CN111018989A - 一种抗pd-l1单克隆抗体以及在制备抗癌药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗PD‑L1单克隆抗体，通过使用PD‑L1蛋白免疫小鼠，确定免疫成功后，分离出小鼠脾脏，提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR扩增出抗体轻、重链基因，然后构建单链抗体噬菌体库，通过筛选获得目标抗体。本发明从噬菌体抗体库筛选出的抗PD‑L1单克隆抗体对PD‑L1具有良好的亲和力，并能够抑制PD‑L1和PD‑1的结合。该抗PD‑L1单克隆抗体进一步人源化后作为免疫检查点抑制剂，可用于癌症及感染性疾病的治疗。

Description

一种抗PD-L1单克隆抗体以及在制备抗癌药物方面的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗PD-L1单克隆抗体，本发明还涉及该抗体在制备抗癌药物方面的应用。

背景技术

癌症被称为世界五大绝症之一，全世界对癌症治疗的探索从未中断过，但时至今日，癌症治疗依旧是世界性难题，给社会和患者（包括其家庭）造成了巨大的经济压力。癌症病变的基本单位是癌细胞，无止境增生的癌细胞使患者体内的营养物质被大量消耗，同时癌细胞还能释放出多种毒素，使人体产生一系列症状，如果发现和治疗不及时，它还可转移到全身各处生长繁殖。传统治疗癌症的手段包括放化疗、手术等，但治疗效果远不能令人满意。近年来兴起的免疫治疗方法依靠其突出的表现已成为癌症治疗的标准方法，其原理是通过调控患者的免疫应答，以增强自身免疫系统杀伤肿瘤细胞的能力。

免疫治疗方法主要集中在三个方面：一是免疫检验点的阻断；二是过继性细胞疗法；三是癌症疫苗。免疫检验点是机体防止过度激活免疫系统的抑制途径，对于维持自身耐受至关重要。肿瘤细胞利用某些免疫检验点避免被 T 细胞杀伤，

PD-1/PD-L1 是经常被利用的检验点之一，肿瘤细胞通过表达PD-L1与T细胞表面的PD-1结合从而避免被肿瘤细胞识别和杀伤，因此阻断 PD-1 和 PD-L1 的结合对解除免疫系统的抑制有重要意义。

程序性死亡受体-1 (Programmed Death receptor-1， PD-1) ，由TasukuHonjo及其同事在1992年首次报道，并提出PD-1与程序性凋亡有关。现在发现PD-1是一种跨膜蛋白，参与免疫检查点，在T细胞和祖B细胞表面广泛表达。PD-L1（B7-H1，CD274）是PD-1的配体，PD-L1大小为40KD，在多种造血细胞和非造血细胞上诱导表达。PD-1是CD28 / CTLA-4 /ICOS共刺激受体家族成员，可提供对淋巴细胞免疫有深远影响的负信号，调控免疫应答。研究表明，可以通过破坏PD-1和PD-L1之间的结合来增强T细胞杀伤能力，使肿瘤部位T细胞和IFN-γ增加，有利于形成抗肿瘤微环境。

目前，国外已上市的PD1和PD-L1药物总共有6种，其中PD-1药物3种，PD-L1药物3种。2014年Nivolumab（纳武利尤单抗，商品名：Opdivo，欧狄沃）获批上市，成为第一个PD-1抑制剂，用来治疗晚期黑色素瘤，开启了此类药物的飞速发展时代。另两个PD-1药物分别为为Pembrolizumab（帕博利珠单抗，商品名：Keytruda，可瑞达）和Cemiplimab（商品名：Libtayo）。PD-L1药物有Atezolizumab（阿特珠单抗，商品名：Tecentriq），Duravulumab（商品名：Imfinzi），Avelumab（商品名：Bavencio）。这些药物被用于治疗多种类型的癌症，包括黑素瘤，非小细胞肺癌，肾细胞癌，尿路上皮癌，肝细胞癌，胃癌，结肠直肠癌，头颈癌，Merkel细胞癌和霍奇金淋巴瘤。Nivolumab和Pembrolizumab也已在我国上市，同时我国国内研发的特瑞普利单抗（商品名：拓益）和信迪利单抗（商品名：达伯舒）两种PD-1抗体，也于同一时间在国内获批上市，但国内暂时没有PD-L1抗体药物上市。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗PD-L1单克隆抗体，本发明还提供该抗体在制备抗癌药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的抗PD-L1单克隆抗体，其轻链序列和重链序列如下：

轻链序列：

DVVMTQAPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFCGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQGTNAPLTFGAGTKLELKRADA；

重链序列：

QLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARYEGAYGNYFDYWGQGTTLTVSSA。

所述轻链序列的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；其中

LCDR1的序列为SEQ NO .1：RSSQSLVHSNGNTYLH，

LCDR2的序列为SEQ NO .2：KVSNRFS，

LCDR3的序列为SEQ NO .3：SQSTHAPLT。

所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；其中：

HCDR1的序列为SEQ NO .4：GYAFTNY，

HCDR2的序列为SEQ NO .5：YPGSGN，

HCDR3的序列为SEQ NO .6：YEGAYGNYFDY。

本发明所述抗PD-L1单克隆抗体在制备抗癌药物方面的应用。

本发明从噬菌体抗体库筛选出的抗PD-L1单克隆抗体对PD-L1具有良好的亲和力，并能够抑制PD-L1和 PD-1的结合。该抗PD-L1单克隆抗体进一步人源化后作为免疫检查点抑制剂，可用于癌症及感染性疾病的治疗。

附图说明

图1是小鼠血清抗体效价检测监测统计曲线。

图2是Fab抗体Westem Blot检测图。

图3是本发明抗PD-L1单克隆抗体的亲和力检测图。

图4是抗PD-L1抗体显著抑制PD-1与细胞表面PD-L1的相互作用。

图5是抗PD-L1抗体显著抑制肿瘤生长。

图6是抗人PD-L1单克隆抗体特异性结合PD-L1。

具体实施方式

实施例1 本发明抗PD-L1单克隆抗体的制备

本发明的技术路线为：

通过使用PD-L1蛋白免疫小鼠，确定免疫成功后，分离出小鼠脾脏，提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR扩增出抗体轻、重链基因，然后构建单链抗体噬菌体库，通过筛选获得目标抗体。

一、实验材料

1、菌株 E.coli TG1；E.coli DH5α，用于Fab抗体的表达。实验室保存。

2、质粒载体 pComb3XTT。实验室保存。

3、试剂 Trizol总RNA 抽提试剂盒、M-MLV 反转录酶、RNA 酶抑制剂购自Invitrogen 公司。

Tag DNA 聚合酶、重组连接酶及内切酶均购自NEB公司。DNA胶回收试剂盒购自上海生工公司。

二、实验步骤

1、免疫小鼠

选择SPF级别的8周龄balb/c小鼠，每次腹腔注射100ng的PD-L1蛋白，每隔14天注射一次。初次免疫选用完全弗氏佐剂乳化，之后使用非完全弗氏佐剂乳化。3次加强免疫后，取小鼠尾血ELISA检测。具体方法：

（1）用1%BSA封闭液将小鼠血清按1:5000，1:10000，1:30000，1:50000，1:100000，1:50000稀释比例稀释。将PD-L1蛋白稀释至5μg/mL，包被于96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被12小时。

（2）拍掉酶标板中抗原，每孔加入100μL的PBST进行清洗，每次洗30s后倒掉孔中的PBST清洗液，洗3次，将板中PBST甩干。

（3）每孔加入PBS稀释的2%的BSA封闭液，37℃封闭1小时。用PBST洗三次，每次30s，甩干PBST。

（4）加入稀释的小鼠血清，用未处理过的小鼠血清相同比例使用1%BSA稀释后作为阴性对照，各加入100μL。37℃孵育2小时。用PBST洗三次，每次30s，甩干PBST。

（5）每孔加入1:5000使用1%BSA稀释稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100μL，37℃孵育1小时，用PBST洗五次，每次30s，甩干PBST。

（6）每孔加入100μLTMB单组份显色液显色，达到预期显色后每孔加入100μL 1MHCL终止显色。阳性判定条件为检测值≥2.1*阴性。未达到要求继续免疫。

图1为小鼠血清抗体效价检测监测统计表。

从图1显示结果可以看出，PD-L1蛋白包被浓度为5μg/mL时，三只小鼠的血清在1:500000稀释后均有效价，说明免疫效果都很好，达到预期要求，准备进行下一步实验。

2、分离纯化脾细胞

取出小鼠脾脏；用PBS洗涤并移除多余脂肪组织，将脾脏结置于200 目不锈钢网膜中，轻轻按压脾脏，使脾脏细胞分散并通过网膜流入平皿中。用PBS 轻轻冲洗不锈钢网膜和平皿，轻轻吹打均匀后将细胞悬液置于15ml 离心管中，离心收集细胞。

3、提取淋巴细胞总RNA

按照Invitrogen 公司的Trizol总RNA 抽提试剂盒说明书提取淋巴细胞总RNA。

4、单克隆抗体细胞RNA反转录

反应体系：

在200 μL的EP管中加入反应体系，充分混合，37 ℃反应30 min，85 ℃5 s终止反应，进行RNA反转录。

5、扩增轻、重链基因

5.1 引物序列

引物列表：

5.2 轻、重链基因扩增体系

反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30 个循环，72℃延伸10min。电泳胶回收纯化轻、重链基因片段。

6、Fab抗体库的构建和鉴定

轻链片段和pComb3XTT经XbaI和Sac I双酶切后重组连接转化大肠杆菌TG1，扩增后提取质粒与重链FD段经XhoI和SpeI双酶切后重组连接转化TG1，加入培养基37℃培养，当OD600为0.8 时，加入VCMS13辅助噬菌体，37℃培养过夜培养。三次富集筛选后获得理想Fab抗体，纯化质粒，转化DH5α-IQ，IPTG诱导表达Fab抗体。

将获得的质粒送至公司测序，比对后获得抗体轻、重链序列如下：

抗体轻链序列为DVVMTQAPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFCGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQGTNAPLTFGAGTKLELKRADA。

重链序列为

QLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARYEGAYGNYFDYWGQGTTLTVSSA。

实施例2 抗PD-L1单克隆抗体的检测

1、抗体Western blot检测

（1）制聚丙烯酰胺凝胶：配置12%分离胶液体纯水封闭15分钟后即可凝固，然后加入浓缩胶插上相应梳子，15分钟后即可凝固使用，现配现用保证实验效果。

（2）处理样品：取适量PD-L1稀释至40 μL，按4：1比例加入5x变形非还原缓冲液，100℃金属浴煮沸5分钟，离心机12000 rmp离心5分钟。

（3）电泳：每孔加入20 μL样品，加入5 μL彩虹Marker作为对照，50 mA恒流进行电泳，直至指示剂达到胶板底部。

（4）转膜：根据彩虹Marker将目的蛋白大小处胶按合适面积切下，裁剪比胶略大的滤纸6片，裁剪与胶相同大小的PVDF膜1片。将胶和滤纸浸泡在电转缓冲液中。用镊子将PVDF膜浸泡在甲醇中30秒后拿出，激活PVDF膜吸附蛋白能力。依次按照负极，3片滤纸，蛋白胶，PVDF膜，3片滤纸，正极的顺序一层一层叠加，用镊子慢慢挤出中间气泡，防止气泡阻碍蛋白转膜。在冰浴中进行电转，保证全程低温防止温度过热影响转膜效果，电泳仪调至300 mA恒流1小时即可。

（5）洗涤：戴上一次性PE手套用镊子取出PVDF膜，防止PVDF膜粘上其他蛋白，用PBST缓冲液洗膜3次。

（6）封闭：用PBS缓冲液配置5%脱脂奶粉，常温封闭PVDF膜2小时，取出PVDF膜用PBST缓冲液洗膜3次。

（7）一抗孵育：加入5 μg/mL表达的Fab抗体稀释液进行孵育，摇床常温放置2小时，取出PVDF膜用PBST缓冲液洗膜3次。

（8）二抗孵育：用1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠二抗孵育，摇床常温放置2小时，取出PVDF膜用PBST缓冲液洗膜3次。

（9）ECL显影：将 ECL发光试剂盒中发光剂和稳定剂1:1充分混合均匀的均匀涂抹在 PVDF 膜上。放入凝胶成像系统曝光，拍照保存，如图2所示。

从图中可以看出，Western blot检测筛选到的抗体与PD-L1可以特异性结合。

2、抗体亲和力检测

1）包被抗原：将PD-L1蛋白稀释至20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL的浓度，分别在96孔酶标板上包被足够数量的孔，放置4 ℃12小时。

（2）拍掉酶标板中包被的PD-L1稀释液，每孔加入100 μL的PBST清洗液进行清洗，每次洗30 s后倒掉孔中的PBST清洗液，洗三次，将板中PBST清洗液甩干。

（3）每孔加入PBS稀释的2%的BSA封闭液，37 ℃封闭1小时。用PBST清洗液洗三次，每次洗30 s后倒掉孔中的PBST清洗液，甩干PBST清洗液。

（4）将单抗从20 μg/mL浓度开始倍比稀释8次，将稀释液依次分别加入包被各PD-L1浓度的8个孔中，每孔加入100 μL。用PBS缓冲液作为空白对照，用血清效价达到要求的血清按效价结果使用1%BSA溶液稀释后作为阳性对照，用未处理过的小鼠血清相同比例使用1%BSA溶液稀释后作为阴性对照，各加入一个孔，每个孔加100 μL。将酶标板37 ℃孵育2小时。用PBST洗三次，每次洗30 s后倒掉孔中的PBST清洗液，甩干PBST清洗液。

（5）每孔加入1:5000使用1%BSA溶液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100 μL，将酶标板37 ℃孵育1小时，用PBST清洗液洗5次，每次洗30s后倒掉孔中的PBST清洗液，甩干PBST清洗液。

（6）每孔加入100μLTMB单组份显色液显色。显色到预期水平后加入100 μL 1M HCl终止显色，使用酶标仪记录OD450吸光度数据，对数据进行分析。

（7）计算抗体亲和系数：使用 Prism 6软件拟合抗原抗体结合曲线，如图3所示。计算公式为：K =(n-1)/(n*[Ab’]总-[Ab]总)，其中[Ab]总是[Ag]总浓度下半数吸光值时抗体的摩尔浓度，[Ab’] t 是[Ag’] t 浓度下半数吸光值时抗体的摩尔浓度，n=Ag/Ag’。

计算后得到单抗的IC50值，通过公式计算出抗体的亲和常数为5.5*10⁸ M^-1。这说明本发明制备的抗体亲和力较高，可有效降低抗体剂量，降低用药成本。

实施例3 抗人PD-L1单克隆抗体对PD-1/ PD-L1相互作用的阻断效应

将表达人PD-L1的CHO细胞悬浮于FACS缓冲液中。向细胞悬浮液中加入本发明制备的抗PD-L1抗体（0.5 ug/ml）并于4℃温育30分钟。洗去未结合的抗体并将FITC标记的PD-1重组蛋白（1 ug/ml）加入到试管中并于4℃温育30分钟。

使用FACScan流式细胞仪进行流式细胞计量分析，根据染色的平均荧光强度（MFI）的测量，结果显示抗PD-L1单克隆抗体阻断PD-1与表达PD-L1的CHO细胞的结合，如图4所示。证明本发明制备的抗PD-L1单克隆抗体能显著抑制PD-1与细胞表面PD-L1的相互作用。

实施例4 使用抗人PD-L1单克隆抗体处理体内肿瘤模型

用抗PD-L1抗体体内处理植入有癌性肿瘤的小鼠以检验抗体对肿瘤生长的体内影响。

根据体重将6-8周龄之间的雌性AJ小鼠随机分成6组。在第0天将溶于200 u1 DMEM培养基的2

10⁶个SA1/N纤维肉瘤细胞在右侧皮下植入小鼠。用PBS对照或10 mg/kg的抗体处理小鼠。在第1、4、8和11天用大约200 ul含有抗体的PBS或对照通过腹腔内注射给动物给药。每组包含10只动物，各组组成如下：（1）PBS对照组，（2）对照小鼠IgG，（3）对照仓鼠IgG，（4）本发明抗PD-L1抗体。对小鼠每周两次监测肿瘤生长，持续大约6周。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度

宽度

长度)并计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点(1500 mm³)或显示大于15%的体重减少时将小鼠处死，结果显示于图5：抗PD-L1抗体将达到肿瘤终点体积(l500 mm³)的平均时间从对照组的25天延长到40天，因而，抗PD-L1抗体处理对肿瘤生长具有直接的体内抑制效果。

实施例5 抗人PD-L1单克隆抗体特异性结合PD-L1而不结合PD-L2 蛋白

PD-1有两个配体，分别是PD-L1和PD-L2，它们都是跨膜糖蛋白，约有40％的氨基酸残基完全一样。采用间接ELISA分析PD-L1单克隆抗体识别PD-L1的特异性。

将人PD-L1和PD-L2重组蛋白稀释为1 ug/ml，每孔100 ul加入酶标板中，4℃孵育过夜。用含0. 05%吐温的PBST 洗涤3次，每次3 min，再用2%的牛血清白蛋白（BSA）于37℃封闭1 h，PBST 洗涤3次，每次3 min。将不同浓度的抗体每孔加入100 ul，37℃孵育1 h。PBST 洗涤3 次，每次3 min，再加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗100 ul，37℃孵育40 min。PBST 洗涤5 次，加入TMB 单组分显色液，室温避光反应10 min 后加入50 ul浓硫酸终止液终止反应，酶标仪读取OD450值，进行结果分析。结果显示于图6，证明抗人PD-L1单克隆抗体特异性结合PD-L1而不结合PD-L2 蛋白。

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SequenceName : 重链序列

SequenceDescription :

Claims (4)

1.一种抗PD-L1单克隆抗体，其特征在于：所述抗体的轻链序列和重链序列分别为：

轻链序列：

DVVMTQAPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFCGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQGTNAPLTFGAGTKLELKRADA；

重链序列：

QLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARYEGAYGNYFDYWGQGTTLTVSSA。

2.根据权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体，其特征在于：所述轻链序列的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；其中

LCDR1的序列为SEQ NO .1：RSSQSLVHSNGNTYLH，

LCDR2的序列为SEQ NO .2：KVSNRFS，

LCDR3的序列为SEQ NO .3：SQSTHAPLT。

3.根据权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体，其特征在于：所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；其中：

HCDR1的序列为SEQ NO .4：GYAFTNY，

HCDR2的序列为SEQ NO .5：YPGSGN，

HCDR3的序列为SEQ NO .6：YEGAYGNYFDY。

4.权利要求1所述抗PD-L1单克隆抗体在制备抗癌药物方面的应用。

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