CN116217730B - 一种Taq酶的单克隆抗体F7H6及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种Taq酶的单克隆抗体F7H6，其重链可变区的氨基酸序列的CDR1序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列的CDR1序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6所示。所述单克隆抗体F7H6同时具有较佳的聚合活性的封闭效果和外切酶活性的封闭效果。

Description

一种Taq酶的单克隆抗体F7H6及其应用
技术领域
本发明涉及一种Taq酶的单克隆抗体F7H6及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
然而，在PCR预变性前，Taq酶5’-3’外切活性能够引起引物、探针或模板的降解；而其5’-3’聚合活性在PCR预变性前阶段即可引起模板或引物错配而产生非特异性的扩增；非特异性产物在后续的扩增循环中将进一步被放大，从而造成目的产物扩增产量降低，甚至扩增失败。
抗体法是一种有效解决上述问题的方法。抗体法是在热启动PCR中，Taq酶抗体与Taq酶可逆性结合，与Taq酶维持动态平衡；高温变性前，Taq酶抗体结合在Taq酶活性位点上，封闭其酶活性；变性阶段，Taq酶抗体失活，Taq酶快速释放；退火阶段，Taq酶抗体恢复活性，封闭Taq酶活性；延伸阶段，Taq酶抗体再次失活，Taq酶以目的基因为模板、引物为出发点合成完整双链DNA。
然而，现有的Taq酶抗体大多仅有较佳的聚合酶的聚合活性的封闭效果或外切酶活性的封闭效果，很少同时具有较佳的聚合活性的封闭效果和外切酶活性的封闭效果，这也将影响到聚合酶的热启动效果。因此，本领域亟需一种能够同时具有较佳的聚合活性的封闭效果和外切酶活性的封闭效果的Taq酶的抗体。
发明内容
本发明提供了一种Taq酶的单克隆抗体F7H6及其应用，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种Taq酶的单克隆抗体F7H6，其重链可变区的氨基酸序列的CDR1序列如SEQ IDNO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列的CDR1序列如SEQ IDNO:4所示，CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ IDNO:6所示。
优选的，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选的，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选的，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
一种上述的单克隆抗体F7H6在构建热启动Taq酶扩增中的应用。
一种生产上述的单克隆抗体F7H6的细胞。
本发明的有益效果是：本发明提供的单克隆抗体F7H6，同时具有较佳的封闭Taq酶5’-3’聚合活性和5’-3’外切酶活性的效果，在0～60℃温度范围内，其Taq酶5’-3’聚合活性封闭效果达83％以上，其Taq酶5’-3’外切酶活性封闭效果达60％以上，能有效降低非特异性扩增和引物二聚体产生。随着温度升高至75℃，单克隆抗体开始与Taq酶解离，恢复Taq酶聚合活性。与未封闭的Taq酶相比，特异性扩增效率显著提高。
本发明的单克隆抗体F7H6，用于聚合酶的热启动，相比野生Taq酶，其扩增灵敏度显著提升，能很好的扩增出低浓度15copies/反应的样本；其次，其扩增CT值较现有的抗体酶提前1个CT值，说明其能更早完成核酸，其扩增的效率也更高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例2提供的Taq酶抗体聚合酶活性活性封闭检测结果。
图2是本发明实施例3提供的Taq酶抗体外切酶活性活性封闭检测结果。
图3是是本发明实施例4提供的Taq酶抗体的扩增效果图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种Taq酶的单克隆抗体F7H6，其重链可变区的氨基酸序列的CDR1序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列的CDR1序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6所示。
优选的，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选的，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选的，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
一种上述的单克隆抗体F7H6在构建热启动Taq酶扩增中的应用。
一种生产上述的单克隆抗体F7H6的细胞。
实施例1
特异结合Taq酶单克隆抗体制备
1、免疫动物
取8-12周龄的BALB/c小鼠，以100μg/只的含野生型Taq酶蛋白重组抗原与等量福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的野生型Taq酶蛋白重组抗原与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法)滴度在1∶5000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。
2、饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用含HAT的RPMI 1640完全培养液中重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
3、免疫脾细胞的制备
小鼠最后一次免疫三天后，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
4、细胞融合
(1)取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温；
(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(2-5×107个)、上述免疫脾细胞(108个)悬液加入50mL离心管中混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；
(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7mL预温的50％PEG溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液；
(4)补加DMEM无血清培养液至40mL，离心10分钟，倒尽上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培养箱中培养。
5、杂交瘤细胞的选择培养
在细胞融合后第1，3，5，7天用前述的HAT培养液换液培养，选择出真正的杂交细胞。
6、特异性抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化
吸取每个培养孔的上清液，用间接ELISA法检测出培养液中含特异性识别Taq酶蛋白重组抗原的抗体的培养孔，筛选得到有较好反应性的抗体F7H6。
人工合成(上海生工生物工程(上海)股份有限公司)上述抗体重链和轻链序列(SEQ ID NO:9和10)，并插入至pcDNA3.1载体中。按Thermo Fisher公司FreeStyle TM293Expression System User Manual操作，转染含重链序列和轻链序列的载体至293-F细胞中，培养并收集细胞培养物上清。
细胞培养物上清经蛋白A亲和层析分离纯化，操作按Cytiva公司handbook:Affinity Chromatography,Vol 1:Antibodies进行。
纯化制备得Taq酶单克隆抗体F7H6。
上述操作为本领域技术人员所公知，亦可以采用公知领域的其它质粒构建、细胞转染、培养方法、分离纯化技术手段获取上述单克隆抗体。
实施例2
特异结合Taq酶单克隆抗体聚合酶活性封闭检测
取Taq酶抗体F7H6和野生Taq酶，按质量比2:1混匀，制备为抗体-Taq酶(抗体酶)。
取发夹型寡核苷酸(SEQ ID NO:11)，稀释至100μmol/L。
配制10×PCR buffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl2，25mmol/L dNTP。
按照表1的配方配制，所有操作在冰上进行，每个实验均有三个重复：
表1
反应液组分 用量(μL)
10×PCR buffer 2.5
PicoGreen 0.5
发夹型寡核苷酸 0.1
野生Taq酶或抗体酶 0.5
纯化水 21.4
总计 25
在荧光定量PCR仪上设置不同温度程序，检测不同温度下封闭效果：
扩增温度为37℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，扩增时间为16s；120个循环。荧光采集通道：FAM。
将加入反应液的PCR八联管置于荧光定量PCR仪前，按照以上温度分别预热荧光定量PCR仪半小时，开始聚合反应。
反应结束后，根据荧光定量PCR数据，计算第30cycles的荧光值与初始值的差异。检测酶的5’-3’聚合酶活性活性封闭效果＝100％-测试酶的前后荧光差异/野生型酶的前后荧光值差异。
结果如图1所示，根据图谱，经单抗F7H6封闭，具有较佳的封闭Taq酶5’-3’聚合活性，在0～60℃温度范围内，其Taq酶5’-3’聚合活性封闭效果达83％以上，最高可达97.2％。在75℃时，抗体明显失活，聚合酶活开始释放。
实施例3
特异结合Taq酶单克隆抗体外切酶活性封闭检测
取Taq酶抗体F7H6和野生Taq酶，按质量比2:1混匀，制备为抗体-Taq酶(抗体酶)。
取发夹型寡核苷酸探针，序列(SEQ ID NO:12)，稀释至100μmol/L。
配制10×PCR buffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl2，25mmol/L dNTP。
按照以下表2的配方配制，所有操作在冰上进行，每个实验均有三个重复：
表2
反应液组分 用量(μL)
10×PCR buffer 2.5
发夹型寡核苷酸探针 0.05
野生Taq酶或抗体酶 0.5
纯化水 21.95
总计 25
在荧光定量PCR仪上设置不同温度程序，检测不同温度下封闭效果：
扩增温度分别为37℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，扩增时间为0s；80个循环。荧光采集通道：FAM。
将加入反应液的PCR八联管置于荧光定量PCR仪前，按照以上温度分别预热荧光定量PCR仪半小时，开始反应。
反应结束后，根据荧光定量PCR数据，计算第80cycles的荧光值与初始值的差异。检测酶的5’-3’外切酶活性封闭效果＝100％-测试酶的前后荧光差异/野生型酶的前后荧光值差异。
结果如图2所示，根据图谱，抗体F7H6具有较佳的封闭Taq酶5’-3’外切酶活性，在0～60℃温度范围内可达60％。
实施例4
q-pcr检测HBV样本扩增效果
合成引物HBV-L，序列为SEQ ID NO:13，引物HBV-R，序列为SEQ ID NO:14，探针HBV-P，序列为SEQ ID NO:15。稀释至100μmol/L。
样本为HBV阳性血清，采用购置于天根生化科技的血清/血浆游离DNA提取试剂盒(货号DP339)提取样本DNA，应用HBV的q-pcr试剂盒测定样本DNA的拷贝数，制备15copies/5μL低浓度样本。
配制10×PCR buffer 2：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/LMgCl2，25mmol/L dNTP，1mmol/LEDTA·2Na。
实验分成三组，分别为抗体酶组、野生Taq酶组及商抗酶组。
抗体酶：取抗体F7H6，浓度为5mg/mL，分别与浓度为0.5mg/mL的野生Taq DNA聚合酶按照2：1的质量比混合均匀，37度孵育30min，即为抗体酶。
野生Taq酶：另取浓度为0.5mg/mL的野生型Taq DNA聚合酶加相同体积的抗体储存缓冲液混合均匀，37度孵育30min。
商抗酶：取现有抗体(购自TAKARA)与浓度为0.5mg/mL的野生Taq DNA聚合酶混合均匀，混合比例为抗体与酶的质量比2：1。
按照以下表3配方配制扩增体系：
表3
在荧光定量PCR仪上设置温度程序如表4所示：
表4
实验结果如图3所示。由图3可知，抗体酶能很好的扩增出低浓度15copies/反应的样本，相比野生Taq酶，抗体酶的灵敏度有很大提升。相比商抗酶，抗体酶扩增CT值提前1个CT值，荧光终值基本一致，说明抗体酶能更早达到核酸扩增的指数期，能更早完成核酸扩增，扩增效率更高；同时，抗体酶能在更少的循环数(CT值)下就能检测到荧光反应，说明抗体酶相较于商抗酶，其检测灵敏度更高。
本发明实施例涉及到的DNA序列及氨基酸序列如下：
重链CDR1
YWIN(SEQ ID NO:1)
重链CDR2
DYPGSSTYYEKFKS(SEQ ID NO:2)
重链CDR3
GLGTFFY(SEQ ID NO:3)
轻链CDR1
ASQSSTSSSFMH(SEQ ID NO:4)
轻链CDR2
YSNLE(SEQ ID NO:5)
轻链CDR3
HHWEIPT(SEQ ID NO:6)
重链可变区
QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASAYNFTYWINWVKLRPGQGLEWIG
DYPGSSTYYEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLASEDSALYYCARGLGTFFYWGQGTTLTVSA(SEQID NO:7)
轻链可变区
DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCASQSSTSSSFMHWYQQKPGQPPKLLIK
YSNLEGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCHHWEIPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:8)
重链
QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASAYNFTYWINWVKLRPGQGLEWIG
DYPGSSTYYEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLASEDSALYYCARGLGT
FFYWGQGTTLTVSASTPPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVT
LTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPAS
STKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIV
TCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPI
QHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEE
MTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ IDNO:9)
轻链
DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCASQSSTSSSFMHWYQQKPGQPPKLLIK
YSNLEGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCHHWEIPTFGGGTK
LEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSE
RQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:10)
SEQ ID NO:11
5’-TAGCGAAGGATGTGAACCTAATCCCTGCTCCCGCGGCCGATCT GCCGGCCGCGG-3’
SEQ ID NO:12
5-FAM-CTAGCTC(BHQ)CATGGTCCGTAGGCGTAACGGTCCCGGGTAGATCCCGGTCCGATGGGCCTTAGACTGTC-3’
SEQ ID NO:13
CAATCACTCACCAACCTCCTG
SEQ ID NO:14
CGGGCAACATACCTTGATAA
SEQ ID NO:15
5’-FAM-CCAATTTGTCCTGGTTATCG(BHQ)-3’
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种Taq酶的单克隆抗体F7H6，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列的CDR1序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列的CDR1序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的Taq酶的单克隆抗体F7H6，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求1所述的Taq酶的单克隆抗体F7H6，其特征在于，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
4.根据权利要求1所述的Taq酶的单克隆抗体F7H6，其特征在于，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
5.一种权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体F7H6在构建热启动Taq酶扩增中的应用。
6.一种生产权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体F7H6的细胞。
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