CN117384293A - Taq DNA聚合酶抗体及其组合物、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用 - Google Patents

Taq DNA聚合酶抗体及其组合物、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及Taq DNA聚合酶抗体及其组合物、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用。本发明提供的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段能够与Taq DNA聚合酶结合，具有较高的亲和力，可用于修饰Taq DNA聚合酶制备热启动Taq DNA聚合酶，在低温时抗体能够封闭Taq DNA聚合酶的活性位点，高温时抗体失活，Taq DNA聚合酶活性释放，能够有效减少PCR中的非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高目的片段的扩增效率和扩增特异性，且抗体修饰的Taq DNA聚合酶具有较好的储存稳定性和热稳定性，在核酸扩增和检测领域具有较好的应用前景。

Description

Taq DNA聚合酶抗体及其组合物、其修饰的Taq DNA聚合酶及 其应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及Taq DNA聚合酶抗体及其组合物、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用DNA在体外高温条件下变性解链形成单链，低温条件下引物与单链按碱基互补配对的原则结合，当温度为DNA聚合酶最适反应温度时，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。PCR通过模板DNA变性、模板DNA与引物退火、引物的延伸等步骤，经多次循环得到目的片段，DNA聚合酶是实现DNA复制的关键。
Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌YT-1分离的耐热DNA聚合酶。然而，在PCR反应体系中，低温条件下Taq DNA聚合酶仍有活性，导致碱基互补配对，进而容易产生非特异性扩增和引物二聚体。为解决该问题，现有技术通过蜡隔绝法、基因突变、化学修饰、抗体修饰、核酸适配体或共价键结合修饰Taq DNA聚合酶，即通过控制Taq DNA聚合酶在高温条件下才具有活性，克服原有Taq DNA聚合酶的缺陷。
利用热启动Taq DNA聚合酶进行扩增是提高PCR扩增特异性、提升扩增灵敏度的主要方法。热启动Taq DNA聚合酶的修饰方法主要包括化学修饰、抗体修饰、蛋白修饰以及配体肽修饰，或者多种修饰方法混合使用以达到对Taq DNA聚合酶活性的封闭作用，常温或者低温条件下，Taq DNA聚合酶活性被封闭，大量减少非特异性反应，保持酶活稳定性，再通过95℃高温使封闭酶活的物质脱落、失活，释放Taq DNA聚合酶活性，从而达到热启动效果。采用肝素、酸酐类物质进行化学修饰通常通过共价键方式结合Taq DNA聚合酶，高温条件下肝素脱落，启动酶活性，低温条件下则继续结合Taq DNA聚合酶以封闭活性。此类热启动TaqDNA聚合酶的主要缺点是需要15min左右持续高温才能彻底使酶活性恢复，因此导致模板的高温降解。抗体修饰、蛋白修饰以及肽修饰是通过非共价键结合Taq DNA聚合酶的活性位点，高温使抗体、蛋白、肽等配体失活，达到实时热启动，然而目前此类热启动Taq DNA聚合酶或存在抗体与Taq DNA聚合酶的亲和力较低，活性位点的封闭效果较差的问题，或存在抗体稳定性差，容易出现抗体失活、封闭效果减弱的问题。
发明内容
本发明提供Taq DNA聚合酶抗体及其组合物、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用。
本发明通过利用Taq DNA聚合酶作为免疫原免疫动物、经细胞融合和筛选，得到了两株杂交瘤细胞株2C11与6B9及其产生的单克隆抗体2C11和6B9。利用上述抗体修饰TaqDNA聚合酶，可以在低温时使Taq DNA聚合酶的活性位点被封闭，单独每个抗体修饰均具有较好的封闭效果，且两个抗体组合封闭时，封闭效果明显优于每个抗体；当温度升高时，抗体失活，Taq DNA聚合酶活性释放，发挥热启动的作用，用于PCR能够有效减少非特异性扩增和引物二聚体的产生；而且，本发明的抗体修饰Taq DNA聚合酶具有较高的稳定性，经储存后仍具有较好的热启动以及降低非特异性扩增和引物二聚体的效果。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、CDR2的氨基酸序列为AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示或与如SEQ ID NO.9所示序列具有至少80%的相似性，重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.10所示或与如SEQ ID NO.10所示序列具有至少80%的相似性。
在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明提供的上述抗体能够与Taq DNA聚合酶结合，具有较高的亲和力，上述抗体与Taq DNA聚合酶结合后，在低温时能够封闭Taq DNA聚合酶的活性位点，高温时抗体失活，Taq DNA聚合酶活性释放，实现热启动效果，能够有效减少PCR中的非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高目的片段的扩增效率和扩增特异性，且抗体结合的Taq DNA聚合酶具有较高的储存稳定性和较好的热稳定性。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体或多特异抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。所述抗体还包含恒定区序列。所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的恒定区序列。所述恒定区可为鼠的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的恒定区。
第二方面，本发明提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中，编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
第四方面，本发明提供抗体偶联物，其为将所述Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
第五方面，本发明提供Taq DNA聚合酶的抗体组合物，所述抗体组合物包含以下（1）和（2）中的抗体：
（1）轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、CDR2的氨基酸序列为AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示；
（2）轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示、CDR2的氨基酸序列为AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、8所示。
利用上述抗体组合物修饰Taq DNA聚合酶对活性位点的封闭效果明显优于各抗体单独修饰的效果，能够更有效地降低非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高目的片段的扩增效率。
优选地，上述（1）中所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示或与如SEQ ID NO.9所示序列具有至少80%的相似性，重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示或与如SEQ ID NO.10所示序列具有至少80%的相似性。
上述（2）中所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示或与如SEQ ID NO.11所示序列具有至少80%的相似性，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示或与如SEQ ID NO.12所示序列具有至少80%的相似性。
第六方面，本发明提供以上所述的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述Taq DNA聚合酶的抗体组合物的如下任一种应用：
（1）在制备热启动Taq DNA聚合酶中的应用；
（2）在制备抗体修饰的Taq DNA聚合酶中的应用；
（3）在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增中的应用；
（4）在制备降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增的产品中的应用；
（5）在提高Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用；
（6）在制备提高Taq DNA聚合酶的热稳定性的产品中的应用。
第七方面，本发明提供一种热启动Taq DNA聚合酶，所述热启动Taq DNA聚合酶包含Taq DNA聚合酶，还包含以上所述的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段或所述TaqDNA聚合酶的抗体组合物。
优选地，所述热启动Taq DNA聚合酶中，Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段或所述抗体组合物与Taq DNA聚合酶通过非共价方式结合。
本发明提供的抗体修饰的Taq DNA聚合酶能够有效减少PCR中的非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高目的片段的扩增效率和扩增特异性，且抗体修饰的Taq DNA聚合酶具有较高的储存稳定性，还具有较好的热稳定性。
第八方面，本发明提供以上所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，所述方法包括：采用所述Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段或所述Taq DNA聚合酶的抗体组合物修饰Taq DNA聚合酶。
优选地，所述方法包括：将Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段或所述Taq DNA聚合酶的抗体组合物与Taq DNA聚合酶共孵育。
优选地，所述孵育的温度为28-32℃，封闭时间20-40min。
在本发明的一些实施方式中，采用所述Taq DNA聚合酶抗体修饰Taq DNA聚合酶，将Taq DNA聚合酶抗体与Taq DNA聚合酶按照1：1的比例共孵育。
在本发明的一些实施方式中，采用所述抗体组合物修饰Taq DNA聚合酶，将上述（1）中所述的抗体、（2）中所述的抗体与Taq DNA聚合酶按照（1-19）：（1-19）：20的比例共孵育。优选地，将上述（1）中所述的抗体、（2）中所述的抗体与Taq DNA聚合酶按照（11-16）：（4-9）：20的比例共孵育。
第九方面，本发明提供所述热启动Taq DNA聚合酶的以下任一种应用：
（1）在DNA扩增中的应用；
（2）在制备用于DNA扩增的产品中的应用；
（3）在PCR中的应用；
（4）在制备PCR产品中的应用；
（5）在核酸检测中的应用。
第十方面，本发明提供一种DNA扩增或核酸检测方法，所述方法包括：以所述热启动Taq DNA聚合酶作为DNA聚合酶进行PCR扩增。
本发明中，所述PCR包括任意聚合酶链式反应，例如：普通PCR、荧光定量PCR、等位基因特异性PCR、多重PCR等。
本发明中，所述Taq DNA聚合酶可为从水生栖热菌YT-1分离的Taq DNA聚合酶，或者为Taq DNA聚合酶突变体。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段能够与Taq DNA聚合酶结合，具有较高的亲和力，可用于修饰Taq DNA聚合酶制备热启动Taq DNA聚合酶，在低温时抗体能够封闭Taq DNA聚合酶的活性位点，高温时抗体失活，TaqDNA聚合酶活性释放，能够有效减少PCR中的非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高目的片段的扩增效率和扩增特异性，且抗体修饰的Taq DNA聚合酶具有较高的储存稳定性和较好的热稳定性，在核酸扩增和检测领域具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中Taq DNA聚合酶纯化鉴定电泳图，其中M为蛋白分子量标准。
图2为本发明实施例1中2C11、6B9抗体纯化电泳图，其中M为蛋白分子量标准。
图3为本发明实施例2中BCA法测量抗体浓度标准曲线。
图4为本发明实施例4中以嗜热芽孢杆菌基因组为模板进行单一抗体对Taq DNA聚合酶封闭效果检测电泳图，其中M为DNA分子量标准，1、2、3为相同体系的3次平行实验结果。
图5为本发明实施例4中以人鼻腔黏膜基因组为模板进行单一抗体对Taq DNA聚合酶封闭效果检测电泳图，其中M为DNA分子量标准。
图6为本发明实施例4中未经修饰Taq DNA聚合酶进行qPCR的起峰值，其中三条曲线为三次平行实验。
图7为本发明实施例4中未经修饰Taq DNA聚合酶进行qPCR的溶解曲线，其中三条曲线为三次平行实验。
图8为本发明实施例4中2C11单克隆抗体修饰Taq DNA聚合酶进行qPCR的起峰值，其中三条曲线为三次平行实验。
图9为本发明实施例4中2C11单克隆抗体修饰Taq DNA聚合酶进行qPCR的溶解曲线，其中三条曲线为三次平行实验。
图10为本发明实施例4中6B9单克隆抗体修饰Taq DNA聚合酶进行qPCR的起峰值，其中三条曲线为三次平行实验。
图11为本发明实施例4中6B9单克隆抗体修饰Taq DNA聚合酶进行qPCR的溶解曲线，其中三条曲线为三次平行实验。
图12为本发明实施例5中组合抗体对Taq DNA聚合酶封闭效果的检测结果，其中M为DNA分子量标准。
图13为本发明实施例6中优选单克隆抗体组合修饰Taq DNA聚合酶的活性稳定性验证结果，其中M为DNA分子量标准。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的制备
1、Taq DNA聚合酶纯化蛋白的制备
Taq DNA聚合酶基因来源于水栖热菌，设计特异性引物进行PCR扩增，获取全长序列后，构建至pET-28a载体上，命名为Taq-28a，将构建好的重组质粒转化表达菌株大肠杆菌Rosseta，挑取阳性克隆子培养并测序（Taq DNA聚合酶基因的测序结果如SEQ ID NO.17所示），得到表达Taq DNA聚合酶的重组菌株。将重组菌株以IPTG诱导表达，同时设置未诱导菌株和空载体菌株对照。通过SDS-PAGE检测蛋白质表达情况。确定蛋白质表达后，超声波破碎菌体，将上清液和沉淀分离，通过SDS-PAGE检测蛋白质表达形式。检测结果表明蛋白质有可溶性的形式表达，经盐析，Ni亲和层析纯化、肝素层析三步纯化流程，得到目的蛋白，检测鉴定后作为Taq DNA聚合酶抗原进行下一步动物免疫实验。目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果见图1。
2、动物免疫
选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，使用纯化的Taq DNA聚合酶抗原与等体积弗氏佐剂乳化后进行免疫，免疫周期为两周，免疫3次后取血测效价，于融合前三天再次加强免疫。
3、细胞融合
采用断颈法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。具体操作如下：
1）骨髓瘤（SP2/0）细胞活化：解冻并复苏商品化SP2/0细胞，随后重悬于营养液（添加小牛血清的RPMI-1640）中，置于37℃、5% CO2条件下培养箱培养；3-5d后进行传代；收集细胞并悬浮于1640基础液中，计数后取0.5~1×106个注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9~10d。待背部肿瘤体积增大至直径约0.8cm，将小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5 min后无菌操作取瘤。剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，添加RPMI-1640充分研磨后补加10 mL RPMI-1640，静置2 min，吸取上层的细胞悬液置于另一离心管中，再补加10mL RPMI-1640，重复研磨两次；将上述取得的细胞悬液于1000 rpm/min离心10 min去上清，随后重悬于30 mLRPMI-1640中。
于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液小心置于分离液之上；随后1200 rpm/min离心15min，吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，使用RPMI-1640清洗细胞2遍后重悬于10mL RPMI-1640中，计数后备用。
2）免疫脾细胞的制备：取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死（收集血清，即为阳性血清），于75%酒精中浸泡5-10 min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同1）中SP2/0所述，计数后备用。
3）饲养细胞的制备：取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2~3 mL RPMI-1640，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000 r/min离心10 min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5% CO2培养箱中待用。
4）融合：将1-2×107个SP2/0与108个免疫脾细胞于50mL离心管中混匀，1000 rpm/min，离心8 min。弃净上清后，将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50% PEG 0.8 mL（Sigma），搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的RPMI-164010mL。混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清于37℃放置5-8min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，250μL/孔，于37℃，5% CO2培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，无法利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，因此能够在HAT培养基中存活和增殖。具体操作如下：
1）用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
a. 包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10mg/mL；向微孔中每孔加100μL，轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃ 1h；甩掉孔内液体（尽量拍干孔内液体）；洗涤3次，每次2～3min。
b. 封闭酶标孔中未被抗原包被的位置：向微孔中每孔加200μL封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃ 1h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液，静置2～3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液洗3次。加样：将待测的杂交瘤每孔取50μL上清液按顺序加入酶标孔中，轻轻摇匀，37℃ 1h，洗涤，拍干。
c. 加酶标抗抗体：先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度，每孔加入100μL，轻轻摇匀，置37℃ 1h；然后洗涤，拍干。加显色液：每孔加新鲜配置的显色液100μL，轻轻摇匀，37℃，10min。终止反应：每孔加终止液50μL。
d. 判定结果：酶标仪OD450下进行读数，大于阴性孔3倍可判定为阳性。
2）杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）
a. 克隆前制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到10个细胞/mL；
b. 将上述浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100μL/孔，使相应的每孔含1个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；
c. 特异性抗体的检测：在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠，采制腹水。
经筛选获得两株结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将单克隆抗体分别命名为2C11和6B9。
5、单克隆抗体纯化
单克隆抗体2C11、6B9的大量制备：将建株后的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，7天左右收集腹水，采用Protein G亲和层析纯化抗体，具体如下：
1）装柱：上下筛板浸湿超纯水，浸湿时间大于5min，排除气泡，柱内加20%酒精，混匀2-4mL填料到柱子里。
2）平衡：依次使用纯水，Blinding Buffer （NaCl 17.532g，Na2HPO4•H2O14.3256g，HCl调节pH 7.0，定容到2L）平衡5个柱体积。
3）上样：将离心去杂后的抗体稀释5倍后，上样，重复2-3次。
4）洗涤：用60mL Blinding Buffer过柱洗掉杂蛋白，柱内留2-3mL BlindingBuffer。
5）洗脱：连接核酸蛋白检测仪检测洗脱峰，待柱内Blinding Buffer流完，吸光值稳定，向柱内添加10mL Elution Buffer（0.1M 甘氨酸 pH 3.0）。准备10-15mL离心管，提前加入1mL中和液（1M Tris-HCl pH 8.0），待数值2-3个跳动，收集洗脱液，收集5mL后，补加1mL中和液，边收集边轻轻晃动。
6）透析：将收集的洗脱液放入透析袋中（透析袋截留≤50kDa），在PBS试剂中透析，透析体积为待透析样品体积100倍以上，过夜，纯化抗体的SDS-PAGE检测结果见图2。
6、单克隆抗体2C11与6B9的可变区序列测定
收集杂交瘤细胞数量大于106，采用索莱宝科技有限公司总RNA提取试剂盒，并按照说明书操作分别提取两株细胞的总RNA；按照索莱宝反转录试剂盒合成基因组DNA第一条链；送至苏州泓迅进行后续构建及测序，得到抗体基因测序结果。
测序结果显示，单克隆抗体2C11的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQID NO.4所示、CDR2的氨基酸序列为AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
单克隆抗体6B9的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示、CDR2的氨基酸序列为AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示。
实施例2 BCA法测量单克隆抗体浓度
1、BCA工作液：按照50：1的比例添加BCA试剂与Cu试剂，混匀后作为BCA工作液备用。
2、BSA标准曲线：用PBS稀释标准品BSA，使其浓度为1.5mg/mL，按照0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、12mL、16mL、20mL的体积添加，随后每孔各加200μL BCA工作液，置于37℃培养箱中，培养30min，作为BSA标准曲线。
3、单克隆抗体浓度稀释：将抗体稀释为2×、4×、8×、16×，每孔加20μL稀释后的抗体，随后每孔各加200μL BCA工作液，置于37℃培养箱中，培养30min。
4、于酶标仪波长562nm处测量吸光值，通过标准曲线计算2个单克隆抗体浓度大约在2.5-2.6mg/mL。BCA法测量抗体浓度标准曲线见图3，BCA法测量抗体浓度见表1。
表1 BCA法测量抗体浓度
实施例3 单克隆抗体与Taq DNA聚合酶结合的ELISA效价评估
利用ELISA方法对纯化后的单克隆抗体进行效价检测，通过效价反映抗体与TaqDNA聚合酶的结合能力，效价越高，结合能力越强。
1、实验操作流程
1）用包被液（0.05M CB pH 9.6）将Taq DNA聚合酶包被在ELISA检测板上，包被浓度2μg/mL，100μL/孔，4℃过夜或37℃ 2h。
2）用0.01M PBST（pH 7.4）洗板，两次。
3）用封闭液（2% BSA、5%蔗糖的PBS溶液，0.05%防腐剂）对包被好的ELISA检测板进行封闭，200μL/孔，37℃，2h。
4）用0.01M PBST（pH 7.4）洗板，3次。
5）用一抗稀释液（1% BSA的PBST）将待测的单克隆抗体进行梯度稀释，将稀释后用移液器加入ELISA检测板中，100μL/孔，37℃ 1h。
6）用含0.05%（v/v）吐温20的0.01M PBST（pH 7.4）洗板3次。
7）HRP标记的二抗孵育，采用羊抗鼠-HRP 1：5000，用移液器加入ELISA检测板中孵育，100μL/孔，37℃ 45min。
8）用0.01M PBST（pH 7.4）洗板，5次。
9）用TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，25℃±2℃避光3-5min。
10）加终止液（2M H2SO4），50μL/孔。
11）用酶标仪450nm读取显色数值，标注OD值大于1.0时的一抗稀释比。
2、实验结果
单克隆抗体2C11、6B9与Taq DNA聚合酶结合能力效价检测结果见表2。
表2 单克隆抗体效价检测
实施例4 单一抗体修饰对Taq DNA聚合酶封闭效果的检测
分别采用单克隆抗体2C11、6B9对Taq DNA聚合酶进行修饰，并通过PCR扩增检测各单克隆抗体对Taq DNA聚合酶的封闭效果。使用2C11、6B9两种单克隆抗体分别与Taq DNA聚合酶按照1：1的比例添加，封闭温度30℃，封闭时间30min，添加50%甘油、0.1mM EDTA、1mMDTT、0.5% Tween 20和0.5% NP40作为保存液，得到不同单一抗体修饰封闭的Taq DNA聚合酶。
选用两种基因组DNA为模板，设计两对特异性引物进行验证，见表3。
表3 PCR验证用模板及引物
1、PCR扩增检测单一抗体修饰对Taq DNA聚合酶的封闭效果
1）使用Taq DNA聚合酶的10×Buffer作为反应液，基因组DNA为模板进行扩增，以未经修饰的Taq DNA聚合酶为阴性对照，验证单一抗体对Taq DNA聚合酶封闭的效果，按照以下体系进行：10×PCR Buffer 5μL，引物F（10μM）1μL，引物R（10μM）1μL，dNTPs（2.5mM）5μL，基因组DNA 1μL，Taq DNA聚合酶1μL，ddH2O补足至50μL。
2）将体系加入到PCR小管中，涡旋直至充分混匀，按照以下扩增程序进行：
a. 嗜热芽孢杆菌基因组为模板，BF-9为引物，扩增目的片段大小2000bp，预变性94℃，5min；35 cycles：94℃，15s，56℃，30s，72℃，3min。
扩增产物使用6×Loading Buffer上样，琼脂糖凝胶电泳检测，阴性对照采用未经修饰的Taq DNA聚合酶。结果显示，单一抗体2C11、6B9与Taq DNA聚合酶1：1比例修饰时，PCR扩增得到的二聚体含量都比阴性对照明显更少，目的条带较阴性对照明显更亮，如图4所示，同对照相比，采用单一抗体修饰的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增时无非特异性条带，目的条带单一且较亮，说明抗体2C11、6B9对Taq DNA聚合酶的封闭性较好。
b. 人鼻腔黏膜基因组为模板，F-1为引物，扩增目的片段大小230bp，预变性94℃，5min；35 cycles：94℃，15s，56℃，30s，72℃，40s。
扩增产物使用6×Loading Buffer上样，琼脂糖凝胶电泳检测，阴性对照采用未经修饰的Taq DNA聚合酶。结果显示，单一抗体2C11、6B9与Taq酶1：1比例修饰时，PCR扩增得到的二聚体含量较阴性对照明显更少，目的条带较阴性对照明显更亮，如图5所示，同对照相比，采用单一抗体修饰的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增时无非特异性条带，目的条带单一且较亮，引物二聚体较少，说明抗体2C11、6B9对Taq DNA聚合酶的封闭性较好，能够显著提高PCR的特异性，减少引物二聚体的产生，进而提高目标产物扩增效率。
2、qPCR检测单一抗体修饰对Taq DNA聚合酶的封闭效果
1）使用Taq DNA聚合酶的10×Buffer作为反应液，人鼻腔黏膜基因组为模板，F-1为引物进行扩增，以未经修饰的Taq DNA聚合酶为阴性对照，验证单一抗体对Taq DNA聚合酶封闭的效果，96孔板中按照以下体系进行：10×PCR Buffer（Mg+）2.5μL，引物F（10μM）0.5μL，引物R（10μM）0.5μL，dNTPs（2.5mM）5μL，基因组DNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，SYBRGreen（10×）2.5μL，ddH2O补足至25μL。
2）扩增程序，预变性95℃，5min；45cycles：95℃，10s，60℃，15s，72℃，30s。
结果显示（表4），未经修饰的Taq DNA聚合酶为阴性对照体系，溶解曲线出现杂峰，CP（Cycling Threshold）值为27.31（图6、图7）。2C11单克隆抗体修饰的Taq DNA聚合酶体系，溶解曲线为单一峰，CP值为23.85（图8、图9）。6B9单克隆抗体修饰的Taq DNA聚合酶体系，溶解曲线为单一峰，CP值为24.46（图10、图11）。
表4 单一抗体对Taq DNA聚合酶封闭效果检测
结果表明，采用单一抗体对Taq DNA聚合酶进行修饰，对Taq DNA聚合酶的活性起到了封闭作用，提高了PCR的特异性和目标产物的扩增效率。
实施例5 组合抗体修饰对Taq DNA聚合酶封闭效果的检测
将单克隆抗体2C11和6B9与Taq DNA聚合酶按照一定比例混合后进行修饰，封闭温度30℃，封闭时间30min，添加50%甘油、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.5% Tween 20、0.5% NP40作为保存液，得到不同抗体组合修饰封闭的Taq DNA聚合酶，各抗体组合详细比例见表5。
表5 抗体组合比例
1、PCR扩增检测组合抗体修饰对Taq DNA聚合酶的封闭效果
1）使用Taq DNA聚合酶的10×Buffer作为反应液，人鼻腔黏膜基因组为模板，F-1为引物进行扩增，以未经修饰的Taq DNA聚合酶为阴性对照，以热启动酶Hot Start TaqDNA Polymerase（PC1110）为阳性对照，验证组合抗体对Taq DNA聚合酶封闭的效果，按照以下扩增体系进行：10×PCR Buffer 5μL，引物F（10μM）1μL，引物R（10μM）1μL，dNTPs（2.5mM）5μL，基因组DNA 1μL，Taq DNA聚合酶1μL，ddH2O补足至50μL。
2）人鼻腔黏膜基因组为模板，F-1为引物，预变性94℃，5min；35 cycles：94℃，15s，56℃，30s，72℃，40s。
扩增产物使用6×Loading Buffer上样，琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示（图12），6号、7号、8号、9号、10号、11号、12号、13号、15号、16号、17号、19号组合抗体对Taq DNA聚合酶封闭效果更优，目的条带较阴性对照明显更亮；最优为11-19号，二聚体含量较对照组明显更少。
2、qPCR检测组合抗体修饰对Taq DNA聚合酶的封闭效果
1）使用Taq DNA聚合酶的10×Buffer作为反应液，人鼻腔黏膜基因组为模板，F-1为引物进行扩增，以未经修饰的Taq DNA聚合酶为阴性对照，验证组合抗体对Taq DNA聚合酶封闭的效果，96孔板中按照以下体系进行：10×PCR Buffer（Mg+）2.5μL，引物F（10μM）0.5μL，引物R（10μM）0.5μL，dNTPs（2.5mM）5μL，基因组DNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，SYBRGreen（10×）2.5μL，ddH2O补足至25μL。
2）扩增程序，预变性95℃，5min；45cycles：95℃，10s，60℃，15s，72℃，30s。
结果如表6所示。
表6 组合抗体对Taq DNA聚合酶封闭效果的检测（qPCR）
上述结果表明，采用抗体组合2C11和6B9对Taq DNA聚合酶进行修饰，其封闭效果明显优于各单一抗体修饰，对PCR特异性的提升效果更优。综合PCR与qPCR的结果，可以筛选出组合抗体封闭效果最优组合为11-16号（未修饰Taq DNA聚合酶的CP值在26-27左右，抗体修饰Taq DNA聚合酶的CP值低于未修饰Taq DNA聚合酶即证明封闭效果比较好，一般CP值范围在15-35之间认为是正常的，在这个范围内，CP值越低则特异性越高、灵敏度越高、且也能证明Taq DNA聚合酶的耐热稳定性较好）。
实施例6 优选单克隆抗体组合修饰Taq DNA聚合酶活性稳定性验证
综合图12、表6结果进行筛选，通过PCR效果图的条带亮度，选取和对照组亮度相同的组合，再通过qPCR验证实验，选取CP值较低的组合，最终选取效果最好的6号、11号、13号、15号、16号、17号、19号共7个组合修饰Taq DNA聚合酶，以未修饰的Taq DNA聚合酶为阴性对照，分别将修饰和未修饰的Taq DNA聚合酶在室温、4℃、-20℃的环境下放置3天，然后进行PCR扩增验证。
1、PCR扩增检测组合抗体修饰Taq DNA聚合酶的稳定性
1）使用Taq DNA聚合酶的10×Buffer作为反应液，人鼻腔黏膜基因组为模板，F-1为引物进行扩增，以未修饰的Taq DNA聚合酶为阴性对照，加入至PCR小管中，按照以下体系进行：10×PCR Buffer 5μL，引物F（10μM）1μL，引物R（10μM）1μL，dNTPs（2.5mM）5μL，基因组DNA 1μL，Taq DNA聚合酶1μL，ddH2O补足至50μL。
2）将PCR小管涡旋直至充分混匀，预变性95℃，5min；45cycles：94℃，15s，56℃，30s，72℃，40s。
扩增产物使用6×Loading Buffer上样，琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示（图13），11号、13号、15号抗体组合的目的条带较亮，特异性较好。
2、qPCR检测组合抗体修饰Taq DNA聚合酶的稳定性
1）使用Taq DNA聚合酶的10×Buffer作为反应液，人鼻腔黏膜基因组为模板，F-1为引物进行扩增，以未修饰的Taq DNA聚合酶为阴性对照，按照以下扩增体系进行：10×PCRBuffer（Mg+）2.5μL，引物F（10μM）0.5μL，引物R（10μM）0.5μL，dNTPs（2.5mM）5μL，基因组DNA1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，SYBR Green（10×）2.5μL，ddH2O补足至25μL。
2）按照以下扩增程序进行，预变性95℃，5min；45cycles：95℃，10s，60℃，15s，72℃，30s。
结果如表7所示，在室温、4℃、-20℃放置的组合抗体修饰Taq DNA聚合酶的CP值总体来说都比在同等环境保存的未修饰的Taq DNA聚合酶的CP值低，其中单克隆抗体组合为11号、13号、15号修饰Taq DNA聚合酶的CP值更低，稳定性更优。
表7 优选单克隆抗体组合修饰Taq DNA聚合酶活性稳定性验证
上述结果表明，将组合抗体修饰的Taq DNA聚合酶置于-20℃、4℃、25℃环境中，分别使用PCR和qPCR进行验证，其非特异性扩增均比阴性对照少，其中11号、13号、15号组合抗体修饰Taq DNA聚合酶的条带浓度更高，CP值更低，稳定性更好。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、CDR2的氨基酸序列为AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示。
2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示或与如SEQ ID NO.9所示序列具有至少80%的相似性，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示或与如SEQID NO.10所示序列具有至少80%的相似性。
3.根据权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体或多特异抗体。
4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1~3任一项所述的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料含有权利要求4所述的核酸分子；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.Taq DNA聚合酶的抗体组合物，其特征在于，所述抗体组合物包含以下（1）和（2）中的抗体：
（1）轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、CDR2的氨基酸序列为AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示；
（2）轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示、CDR2的氨基酸序列为AAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、8所示。
7.权利要求1~3任一项所述的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的Taq DNA聚合酶的抗体组合物的如下任一种应用：
（1）在制备热启动Taq DNA聚合酶中的应用；
（2）在制备抗体修饰的Taq DNA聚合酶中的应用；
（3）在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增中的应用；
（4）在制备降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增的产品中的应用；
（5）在提高Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用；
（6）在制备提高Taq DNA聚合酶的热稳定性的产品中的应用。
8.一种热启动Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述热启动Taq DNA聚合酶包含Taq DNA聚合酶，还包含权利要求1~3任一项所述的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的Taq DNA聚合酶的抗体组合物。
9.权利要求8所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1~3任一项所述的Taq DNA聚合酶抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的Taq DNA聚合酶的抗体组合物修饰Taq DNA聚合酶。
10.权利要求8所述的热启动Taq DNA聚合酶的以下任一种应用：
（1）在DNA扩增中的应用；
（2）在制备用于DNA扩增的产品中的应用；
（3）在PCR中的应用；
（4）在制备PCR产品中的应用；
（5）在核酸检测中的应用。
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