CN111995683A

CN111995683A - 抗pd-l1蛋白单克隆抗体、细胞株及其制备方法和应用

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Publication number: CN111995683A
Application number: CN202010907657.1A
Authority: CN
Inventors: 王小亚; 杨清海; 陈惠玲; 周洪辉
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-09-02
Also published as: CN111995683B

Abstract

本发明涉及生物检测领域，提供抗PD‑L1蛋白单克隆抗体，其重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.1；轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明还提供抗体的制备方法，包括以下步骤：免疫原制备、免疫实验兔、构建抗体cDNA文库并筛选、噬菌体单链抗体库筛选得到可变区序列、构建表达PD‑L1的CHO细胞株并筛选、细胞株大量生产单克隆抗体；其中免疫原为重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了一株稳定高表达CHO细胞株4‑5G，分泌的抗PD‑L1蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达PD‑L1蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗PD-L1蛋白单克隆抗体、细胞株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗PD-L1蛋白单克隆抗体、细胞株及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤的免疫治疗是目前精准医学领域最热门的研究课题，肿瘤的免疫治疗在近5年来进入了一个全新的时代，即现在比较流行的肿瘤免疫治疗技术——单克隆抗体类免疫检查点抑制。其中程序性死亡受体(PD-1)以及它的配体(PD-L1)的免疫检查点抑制技术是目前肿瘤免疫治疗的新颖且热门的研究方向，其与临床治疗指导和预后疗效评估密切相关的，已经被证明是当前最有检测价值的免疫生物标志物。

研究显示PD-1/PD-L1信号通路的激活可导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤，而阻断PD-1/PD-L1信号通路则可以逆转肿瘤免疫微环境，增强内源性抗肿瘤免疫效应，因此检测肿瘤组织中肿瘤细胞和免疫细胞的PD-L1的表达水平是目前PD-1/PD-L1免疫治疗关注的焦点，表达水平高低直接影响到PD-1/PD-L1抑制剂治疗效果。

目前PD-1/PD-L1抑制剂在用药前均需要检测PD-L1的表达。而PD-L1的检测是基于细胞蛋白水平的检测，免疫组化法(IHC)是目前有且仅有的一种PD-L1检测方法。因此，优良的PD-L1免疫组化抗体对于患者组织样本的的精准诊断及准确的指导用药至关重要。

发明内容

本发明提供了一种抗PD-L1蛋白单克隆抗体，所述抗PD-L1蛋白单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述抗PD-L1蛋白单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述抗PD-L1蛋白单克隆抗体特异性识别PD-L1蛋白C端的100-290aa。

进一步地，所述抗PD-L1蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.19958的稳定高表达CHO细胞株4-5G产生。

本发明又提供一种抗PD-L1蛋白单克隆抗体的制备方法，所述抗体的制备包括以下步骤：免疫原制备、免疫实验兔、构建抗体cDNA文库并筛选、噬菌体单链抗体库筛选得到可变区序列、构建表达PD-L1的CHO细胞株并筛选、细胞株大量生产单克隆抗体；其中所述免疫原为经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明再提供了一株分泌抗PD-L1蛋白单克隆抗体的稳定高表达CHO细胞株4-5G，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC NO.19958，保藏时间为2020年7月30日。

本发明还提供了一株分泌抗PD-L1蛋白单克隆抗体的稳定高表达CHO细胞株4-5G的制备方法，其特征包括，所述制备方法包括以下步骤：免疫原制备、免疫实验兔、构建抗体cDNA文库并筛选、噬菌体单链抗体库筛选得到可变区序列；构建表达PD-L1的CHO细胞株并筛选。

本发明进一步提供了上述的抗PD-L1蛋白单克隆抗体，在PD-L1蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法。

区别于现有技术，上述技术方案依据PD-L1蛋白的抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择PD-L1蛋白第100-290位氨基酸序列进行大肠杆菌重组,得到氨基酸序列为SEQ ID No.3免疫原。对兔进行免疫，免疫实验兔、构建抗体cDNA文库并筛选、噬菌体单链抗体库筛选得到可变区序列、构建表达PD-L1的CHO细胞株并筛选、细胞株大量生产单克隆抗体。本方案得到的稳定高表达CHO细胞株4-5G可以稳定、大量的生产抗体，PD-L1抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达PD-L1的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为PD-L1重组蛋白纯化电泳图，其中M：Marker；1：PD-L1重组蛋白过柱收集液；

2-5为蛋白洗脱液，Wash buffer浓度依次为：10mM、20mM、50mM、250mM；黑框标注为目的蛋白位置。

图2血清效价变化曲线图，其中用免疫次数作为横坐标，血清稀释倍数1:125000条件下波长450nm处的吸光值作为纵坐标。

图3为质粒载体pCANTAB5e的图谱及酶切位点图。

图4为不同细胞克隆抗体表达量WB检测图；(其中NC表示：CHO宿主细胞培养上清；其余名称表示不同克隆号)WB检测采用非还原性电泳，样品上样量均为20μL。

图5为不同细胞克隆抗体表达量胎盘组织免疫组化鉴定图(其中NC表示：CHO宿主细胞培养上清，其余名称表示不同克隆号)。

图6为PD-L1抗体(4-5G)的WB检测图，其中，1为CHO-K1-PD-L1细胞裂解液，2为CHO-K1细胞裂解液。

图7为PD-L1抗体(4-5G)在胎盘组织的免疫组化染色图。

图8为PD-L1抗体(4-5G)在扁桃体隐窝组织的免疫组化染色图。

具体实施方式

实施例1免疫原制备

一、免疫原表达载体的构建

根据NCBI中人PD-L1的基因序列(NM_014143)，合成PD-L1的C端PD-L1 C端(氨基酸残基100-290aa)的基因，并克隆到pET-22b(+)表达载体上，构建pET-22b(+)-PD-L1表达载体。

同时，融合pET-22b(+)载体上的His-tag，组成重组人PD-L1蛋白。最终表达的重组人PD-L1蛋白约为22kD，其序列如SEQ ID NO.3所示：

二、免疫原的诱导表达

1、表达菌构建：将pET-22b(+)-PD-L1表达载体转化入大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆，测序验证成功后于-20℃冻存保藏。

2、菌液培养：复苏冻存保藏的含pET-22b(+)-PD-L1表达载体BL21大肠杆菌，将2mL菌液接入100mL LB液体培养基中，加入50μL浓度为100mg/mL的氨苄溶液，放置于37℃摇床中，转速200×rpm培养2.5-3小时，至分光光度计测定菌液OD600为0.6-0.8时最佳。

3、蛋白诱导：加入63μL浓度为80mg/mL的IPTG作为诱导剂，转速200×rpm的37℃摇床中诱导6小时。将诱导后的菌液转移至50mL离心管中，4℃，8000×g离心5分钟。去上清，加入20mLPBS重悬沉淀，超声破碎。

4、诱导后处理：破碎后的菌液12000×g，4℃离心20分钟。去上清，在沉淀中加入约25mL浓度为8M脲使之溶解。沉淀放置于4℃保存，尽快纯化。

三、免疫原的分离纯化

1、PD-L1重组蛋白带有His-tag，采用蛋白质亲和层析法分离纯化HER2蛋白，使用的金属螯合亲和层析胶体为Ni-NTA agarose。

2、装柱：吸取约7mL浸泡在20％酒精中保存的Ni胶体装入管柱内，管柱内呈现淡蓝色。等待约半小时，令Ni胶体颗粒自行沉降至管柱底部,调节流速1.8mL/分钟，流出酒精。加入约10mL8M脲(pH8.0)作为Wash buffer，洗掉Ni胶体颗粒间隙的酒精。

3、上样及洗脱：使用5mL移液枪吸取样品加入管柱中，调节流速为0.8mL/分钟，收集流出液，标记为流穿。按顺序加入10mM、20mM、50mM、250mM的Wash buffer(即8M脲·咪唑混合液)洗脱蛋白，分别收集并做好标记，放入4℃冰箱保存。

4、再生：吸取约10mL8M脲·500mM咪唑冲洗平衡柱子，将Ni柱胶体保存在20％酒精中，放入4℃冰箱保存。

5、SDS-PAGE检测蛋白：根据PD-L1重组蛋白的分子量，配制12.5％的分离胶，将收集的溶液进行SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯化情况。

检测结果如图1所示，编号为5的泳道样品是浓度250mM的Wash buffer洗脱下的蛋白，其蛋白分子量大小约为22KDa(即黑框标注处)，与PD-L1重组蛋白大小相符，且条带干净没有杂蛋白，确定蛋白纯化成功。

四、免疫原的复性

洗脱后的蛋白溶解于250mM wash buffer中，将其装入透析袋中，浸没在装满透析液(PBS溶液)的烧杯里，透析过夜，次日每隔2小时换液一次，浸泡透析液24小时后，收集透析袋内的蛋白液，测定蛋白浓度。

实施例2免疫实验兔

一、免疫原乳化

在免疫注射前，将经过复性处理后的PD-L1重组蛋白稀释至浓度0.4mg/mL，与佐剂等体积混合。于乳化器上制备乳剂(通常震荡45s，停15s，以确保蛋白活性)，直至乳剂滴水不化，放于冰上备用。

二、免疫注射

选取一只雄性两月龄新西兰大白兔作为免疫对象，每隔14日注射一次，背部皮下多点注射，共注射5次。初次与终次加强免疫，注射量为0.8mg蛋白，其余注射量均为0.4mg蛋白。免疫过程如表1。

表1免疫过程

三、免疫血清鉴定

每次免疫结束，均在一周后取兔子耳部静脉血，离心获得上层血清，用间接竞争ELISA法进行抗体效价测定，观察血清抗体变化情况。

1.将PD-L1重组蛋白用ELISA包被液稀释浓度为1μg/mL，包被聚苯乙烯微量反应板，4℃过夜；倒掉包被液，PBST洗涤3次，每次3分钟，用3％BSA-PBS封闭过夜。

2.依次将血清稀释1000、5000、25000、125000、625000、3125000倍，将稀释后的血清加入酶标板，每孔100μL，37℃孵育2h后作为一抗进行反应，同时设置阴性对照(将血清换成等体积的PBS)，37℃孵育2h。

3.倒掉反应物，PBST洗涤3次，每次3分钟。每孔加入HRP标记IgG复合物(1:50稀释)100μL作为二抗，37℃孵育1h。

4.倒掉二抗，PBST洗涤3次，每次3分钟。每孔加入TMB 100μL，进行显色反应，37℃避光孵育30分钟后，立即加入100μL 1M盐酸终止液，终止显色反应，并用酶标仪测定溶液在450nm处的吸光值A450。

抗体效价计算方法为OD值乘以稀释倍数。用免疫次数作为横坐标，血清稀释倍数1:125000条件下波长450nm处的吸光值作为纵坐标，绘制图2，血清效价变化曲线图。从图2中可以看出，每次免疫后实验兔子的血清中抗体效价均有所增长，说明血清抗体与PD-L1重组蛋白特异性结合；第四次免疫后效价大幅上升，说明兔子对PD-L1重组蛋白产生较强的体液免疫应答。终次免疫后效价达到2.25×10⁵，高于标准值1.25×10⁵，血清可进一步用于免疫组化检测。

实施例三、构建抗体cDNA文库并筛选

一、脾脏总RNA提取

1脾脏细胞分离

确定经PD-L1重组蛋白免疫的兔子血清中产生了特异性抗体，使用乙醚迷晕兔子，将其安乐死，取出脾脏组织。

1)将脾脏放于灭菌平皿中，加入PBS，在铜网上研磨，使细胞分散；

2)将研磨后溶液转移至50mL离心管中，转速2000rpm离心10分钟，

小心去上清；

3)用40mL NH₄Cl溶液重悬沉淀，4℃，转速2000rpm低温离心10分钟；

4)重复操作步骤3一次；

5)加入40mL PBS混匀，离心同上，弃上清；

6)重复操作步骤5，即得到脾脏细胞，冻存于-80℃冰箱。

2脾脏总RNA提取

脾脏细胞总RNA的提取使用TRIzol LS Reagent。以下所有器具(如镊子、枪头、离心管等)皆提前浸泡DEPC水过夜，后高温高压灭菌烘干，以去除RNA酶。

1)取300μL上述脾脏细胞，加入1.5mL离心管中，向离心管中加入1mL TRIzol LSReagent，振荡混匀后静置5分钟。

2)向上述溶液中加入氯仿(CHCl3)200μL，振荡混匀后静置2-3分钟，接着4℃，12000rpm离心10分钟。

3)小心抽取上清到洁净离心管中，加入500μL异丙醇，剧烈振荡混匀后静置10分钟；然后4℃12000rpm离心10分钟。

4)弃上清，沉淀中加入75％乙醇1mL，震荡重悬，4℃，12000rpm离心10分钟。

5)弃上清并在通风橱风干沉淀后加入20μL DEPC水溶解沉淀的RNA。将RNA置于-80℃冰箱冷藏保存，取少量通过琼脂糖凝胶电泳检测提取结果。

二、逆转录生成cDNA

使用北京全式金公司生产的Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis Super mix试剂盒，逆转录RNA合成cDNA。具体反应体系如表2：

表2逆转录反应体系

实验操作时，先加入Total RNA、Anchored Oligo(dT)18Primer、RNase-freeWater，65℃水浴5分钟，冰浴2分钟，再加入其它组分，42℃水浴30分钟，85℃热激5S。获得的cDNA放置于-20℃冰箱保存。

三、引物设计

重链引物序列如表3，轻链引物序列如表4，Linker引物序列如表5：

表3重链引物序列

表4轻链引物序列

表5 Linker引物序列

四、抗体VH、VL基因的获取

1、以逆转录生成的cDNA作为模板，上下游引物配对如表6：

表6引物配对

2、设置温度梯度摸索最佳退火温度，退火温度分别为51℃-64℃。确定最佳退火温度为61℃，由此设置PCR反应条件。具体PCR反应条件如表7，反应体系如表8：

表7 PCR反应条件

表8 PCR反应体系

3、PCR产物的回收与纯化

配制1.0％琼脂糖凝胶核酸电泳对PCR产物进行检测。确定目的条带正确后，用洁净刀片切割目的胶体，之后使用OMEGA公司生产的Gel Extraction Kit胶回收试剂盒进行胶回收，回收后的DNA放入-20℃冰箱保存。

五、ScFv基因的拼接

1、将上一步获得的VH、VL的PCR产物，使用RS-FP SfiI和RS-RP NotI两个具有互补末端的引物作为Linker，经由重叠延伸PCR随机拼接组装ScFv。首先确定PCR反应条件，设置温度梯度，其余条件同前，先进行梯度PCR。反应结束后，确定最佳退火温度，再大量进行扩增。

2、配制1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，切割目的条带胶回收。回收后的DNA取1μL，使用微量紫外分光光度计检测浓度与纯度。

六、pCANTAB5e质粒载体与ScFv基因双酶切

实验使用噬菌体展示系统，其中质粒载体pCANTAB5e具有氨苄抗性，大小为4522bp，具体图谱及酶切位点见图3。

将含有pCANTAB5e质粒的菌株接种至LB液体培养基中，过夜扩培后提取质粒，测定质粒浓度。酶切使用的SfiⅠ与NotⅠ-HF两种酶皆为NEB公司产品，经多次预实验摸索出最佳酶切体系，如表9、10所示。

1、pCANTAB5e质粒载体双酶切

表9 pCANTAB5e双酶切体系

酶切结束后，取全部酶切产物与Loading Buffer混合，加入1.0％琼脂糖凝胶中，电压设置80V。切割目的片段胶体，胶回收后保存于-20℃。

2、ScFv基因双酶切

表10 ScFv双酶切体系

七、pCANTAB5e-ScFv重组质粒构建

根据表11的反应体系，依次将组分加入200μL洁净离心管，放置于酶连反应仪中，设置反应温度为16℃，反应时间为18h。

表11酶连体系

八、初级抗体库的构建(cNDA文库)

1、取-80℃中冻存保藏的TG1感受态细胞(经过pCANTAB5e-ScFv重组质粒转化的)，置于冰上放置，轻弹溶解，加入全部酶连产物(包括pCANTAB5e-ScFv重组质粒)，轻轻混匀，继续冰上放置30分钟。

2、42℃水浴90s，立刻转移到冰上放置3分钟。加入600μL不含抗生素的2×YT液体培养基，放置于37℃转速为150r/分钟的摇床里，培养1h得到菌液。

3、吹匀菌液，用2×YT液体培养基进行梯度倍比稀释，分别涂布于含100mg/L氨苄的2×YT-A平板上，37℃培养箱里正置30分钟后，倒置培养16-24h。

4、转化后剩余的菌液，加入50％终浓度灭菌甘油，-20℃冰箱中放置2h后，转移至-80℃冰箱冷冻保存，即为初级抗体库(cDNA文库)。次日对平板上的菌落进行计数，推算库容。

5、随机挑取18个2×YT-A平板上的单克隆，分别接种于400μL含50mg/L氨苄的2×YT-A液体培养基中，37℃，转速为200r/分钟摇床培养过夜。次日取培养后的菌液进行菌液PCR，初步鉴定阳性克隆，计算该抗体库的重组率。菌液PCR反应条件如表12，反应体系如表13。

表12 PCR反应条件

表13 PCR反应体系

实施例4.噬菌体单链抗体库筛选

一、淘筛前准备

1辅助噬菌体毒种制备

1)将辅助噬菌体M13KO7划线于2×YT固体平板上。

2)制备2×YT半固体培养基(0.7％琼脂)作为上层培养基(Top Agar),冷却至手心不烫，取4mL Top Agar并加入0.5mL过夜培养的新鲜TG1菌液(OD660约为0.8)，充分混匀，沿着划线浓度从低至高的方向倾倒Top Agar。

3)37℃培养6-12小时，用接种针挑取单个噬菌斑，接种于100mL含50mg/L卡那的2×YT-K液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。

4)4℃，8000rpm离心15分钟。

5)小心收集上清，用0.45μm无菌滤膜过滤后，分装至10mL无菌离心管中，存放于4℃冰箱保存，可用半年。

2辅助噬菌体滴度测定

1)准备不含任何抗生素的2×YT固体平板5-6个，制备2×YT半固体培养基(0.7％琼脂)作为上层培养基(Top Agar)，冷却至手心不烫。

2)将4.1.1步骤中制备好的噬菌体溶液用2×YT液体培养基梯度倍比稀释，稀释倍数为10^-7、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12。

3)取过夜培养的TG1菌液(OD660约为1)，分装小试管，每管500μL，标注10^-7、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12稀释度。依次加入相应稀释的噬菌体溶液100μL，充分混匀，37℃水浴30分钟，37℃摇床200rpm振荡培养30分钟。

4)每个试管加入3mL Top Agar，混匀后立刻浇注事先准备好的2×YT固体平板，37℃培养过夜。

5)计算平板上的噬菌斑数，乘以相应稀释倍数，即可得到该批噬菌体毒种的滴度。

3噬菌体增殖培养

1)取初级抗体库一支(1mL)，加入到50mL含0.1倍50％葡萄糖的2×YT-G液体培养基中，37℃，250rpm摇床振荡培养1h。

2)取培养液，测定细菌浓度，加入100μg/mL AMP和moi＝20:1的M13KO7辅助噬菌体，37℃水浴轻摇30分钟，再放置摇床上37℃200rpm振荡培养30分钟。此时从培养瓶中取出适量培养液，用2×YT液体培养基做梯度倍比稀释，以确定感染的有效性。

3)1000×g离心10分钟，小心去上清。用500μL含50mg/L氨苄和50mg/L卡那2×YT-AK液体培养基重悬沉淀，加入100mL2×YT-AK液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。

4)4℃，10000rpm离心20分钟，小心收集上清，尽快进行淘筛。

4噬菌体沉析

1)向收集的噬菌体上清中，按1/5体积(约20mL)的量加入PEG 8000/NaCl，4℃冰浴1小时。

2)分装入多个50mL洁净离心管中，4000rpm离心20分钟，弃上清，去除管壁残留液体；加入1/50体积的PBS(约2mL),重悬沉淀；4℃，10000rpm离心5分钟，取上清。

3)此时获得的上清，取100μL用2×YT液体培养基做梯度倍比稀释，稀释度分别为10^-7、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12。每个稀释度取100μL加入至新鲜培养的TG1宿主菌菌液(OD600＝0.5)中，37℃水浴30分钟，200rpm摇床震荡培养30分钟。涂平板，37℃倒置过夜培养。次日菌落计数，即为该淘筛步骤的噬菌体输入量。

二、酶标板淘筛

1、提前一天将酶标板用PD-L1重组蛋白包被，4℃过夜。包被量为每孔100μL。第一轮淘筛包被蛋白浓度为100μg/mL，此后浓度依次递减，分别为50μg/mL、25μg/mL、15μg/mL和10μg/mL。

2、次日，取出包被完毕的酶标板，每孔加入200μLPBS，洗板3次，拍干。

3、封闭液现配现用(2％脱脂奶)，每孔加入200μL，放入37℃封闭2小时。

4、倒掉封闭液，PBS洗板3次，拍干。

5、加入噬菌体上清，100μL/孔，37℃培养箱孵育1.5小时。

6、倒掉板内噬菌体上清，用PBST洗涤，洗涤次数根据淘筛轮数增加，分别为5次、8次、10次、15次、20次。拍干。

7、加入等体积(100μL)的甘氨酸-HCl，37℃静置8-10分钟，吹打吸入洁净离心管，每孔吹打三次，洗脱吸附于酶标板孔内的噬菌体。再加入等体积(100μL)Tris-HCl pH7.4中和洗脱液，后加入新鲜培养的宿主菌TG1菌液500μL，37℃水浴30分钟，37℃摇床200rpm振荡培养30分钟。即完成第一轮淘筛，获得一级抗体库。

8、取100μL培养后的菌液，用2×YT液体培养基梯度倍比稀释，稀释度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。涂布平板，37℃倒置培养过夜。次日菌落计数，即可计算出此轮淘筛的噬菌体输出量。

9、下一轮淘筛从噬菌体增殖培养步骤开始，进行循环淘筛。最终经过5轮淘筛，获得终极抗体库，用50％灭菌甘油保种，-20℃放置1h后，置于-80℃保藏。

10、从最后一次的筛选平板上随机挑取20颗单克隆，接种于2×YT液体培养基，37℃过夜培养，菌液PCR鉴定阳性率。

三、phage-ELISA检测重组抗体

1、从终极抗体库涂布的平板里随机挑取的单克隆接种于2×YT培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜后，菌液PCR鉴定阳性克隆，共选取20个阳性克隆编号并分别制备噬菌体上清。

2、用PD-L1重组蛋白包被酶标板，包被量为每孔100μL，蛋白浓度为10μg/mL，4℃过夜。

3、次日，倒干净包被液，PBST洗3次，每次3分钟，拍干，加入100μL 3％BSA-PBS，37℃封闭1h。

4、倒掉封闭液，PBST洗5次，每次3分钟，拍干。加入制备的噬菌体抗体上清，每孔100μL，设空白对照一个，空载体噬菌体上清，BSA作为阴性对照，37℃孵育2h。

5、倒掉结合液，PBST洗3次，每次3分钟，拍干。加入HRP-羊抗鼠IgG(1:5000稀释)，每孔100μL，37℃孵育1h。

6、倒掉结合液，PBST洗3次，每次3分钟，拍干。加入TMB进行显色反应，每孔100μL，37℃避光反应30分钟，每孔加入100μL 1M盐酸终止反应，使用酶标仪测定450nm处的吸光值。

四、胎盘组织免疫组化特异性鉴定阳性克隆

1、脱蜡水化：将制作好的胎盘组织石蜡切片置于60℃恒温箱中烘烤20分钟，二甲苯脱蜡2次，每次10分钟，梯度乙醇水化，100％-100％-95％-85％，每次3分钟，迅速进行自来水冲洗，浸泡。

2、抗原修复：取1L柠檬酸盐缓冲液于高压锅内煮沸，将脱蜡后的组织切片置于沸腾的缓冲液中，立即盖上锅盖，加热待喷气后计时90s，冷却至室温，取出玻片后自来水冲洗，PBS洗一次。

3、甩去PBS，用PAP笔在组织片周围画圈，油圈距离组织片边缘2-3mm。

4、内源性过氧化物酶阻断：在画圈的组织上滴加2-3滴内源性过氧化物酶阻断剂，轻轻摊匀，室温下封闭10分钟；PBS冲洗三次，每次3分钟。

5、结合：加入制备好的噬菌体上清，37℃培养箱孵育1.5小时。

6、二抗孵育：PBS洗去噬菌体，滴加稀释好的HRP标记鼠抗噬菌体二抗100μL，放入37℃培养箱中孵育5分钟。

7、PBS洗去二抗，加入配制好的DAB显色液100μL，室温静置5分钟，PBS洗去。苏木素染色20s，自来水冲洗，PBS返蓝20s，自来水冲洗。置于60℃恒温干燥箱，烘干水分。

8、封片：滴加2滴中性树脂，盖上盖玻片，晾干。使用显微镜观察并拍照，寻找阳性较强的克隆。

五、特异性抗体测序

通过phage-Elisa对菌液PCR呈阳性的重组噬菌体进行亲和力鉴定，以及胎盘组织免疫组化结果，取反应效果最佳的阳性克隆送往上海生工公司测序，获得重链、轻链可变区基因序列。重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例5.构建表达PD-L1的CHO细胞及稳定高表达细胞株筛选

一、CHO细胞表达载体的构建

根据获得的阳性克隆的重链、轻链可变区基因序列，交由基因公司分别合成对应的重链、轻链的完整基因即包括可变区、恒定区和信号肽。同时，将抗体完整的重链基因和轻链基因分别克隆于pcDNA3.1(+)表达载体上，分别构建pcDNA3.1(+)-Heavy Chain和pcDNA3.1(+)-Light Chain表达载体，两个载体一起构成完整的兔单克隆抗体表达载体。

二、确定单克隆筛选的G418浓度

1、观察正常CHO细胞状态良好，待贴壁率95％以上，弃旧培养液，加入0.25％胰酶溶液。放入5％CO₂培养箱孵育5分钟，加入1640(含10％FBS)培养基终止胰酶消化，800rpm离心5分钟，弃上清。

2、用1640(含10％FBS)培养基重悬细胞，轻轻吹打细胞8-10次，成单个细胞。将细胞以30％密度接种于24孔板中。

3、待细胞密度达50％左右，将孔中培养基吸除，PBS洗涤两次，每孔加入不同浓度G418筛选培养基，3天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低浓度细胞全部死亡为基准。设定G418浓度为0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL、1100μg/mL。最终选择800μg/mL用于后续实验。

三、G418筛选稳定高表达细胞株

1、将构建好的兔单克隆抗体重链、轻链重组质粒pcDNA3.1(+)-Heavy Chain和pcDNA3.1(+)-Light Chain按1:1的比例瞬时转染CHO细胞，48小时后Western Blot鉴定转染效率。同时，将细胞进行传代，此时可加入G418，使其终浓度达到800μg/mL。(注：转染时需转染两盘细胞，一盘鉴定，一盘用于筛选)。

2、每天观察细胞生长状态，48小时换液一次，维持G418浓度(800μg/mL)。

3、筛选第6天，观察细胞生长状态，细胞会出现大量死亡，此时选用适应性培养基，细胞传代，并将剩余细胞做好标记冻存。若死细胞过多，细胞需及时换液。

适应性培养基：转染前，在细胞汇合度达到80％的时候，换液，培养过夜之后收集培养液(未变黄)，离心3000rpm，10分钟，吸上清0.22μm过滤，和新鲜的培养液按1：1混合4℃备用。

4、第7天至第14天，每3天对细胞进行传代。第14天，可见细胞成簇状分布，有抗性克隆出现。对细胞进行计数后，以10个/mL接种于96孔板，进行高表达细胞株筛选。

5、单克隆种于96孔板后，第2天可进行观察，标记出每个孔中仅有一个细胞的孔，细胞生长到5-7天成簇状分布，此时将标记出的单克隆细胞传代至48孔板。(注：应该每天对标记的孔进行观察，排除不是单克隆的孔，细胞传代时，将10μL胰酶加入96孔中，在显微镜下观察确定细胞被消化下来后，加入90μL培养基，混匀后全部转至24孔板中)。

6、单克隆种于24孔板后，生长5-7天，待细胞密度达70％左右，将细胞传代至T25培养瓶中。

7、细胞传代至T25后，待细胞密度达到90％左右，以2×10⁶个细胞继续传代至T25培养瓶，48小时后收集细胞培养上清Western Blot和胎盘组织免疫组化鉴定抗体表达。选取抗体表达量最高的细胞株4-5G进行保种，并用于后续的抗体生产。其筛选结果如图4、图5所示，在挑选的9株单克隆细胞中，4-5G细胞株的抗体表达量最高。所述稳定高表达CHO细胞株4-5G，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.19958。

实施例6 4-5G细胞株大量生产抗体

一、CHO-PD-L1细胞的悬浮驯化

1、5％FBS的培养基(1640+400μg/mLG418)培养实施例5中筛选的4-5G细胞株。

2、当细胞汇合度达到80％-90％时，PBS洗涤，胰酶消化，2％FBS的培养基(1640+400μg/mLG418)终止。计数并离心。

3、2％FBS的培养基(1640+400μg/mLG418)重悬细胞，以1×10⁵个细胞/mL的密度接种细胞。

4、当细胞的汇合度达到80％-90％，保留培养基中悬浮的细胞，观察悬浮细胞的活力，如果悬浮细胞无活力，丢弃。如果有活力，保留并与胰酶消化的贴壁细胞混合。

5、消化按照步骤2进行，1％FBS的培养基(CDM4CHO+400μg/mLG418)终止。计数并离心。

6、1％FBS的培养基(CDM4CHO+400μg/mLG418)重悬细胞，以2×10⁵个细胞/mL的密度接种细胞。

7、每天观察细胞，并用手掌轻拍细胞瓶让细胞悬浮，重放回培养箱直到细胞的汇合度达到80％-90％(约4-5天)。

8、一旦细胞汇合，保留悬浮的细胞并用手掌轻拍细胞瓶，避免气泡产生。用吸管吹落瓶壁上的细胞，同时将细胞吹散。细胞计数并离心。

9、无FBS的培养基(CDM4CHO+400μg/mLG418)重悬细胞，以8×10⁵个细胞/mL的密度接种细胞培养。直到细胞的密度达到1.5-2×10⁶个细胞/mL(约3-4天)。

10、吹散细胞，计数并离心。

11、无FBS的培养基(CDM4CHO+400μg/mLG418)重悬细胞，以8×10⁵个细胞/mL的密度接种细胞。直到细胞的密度达到1.5-2×10⁶个细胞/mL。注意细胞聚团的大小(每团细胞的个数)。

12、反复重复步骤9-11。

13、以6×10⁵个细胞/mL的密度接种细胞，60rpm转速培养。

14、培养方法建立之后，可以进行滚瓶的扩大培养。

二、CHO-单克隆抗体细胞的扩大培养

1、将步骤一中驯化成功的CHO-单克隆抗体细胞用无FBS的培养基(CDM4CHO+400μg/mLG418)培养至对数生长期。

2、以4×10⁵个细胞/mL的密度接种细胞于滚瓶中，每个滚瓶培养基总量在500mL左右。

3、培养3-4天时取样，台盼蓝染色计数细胞活力。此时，细胞活力应在90％以上，如果低于90％应及时调整。

4、培养10-14天时取样，台盼蓝染色计数细胞活力。此时，细胞密度应在7×10⁶-1×10⁷个细胞/mL。当细胞活力低于50％时，立即停止培养并收集细胞培养液(含有单克隆抗体和杂质)。

三、单克隆抗体的浓缩

1、将步骤二生产的细胞培养液分装于500mL离心瓶中，1000g离心5分钟。取上清，经0.45μm和0.22μm过滤后置于4℃备用。

2、取步骤1中的滤液，使用Millipore XX42LSS12超滤系统进行浓缩，浓缩倍数约为10倍左右。浓缩液马上进行后续纯化操作或添加0.02％叠氮钠置于4℃保存。

四、单克隆抗体的纯化

4.1Protein A亲和层析

1、将空的重力层析柱用二次水洗净并固定住，加二次水冲洗一会儿后留3-5cm高的水，重悬Protein A介质，把Protein A介质加入柱子中，不断用玻璃棒沿着柱子内壁搅动介质，以减少汽泡的出现，静置5-10分钟让柱料自然沉降(已装柱只需重新重悬赶气泡后自然沉降即可)。

2、以1滴/秒的流速使蒸馏水流过柱料最少5个柱体积，直到柱子达到预定高度并标出柱床高度。

3、将层析柱出水管接到核酸蛋白检测仪(参数设定：0.1A，280nm)进口，10倍柱体积平衡缓冲液(含1.5M NaCl的0.05M Tris-HCl，pH8.0，无菌过滤)以1滴/秒的流速冲洗柱子，开启电脑检测仪软件采集数据，直到核酸蛋白检测仪上显示基线平整为止，将吸光值调整至0。

4、将步骤三生产的浓缩液与样品缓冲液(含3.0M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，pH 8.0，无菌过滤)等体积混合后加入柱子，调整流速至1滴/4秒，同时注意观察核酸蛋白检测仪数值的变化，当核酸蛋白检测仪的曲线开始上升时收集柱子流出液。

5、样液上完之后加入与之前相同的平衡缓冲液继续冲洗，待检测仪曲线停止下降变为平直后停止收集流出液，记录流出液体积并测定蛋白含量后记录。

6、在柱中平衡缓冲液流完之前加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸溶液，pH3.0，无菌过滤)，待检测仪曲线开始上升时收集流出的洗脱液，检测仪曲线停止下降变为平直后停止收集，测定洗脱液体积和蛋白含量并记录。

7、加入2倍柱体积的0.1M柠檬酸洗脱色谱柱，使色谱柱再生。

8、用平衡缓冲液平衡色谱柱，直至pH值大于7.0。

9、最后加入1倍柱体积的20％乙醇冲洗，冲洗之后再用20％乙醇加满柱子后于4℃保存。

4.2透析及超滤浓缩

1、选取合适透过率大小的透析袋，超纯水沸水浴中煮10分钟后超纯水清洗干净。

2、在透析袋中装入水并用夹子夹紧透析袋两端检查透析袋是否破损。

3、如果透析袋未破损则把过柱后的洗脱液加入透析袋中并将透析袋放入装有PBS缓冲液的烧杯中，再将烧杯置于4℃冰箱中用搅拌器上搅拌，每隔4小时换一次PBS缓冲液，如果时间不够可放置过夜，透析缓冲液体积应至少为样品体积的100倍。

4、从透析袋中取出透析抗体，并转移至适当大小的洁净容器中，加入叠氮化钠至最终浓度0.05％，用0.22-1.0μm注射器式过滤器过滤抗体溶液，以除去任何沉淀物(注：透析后用pH试纸检测溶液是否为中性)。

5、超滤浓缩并取少量于微量分光光度计测定抗体含量，浓缩抗体溶液至最终浓度1.0-10.0mg/mL。

实施例7单克隆抗体特性鉴定

一、亲和常数测定

2.依次将实施例6中纯化的PD-L1单克隆抗体(4-5G)稀释40、200、1000、5000、25000、125000倍，将稀释后的抗体加入酶标板，每孔100μL，37℃孵育2h后作为一抗进行反应，同时设置阴性对照(将抗体换成等体积的PBS)和空白对照，37℃孵育2h。

4.倒掉二抗，PBST洗涤3次，每次3分钟。每孔加入TMB 100μL，进行显色反应，37℃避光孵育30分钟后，立即加入100μL 1M盐酸终止液，终止显色反应，并用酶标仪测定溶液在450nm处的吸光值A450，进行2组平行测试，结果如表14所示：

表14 ELISA检测抗体不同稀释倍数OD值表

滴度	测试1	测试2
			空白对照	0.0467	0.0522
PBS阴性对照	0.0543	0.0561
			1:40	2.5032	2.5676
1:200	2.1599	2.4777
			1:1000	0.8666	0.9637
1:5000	0.3149	0.3653
			1:25000	0.1337	0.1425
1:125000	0.0751	0.0732

画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。

根据拟合的曲线算出来的A是649.88,利用下列公式计算出亲和常数。

其中抗体原始浓度10μg/ml，抗PD-L1单克隆抗体(4-5G)的亲和常数为9.75×10⁹L/mol。

二、单抗反应特异性

选择CHO-K1-PD-L1细胞裂解液(裂解的表达PD-L1的CHO细胞)和CHO-K1细胞裂解液(裂解的CHO细胞)，免疫印迹法检测本发明实施例6所大量生产出的单克隆抗体的识别特异性，每种裂解液/蛋白上样量为20μg，细胞株4-5G分泌的抗PD-L1单克隆抗体稀释度(1:1000)，结果如图6所示。抗PD-L1单克隆(4-5G)抗体具有特异性。

实施例8染色和鉴定

一、芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在55～58℃)倒入模具，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4mm，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60℃烤箱内15min，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在凉水中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入65℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。

三、样本检测结果：

细胞株4-5G分泌的抗PD-L1单克隆抗体在11例胎盘(PD-L1阳性)、36例扁桃体(PD-L1阳性)以及H226细胞(PD-L1弱阳性)的芯片中进行检测，结果如表15所示：

表15芯片中样本检测结果表

结果显示：4-5G细胞株所分泌的抗PD-L1蛋白单克隆抗体能识别弱阳性片，说明其敏感性高，染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净,说明其特异性高，适用于免疫组化染色及病理诊断。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗PD-L1蛋白单克隆抗体、细胞株及其制备方法和应用

<130> 2020

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

caggagcagc tggtggagag cggcggcaag gaggcccacg tgggctacag ctacctgacc 60

ctgacctgca ccgtgagcaa ccccatgaag tgcgaggacg acttcctgta caaccagaag 120

tgcaaccaga tcggcctgga gtggatcggc accacctgcc aggacctggc cgactggtgc 180

agccagatcc cccaggtgtg cgtggagatc gtgaggatcc ccaccaccac cgtggacctg 240

aagatgaccg gcctggcctt catgcagcac ccccaggtgc actgcgccta ccactggatg 300

ccctacaaca tcatgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcttca 348

<210> 2

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

caggtgctga cccagaaggt ggccgagccc gtgagcgcca gcgtgggcag cgtgtggggc 60

ctgaggcacc ccaactgcca ggccagccag accaacaagt acaagcagta catggtgatg 120

atccacccct gccccggcca gccccccaag cagctgatct accagaagat gacctgcgcc 180

gagtacagca ccatggccgt gaccatctac gccagcggca cccagttcac cctgaccatc 240

agctgggaga actacgtgcc ctggtgctgg tacatcatca tcggcggcgt gagcggcggc 300

caccccgac 309

<210> 3

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

Met Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

1 5 10 15

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

20 25 30

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

35 40 45

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

50 55 60

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

65 70 75 80

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

85 90 95

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

100 105 110

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

115 120 125

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val

130 135 140

Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile

145 150 155 160

Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile

165 170 175

Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu Glu Thr

180 185 190

Leu Glu His His His His His His

195 200

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

cctgcggccg cacagtgact gayggagcct taggttgccc 40

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

ggtggttcct ctagatcttc ccagtcggtg gaggagtccr gg 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

ggtggttcct ctagatcttc ccagtcggtg aaggagtccg ag 42

<210> 7

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

ggaagatcta gaggaaccac ccccaccacc gcccgagcca ccgccaccag aggataggat 60

ctccagctcg gtccc 75

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ggaagatcta gaggaaccac ccccaccacc gcccgagcca ccgccaccag aggatttgac 60

saccacctcg gtccc 75

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

gggcccagcc ggccatggag ctcgtgmtga cccagactcc av 42

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

gggcccagcc ggccatggag ctcgatmtga cccagactcc a 41

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagc cggccatgga gctc 44

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

gaggaggagg aggaggagcc tgcggccgca cagtg 35

Claims

1.一种抗PD-L1蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述抗PD-L1蛋白单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗PD-L1蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述抗PD-L1蛋白单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗PD-L1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗PD-L1蛋白单克隆抗体特异性识别PD-L1蛋白C端的100-290aa。

4.根据权利要求1所述的抗PD-L1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗PD-L1蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.19958的稳定高表达CHO细胞株4-5G产生。

5.一种抗PD-L1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗体的制备包括以下步骤：免疫原制备、免疫实验兔、构建抗体cDNA文库并筛选、噬菌体单链抗体库筛选得到可变区序列、构建表达PD-L1的CHO细胞株并筛选、细胞株大量生产单克隆抗体；其中所述免疫原为经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一株分泌抗PD-L1蛋白单克隆抗体的稳定高表达CHO细胞株4-5G，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.19958。

7.一株分泌抗PD-L1蛋白单克隆抗体的稳定高表达CHO细胞株4-5G的制备方法，其特征包括，所述制备方法包括以下步骤：免疫原制备、免疫实验兔、构建抗体cDNA文库并筛选、噬菌体单链抗体库筛选得到可变区序列；构建表达PD-L1的CHO细胞株并筛选。

8.权利要求1-4任一所述的抗PD-L1蛋白单克隆抗体，在PD-L1蛋白免疫检测中的用途。

9.根据权利要求8所述的免疫检测，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法。