CN115536748A

CN115536748A - 中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN115536748A
Application number: CN202110734056.XA
Authority: CN
Inventors: 高重亮; 陈茁; 周娇娇; 谢庆庆; 郑越; 董宇亮; 章文蔚
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2022-12-30

Abstract

本发明提出了中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用，该抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12，所述抗体可特异性作用于Taq DNA聚合酶或其突变体，从而显著减少PCR过程中引物、探针或模板的降解，及模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

Description

中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及特异性中和Taq DNA聚合酶聚合活性的抗体及其应用，更具体地，本发明涉及一种抗体或抗原结合片段、抗体的用途、抗体的制备方法、热启动Taq DNA 聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶的用途、热启动Taq DNA聚合酶的制备方法以及一种药物组合物、一种试剂盒。

背景技术

Taq DNA聚合酶参与的PCR技术广泛应用于生化试验和体外诊断行业中。Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，是一种高温酶，该酶在常温下仍具有一定的活性。因此，在PCR预变性前，Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性能够引起引物、探针或模板的降解，而其聚合活性在PCR预变性前阶段可引起模板或引物错配而产生非特异性的扩增；在后续PCR循环过程中非特异性产物被进一步放大，造成目的产物产量降低，甚至扩增不出来目的条带。热启动的方法可以有效地解决上述问题，即在PCR预变性前阶段可逆地使Taq DNA聚合酶失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq DNA聚合酶活性，使其恢复活性。

目前常用的热启动方法有抗体法、化学修饰法、适体法等。其中化学修饰法较为常用，活性封闭较为完全、不会引入外源污染，但是其活性较难完全激活，需要高温孵育较长时间。而适体法活性又较难彻底封闭，温度往往升高到45℃以上即可恢复活性，很难达到严格的热启动。和上述两种方法相比，抗体法具有一定的优势：Taq DNA聚合酶抗体能够在常温下完全抑制Taq DNA聚合酶活性，随着温度的升高，活性在60℃以上才慢慢释放，95℃热激3-5分钟，可完全释放Taq酶活性。

一步法RT-qPCR是目前最常用的分子诊断检测方法，而热启动Taq DNA聚合酶是一步法RT-qPCR 反应的核心酶。因此，研发具有中和Taq DNA聚合酶聚合活性的抗体，具有巨大的应用空间和市场前景。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

Taq DNA聚合酶是一种在分子诊断领域广泛应用的酶，热启动Taq DNA聚合酶是指该聚合酶在低温下活性被抑制，随着温度的升高，在预变性阶段Taq酶活性被完全释放。该方法能够有效地降低PCR 预变性前非特异性扩增的产生，提高PCR/RT-PCR反应的灵敏度及产量。发明人采用Taq DNA聚合酶聚合活性区域(即KlenTaq DNA聚合酶)免疫小鼠制备杂交瘤细胞，通过筛选获得能够中和Taq酶聚合活性的抗体，惊喜的发现该抗体可在PCR预变性前阶段可逆地使Taq DNA聚合酶失去活性，在PCR 预变性阶段激活Taq DNA聚合酶活性，使其恢复活性，该抗体可应用于一步法RT-qPCR反应，并具有显著的优势。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:7～12。根据本发明的实施例，含有所述CDR序列的所述抗体可与Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体进行结合，使得Taq DNA聚合酶或Taq DNA 聚合酶突变体在PCR预变性前阶段可逆地失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，能够显著提高PCR 的反应效率。

ASGYTFTNY(SEQ ID NO:1)。

DKSSST(SEQ ID NO:2)。

GPLVFVTSHDFAMDY(SEQ ID NO:3)。

ASTYTFNNY(SEQ ID NO:4)。

DKSKST(SEQ ID NO:5)。

GPNVFVTSHDFAFDG(SEQ ID NO:6)。

ASQSVNN(SEQ ID NO:7)。

GFGTD(SEQ ID NO:8)。

DYSSPYT(SEQ ID NO:9)。

DYSSPYT(SEQ ID NO:10)。

LFGDD(SEQ ID NO:11)。

DYSVSYS(SEQ ID NO:12)。

根据本发明的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ IDNO:1、2和3 具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、 CDR2、CDR3序列。高变区是在可变区内的一小部分氨基酸残基，该部分区域内的氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸残基的组成和排列顺序更易发生变异的；高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2～3个，高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性。

根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ IDNO:7、8和9 具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区 CDR1、CDR2、CDR3序列。

根据本发明的实施例，所述抗体含有如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。根据本发明的实施例，含有所述重链可变区的所述抗体可使得Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体在PCR预变性前阶段可逆地失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQWPGQGLEWIGEINPSIGRTIYNEKF KTQATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGPLVFVTSHDFAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSD YPLA(SEQ IDNO:13)。

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASTYTFNNYWMHWVKQWPGQGLEWIGEINPSIGRTIYNEKF KTQATLTVDKSKSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGPNVFVTSHDFAFDGWGQGTSVTVSSAKTTPPSD YPLA(SEQ IDNO:14)。

根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链可变区，或者与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。根据本发明的实施例，含有所述轻链可变区的所述抗体可使得Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体在PCR预变性前阶段可逆地失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

IVITQTPKFLLVSAGDRVTMTCKASQSVNNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSG FGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIRRADAAPTVS(SEQ ID NO:15)。

IVMTQAPKFLLVSAGDRVTMTCKASSSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSL FGDDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSVSYSFGGGTKLEIRRADAAPTVS(SEQ ID NO:16)。

根据本发明的实施例，所述抗体可结合Taq DNA聚合酶或其突变体。根据本发明的实施例，所述抗体于48～55℃温度下可特异性抑制96％～99％Taq DNA聚合酶或其突变体的聚合活性。

根据本发明的实施例，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:17。

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVV FDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEG YEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGE KTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERL RAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPE PYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGE RAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAE VFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKS TYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIE LRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELA IPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNM PVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID NO:17)。

根据本发明的实施例，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKNLKEDGDAVIVN FDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEG YEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGE KTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERL RAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPE PYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGE RAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAE VFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTAKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKS TYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIE LRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELA IPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNM PVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID NO:18)。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种DNA聚合酶组合物，包括：第一方面所述的抗体和Taq DNA聚合酶或其突变体。根据本发明的实施例，所述DNA聚合酶组合物可降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

根据本发明的实施例，上述DNA聚合酶组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述抗体与所述Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体的质量比为1： 1～4：1。根据本发明的实施例，当所述抗体与所述Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体的质量比为1：1～4：1时，所述抗体可与大部分Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体进行结合，从而抑制大部分Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体的活性。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含第二方面所述的DNA聚合酶组合物。根据本发明的实施例，所述试剂盒可用于任何PCR扩增，可显著降低PCR 过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种PCR方法。根据本发明的实施例，将第二方面所述的DNA 聚合酶组合物与DNA模板进行混合；将所述混合液进行PCR反应，以便扩增所述DNA模板。根据本发明的实施例，DNA聚合酶在常温下仍具有一定的活性，因此，在PCR预变性前，Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性能够引起引物、探针或模板的降解，而其聚合活性在PCR预变性前阶段可引起模板或引物错配而产生非特异性的扩增；在后续PCR循环过程中造成目的产物产量降低，甚至扩增不出来目的条带；而所述PCR方法包含DNA聚合酶组合物，DNA聚合酶在PCR预变性前阶段与所述抗体结合可逆地失去活性，在PCR预变性阶段DNA聚合酶活性被激活，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR 过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高了PCR的反应效率。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备抗体的方法，所述抗体用于结合TaqDNA聚合酶或其突变体，包括以下步骤：1)将脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行混合处理，以便获得杂交瘤细胞，所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞来源于经过Taq DNA聚合酶免疫的小鼠；2)对所述杂交瘤细胞进行第一筛选处理，以获得阳性克隆；3)对所述阳性克隆进行有限稀释处理，以便获得单克隆株，在预定培养孔中只含有一株所述单克隆株；对所述单克隆株进行第二筛选处理，以便获得优势亚克隆杂交瘤细胞株，其中ELISA 结果中OD值不低于1.0是所述优势亚克隆杂交瘤细胞株的指示；获得所述优势亚克隆杂交瘤细胞株培养液的上清液，所述上清液中含有目标抗体。根据本发明实施例，通过所述方法获得的抗体可与Taq DNA 聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体进行结合，使得Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体在PCR预变性前阶段可逆地失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明实施例，进一步包括对所述上清液进行纯化处理。

根据本发明实施例，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:19。

LLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRD LKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERL FANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGH PFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPD LIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLCCCDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHL SGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQ AFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAA DLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIG EDWLSAKE(SEQ ID NO:19)。

根据本发明实施例，所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞来源于经过Taq DNA聚合酶免疫至少3次的小鼠。根据本发明的实施例，免疫3次后可获得血清效价达到1：128000的免疫小鼠。

根据本发明实施例，所述经过Taq DNA聚合酶免疫至少3次的小鼠预先经过预筛选处理。

根据本发明实施例，所述纯化为磁珠纯化。

根据本发明的实施例，所述预筛选、第一、二筛选处理是通过ELISA法、荧光探针法和M13-7P底物法进行的。其中，荧光探针法基于PCR反应原理，用于检测PCR扩增反应是否正常进行，若含有待检测抗体的PCR扩增体系中扩增反应正常进行，则表明待测抗体无法中和Taq DNA聚合酶的聚合活性；更进一步，当含有所述抗体的PCR扩增体系中扩增反应无法正常进行时，M13-7P底物法可以进一步检测扩增反应无法正常进行是否为待测抗体中和TaqDNA聚合酶的聚合活性导致的，从而达到筛选目标抗体的目的。

根据本发明的实施例，利用所述ELISA法对待测样本进行所述预筛选、第一、二筛选处理时，OD 值不小于0.8是待测样本为目标样本的指示。根据本发明的实施例，进行所述预筛选时，所述待测样本为经过KlenTaq DNA聚合酶免疫至少3次的小鼠血清，包被免疫抗原蛋白KlenTaq DNA聚合酶、采用 ELISA法检测KlenTaq DNA聚合酶免疫至少3次的小鼠的血清，含有OD值不小于0.8血清样本的免疫小鼠为所述目标样本；进行所述第一筛选处理时，所述待测样本为杂交瘤细胞培养基的上清液，包被免疫抗原蛋白KlenTaq DNA聚合酶、采用ELISA法检测杂交瘤细胞培养基的上清液，培养基上清液OD 值不小于0.8的杂交瘤细胞为所述目标样本；进行所述第二筛选处理时，所述待测样本为进行第一轮或第二轮有限稀释后获得单克隆株培养基的上清液，包被免疫抗原蛋白KlenTaq DNA聚合酶、采用ELISA法检测进行第一轮或第二轮有限稀释后获得单克隆株培养基的上清液，培养基上清液OD值不小于0.8 的单克隆株为所述目标样本。

根据本发明的实施例，所述荧光探针法中所用探针组具有SEQ ID NO:20～22所示核酸序列。

5'-Dabcyl-GCATCTGCTCGAGTCACGCGCTATGGCGATGCTTGATAGTGATGCTGTGTACAGAAAG-3'(SEQ ID NO:20)。

5'-CCATAGCGCGTGACTCGAGCAGATGC-FAM-3'(SEQ ID NO:21)。

5'-CTTTCTGTACACAGCATCACTATCAAGCATCG-3'(SEQ ID NO:22)。

根据本发明的实施例，所述荧光探针法是通过如下方式实现的：1)将所述探针组进行等比例第一混合处理并经退火处理形成探针底物；2)将所述探针底物与Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液、dNTPs 以及荧光探针进行第二混合处理，以便获得反应体系，任选地，基于20μL的反应体系，所述探针底物的用量为1～2μL，所述Taq DNA聚合酶-抗体预混液的用量为1.5～2.5μL；3)将所述反应体系进行加热处理并检测FAM通道荧光信号，所述加热处理条件依次为：40～50℃，15～30min，55～65℃，15～30min； 4)检测FAM通道荧光信号，其中，未检测到荧光信号是待检抗体为目标抗体的指示。

根据本发明的实施例，所述退火处理条件为：起始温度80℃～90℃，以0.5℃/min的梯度降温到 25℃～35℃。

根据本发明的实施例，所述Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液是将Taq DNA聚合酶与待测抗体样本混合并在20℃～28℃孵育13～16min获得的。根据本发明的实施例，所述Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液中的Taq DNA聚合酶为野生型Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体，待测抗体来源于免疫小鼠的血清、杂交瘤细胞的培养液、单克隆株培养液或优势亚克隆杂交瘤细胞株培养液，根据本发明实施例的孵育温度和时间可使得Taq DNA聚合酶与免疫小鼠血清中含有的目标抗体有效结合。

根据本发明的实施例，所述待测抗体样本与所述Taq DNA聚合酶的质量比为1：1～8：1。

根据本发明的实施例，所述M13-7P底物法中所用引物组具有SEQ ID NO:23～29所示的序列。

CAAAGCGAACCAGACCGGAAGCAAACTCCAACA(SEQ ID NO:23)。

AGACAGCATCGGAACGAGGGTAGCAACGGCT(SEQ ID NO:24)。

GAACCAGAGCCACCACCGGAACCGCCTC(SEQ ID NO:25)。

AGCGAACCTCCCGACTTGCGGGAGG(SEQ ID NO:26)。

ACCTTTTACATCGGGAGAAACAATAACGGATTCGCCTGATTGC(SEQ ID NO:27)。

AGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC(SEQ ID NO:28)。

AGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC(SEQ ID NO:29)。

根据本发明的实施例，所述M13-7P底物法是通过如下方式实现的：1)将M13 DNA和所述引物组依次进行如下反应，95℃进行5min、75℃进行10min、60℃进行10min、50℃进行10min、40℃进行 10min、25℃进行30min，以获得M13-7P底物，其中，由95℃降温至60℃的降温速度为0.1℃/s；2)将所述M13-7P底物、Taq DNA酶-待测抗体预混液以及dNTPs进行混合处理，以便获得反应体系，任选地，基于25μL的反应体系，所述M13-7P底物的用量为2～3μL，所述Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液的用量为1～3μL；3)将所述反应体系进行加热处理。

根据本发明的实施例，所述加热处理是在45～60℃的条件下进行8～18min。根据本发明实施例的加热处理条件对所述反应体系进行加热处理，可筛选出该温度下抑制TaqDNA聚合酶的目标抗体。

根据本发明的实施例，所述M13-7P底物法进一步包括对所述反应体系进行中止反应处理。

在本发明的第六方面，发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子用于编码第一方面所述抗体或抗原结合片段。根据本发明的具体实施例，所述核酸分子编码的所述抗体或抗原结合片段可与Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体进行结合，使得Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体在PCR预变性前阶段可逆地失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明实施例，所述核酸分子包括SEQ ID NO:30～34所示的核苷酸序列。

GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGCTGA GCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCACTGGG TGAAGCAGTGGCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAACCCCAGCATCGGCAGGACC ATCTACAACGAGAAGTTCAAGACCCAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTA CATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGTGAGGGGCCCCCTGG TGTTCGTGACCAGCCACGACTTCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGC AGCGCCAAGACCACCCCCCCCAGCGACTACCCCCTGGCC(SEQ ID NO:30)。

GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGCTGA GCTGCAAGGCCAGCACCTACACCTTCAACAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGTGGCCCGGC CAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAACCCCAGCATCGGCAGGACCATCTACAACGAGAAGTT CAAGACCCAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGC CTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGTGAGGGGCCCCAACGTGTTCGTGACCAGCCA CGACTTCGCCTTCGACGGCTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGCCAAGACCACCC CCCCCAGCGACTACCCCCTGGCC(SEQ ID NO:31)。

ATCGTGATCACCCAGACCCCCAAGTTCCTGCTGGTGAGCGCCGGCGACAGGGTGACCATGAC CTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGAACAACGACGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGC CCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCAACAGGTACACCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAG CGGCTTCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCACCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTT CTGCCAGCAGGACTACAGCAGCCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAGGAGGG CCGACGCCGCCCCCACCGTGAGC(SEQ ID NO:32)。

ATCGTGATGACCCAGGCCCCCAAGTTCCTGCTGGTGAGCGCCGGCGACAGGGTGACCATGAC CTGCAAGGCCAGCAGCAGCGTGAGCAACGACGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGC CCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCAACAGGTACACCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAG CCTGTTCGGCGACGACTTCACCTTCACCATCAGCACCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTT CTGCCAGCAGGACTACAGCGTGAGCTACAGCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAGGAGGG CCGACGCCGCCCCCACCGTGAGC(SEQ ID NO:33)。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的Taq DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶的结构图，其中：Taq DNA聚合酶包含聚合活性域和外切活性域，KlenTaq DNA聚合酶只包含聚合活性域；

图2是根据本发明实施例的荧光探针法检测含有抗体的血清对Taq DNA聚合酶中和活性的原理图；

图3是根据本发明实施例的小鼠用KlenTaq DNA聚合酶作为抗原进行免疫后，采用荧光探针法测试 5只免疫后小鼠血清对Taq DNA聚合酶的中和活性的结果图，其中，PC组为阳性对照组，该组荧光探针反应体系中不含有抗体，NC组为阴性对照组，该组荧光探针反应体系中不含有Taq DNA聚合酶；

图4是根据本发明实施例的荧光探针法检测200株亚克隆细胞株对Taq DNA聚合酶的中和活性的实验流程图；

图5是根据本发明实施例的荧光探针法检测200株亚克隆细胞株在50℃和60℃条件下对Taq DNA 聚合酶的中和活性的实验结果图；

图6是根据本发明实施例的荧光探针法检测第一轮亚克隆化筛选出的两株优势亚克隆细胞株分泌的优势抗体对Taq DNA聚合酶的封闭效果的结果图；

图7是根据本发明实施例的荧光探针法检测第一轮亚克隆化筛选出的两株优势亚克隆细胞株分泌的优势抗体对Taq DNA聚合酶的恢复效果的结果图；

图8是根据本发明实施例的M13-7P法检测抗体对Taq DNA聚合酶的中和活性的原理图；

图9是根据本发明实施例的荧光探针法检测第二轮亚克隆化筛选出来的6D7F8H4抗体添加量对Taq DNA聚合酶活性影响的结果图；

图10是根据本发明实施例的荧光探针法检测第二轮亚克隆化筛选出来的6D7F8H4抗体添加量对 Taq DNA聚合酶突变体活性影响的结果图；

图11是根据本发明实施例的荧光探针法检测第二轮亚克隆化筛选出来的6D7F9G7抗体添加量对 Taq DNA聚合酶及其突变体活性影响的结果图；

图12是根据本发明实施例的荧光探针法检测第二轮亚克隆化筛选出来的6D7F8H4和6D7F9G7抗体纯化后，进行SDS-PAGE分析的结果图；

图13是根据本发明实施例的荧光探针法检测第二轮亚克隆化筛选出来的6D7F8H4和6D7F9G7抗体轻、重链可变区序列扩增的结果图；

图14是根据本发明实施例的荧光探针法检测第二轮亚克隆化筛选出来的6D7F8H4抗体制备的热启动Taq DNA聚合酶与竞品A抗体-热启动Taq DNA聚合酶、竞品B抗体-热启动Taq DNA聚合酶和非热启动Taq DNA聚合酶在不同模板量的条件下，利用一步法RT-qPCR扩增的平均Ct值及扩增曲线；

图15是根据本发明实施例的荧光探针法检测第二轮亚克隆化筛选出来的6D7F8H4抗体制备的热启动Taq DNA聚合酶与竞品A抗体-热启动Taq DNA聚合酶、竞品B抗体-热启动Taq DNA聚合酶和非热启动Taq DNA聚合酶在不同模板量的条件下，利用一步法RT-qPCR扩增产物进行核酸电泳的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。

在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2～3个，高变区为抗原和抗体结合的位置，决定了该抗体结合抗原的特异性，因此也称为决定簇互补区 (complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。

同一性，本发明，为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以通过将[第一序列中与相应位置的核苷酸相同的核苷酸的数目相除]来计算第一序列和第二序列之间的“序列同一性”的百分比。第二个序列中的核苷酸]减去[第一个序列中核苷酸的总数]，然后乘以[100％]，其中第二个核苷酸序列中每个核苷酸的缺失，插入，取代或添加-相对于第一核苷酸序列-被认为是单个核苷酸(位置)上的差异。

或者，可以使用标准设置，使用用于序列比对的已知计算机算法，例如NCBI Blastv2.0，计算两个或多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。

用于确定序列同一性程度的一些其他技术，计算机算法和设置例如在WO 04/037999，EP 0 967 284， EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO 98/49185和GB2357768-A。

同一性，本发明，为了比较两个或多个氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比可以通过将[第一氨基酸序列中的氨基酸残基数目]除以与[第二个氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基]相同，为[第一个氨基酸序列中核苷酸的总数]，然后乘以[100％]，其中每个缺失，插入，取代或添加与第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中氨基酸残基的“残基”被认为是单个氨基酸残基 (位置)上的差异，即，如本文所定义的“氨基酸差异”。

备选地，可以再次使用标准设置，使用已知的计算机算法来计算两个氨基酸序列之间的序列同一性程度，例如上述用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的算法。

通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大氨基酸残基数量的氨基酸序列作为“第一”氨基酸氨基酸序列，另一个氨基酸序列将作为“第二”氨基酸序列。

同样，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为其中氨基酸残基被替换为的氨基酸取代。具有相似化学结构的另一个氨基酸残基，其对多肽的功能，活性或其他生物学特性几乎没有影响或基本没有影响。这样的保守氨基酸取代在本领域中是众所周知的，例如，从WO 04/037999，GB-A-2357768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300；和WO 01/09300。可以基于来自WO 04/037999以及WO 98/49185的相关教导以及从其中引用的其他参考文献中选择和/或(优选)这种取代的类型和/或组合。

在文中，“阳性克隆”是指经过第一筛选处理(荧光探针法和M13-7P底物法)后得到的能够产生结合Taq DNA聚合酶或其突变体的抗体的杂交瘤细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体含有选自下列至少之一的 CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:7～12。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原能力的抗体片段。

在一些实施方案中，本发明提供了一种Taq DNA聚合酶抗体，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、 2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、 CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:7、8和 9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3 序列；或者，分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

在一些实施方案中，所述抗体含有具有如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。所述抗体可使得Taq DNA 聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体在PCR预变性前阶段可逆地失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

在一些具体实施方案中，所述抗体具有如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链可变区，或者与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。

在一些具体实施方案中，所述抗体可特异性作用于Taq DNA聚合酶或其突变体。

在一些具体实施方案中，所述抗体可特异性抑制Taq DNA聚合酶或其突变体的聚合活性。

在一些优选实施方案中，所述抗体于48℃～55℃温度下可特异性抑制96％～99％Taq DNA聚合酶或其突变体的聚合活性。

在一些具体实施方案中，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:17。

在一些具体实施方案中，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。

在一些实施方案中，本发明提供了一种DNA聚合酶组合物，包括：所述的抗体和TaqDNA聚合酶或其突变体，所述DNA聚合酶组合物可降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

在一些具体实施方案中，所述抗体与所述Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体的质量比为1： 1～4：1。当所述抗体与所述Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体的质量比为1：1～4：1时，所述抗体可与大部分Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体进行结合，从而抑制大部分Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体的活性。

在一些实施方案中，本发明提出了一种试剂盒，所述试剂盒包含所述的DNA聚合酶组合物。在一些具体实施方案，所述试剂盒用于PCR扩增时可显著降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

在一些实施方案中，所述试剂盒可用于任何PCR检测，如：新型冠状病毒检测。

在一些实施方案中，本发明提出了一种PCR方法。在一些具体实施方案中，将所述的DNA聚合酶组合物与DNA模板进行混合；将所述混合液进行PCR反应，以便扩增所述DNA模板，所述的方法可显著降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

在一些实施方案中，本发明提出了一种制备抗体的方法，所述抗体用于结合TaqDNA聚合酶或其突变体，包括以下步骤：1)将脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行混合处理，以便获得杂交瘤细胞，所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞来源于经过Taq DNA聚合酶免疫的小鼠；2)对所述杂交瘤细胞进行第一筛选处理，以获得阳性克隆；3)对所述阳性克隆进行有限稀释处理，以便获得单克隆株，在预定培养孔中只含有一株所述单克隆株；对所述单克隆株进行第二筛选处理，以便获得优势亚克隆杂交瘤细胞株，其中ELISA 实验测得的OD值不低于0.8是所述优势亚克隆杂交瘤细胞株的指示；获得所述优势亚克隆杂交瘤细胞株培养液的上清液，所述上清液中含有目标抗体。根据本发明实施例，通过所述方法获得的抗体可使得 TaqDNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体在PCR预变性前阶段可逆地失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。

在一些具体实施方案中，所述制备抗体的方法进一步包括对所述上清液进行纯化处理。

在一些具体实施方案中，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:19。

在一些具体实施方案中，所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞来源于经过Taq DNA聚合酶至少3次免疫的小鼠，免疫3次后可获得血清效价达到1：128000的免疫小鼠。

在一些具体实施方案中，所述纯化为磁珠纯化。

在一些具体实施方案中，所述预筛选、第一、二筛选处理是通过ELISA法、荧光探针法和M13-7P 底物法进行的。其中，荧光探针法基于PCR反应原理，用于检测PCR扩增反应是否正常进行，若含有待检测抗体的PCR扩增体系中扩增反应正常进行，则表明待测抗体无法中和Taq DNA聚合酶的聚合活性；更进一步，当含有所述抗体的PCR扩增体系中扩增反应无法正常进行时，M13-7P底物法可以进一步检测扩增反应无法正常进行是否为待测抗体中和Taq DNA聚合酶的聚合活性导致的，从而达到筛选目标抗体的目的。

在一些具体实施方案中，所述荧光探针法中所用探针组具有SEQ ID NO:20～22所示核酸序列。

在一些具体实施方案中，所述荧光探针法是通过如下方式实现的：1)将所述探针组进行等比例第一混合处理并经退火处理形成探针底物；2)将所述探针底物与Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液、dNTPs 以及荧光探针进行第二混合处理，以便获得反应体系；基于20μL的反应体系，所述探针底物的用量为 1～2μL，所述Taq DNA聚合酶-抗体预混液的用量为1.5～2.5μL；3)将所述反应体系进行加热处理并检测FAM通道荧光信号，所述加热处理条件依次为：40～50℃，15～30min，55～65℃，15～30min；4)检测FAM通道荧光信号，其中，未检测到荧光信号是待检抗体为目标抗体的指示。

在一些优选实施方案中，所述退火处理条件为：起始温度80℃～90℃，以0.5℃/min的梯度降温到 25℃～35℃。

在一些具体实施方案中，所述Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液是将Taq DNA聚合酶与待测抗体样本混合并在20℃～28℃孵育13～16min获得的。所述Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液中的Taq DNA聚合酶为野生型Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体，待测抗体来源于免疫小鼠的血清、杂交瘤细胞的培养液、单克隆株培养液或优势亚克隆杂交瘤细胞株培养液，根据本发明具体实施例的孵育温度和时间可使得Taq DNA聚合酶与免疫小鼠血清中含有的目标抗体有效结合，从而筛选出含有目标抗体的免疫小鼠。

在一些具体实施方案中，所述待测抗体样本与所述Taq DNA聚合酶的质量比为1：1～8：1。

在一些具体实施方案，所述M13-7P底物法中所用引物组具有SEQ ID NO:23～29所示的序列。

在一些具体实施方案中，所述M13-7P底物法是通过如下方式实现的：1)将M13 DNA和所述引物组进行退火处理，以获得M13-7P底物；2)将所述M13-7P底物、Taq DNA酶-待测抗体预混液以及 dNTPs进行混合处理，以便获得反应体系，任选地，基于20μL的反应体系，所述M13-7P底物的用量为2～3μL，所述Taq DNA酶-待测抗体预混液的用量为1～3μL；3)将所述反应体系进行加热处理。

在一些具体实施方案中，所述加热处理是在45～60℃的条件下进行8～18min。

在一些具体实施方案中，所述M13-7P底物法进一步包括对所述反应体系进行中止反应处理。

在一些实施方案中，本发明提出了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码第一方面所述抗体或抗原结合片段。

在一些具体实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:30～34所示的核苷酸序列。需要说明的是，由于密码子简并性原则，编译重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列并不是唯一恒定的序列，任何可以编码相同重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列都是本发明范围内的核酸序列。

下面将对实施例作具体介绍。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中小鼠免疫阶段及ELISA检测所用抗原为KlenTaq DNA聚合酶，其它实验例如活性测定实验均采用Taq DNA聚合酶。

实施例1小鼠免疫及其血清亲和活性、中和活性检测

1、小鼠免疫及其血清亲和活性检测

采用重组KlenTaq DNA聚合酶(纯度90％以上，蛋白储存于1×PBS缓冲液中)作为抗原。选用5 只BALB/c小鼠进行三轮免疫实验，免疫结束后进行小鼠血清效价ELISA检测以确认免疫后血清效价，具体操作如下：

(1)KlenTaq DNA聚合酶作为抗原，将其稀释至合适浓度0.5-10μg/mL，按100μL/孔的量加入酶标板孔内，4℃包被过夜；次日加入200μL PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加入200μL PBS震荡洗涤 10min，洗涤3次。(2)加入200μL封闭液(1％BSA-PBS)，37℃封闭1-2h。加入200μL PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加入200μL PBS震荡洗涤10min，洗涤3次。(3)加入稀释后上清100μL， 37℃孵育2h。加入200μL PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加入200μL PBS震荡洗涤10min，洗涤 3次。(4)加入新鲜稀释的羊抗鼠(Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP)，产品号ab97023，购自abcam) 抗体100μL，37℃孵育1h。加入200μL PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加入200μL PBS震荡洗涤 10min，洗涤3次。(5)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物，室温避光反应10min。 (6)加入50μL终止液(0.1mol/L的硫酸)，于酶标仪上测量450nm的吸光度。具体结果如表1所示， ELISA检测中，使用KlenTaqDNA聚合酶进行免疫原蛋白包被，至少有1只动物血清效价达到1：128000，其中空白对照值OD450为0.049。

表1：

2、免疫小鼠血清中和活性检测

采用荧光探针法检测含有抗体的血清对Taq DNA聚合酶的中和活性，该检测方法中所用探针序列如表2所示。

表2：

将表2所示三种单链DNA探针序列等比例混合后退火(退火方法为90℃以0.5℃/min逐渐降温到 30℃)形成荧光探针底物。免疫小鼠血清中和活性检测包括以下步骤：取2μL的0.2mg/mL的野生型Taq 酶与6μL免疫小鼠血清混合，25℃孵育15min，然后加入9.4μLPBS缓冲液，混合均匀，所得混合液为0.23mg/mL的Taq酶-血清混合液，置于冰上备用。反应体系为：2μL Taq酶-血清预混液，4μL 5×反应缓冲液(reaction buffer)(50mM Tris-HCl,，250mM KCl，7.5mM MgCl₂，pH 8.3)，0.5μL 10mM dNTPs， 11.5μL无核酸酶水，2μL荧光探针底物。阳性对照为不含抗体的上述反应体系，阴性对照为不含Taq酶的上述反应体系。反应条件为在50℃，20min，然后60℃，20min，持续收集荧光信号。若血清中含有中和活性较好的抗体，会抑制荧光信号的释放。反之，荧光信号变化速率和未加抗体的阳性对照一致。

免疫后小鼠血清中和活性测定结果如图3所示，反应在50℃进行20min，然后60℃进行20min，和阳性对照组(未经血清孵育的Taq DNA聚合酶)相比，含有血清孵育过后的TaqDNA聚合酶的反应荧光信号变化均得到抑制；结果提示，5只小鼠血清种含有的抗体均能抑制Taq酶活性。

此外，采用M13方法进行进一步筛选，使用7条M13引物和M13(M13mp18 Single-stranded DNA，购自NEB)，相应的M13退火引物序列如表3所示。将单链M13和所示7种引物通过梯度降温的方式进行退火，退火流程为95℃，5min；75℃，10min；60℃，10min；50℃，10min；40℃，10min；25℃，30min；其中各步骤间降温速度为0.1℃/s，热盖设置为103℃，预退火得到M13-7P底物，测试抗体对 Taq酶聚合活性(合成dsDNA的能力，新合成的dsDNA可以通过qubit试剂盒进行检测)的抑制能力。通过以上步骤筛选出免疫后血清具有较高亲和活性和中和活性的小鼠，进行后续的细胞融合实验。具体操作如下：

M13-7P法反应体系为：2μL Taq酶-血清预混液，5μL 5×反应缓冲液(50mM Tris-HCl,250mM KCl， 7.5mM MgCl2，pH8.3)，2.5μL M13-7P底物，1μL 10mM dNTPs，14.5μL无核酸酶水。阳性对照为不含抗体的上述反应液，阴性对照为不含有Taq酶的反应混合液。反应条件为50℃下孵育10min，然后加入 1μL 0.5M EDTA终止反应。通过Qubit^TMdsDNA HS AssayKit检测合成的双链DNA来确定抗体对Taq DNA聚合酶活性抑制能力。

表3：

引物名称	核酸序列(5'～3')
		M13引物1	CAAAGCGAACCAGACCGGAAGCAAACTCCAACA(SEQ ID NO:23)
M13引物2	AGACAGCATCGGAACGAGGGTAGCAACGGCT(SEQ ID NO:24)
		M13引物3	GAACCAGAGCCACCACCGGAACCGCCTC(SEQ ID NO:25)
M13引物4	AGCGAACCTCCCGACTTGCGGGAGG(SEQ ID NO:26)
		M13引物5	ACCTTTTACATCGGGAGAAACAATAACGGATTCGCCTGATTGC(SEQ ID NO:27)
M13引物6	GCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGT(SEQ ID NO:28)
		M13引物7	AGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC(SEQ ID NO:29)

具体结果如表4所示，小鼠E免疫后血清中和活性最好，在50℃能够抑制97.8％的Taq酶聚合活性。因此选取小鼠E进行后续细胞融合试验。

表4：

项目	小鼠A	小鼠B	小鼠C	小鼠D	小鼠E
						50℃	95.2％	94.3％	93.1％	96.4％	97.8％
70℃	0.0％	15.3％	0.0％	3.0％	11.8％

实施例2细胞融合及杂交瘤细胞株筛选

选取血清效价及中和活性满足要求的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，该步骤主要目的为筛选能够稳定产生亲和抗体的杂交瘤细胞株。首先选取成功免疫的小鼠E，将其处死并固定于解剖板上，用小刀剪去结缔组织即可取出脾脏，置于含有新鲜培养基的玻璃匀浆器中进行匀浆，200目晒网过滤，洗涤后加入红细胞裂解液裂解10min，加新鲜培养基稀释，离心去上清，重新溶解于培养基中，测细胞密度，然后将所脾细胞稀释至一定浓度。随后将SP2/0Ag14骨髓瘤细胞与上述处理过的脾细胞进行细胞混合，后加入聚乙二醇2000(PEG2000)进行融合，融合试验。获得杂交瘤细胞，将获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中进行加压，然后加入96孔板中进行培养。获得杂交瘤主克隆。所有融合后细胞接种96孔板进行细胞培养。包被免疫抗原蛋白(KlenTaq DNA聚合酶)对主克隆细胞上清进行 ELISA检测，挑选阳性克隆，优先挑选亲和力较高(1ug/ml抗原(Klentag)包被条件下，OD值减去空白对照后大于1.0)的杂交瘤主克隆进行后续实验，具体操作与实施例1一致，所得实验结果如表5所示：

表5：

实施例3亚克隆化及筛选

将实施例2中所述的阳性主克隆进行第一轮有限稀释和ELISA亲和力筛选。具体操作如下：

1、亚克隆亲和活性检测

将第一轮有限稀释获得的阳性克隆选取30～40株作为主克隆，每个主克隆挑选5～7株亚克隆进一步确认其上清的亲和活性(采用ELISA法，此处所用抗原为Klen Taq DNA聚合酶)。具体操作同实施例 1。第一轮亚克隆细胞抗体ELISA检测亲和能力的具体实验结果如表6所示，该表展示了共200株抗体 ELISA检测结果，其中，Blank OD值为0.045；ELISA检测体系为10μL抗体酶混合物(0.05mg/mL酶， 0.1mg/mL抗体)。ELISA结果显示，减去空白对照后，OD值基本上均大于1.0，证明所筛选抗体对Taq DNA聚合活性区域(即KlenTaq DNA聚合酶)具有一定的亲和活性，如果该抗体结合在酶催化中心部位，则很可能能够抑制该酶的聚合活性，即具有中和活性。如果该抗体结合在酶催化中心之外的部位，则该抗体很可能只有亲和活性没有中和活性。

表6：

2、亚克隆中和活性检测

通过实施例1中的使用的荧光探针法检测其对Taq DNA聚合酶的中和活性，具体操作如下：

具体操作流程如图4所示。抗体和Taq DNA酶按照质量2：1的比例混合，25℃孵育15min后制成热启动Taq酶，其中孵育buffer为1×PBS。反应体系为：1.8μL热启动Taq酶，4μL5×反应缓冲液(50mM Tris-HCl,250mM KCl，7.5mM MgCl2，pH8.3)，0.5μL 10mM dNTPs，11.7μL无核酸酶水，2μL荧光探针底物。阳性对照为不含抗体的上述反应体系，阴性对照为不含酶的上述反应体系。反应条件在qPCR 仪上50℃，20min，然后60℃，20min。检测反应过程种荧光信号变化。Taq酶活性被抑制会抑制荧光信号释放。由图5可知，200株抗体中只有两株抗体能够明显抑制荧光变化速率的抗体(此处为和阳性对照相比)，其余198株抗体未能明显抑制Taq酶活性(结果未在此处显示)。

3、亚克隆优势抗体对Taq酶封闭效果及恢复效果检测

(1)荧光探针法

制备热启动酶，比较热激活前后Taq酶活性的变化，对含有抗体-Taq DNA聚合酶的反应混合物进行热激活(95℃，5min)，采用荧光探针法比较热激活前后荧光信号变化，与进而确定抗体对Taq酶的封闭效果和激活后活性的恢复，具体操作与实施例3第(2)部分操作一致，该步骤对初筛得到的两株抗体进行进一步的中和活性确认，最终确定2株抗体能够不同程度地抑制Taq酶活性。结果如图6和图7所示，前20min为50℃，后20min反应温度为60℃。由以上结果可知两株抗体对Taq酶中和活性最好，在50℃几乎能够完全抑制Taq酶活性。

(2)M13-7p底物法

荧光探针法筛选出来的优势抗体，通过M13-7p底物法进一步确认中和活性，实验原理如图8所示，具体操作步骤如下：(1)抗体：Taq DNA聚合酶按照4：1(w/w)的比例混合，25℃孵育15min，制备成热启动Taq DNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶终浓度为0.025mg/mL，所添加抗体终浓度未 0.1mg/mL。(2)反应体系为1.8μL热启动Taq酶，5μL 5×反应缓冲液(50mM Tris-HCl,250mM KCl， 7.5mM MgCl2，pH8.3)，1μL 10mM dNTPs，2.5μL M13-7P底物，14.7μL无核酸酶水。NC为未添加Taq DNA聚合酶的反应混合液。阳性对照为不含抗体的上述反应液，阴性对照为不含有Taq酶的反应混合液。反应条件为50℃下孵育10min，然后加入1μL 0.5M EDTA终止反应。通过Qubit^TMdsDNA HS Assay Kit检测合成的双链DNA来确定抗体对Taq DNA聚合酶活性抑制能力。所得结果如表7所示，该结果和探针法测活结果一致。在50℃条件下，筛选所得到的优势抗体对Taq DNA聚合酶聚合活性抑制能力达到99％。由于所得抗体为采用KlenTaq DNA聚合酶(即Taq DNA聚合酶聚合活性域)免疫小鼠所得，因此该抗体只能够作用于Taq DNA聚合活性区域。通过该方法筛选到了两株最优杂交瘤(6D7F8和 6D7F9)及特异性作用于Taq DNA聚合活性域并能够抑制其聚合活性的抗体。

表7：

编号	热激前(ng/μL)	热激后(ng/μL)	聚合活性封闭效果
				6D7F9	1.73	14.30	99.4％
6D7F8	1.75	14.90	99.2％
				阴性对照	1.61	1.65	-

注：上述表格为热激活前后的反应体系所测得的dsDNA浓度，封闭活性效果计算方法为:热激活前后反应溶液中dsDNA浓度差值除以热激活后反应体系中dsDNA浓度:所述dsDNA浓度均应是减去相应阴性对照数值后的修正浓度。

实施例4稳定杂交瘤细胞株制备

将实施例3筛选出来优势杂交瘤进行第二轮有限稀释，并确认抗体中和活性。

采用磁珠法纯化第二轮亚克隆细胞所分泌的抗体(6D7F8H4，6D7F9G7)，纯化具体操作同实施例 3一致。

1、优势杂交瘤亚克隆细胞株6D7F8H4分泌抗体中和活性检测

(1)荧光探针法

通过对优势杂交瘤6D7F8进行进一步的亚克隆得到6D7F8H4，细胞培养并小批量制备抗体，对所得抗体进行荧光探针法中和活性测试，实验条件及方法与实施例3一致，其中，抗体/Taq DNA聚合酶及抗体/Taq DNA聚合酶突变体的质量比从1：1至8：1，反应条件为50℃下反应20min，然后，60℃下反应20min。该抗体添加量对Taq DNA聚合酶及其突变体活性的影响结果如图9和图10所示，等质量比添加6D7F8H4抗体即可达到50℃封闭Taq DNA聚合酶及其突变体活性信号的目的。

(2)M13-7p底物法

采用M13-7p底物法进一步确认该抗体对Taq DNA聚合酶及其突变体聚合活性的中和能力，实验条件及方法与实施例3一致。结果如表8所示，等质量比例(1：1)添加抗体即可在50℃封闭95％以上 Taq DNA聚合酶及其突变体聚合活性。获得稳定表达的单克隆细胞株，保种，用于后期大规模细胞培养制备单克隆抗体。

表8：

2、优势杂交瘤亚克隆细胞株6D7F9G7分泌抗体中和活性检测

(1)荧光探针法

通过对优势杂交瘤6D7F9进行进一步的亚克隆得到6D7F9G7，细胞培养并小批量制备抗体，对所得抗体进行荧光探针法中和活性测试，实验条件及方法与实施例3一致，其中，抗体/Taq DNA聚合酶及抗体/Taq DNA聚合酶突变体的质量比从2：1至4：1，反应条件为50℃下反应20min，然后，60℃下反应20min。该抗体添加量对Taq DNA聚合酶及其突变体活性的影响结果如图11所示，所示条件下 6D7F9G7抗体在50℃均能封闭Taq DNA聚合酶及其突变体活性信号。

(2)M13-7p底物法

采用M13-7p底物法进一步确认该抗体对Taq DNA聚合酶及其突变体聚合活性的中和能力，实验条件及方法与实施例3一致。结果如表9所示，抗体对Taq DNA聚合酶的活性中和能力优于对Taq酶突变体的活性中和能力，在50℃环境下，该抗体能够抑制99％Taq酶聚合活性。抗体/酶质量比例(4：1) 条件下能够抑制大部分Taq突变体活性。

表9：

实施例5优势细胞株可变区序列测定

1、优势杂交瘤培养

将实施例4获得的优势杂交瘤细胞无血清驯化后进行无血清悬浮培养，所用培养基为CD Hybridoma Medium，具体操作如下：1)细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30min；2)培养基置于恒温水浴箱中 37℃放置20min以上；3)从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃直至冻存液完全融化； 4)将细胞悬液移入15mL离心管，缓慢加入9mL培养液(RPMI 1640Medium，20％FBS)，1000rpm离心5min；5)用4mL培养液悬浮细胞后转入T25培养瓶中，37℃静置培养获得优势杂交瘤细胞；将优势杂交瘤细胞培养液离心收集上清获得抗体，并对抗体进行纯化。纯化所用填料为Protein A Agarose Beads (SinoBiological Inc.)。Binding buffer为1×PBS，洗脱液为0.1M甘氨酸、0.02M精氨酸和醋酸，pH3.0。上样速度为8mL/min，收集UV280大于30的洗脱液。随后对纯化后抗体进行SDS-PAGE分析，结果如图12所示，抗体轻链和重链分别位于25kDa和55kDa附近。

2、获取抗体轻重链序列

获得本实施例实验1的足量优势杂交瘤细胞用于总RNA提取，其中，使用试剂盒测定时具体操作步骤参见相应试剂盒说明书。具体操作为：1)提取杂交瘤细胞总RNA(试剂盒：PureLink RNA Mini Kit, Thermofisher)；2)通过RT-PCR合成cDNA(试剂盒：SuperScript^TMII Reverse Transcriptase,thermofisher)；3)利用Mouse Igg LibraryPrimer Set，以cDNA为模板通过PCR分别扩增轻，重链可变区；4)核酸电泳，胶回收(

Gel Extraction Kit，Omega)，获得轻重链片段；5)将轻、重链可变区构建进质粒载体中(pMD 19-T Vector Cloning Kit,Takara)，转化进大肠杆菌DH5α后，送样测序。轻重链可变区序列扩增结果如图13所示，扩增所得轻重链可变区DNA片段集中在400bp附近。

实施例6热启动Taq DNA聚合酶的应用

1、热启动Taq DNA聚合酶加速稳定性测试

热启动酶的制备需要合适比例的抗体添加量，使得抗体能够较好地封闭Taq DNA聚合酶活性，同时又能够保持较好的抗体-酶复合物稳定性。选取中和活性最好的抗体6D7F8H4制备热启动Taq DNA聚合酶，在37℃条件下进行为期一周的加速稳定性测试。测试了不同抗体添加量条件下制备的热启动Taq DNA聚合酶稳定性。具体操作为：

首先制备抗体-Taq热启动酶混合物，其中Taq酶浓度为0.1mg/mL，抗体浓度为0.1-2mg/mL，所用储存buffer为含有50％灭菌甘油的1×PB；将上述混合物在25℃孵育15min制备出热启动Taq DNA聚合酶，然后将其置于37℃进行加速稳定性测试，7天之后采用M13-7p底物测定其热启动效果(即抗体对 Taq酶活性封闭效果，封闭活性测试条件为50℃/20min)。如表10所示：37℃加速稳定性测试7天后所制备的热启动Taq DNA聚合酶依然具有较好的热启动效果，即50℃反应20min后仍能抑制90％以上 Taq DNA聚合酶活性，和加速稳定性处理之前(50℃条件下活性封闭均在95％以上)相当。加速稳定性结果显示，抗体/酶比例2：1即可保证所制备的热启动Taq DNA聚合酶在50℃条件下无聚合活性，并可在-20℃长时间保存(1年)。

表10：

2、抗体6D7F8H4应用于一步法RT-qPCR

通过抗体6D7F8H4制备热启动Taq DNA聚合酶用于一步法RT-qPCR，并且分别和商品化Taq DNA 聚合酶抗体A和B进行比较。以不同拷贝量的COVID-19RNA为模板进行一步法RT-qPCR。一步法 RT-qPCR程序为：温度为50℃条件下反应10min；95℃条件下反应1min；95℃条件下反应5s；退火，温度为60℃，时间为15s，共循环45次。图14所示为不同模板量条件下，一步法RT-qPCR扩增的平均 Ct值及扩增曲线，表11所示为本发明所述的优势Taq DNA聚合酶抗体与同类商品化Taq酶抗体A和B 循环数的结果，自产抗体制备的热启动Taq DNA聚合酶用于一步法RT-qPCR所产生的Ct值明显低于竞品A和B的Ct值，意味着自产抗体能够更好地提高RT-qPCR检测的灵敏度。由此可知，本专利所述的优势Taq DNA聚合酶抗体用于RT-qPCR扩增的灵敏度明显高于同类商品化Taq酶抗体A和B。

表11：

对上述RT-qPCR扩增产物进行核酸电泳分析，结果如图15所示，自产抗体制备的热启动Taq DNA 聚合酶用于RT-qPCR扩增，在模板量为10拷贝的时候依然能够清晰地扩增出目标条带和内标。

综上所述，6D7F8H4抗体可应用于一步法RT-qPCR用于新冠病毒检测，相同条件下，和市场上同类产品相比，具有更低的Ct值，扩增灵敏性更高。

表12：

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用

<130> BI3210840

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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1 5 10 15

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1 5

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<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 13

<400> 13

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1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Trp Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ile Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Gln Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Pro Leu Val Phe Val Thr Ser His Asp Phe Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr

115 120 125

Pro Pro Ser Asp Tyr Pro Leu Ala

130 135

<210> 14

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<220>

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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Trp Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ile Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Gln Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Pro Asn Val Phe Val Thr Ser His Asp Phe Ala Phe Asp

100 105 110

Gly Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr

115 120 125

Pro Pro Ser Asp Tyr Pro Leu Ala

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<211> 115

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<400> 15

Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asp Val

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser

50 55 60

Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Ala Asp Ala Ala Pro

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Thr Val Ser

115

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Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Ser Ser Val Ser Asn Asp Val

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser

50 55 60

Leu Phe Gly Asp Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Val Ser Tyr Ser

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Ala Asp Ala Ala Pro

100 105 110

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1 5 10 15

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20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

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65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

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Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

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Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

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Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

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Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

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Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

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Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

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Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

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565 570 575

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Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

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Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

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Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

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485 490 495

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740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 19

<211> 552

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 19

<400> 19

Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser

20 25 30

Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg

35 40 45

Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp

50 55 60

Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala

65 70 75 80

Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu

85 90 95

Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg

100 105 110

Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu

115 120 125

Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu

130 135 140

Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val

145 150 155 160

Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu

165 170 175

Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala

180 185 190

Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp

195 200 205

Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly

210 215 220

Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu

225 230 235 240

Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg

245 250 255

Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu

260 265 270

Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala

275 280 285

Thr Ala Thr Gly Arg Leu Cys Cys Cys Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile

290 295 300

Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Gly Phe Ile Ala

305 310 315 320

Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu

325 330 335

Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe

340 345 350

Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly

355 360 365

Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr

370 375 380

Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln

385 390 395 400

Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr

405 410 415

Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu

420 425 430

Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg

435 440 445

Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala

450 455 460

Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu

465 470 475 480

Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly

485 490 495

Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro

500 505 510

Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu

515 520 525

Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly

530 535 540

Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

545 550

<210> 20

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 20

<400> 20

gcatctgctc gagtcacgcg ctatggcgat gcttgatagt gatgctgtgt acagaaag 58

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 21

<400> 21

ccatagcgcg tgactcgagc agatgc 26

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 22

<400> 22

ctttctgtac acagcatcac tatcaagcat cg 32

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 23

<400> 23

caaagcgaac cagaccggaa gcaaactcca aca 33

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 24

<400> 24

agacagcatc ggaacgaggg tagcaacggc t 31

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 25

<400> 25

gaaccagagc caccaccgga accgcctc 28

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 26

<400> 26

agcgaacctc ccgacttgcg ggagg 25

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 27

<400> 27

accttttaca tcgggagaaa caataacgga ttcgcctgat tgc 43

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 28

<400> 28

agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 29

<400> 29

agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc 30

<210> 30

<211> 408

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 30

<400> 30

gaggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagctg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt gaagcagtgg 120

cccggccagg gcctggagtg gatcggcgag atcaacccca gcatcggcag gaccatctac 180

aacgagaagt tcaagaccca ggccaccctg accgtggaca agagcagcag caccgcctac 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgt gaggggcccc 300

ctggtgttcg tgaccagcca cgacttcgcc atggactact ggggccaggg caccagcgtg 360

accgtgagca gcgccaagac cacccccccc agcgactacc ccctggcc 408

<210> 31

<211> 408

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 31

<400> 31

gaggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagctg 60

agctgcaagg ccagcaccta caccttcaac aactactgga tgcactgggt gaagcagtgg 120

cccggccagg gcctggagtg gatcggcgag atcaacccca gcatcggcag gaccatctac 180

aacgagaagt tcaagaccca ggccaccctg accgtggaca agagcaagag caccgcctac 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgt gaggggcccc 300

aacgtgttcg tgaccagcca cgacttcgcc ttcgacggct ggggccaggg caccagcgtg 360

accgtgagca gcgccaagac cacccccccc agcgactacc ccctggcc 408

<210> 32

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 32

<400> 32

atcgtgatca cccagacccc caagttcctg ctggtgagcg ccggcgacag ggtgaccatg 60

acctgcaagg ccagccagag cgtgaacaac gacgtggcct ggtaccagca gaagcccggc 120

cagagcccca agctgctgat ctactacgcc agcaacaggt acaccggcgt gcccgacagg 180

ttcaccggca gcggcttcgg caccgacttc accttcacca tcagcaccgt gcaggccgag 240

gacctggccg tgtacttctg ccagcaggac tacagcagcc cctacacctt cggcggcggc 300

accaagctgg agatcaggag ggccgacgcc gcccccaccg tgagc 345

<210> 33

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 33

<400> 33

atcgtgatga cccaggcccc caagttcctg ctggtgagcg ccggcgacag ggtgaccatg 60

acctgcaagg ccagcagcag cgtgagcaac gacgtggcct ggtaccagca gaagcccggc 120

cagagcccca agctgctgat ctactacgcc agcaacaggt acaccggcgt gcccgacagg 180

ttcaccggca gcctgttcgg cgacgacttc accttcacca tcagcaccgt gcaggccgag 240

gacctggccg tgtacttctg ccagcaggac tacagcgtga gctacagctt cggcggcggc 300

accaagctgg agatcaggag ggccgacgcc gcccccaccg tgagc 345

Claims

1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：

重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，

轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：

分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者

分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：

分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者

分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有如SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链可变区，或者与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1～5任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体结合Taq DNA聚合酶或其突变体；

任选地，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:17；

任选地，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。

7.一种DNA聚合酶组合物，其特征在于，包括：权利要求1～6任一项所述的抗体和TaqDNA聚合酶或其突变体；

任选地，所述抗体与所述Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体的质量比为1：1～4：1。

8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的DNA聚合酶组合物。

9.一种PCR方法，其特征在于，将权利要求7所述的DNA聚合酶组合物与DNA模板进行混合；

将所述混合液进行PCR反应，以便扩增所述DNA模板。

10.一种制备抗体的方法，所述抗体用于结合Taq DNA聚合酶或其突变体，其特征在于，包括以下步骤：

1)将脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行混合处理，以便获得杂交瘤细胞，所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞来源于经过Taq DNA聚合酶免疫的小鼠；

2)对所述杂交瘤细胞进行第一筛选处理，以获得阳性克隆；

3)对所述阳性克隆进行有限稀释处理，以便获得单克隆株，在预定培养孔中只含有一株所述单克隆株；

4)对所述单克隆株进行第二筛选处理，以便获得优势亚克隆杂交瘤细胞株；

5)获得所述优势亚克隆杂交瘤细胞株培养液的上清液，所述上清液中含有目标抗体；

任选地，进一步包括对所述上清液进行纯化处理；

任选地，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:19；

任选地，所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞来源于经过Taq DNA聚合酶免疫至少3次的小鼠；

任选地，所述经过Taq DNA聚合酶免疫至少3次的小鼠预先经过预筛选处理；

任选地，所述纯化为磁珠纯化。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述预筛选、第一、二筛选处理是通过ELISA法、荧光探针法和M13-7P底物法进行的。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，利用所述ELISA法对待测样本进行所述预筛选、第一、二筛选处理时，OD值不小于0.8是待测样本为目标样本的指示。

13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述荧光探针法中所用探针组具有SEQ ID NO:20～22所示核酸序列；

优选地，所述荧光探针法是通过如下方式实现的：

1)将所述探针组进行等比例第一混合处理并经退火处理形成探针底物；

2)将所述探针底物与Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液、dNTPs以及荧光探针进行第二混合处理，以便获得反应体系，任选地，基于20μL的反应体系，所述探针底物的用量为1～2μL，所述Taq DNA聚合酶-抗体预混液的用量为1.5～2.5μL；

3)将所述反应体系进行加热处理并检测FAM通道荧光信号，所述加热处理条件依次为：40℃～50℃，15～30min，55℃～65℃，15～30min；

4)检测FAM通道荧光信号，其中，未检测到荧光信号是待测抗体为目标抗体的指示；

任选地，所述退火处理条件为：起始温度80℃～90℃，以0.5℃/min的梯度降温到25℃～35℃。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶-待测抗体预混液是将Taq DNA聚合酶与待测抗体样本混合并在20℃～28℃孵育13～16min获得的；

任选地，所述待测抗体样本与所述Taq DNA聚合酶的质量比为1：1～8：1。

15.根据权利要求11所述方法，其特征在于，所述M13-7P底物法中所用引物组具有SEQID NO:23～29所示的序列；

任选地，所述M13-7P底物法是通过如下方式实现的：

1)将M13 DNA和所述引物组依次进行如下反应，95℃进行5min、75℃进行10min、60℃进行10min、50℃进行10min、40℃进行10min、25℃进行30min，以获得M13-7P底物，其中，由95℃降温至60℃的降温速度为0.1℃/s；

2)将所述M13-7P底物、Taq DNA酶-待测抗体预混液以及dNTPs进行混合处理，以便获得反应体系，任选地，基于25μL的反应体系，所述M13-7P底物的用量为2～3μL，所述Taq DNA酶-待测抗体预混液的用量为1～3μL；

3)将所述反应体系进行加热处理，任选地，所述加热处理是在45℃～60℃的条件下进行8～18min；

任选地，进一步包括对所述反应体系进行中止反应处理。

16.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1～6任一项所述的抗体或抗原结合片段；

任选地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:30～33所示的核苷酸序列。