一个保守氨基酸取代。所提供的单克隆抗体用于聚合酶链式反应中，特异性强，准确性高。

Description

抗聚合酶的单克隆抗体及其应用 技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗聚合酶的单克隆抗体及其应用。
背景技术
PCR技术在应用时存在着非特异性扩增产物的出现、引物二聚体的形成或凝胶电泳上无扩增带的问题，例如在室温配置PCR反应体系的过程中，由于低严谨度的引物错配，在聚合酶活性存在的情况下，会进行非特异性的扩增现象，进而在后续PCR反应过程中消耗引物和其他成分，最终导致引物二聚体及非特异性条带的产生，目标DNA条带产量的降低，甚至扩增不出目标产物现象的产生。
通常通过热启动PCR技术来解决PCR扩增过程中的上述问题。例如，在热启动PCR技术中通过特定的热启动DNA聚合酶(抗体热启动酶)来帮助实现热启动PCR的过程，抗体热启动酶抗聚合酶的单克隆抗体，抗聚合酶的单克隆抗体和聚合酶孵育后形成复合物，高温加热前抗聚合酶的单克隆抗体与聚合酶结合从而中和了高保真聚合酶的外切和聚合活性，从而达到抑制低温条件下或预变性前升温阶段由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的聚合酶非特异性扩增作用；高温加热后，抗聚合酶的单克隆抗体失活，高保真聚合酶恢复活性，从而实现正常扩增作用。
然而不同的抗体对聚合酶的中和效果也参差不齐，有关抗聚合酶的单克隆抗体还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一，本发明的目的在于提供一种抗聚合酶的单克隆抗体及其应用，所提供的单克隆抗体与聚合酶，尤其是高保真的聚合酶具有高亲和力，同时能够特异性中和高保真DNA聚合酶的聚合和3’-5’外切作用，可以应用于聚合酶链式反应(PCR)中。
针对抗聚合酶的单克隆抗体的抗原表位不同，单克隆抗体的性能会有不同。本发明所提供的抗聚合酶的单克隆抗体以KOD DNA聚合酶特定表位作为抗原，经过筛选获得。所提供的单克隆抗体与已报道的针对高保真聚合酶的单克隆抗体相比，效果更佳，具体表现为：用于中和聚合酶的聚合活性或者3’-5’外切活性时，所用到的单克隆抗体的量更少，由此应用于PCR反应中，效果更佳，PCR扩增的特异性更强。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种单克隆抗体，包括重链高变区和轻链高变区，所述重链高变区和所述轻链高变区包括下列至少之一：(1)所述重链高变区包括选自ASGYPFSTY、DKSSST和EGITTLVAPMDY中的至少一种，所述轻链高变区包括选自SSVTYMHWY、RVEAED和KLELKRADAAPT中的至少一种；(2)与(1)相比，所述重链高变区至少具有一个保守氨基酸取代，和/或所述轻链高变区至少具有一个保守氨基酸取代。
本发明所提供的单克隆抗体，与高保真的DNA聚合酶具有高的亲和力，同时能够特异性中和高保真DNA聚合酶的聚合和3’-5’外切作用，可以应用于聚合酶链式反应(PCR)中，PCR扩增的特异性更强，准确性更高，效果更佳。以针对KOD聚合酶的已有单克隆抗体为例，本发明所提供的单克隆抗体仅需要已有单克隆抗体的1/8的使用量，即可以达到中和KOD聚合酶的聚合活性和3’-5’外切活性的目的。而且，在应用于PCR反应时，利用低起始量的模板进行PCR扩增，就可以获得高产量、特异性好的PCR扩增产物。
根据本发明的实施例，以上所述的单克隆抗体可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述单克隆抗体包括下列至少之一：(a)具有SEQ ID NO:1所示重链可变区和SEQ ID NO:2所示轻链可变区；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。本发明所提供的单克隆抗体的重链可变区可以为SEQ ID NO:1所示序列，轻链可变区可以为SEQ ID NO:2所示序列；也可以在SEQ ID NO:1所示序列或者SEQ ID NO:2所示序列的基础上，进行至少一个保守氨基酸取代，例如可以是1个保守氨基酸取代，2个保守氨基酸序列，3个保守氨基酸取代，4个保守氨基酸取代等等。这些保守氨基酸取代优选发生在重链可变区和轻链可变区的非高变区域。由此所提供的单克隆抗体具有对高保真DNA聚合酶具有高的亲和力，应用于PCR反应中，特异性强，准确性高。
在本发明的一些实施例中，所述重链可变区由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列编码，所述轻链可变区由SEQ ID NO:4所示核苷酸序列编码。应用SEQ ID NO:3所示核苷酸序列和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列编码相应的重链可变区肽段和轻链可变区肽段，所表达的单克隆抗体对于高保真DNA聚合酶具有高的亲和力，应用于PCR反应中，特异性强，准确性高。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面任一实施例所述的单克隆抗体。
根据本发明的实施例，以上所述的分离的多核苷酸可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述多核苷酸为具有下列至少之一的核苷酸序列：
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；
与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列；和/或
与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列。
在本发明的一些实施例中，所述多核苷酸为具有下列至少之一的核苷酸序列：与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相比，具有95％以上同源性的序列；和/或与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列相比，具有95％以上同源性的序列。
在本发明的一些实施例中，所述多核苷酸为具有下列至少之一的核苷酸序列：与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相比，具有98％以上同源性的序列；和/或与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列相比，具有98％以上同源性的序列。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第二方面任一实施例所述的多核苷酸。应用所提供的表达载体可以用于单克隆抗体的体外制备，例如可以将包含多核苷酸的表达载体导入到宿主细胞中，然后通过培养宿主细胞获得大量的单克隆抗体，所获得的单克隆抗体可以用于PCR反应中，或者和高保证DNA聚合酶复合，用于PCR反应中。
根据本发明的实施例，以上所述的表达载体可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述表达载体进一步包括控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操作地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。
在本发明的一些实施例中，所述控制元件包括下列至少之一：启动子、增强子和终止子。
在本发明的一些实施例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞包含本发明第三方面任一实施例所述的表达载体。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种制备单克隆抗体的方法，所述制备单克隆抗体的方法包括培养本发明第四方面所述的重组细胞。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种复合物，所述复合物包括本发明第一方面任一实施例所述的单克隆抗体和DNA聚合酶。
根据本发明的实施例，以上所述的复合物可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述DNA聚合酶选自KOD DNA聚合酶、KAPA HiFi聚合酶中的至少一种。本发明所提供的单克隆抗体对高保真DNA聚合酶，尤其是KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶均有高的亲和作用，表现为对这两种高保真聚合酶的聚合活性、外切活性都有中和作用。从而可以将所提供的单克隆抗体和DNA聚合酶形成复合物，应用于PCR反应过程中，在低温条件下抑制DNA聚合酶的聚合活性和外切活性，避免引物的非特异性退火和非特异性扩增，提高PCR扩增的准确性。
在本发明的一些实施例中，所述单克隆抗体与所述DNA聚合酶的质量比为1:1～5:1。由此所形成的复合物中单克隆抗体可以中和DNA聚合酶的聚合活性以及3’-5’的外切活性， 在抑制升温之前引物的非特异性退火或者引物二聚体所引起的非特异性扩增作用，提高PCR扩增的准确性。
根据本发明的第七方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的单克隆抗体或者本发明第六方面所述的复合物。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种聚合酶链式反应，所述聚合酶链式方式包括利用本发明第一方面任一实施例所述的单克隆抗体或者本发明第六方面任一实施例所述的复合物或者本发明第七方面所述的试剂盒进行。
在本发明的一些实施例中，所述聚合酶链式反应中所述DNA样品的起始量为0.1-5纳克。由此可以用于低起始量DNA的特异性扩增。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明的实施例提供的不同单克隆抗体对KOD DNA聚合酶聚合活性的作用结果；
图2是根据本发明的实施例提供的不同单克隆抗体对KOD DNA聚合酶外切活性的作用结果；
图3是根据本发明的实施例提供的3H10单克隆抗体与不同DNA聚合酶的亲和活性结果；
图4是根据本发明的实施例提供的3H10单克隆抗体的SDS-PAGE结果图；
图5是根据本发明的实施例提供的不同单克隆抗体对KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶聚合活性的作用效果；
图6是根据本发明的实施例提供的不同单克隆抗体对KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶外切活性的作用效果；
图7是根据本发明的实施例提供的不同PCR反应对应的琼脂糖凝胶结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对本发明描述的过程中，对于文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅 仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。
本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。
在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。为了表述上的方便，位于重链上的CDR区也称为重链高变区，位于轻链上的CDR区也称为轻链高变区。
本文中，单克隆抗体是指的高度均一的，仅针对某一特定抗原表位的抗体。
本发明以KOD DNA聚合酶作为抗原免疫小鼠，然后取小鼠脾脏与骨髓瘤融合后，获得杂交瘤细胞，经过筛选获得具有中和DNA聚合酶聚合活性和外切活性的单克隆抗体。并经过验证，确定该单克隆抗体能够有效在常温或低温条件下抑制DNA聚合酶的聚合活性及外切活性。所提供的单克隆抗体可以应用于热启动聚合酶产品以及聚合酶链式反应中。
为此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体，包括重链高变区和轻链高变区，所述重链高变区和所述轻链高变区包括下列至少之一：(1)所述重链高变区包括选自ASGYPFSTY、DKSSST和EGITTLVAPMDY中的至少一种，所述轻链高变区包括选自SSVTYMHWY、RVEAED和KLELKRADAAPT中的至少一种；(2)与(1)相比，所述重链高变区至少具有一个保守氨基酸取代，和/或所述轻链高变区至少具有一个保守氨基酸取代。
本文中，“保守氨基酸取代”指的是在生物学上、化学上或者结构上，氨基酸被另一相似氨基酸所取代。生物学上相似的氨基酸指的是通过氨基酸的取代不会破坏所提供的单克隆抗体的生物学活性。结构上相似的氨基酸指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学上相似的氨基酸指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的，例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代，或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。本领域技术人员可以根据所提供的单克隆抗体的重链高变区和轻链高变区氨基酸序列进行一个氨基酸的取代，两个氨基酸的取代或者三个氨基酸的取代，所进行的取代和变换也包含在本发明所要求保护的范围之内。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体，所提供的单克隆抗体包括下列至少之一：(a)具有SEQ ID NO:1所示重链可变区和SEQ ID NO:2所示轻链可变区；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。
其中，所提供的一种单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。另外，所提供的单克隆抗体也可以是和SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列相比，进行至少一个保守氨基酸取代。例如可以具体为一个保守氨基酸取代、两个保守氨基酸取代、三个保守氨基酸取代，四个保守氨基酸取代。这些保守氨基酸取代优先发生在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列中除重链高变区和轻链高变区之外的区域。
其中SEQ ID NO:1所示序列如下：
Figure PCTCN2019126582-appb-000001
SEQ ID NO:2所示序列如下：
Figure PCTCN2019126582-appb-000002
根据本发明的实施例，编码上述重链可变区的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:3所示：
Figure PCTCN2019126582-appb-000003
根据本发明的实施例，编码上述轻链可变区的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:4所示：
Figure PCTCN2019126582-appb-000004
Figure PCTCN2019126582-appb-000005
需要说明的是，基于碱基简并性原则，编码上述重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列以及编码上述轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列并不是序列唯一恒定的序列，任何能够编码相同的重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列或者能够编码相同的轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列，都在本发明所要求保护的多核苷酸范围内。
在本发明的又一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码上述单克隆抗体的核苷酸。所称的分离的多核苷酸可以是DNA分子，也可以是RNA分子，其可以包含在任何合适的载体中，例如质粒、人工染色体、噬菌体或者病毒载体等等。
根据本发明的实施例，所提供的分离的多核苷酸可以为包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的核苷酸序列。也可以是与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相比，具有80％以上同源性的序列、具有85％以上同源性的序列、具有90％以上同源性的序列，优选具有95％以上同源性的序列，更优选具有98％以上同源性的序列。或者也可以是与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列相比，具有80％以上同源性的序列、具有85％以上同源性的序列、具有90％以上同源性的序列，优选具有95％以上同源性的序列，更优选具有98％以上同源性的序列。
在本发明的另一方面，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的多核苷酸。本文中所称的表达载体，在本领域也通常被称为克隆载体或者载体，指可以将DNA序列或者RNA序列引入到宿主细胞的载体，其可以用于转化到宿主细胞中，并促进核酸序列的表达，例如促进转录和翻译。这种表达载体可以包含控制元件，例如启动子、增强子、终止子等，用于引起或指导多肽的表达。用于动物细胞的表达载体的启动子和激活子的实施例包括SV40早期启动子和激活子等。合适的载体可以是质粒，例如一些包含复制起点的质粒或者整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。可用的病毒载体包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。此类病毒载体可通过本领域技术人员熟知的技术生产，例如通过病毒的瞬时转染或者稳定转染获得。在进行病毒转染时，可用到的转染细胞可以是PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有上述所述的表达载体。所提供的重组细胞可以通过将表达载体转化到宿主细胞中获得。例如可以通过表达载体将外源基因或者DNA序列或者RNA序列引入到宿主细胞中，以便使得宿主细胞表达所引入的基因或者序列，来产生想要的物质，这些想要的物质通常是由基因或者引入序列所编码的蛋白质，在本文中具体指的是想要的单克隆抗体。常用的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌宿主细胞(在导入时常用质粒载体)、昆虫宿主细胞(在导入时常用杆状病毒载体)，以及哺乳动物宿主细胞。例如，还可以包括原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体的哺乳动物宿主细胞可以为Vero细胞、CHO 细胞、3T3细胞、COS细胞等。
通过在合适的条件下培养上述提供的重组细胞，可以获得所提供的单克隆抗体。在培养所述重组细胞时，可以采用本领域技术人员已知的任何生产技术，例如任何化学上、生物学上、遗传学上或者酶学技术，这些技术可以单独或者组合应用。所获得的单克隆抗体可以通过常规的蛋白纯化方法进行分离和纯化，例如可以通过羟基磷灰石层析、凝胶电泳、亲和透析或色谱法等常规的蛋白纯化方法进行分离和纯化。
在本发明的另一个方面，本发明还提供了一种复合物，所述复合物包括上述提供的单克隆抗体和DNA聚合酶。本文中，所称“复合物”是指两种或两种以上的不同物质所形成的具有一定特性的结合体，所提供的复合物包括上述提供的单克隆抗体和DNA聚合酶，所提供的单克隆抗体和DNA聚合酶形成复合物，应用于PCR反应过程中，在常温或者低温条件下，可以抑制引物的非特异性退火或者非特异性扩增，从而可以提高PCR反应的特异性，提高PCR反应的准确性。可用的DNA聚合酶为具有高保真性能的DNA聚合酶，包括但不限于KOD DNA聚合酶、KAPA HiFi聚合酶等等。以KOD DNA聚合酶为例，KOD DNA聚合酶是从日本鹿儿岛县小宝(Kodakara)岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌Thermococcus kodakaraensis KOD1分离出来的、具有高扩增能力和高保真性的DNA聚合酶，其相较于传统的DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶或者Pfu DNA聚合酶具有更快更准确的PCR扩增效果。KOD DNA聚合酶可以通过自制获得，也可以直接通过购买获得。根据本发明的实施例，所提供的单克隆抗体和DNA聚合酶的质量比可以为1:1～5:1，例如可以为1:1，也可以是2:1,3:1,4:1或者5：1。
另外，上述单克隆抗体或者上述复合物还可以作为试剂盒的一部分，用作DNA聚合酶的检测。利用所提供的试剂盒可以用于检测DNA聚合酶的聚合活性或者中和活性。试剂盒中同时还可以含有本领域常用的PCR反应的试剂，例如缓冲液，dNTP混合物等等，用作聚合酶链式反应。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1免疫小鼠
取KOD DNA聚合酶(购自于Genview，货号为GK1101-250U)作为抗原，将抗原和弗氏完全佐剂溶于PBS中，腹腔注射C57小鼠，进行小鼠免疫，三次常规免疫后，采用试剂盒(Rabbit Anti-Mouse IgG购自abcam，货号为ab6728；EL-TMB显色试剂盒购自生工，货号为C520026-500)对血清进行ELISA检测。
将KOD DNA聚合酶抗原包被于酶标条上，孵育血清稀释液，再以带HRP的抗小鼠IgG的抗体孵育，最后以TMB显色，测定OD450值。
表1为免疫小鼠血清效价ELISA检测结果。
表1免疫小鼠血清效价ELISA检测
Figure PCTCN2019126582-appb-000006
从表1可以看出，2号小鼠、4号小鼠以及5号小鼠的效价较高，选择这些小鼠进行下一步实验。
实施例2细胞融合
实施例2利用骨髓瘤细胞和脾细胞制备杂交瘤细胞，包括如下步骤：
(1)骨髓瘤细胞的制备
培养SP2/0Ag14骨髓瘤细胞(购自于ATCC)，培养至生长状态好形态佳，融合前将细胞培养至对数生长期，并获得细胞悬液。
(2)脾细胞的制备
选取效价最高的数只小鼠，将小鼠处死。固定解剖板上，取出脾脏，置于新鲜培养基中，去除黏连组织，研磨脾脏，200目筛网过滤，洗涤后加入红细胞裂解液裂解10min，加新鲜培养基稀释，离心去上清，重新溶解于培养基中，测细胞密度，将细胞稀释至一定浓度。
(3)细胞融合
将上述SP2/0 Ag14骨髓瘤细胞与脾细胞按细胞数为1:10混合，后加入聚乙二醇2000(PEG2000)进行融合，获得杂交瘤细胞，将获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中进行加压，然后加入96孔板中进行培养，获得杂交瘤主克隆。
实施例3杂交瘤细胞亚克隆筛选
将实施例2中的96孔板杂交瘤细胞进行亚克隆培养，2周后，取上清利用ELISA试剂盒鉴定上清中抗体阳性值。筛选获得阳性细胞株。其中Rabbit Anti-Mouse IgG购自abcam，货号为ab6728。EL-TMB显色试剂盒购自生工，货号为C520026-500。包括如下步骤：
(1)将KOD DNA聚合酶抗原100μl(浓度1μg/ml)过夜包被于酶标条上。加200μl PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加200μl PBS震荡洗涤10min，洗涤3次。
(2)加入1％BSA-PBS 200μl，37℃封闭2h。加200μl PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加200μl PBS震荡洗涤10min，洗涤3次。
(3)加入稀释后上清100μl，37℃孵育2h。加200μl PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加200μl PBS震荡洗涤10min，洗涤3次。
(4)加入稀释的商品辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠抗体100μl，37℃孵育1h。加200μl PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加200μl PBS震荡洗涤10min，洗涤3次。
(5)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色10min。
(6)加入50μl浓度为0.1mol/L的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度。
表2显示了经过ELISA筛选所获得的100株克隆株的OD450数值。
表2 ELISA筛选100株克隆株
细胞株 OD450 细胞株 OD450 细胞株 OD450 细胞株 OD450
1H2 2.515 7E10 1.322 13F1 3.322 21C8 1.578
1F1 2.488 8H1 3.204 13E4 3.035 21C11 1.380
2B1 1.069 8D1 3.454 13D1 3.683 21B11 1.248
2H1 1.026 8A6 2.878 13C5 3.204 21B7 1.246
2H3 0.993 8E5 1.845 13F3 2.884 21F11 2.114
2D1 0.872 9F6 3.308 13B4 2.610 22H1 3.241
2G2 0.769 9H3 3.199 14B7 1.327 22G5 2.773
3A11 3.726 9G4 3.061 14A12 2.751 22E1 2.751
3F11 3.586 9H6 2.510 15A2 1.370 22G2 2.748
3C11 3.561 9D3 2.716 15G2 1.202 22E2 1.882
3H10 3.209 9E4 2.353 15C1 0.995 22F6 1.684
3F7 3.100 9E6 1.667 16D6 2.473 22A3 1.174
3D8 3.167 10A1 1.583 16D3 2.092 22E7 1.958
3H7 2.616 10F5 2.411 16B5 0.816 23G11 2.080
4C6 1.587 10B10 2.001 16B4 0.089 23D11 1.757
4F3 1.446 11H1 1.446 17A4 2.146 23F8 1.454
4E4 1.301 11F4 1.301 18G8 2.388 23D12 1.119
4C1 0.839 12G12 3.105 19D4 1.907 23E9 1.007
5D7 2.324 12F10 2.826 19E1 1.321 23C8 0.925
5D9 1.899 12F12 2.826 20A7 1.877 23E7 0.630
6G3 2.515 12A8 2.820 20H7 2.120 24C2 1.831
7A10 3.551 12C12 2.761 20B10 1.872 24G6 0.913
7C8 3.072 12E10 2.628 20E10 1.713 24D4 0.780
7F8 2.752 12B10 2.543 20E9 1.273 24H5 0.602
7D7 2.748 13A4 3.569 20G9 1.755 24C5 0.591
阴性对照 0.124            
表2中，阴性对照为2％BSA。选择3A11，3F11，3C11，3H10，3F7，3D8，7A10，7C8，8H1，8D1，9F6，9H3，9G4，12G12，13A4，13F1，13E4，13D1，13C5，22H1作为阳性杂交瘤细胞株进一步进行如下实验。
实施例4获得单克隆抗体
利用proteinA磁珠(购自于海狸纳米科技，货号为19B002102)对上述实施例3经Elisa筛选得到的20株阳性杂交瘤细胞株进行纯化，获得20株单克隆抗体。
实施例5鉴定筛选单克隆抗体中和KOD DNA聚合酶聚合活性应用
对实施例4所获得的20株单克隆抗体进行中和功能筛选鉴定，具体操作方式如下：
采用一条引物(TGTACAGCTAATCC，SEQ ID NO:5)与一条5’带有荧光基团和3’带有淬灭基团的分子信标(5’FAM-CGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-3’Dabcyl，SEQ ID NO:6)的环状部分互补退火后形成底物，将筛选获得的单克隆抗体和高保真聚合酶按照质量比2：1进行37℃孵育1h，采用分子信标法检测单克隆抗体对高保真聚合酶聚合活性的抑制情况，采用的体系如下表3所示：
表3反应体系
组分 体积(μl)
分子信标-引物底物 1.6
5x反应buffer 4
25mM dNTP 0.4
单克隆抗体和KOD DNA聚合酶混合物 2
Nuclease Free water 12
同时设置不加单克隆抗体仅含酶的阳性对照(PC)和不加酶也不加单克隆抗体的阴性对照(NC)。
利用Applied Biosystem StepOnePlus Real-Time system仪器对配制好的反应体系进行实时检测荧光信号的变化，反应条件42℃，10min(每15s为1cycle收集一次荧光信号，共40cycle)。
图1显示了不同单克隆抗体对KOD DNA聚合酶聚合活性的中和作用结果。从图1不难看出，不同的单克隆抗体对KOD DNA聚合酶聚合活性的中和效果不同(表现为荧光强度不同)，其中编号为3H10的单克隆抗体对KOD DNA聚合酶的中和效果尤为显著(表现为荧光强度显著降低)，接近于阴性对照水平，即编号为3H10的单克隆抗体对KOD DNA聚合酶的聚合活性中和效果最好。
实施例6鉴定筛选单克隆抗体中和KOD DNA聚合酶外切活性应用
对实施例4所获得的20株单克隆抗体进行中和功能筛选鉴定，具体操作方式如下：
采用一条3’端带有淬灭基团的引物(ATCAGCAGGCCACACGTTAAACTGT-3’BHQ2， SEQ ID NO:7)和一条5’端带有荧光基团的引物(5’Rox-TAGTCGTCCGGTGTGCAATTTCTGT，SEQ ID NO:8)退火后互补配对形成双链底物，该底物末端含有4个错配，将筛选获得的单克隆抗体和KOD DNA聚合酶按照浓度比2：1进行37℃孵育1h，采用双链错配底物法检测单克隆抗体对高保真聚合酶外切活性的抑制情况，采用的体系如下表4所示：
表4反应体系
组分 体积(μl)
双链错配底物 0.5
5x反应buffer 4
25mM dNTP 1
单克隆抗体和KOD DNA聚合酶混合物 12
Nuclease Free water 32.5
同时设置不加单克隆抗体仅含KOD DNA聚合酶的阳性对照(PC)和不加KOD DNA聚合酶也不加单克隆抗体的阴性对照(NC)。
利用多功能酶标仪对所配制的反应体系进行实时荧光信号检测，激发波长为：582nm，发射波长:618nm，反应条件37℃，30min，每隔1min收集一次荧光信号。
图2显示了不同单克隆抗体对KOD DNA聚合酶外切活性的中和作用结果。从图2不难看出，不同的单克隆抗体对KOD DNA聚合酶外切活性的中和效果不同(表现为荧光强度不同)，其中编号为3H10的单克隆抗体对KOD DNA聚合酶的中和效果尤为显著(表现为荧光强度显著降低)，接近于阴性对照水平，即编号为3H10的单克隆抗体对KOD DNA聚合酶的外切活性中和效果最好。
实施例7 3H10单克隆抗体序列的获得
对表达编号为3H10的单克隆抗体(简写为3H10单克隆抗体)的杂交瘤细胞，提取RNA，进行逆转录，得到杂交瘤细胞的cDNA库。根据已知的鼠源抗体重轻链恒定区设计兼并引物，利用设计的兼并引物对cDNA库进行PCR获得单克隆抗体重链及轻链可变区序列。再将可变区序列克隆进入T载体，导入大肠杆菌DH5α中进行扩增，挑选克隆。扩大培养，提取重组载体，进行测序，进而获得该单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列。
其中，编号为3H10的单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
重链可变区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；轻链可变区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例8鉴定3H10单克隆抗体与高保真聚合酶的亲和活性
实施例8对编号为3H10的单克隆抗体与高保真聚合酶(KOD、KAPA HiFi)亲和活性进行了验证，实验采用ELISA方法测定，其中Rabbit Anti-Mouse IgG购自abcam，货号为ab6728。EL-TMB显色试剂盒购自生工，货号为C520026-500。包括如下步骤：
(1)将抗原100μl(DNA聚合酶浓度1μg/ml)过夜包被于酶标条上。加200μl PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，PBS震荡洗涤3次。
(2)加入1％BSA-PBS 200μl，37℃封闭2h。PBST 200μl，10min，洗涤3次，PBS200μl，10min，洗涤3次。
(3)将抗体按下列浓度进行稀释，加入稀释后上清100μl，37℃孵育2h。PBST 200μl，10min，洗涤3次，PBS200μl，10min，洗涤3次。
(4)加入稀释的商品辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠抗体100μl，37℃孵育1h。PBST 200μl，10min，洗涤3次，PBS200μl，10min，洗涤3次。
(5)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色10min。
(6)加入50μl浓度为0.1mol/l的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度。
图3示出了单克隆抗体与不同DNA聚合酶的亲和活性结果。从图3可以看出，3H10单克隆抗体对KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶均有亲和力，且3H10单克隆抗体对KOD DNA聚合酶的亲和力高于对KAPA HiFi DNA聚合酶的亲和力。
实施例9 3H10单克隆抗体的制备与SDS-PAGE鉴定
将表达3H10单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行扩大培养。收集上清，8000rpm离心15min，0.22μm滤膜过滤样品用蛋白A(protein A)柱进行纯化，使用洗脱液进行洗脱，获得纯化后单克隆抗体。对纯化后的单克隆抗体进行SDS PAGE鉴定。
图4显示了3H10单克隆抗体的SDS-PAGE结果，其中图4中M代表蛋白marker，标号1的非变性的抗体，标号为变性的抗体。从图4不难看出，所制备的3H10单克隆抗体无杂带污染，纯度很高，未变性的单克隆抗体分子量正常，经变性的单克隆抗体的重链和轻链的分子量均正常。
实施例10 3H10单克隆抗体应用于中和高保真DNA聚合酶聚合活性
将实施例9所获得的3H10单克隆抗体分别与KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶按照质量比为2：1混合，在37摄氏度条件下孵育1小时，以不加单克隆抗体的KOD DNA聚合酶作为阳性对照，同时比较本发明单克隆抗体与市售单克隆抗体应用于中和KOD DNA 聚合酶聚合活性的效果，具体操作见实施例5。
其中，所用到的市售单克隆抗体为KOD Fx，购自于TOYOBO，货号为KFX-101。
图5显示了不同单克隆抗体对KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶聚合活性的作用效果。图5中NC代表阴性对照，阴性对照为不使用聚合酶；PC1-KOD代表仅使用KOD DNA聚合酶，作为阳性对照；PC2-KAPA HiFi代表仅使用KAPA HiFi DNA聚合酶，作为阳性对照；从图5可以看出，3H10单克隆抗体对KOD DNA聚合酶的聚合活性具有中和效果(荧光强度较PC1-KOD DNA聚合酶的荧光强度变弱)，同时3H10单克隆抗体对KAPA HiFi DNA聚合酶的聚合活性也具有中和效果(荧光强度较PC2-KAPA HiFi DNA聚合酶的荧光强度变弱)。
实施例11 3H10单克隆抗体应用于中和高保真DNA聚合酶外切活性
将实施例9所获得的3H10单克隆抗体分别与KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶按照质量比为2：1混合，在37摄氏度条件下孵育1小时，以不加单克隆抗体的KOD DNA聚合酶作为阳性对照，同时比较本发明单克隆抗体与市售单克隆抗体应用于中和KOD DNA聚合酶外切活性的效果，具体操作见实施例6。
图6显示了不同单克隆抗体对KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶外切活性作用效果。从图6可以看出，3H10单克隆抗体对KOD DNA聚合酶的外切活性具有中和效果(荧光强度较PC1-KOD DNA聚合酶的荧光强度变弱)，同时3H10单克隆抗体对KAPA HiFi DNA聚合酶的外切活性也具有中和效果(荧光强度较PC2-KAPA HiFi DNA聚合酶的荧光强度变弱)。
实施例12 3H10单克隆抗体应用于低起始量热启动聚合酶PCR
(1)将抗体与DNA聚合酶按比例混合，分成4组，分别为
第一组为KOD DNA聚合酶，
第二组为KOD F X聚合酶(厂家TOYOBO，货号KFX-101，该KOD Fx聚合酶为商品化酶，该商品化酶中含有抗体和聚合酶)。
第三组为KOD DNA聚合酶+3H10单克隆抗体(3H10单克隆抗体和KOD DNA聚合酶的质量比为2：1)。
第四组为KAPA HiFi DNA聚合酶+3H10单克隆抗体(3H10单克隆抗体和KAPA HiFi DNA聚合酶的质量比为2:1)。
所用到的模板为人gDNA，选择三个模板起始量，分别是0.1ng、1ng、5ng，所用到的引物F为:GGCAACGCTTAGACTCTGTGTG(SEQ ID NO:9)，引物R： CTGCCCTTGGCCTAACTAACCT(SEQ ID NO:10)。目的条带大小在1kb左右。
(2)按下表配置反应体系
表5反应体系
2*聚合酶Ready Mix(孵育抗体) 12.5μl
引物F 0.4μM
引物R 0.4μM
人gDNA(模板) 0.1ng/1ng/5ng
ddH 2O Add to 25μl
(3)按下表PCR反应条件进行反应
表6反应条件
Figure PCTCN2019126582-appb-000007
反应结束后进行1.5％琼脂糖电泳鉴定。
图7显示3H10单克隆抗体分别与KOD DNA聚合酶、KAPA HiFi聚合酶制备的热启动高保真DNA聚合酶在低起始量PCR应用中的效果，同时以商品酶KOD Fx作为参考。
结果表明，与商品KOD Fx(内含抗体)相比，3H10单克隆抗体的添加，有益于提高KOD DNA聚合酶和KAPA HiFi DNA聚合酶低模板起始量PCR应用中的效果(产量有所提升)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (18)

  1. 一种单克隆抗体，其特征在于，包括重链高变区和轻链高变区，所述重链高变区和所述轻链高变区包括下列至少之一：
    (1)所述重链高变区包括选自ASGYPFSTY、DKSSST和EGITTLVAPMDY中的至少一种，所述轻链高变区包括选自SSVTYMHWY、RVEAED和KLELKRADAAPT中的至少一种；
    (2)与(1)相比，所述重链高变区至少具有一个保守氨基酸取代，和/或所述轻链高变区至少具有一个保守氨基酸取代。
  2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括下列至少之一：
    (a)具有SEQ ID NO:1所示重链可变区和SEQ ID NO:2所示轻链可变区；
    (b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。
  3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列编码，所述轻链可变区由SEQ ID NO:4所示核苷酸序列编码。
  4. 一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体。
  5. 根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为具有下列至少之一的核苷酸序列：
    SEQ ID NO:3所示核苷酸序列和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；
    与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相比，具有95％以上同源性的序列；和/或
    与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列相比，具有95％以上同源性的序列。
  6. 根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为具有下列至少之一的核苷酸序列：
    与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相比，具有98％以上同源性的序列；和/或
    与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列相比，具有98％以上同源性的序列。
  7. 一种表达载体，其特征在于，包括权利要求4～6中任一项所述的多核苷酸。
  8. 根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，进一步包括：
    控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操作地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。
  9. 根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述控制元件包括下列至少之一：启动子、增强子和终止子。
  10. 根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
  11. 一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求7～10中任一项所述的表达载体。
  12. 一种制备单克隆抗体的方法，其特征在于，包括培养权利要求11所述的重组细胞。
  13. 一种复合物，其特征在于，包括权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体和DNA聚合酶。
  14. 根据权利要求13所述的复合物，其特征在于，所述DNA聚合酶选自KOD DNA聚合酶、KAPAHiFi聚合酶中的至少一种。
  15. 根据权利要求13所述的复合物，其特征在于，所述单克隆抗体与所述DNA聚合酶的质量比为1:1～5:1。
  16. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的单克隆抗体或者权利要求13～15任一项所述的复合物。
  17. 一种聚合酶链式反应，其特征在于，包括：
    基于DNA样品，利用权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或者权利要求14～16中任一项所述的复合物或者权利要求16所述的试剂盒进行聚合酶链式反应。
  18. 根据权利要求17所述的聚合酶链式反应，其特征在于，所述DNA样品的起始量为0.1-5纳克。
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