CN113462654B - 一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体及其分泌杂交瘤细胞株和应用 - Google Patents

一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体及其分泌杂交瘤细胞株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体及其分泌杂交瘤细胞株和应用，属于单克隆抗体技术领域。本发明针对肝螺杆菌CdtB蛋白检测空白的问题，用具有良好免疫原性的肝螺杆菌CdtB第19位至273位氨基酸区域经重组表达免疫动物，筛选得到分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9，保藏编号为CCTCCNO：C2021140。杂交瘤细胞株2D9分泌的肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体可特异性结合肝螺杆菌CdtB蛋白，具具有亲和力高、特异性好的特点，且为小鼠IgG1亚型，为利用免疫学检测方法检测或诊断肝螺杆菌的感染提供了基础，为肝螺杆菌相关疾病的研究、新型诊断试剂的研制提供有力的研究基础。

Description

一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体及其分泌杂交瘤细胞株和 应用
技术领域
本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体及其分泌杂交瘤细胞株和应用。
背景技术
肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus,H.hepaticus)是一种小鼠病原体，可在近交系和基因工程小鼠中诱导慢性活动性肝炎、肝细胞癌、结肠炎和炎症性肠病。虽然该菌的自然宿主是鼠类，但近年来，从原发性肝癌患者组织中检测到针对肝螺杆菌16s rRNA的特异性片段，提示着人类肝胆疾病可能与肝螺杆菌感染存在一定的关系。从遗传学上看，肝螺杆菌与人类细菌性病原体幽门螺杆菌和空肠弯曲杆菌密切相关。因此，肝螺杆菌常被用于制备研究人类相关的动物模型，解析其致病机理。
对肝螺杆菌致病机理研究主要集中在外膜蛋白，结构蛋白和毒力因子。已发现多种致病性革兰氏阴性菌可产生细胞致死性肿胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)，包括弯曲杆菌、大肠杆菌、嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌和志贺氏菌，该毒素能通过损伤DNA和阻断细胞周期，最终导致细胞肿胀、死亡。肝螺杆菌CDTs是易感鼠胃肠道持续感染和引起黏膜炎症或肝损伤的必需因子。
肝螺杆菌的细胞致死性肿胀毒素属于AB2型毒素。AB2三聚体由一个活性亚基(CdtB)和两个结合亚基(CdtA和CdtC)组成。活性亚基CdtB具有类DNaseI活性，而CdtA和CdtC是将CdtB传递进入靶细胞的结合蛋白。将CdtB转移到细胞核会对DNA产生基因毒性效应，引发DNA断裂，导致细胞周期停止和最终的细胞死亡。同时，作为肝螺杆菌的主要毒力因子，CdtB还可以刺激肠道和肝脏炎症的发生，引发肝纤维化和肝硬化。
对于肝螺杆菌的检测，最常见的方法包括PCR、免疫印迹技术、免疫组化法等。无论采用何种免疫学检测方法，都需要特异、敏感的检测抗体。现在国内外都没有出现肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的报道。因此，需要制备亲和力、特异性好的单克隆抗体，为肝螺杆菌相关疾病的研究、新型诊断试剂的研制提供有力的研究基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体，具有较强的特异性和敏感性，适用于免疫学检测。
本发明的目的还在于提供一种分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的目的还在于提供一种基于免疫学检测的试剂盒，为肝螺杆菌相关疾病的诊断和检测提供基础。
本发明提供了一种分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9，保藏编号为CCTCC NO：C2021140。
本发明提供了一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞株2D9分泌得到。
优选的，所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体为小鼠IgG1亚型。
优选的，所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体与肝螺杆菌CdtB蛋白特异性结合。
优选的，所述肝螺杆菌CdtB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述肝螺杆菌CdtB蛋白为利用重组原核表达载体进行重组表达获得的肝螺杆菌CdtB重组蛋白；
所述重组原核表达载体包括pET-NUSA-6His-TEV-CdtB载体。
本发明提供了一种基于免疫学检测技术的肝螺杆菌诊断和/或检测用试剂盒，包括所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体。
优选的，包括肝螺杆菌CdtB蛋白；
所述肝螺杆菌CdtB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒；
所述ELISA检测试剂盒包括包被肝螺杆菌CdtB重组蛋白的酶标板和所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体。
本发明提供了所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体和/或肝螺杆菌CdtB重组蛋白在制备免疫诊断和/或免疫检测肝螺杆菌的试剂盒中的应用；
所述肝螺杆菌CdtB重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述免疫检测包括以下检测技术中的一种或几种：ELISA检测、蛋白免疫印迹、免疫荧光检测和免疫组化检测。
本发明提供了一种分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9，保藏编号为CCTCC NO：C2021140。所述杂交瘤细胞株2D9是由肝螺杆菌CdtB蛋白作为抗原免疫动物产生的脾细胞与SP2/0细胞经过融合、杂交筛选获得。所述杂交瘤细胞株2D9经过3次亚克隆后稳定分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体，且所述抗体能够与肝螺杆菌CdtB蛋白抗原发生特异性亲和反应，亲和性较高。
同时，本发明提供的杂交瘤细胞株2D9经过传代40～50代后，分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的能力依旧稳定，说明本发明获得了一株稳定分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
附图说明
图1为为实施例1中肝螺杆菌CdtB基因的PCR扩增电泳图；M:DL5000；1:CdtB基因的扩增；
图2为实施例1中重组质粒pET-6His-NUSA-TEV-CdtB酶切验证图；M:DL2000；1:BamHI+HindIII酶切；
图3为实施例1中重组菌BL21(pET-His-NUSA-TEV-CdtB)的SDS-PAGE验证图；1：未经IPTG诱导的BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)裂解液；2：经IPTG诱导的BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)裂解液；3：未经IPTG诱导的BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)裂解液上清；4：经IPTG诱导的BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)IPTG裂解液上清；5：未经IPTG诱导的BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)重组菌裂解液沉淀；6：经IPTG诱导的BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)重组菌裂解液沉淀；7：经IPTG诱导的空载体BL21(pET-6His-NUSA-TEV)裂解液；
图4为实施例1中6His-NUSA-TEV-CdtB镍柱纯化后的SDS-PAGE验证图；1：未纯化的6His-NUSA-TEV-CdtB裂解液上清；2：纯化的6His-NUSA-TEV-CdtB裂解液上清；
图5为实施例1中TEV酶切助溶标签6His-NUSA和CdtB后的SDS-PAGE验证图；1：6His-NUSA-TEV-CdtB未经TEV酶切；2：6His-NUSA-TEV-CdtB经TEV酶切；
图6为实施例1中CdtB蛋白纯化后的SDS-PAGE验证图；1：CdtB蛋白流穿液；2：CdtB蛋白10mM咪唑洗脱液；3：CdtB蛋白80mM咪唑洗脱液；4：CdtB蛋白500mM咪唑洗脱液；
图7为实施例5中单克隆抗体特性检测的蛋白免疫印迹图；1：6His-NUSA-TEV-CdtB重组蛋白经过TEV酶切；2：pET-6His-NUSA-TEV空载体；
图8为实施例5中单克隆抗体特性检测的细胞间接免疫荧光图；
图9为实施例5中单克隆抗体特性检测的结肠组织间接免疫荧光图；
图10为实施例5中单克隆抗体特性检测的肝脏组织免疫组化图。
附图说明
杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞株已于2021年6月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2021140，细胞株编号为2D9。
具体实施方式
本发明提供了一种分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9，保藏编号为CCTCC NO：C2021140。
在本发明中，所述杂交瘤细胞株2D9是由肝螺杆菌CdtB蛋白作为免疫抗原免疫动物后获得的脾细胞与SP2/0细胞经杂交筛选获得。本发明所述肝螺杆菌CdtB蛋白优选肝螺杆菌CdtB第19位至273位氨基酸区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。实验证明，所述肝螺杆菌CdtB蛋白具有良好的免疫原性，免疫动物产生的脾细胞经细胞融合后得到的杂交瘤细胞能分泌特异性亲和力均高的单克隆抗体。
在本发明中，所述杂交瘤细胞株2D9经过3次亚克隆，分泌的上清液经ELISA检测，检测OD值显示阳性，表明经过亚克隆的杂交瘤细胞株2D9依然保持分泌较强特异性的单抗，而同批次筛选得到的阳性杂交瘤细胞株经3次亚克隆，分泌的上清液经ELISA检测，OD值显示阴性，这说明同批次筛选的阳性杂交瘤细胞株发生回复突变转变为阴性细胞株。同时所述杂交瘤细胞株2D9经过40～50代传代培养，分泌的上清液经ELISA检测，OD值呈阳性，且具有较高的亲和性。这表明所述杂交瘤细胞株2D9具有较强的遗传稳定性。
本发明提供了一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞株2D9分泌得到。
在本发明中，经过单克隆抗体亚型鉴定，所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体为小鼠IgG1亚型，轻链类型为κ。所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体优选与肝螺杆菌CdtB蛋白特异性结合。所述肝螺杆菌CdtB蛋白选自肝螺杆菌CdtB第19位至273位氨基酸区域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明中，所述肝螺杆菌CdtB蛋白优选为利用重组原核表达载体进行重组表达获得的肝螺杆菌CdtB重组蛋白；所述重组原核表达载体包括pET-NUSA-6His-TEV-CdtB载体。所述pET-NUSA-6His-TEV-CdtB载体的构建方法，优选包括以下步骤：
1)采用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物，PCR扩增肝螺杆菌基因组，得到带酶切位点的CdtB基因片段；
2)将所述带酶切位点的CdtB基因片段和pET-6His-NUSA-TEV载体分别采用BamHI和HindIII双酶切，酶切产物连接，得到连接产物；
3)将所述连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取阳性单菌落，经过摇菌提质粒，得到pET-NUSA6His-TEV-CdtB载体。
在本发明中，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对的核苷酸序列如下：CdtB：F(含BamHI酶切位点)：5’CCAATCCGGATCCGAAGATTATAGAGTAAGCACTTGGAATCTA3’(SEQ ID NO：3)；CdtB：R(含HindIII酶切位点)：5’GCTCAAGCTTAAATCGTCCAAAATGCACAGGTGAATGGTC3’(SEQID NO：4)。所述PCR扩增的反应体系优选为50μL：PrimeSTAR Max Premix(含2mM MgCl2，dNTPs 0.4mM)25μl、上游引物(10μM)2μl、上游引物(10μM)2μl、模板1μl、灭菌双蒸水20μl。所述PCR扩增的反应程序优选为95℃预变性3min；95℃变性15min，55℃退火15min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
在本发明中，所述pET-6His-NUSA-TEV载体购自北京中原公司(addgene质粒编号为：29657)。所述pET-6His-NUSA-TEV载体中NUSA为大肠杆菌自身的一种蛋白，可提高不溶靶蛋白的可溶性，TEV是烟草蚀刻病毒蛋白酶，可作为融合蛋白标签去除的理想工具，6个His的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。构建的pET-6His-NUSA-TEV-CdtB载体表达6×组氨酸短肽(6×Histidine，6×His)-NUSA-TEV-CdtB融合蛋白，为排除助溶标签的影响，6His-NUSA-TEV-CdtB蛋白纯化后用TEV切开亲和助溶标签6His-NUSA和CdtB。
在本发明中，所述酶切体系优选如下：10×buffer 5μl、BamHI 1μl、HindIII 1μl、表达质粒pET-6His-NUSA-TEV 5μg、灭菌双蒸水补至50μl。所述双酶切的程序优选如下：37℃，酶切过夜。所述连接用酶优选为T4DNA连接酶。所述连接的体系优选如下：10×T4DNA连接酶buffer 2μl、线性化的表达质粒pET-6His-NUSA-TEV 50ng、扩增的CdtB片段37ng、T4 DNA连接酶1μl、灭菌双蒸水补至20μl。所述连接的程序优选为16℃，连接6～8小时。本发明对原核表达系统的培养和诱导表达没有特殊限制，采用本领域所熟知的培养和诱导表达方法即可。
在本发明中，所述肝螺杆菌CdtB蛋白作为反应原能够与肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体发生特异性亲和反应，说明肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体能够特异性识别肝螺杆菌CdtB蛋白的特定抗原表位，因此，提供肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体在检测肝螺杆菌CdtB蛋白的应用，为肝螺杆菌相关疾病的诊断和检测提供基础。
本发明提供了一种基于免疫学检测技术的肝螺杆菌诊断和/或检测用试剂盒，包括所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体。
在本发明中，所述免疫学检测技术优选包括以下技术中的一种或几种：ELISA检测、蛋白免疫印迹、免疫荧光检测和免疫组化检测。本发明对所述试剂盒的使用方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的ELISA检测、蛋白免疫印迹、免疫荧光检测和免疫组化检测的操作方法即可。
在本发明中，当所述试剂盒优选为ELISA检测试剂盒时，所述试剂盒优选包括肝螺杆菌CdtB蛋白。所述肝螺杆菌CdtB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述ELISA检测试剂盒优选包括包被肝螺杆菌CdtB重组蛋白的酶标板和作为一抗的肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体。本发明对所述ELISA检测试剂盒的其他组分没有特殊限制，采用本领域所熟知的试剂即可，例如洗涤液、样品稀释液、显色液等。
本发明提供了所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体和/或肝螺杆菌CdtB重组蛋白在制备免疫诊断和/或免疫检测肝螺杆菌的试剂盒中的应用；所述肝螺杆菌CdtB重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明中，所述免疫检测优选包括以下检测技术中的一种或几种：ELISA检测、蛋白免疫印迹、免疫荧光检测和免疫组化检测。本发明对所述试剂盒的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的免疫检测试剂即可。
在本发明中，采用ELISA检测、蛋白免疫印迹、免疫荧光检测和免疫组化检测分别验证了所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的特异性，并且检测结果表明，所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体能够特异性识别肝螺杆菌CdtB蛋白，因此，所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体能够通过检测CdtB蛋白从而实现检测或诊断肝螺杆菌的目的。
下面结合实施例对本发明提供的一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体及其分泌杂交瘤细胞株和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
材料来源说明
限制性内切酶BamHΙ、HindIII购于Takara公司；
T4DNA连接酶购于NEB公司；
质粒小提试剂盒及胶回收试剂盒均购于南京诺唯赞公司；
大肠杆菌DH5α、BL21为本实验保存；
载体pET-6His-NUSA-TEV购自北京中原公司(addgene质粒编号为：29657)；
HEK 293T细胞、骨髓瘤细胞SP2/0购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；
BALB/c小鼠(SPF级)、ICR小鼠购自南京集萃药康公司；
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶、PEG1450均购于Sigma公司；
DMEM培养基购于Invitrogen公司；
胎牛血清(FBS)购自上海富衡生物科技公司；
IPTG、TMB显色液、ELISA终止液购自索莱宝公司；
Hoechst(细胞核染色液)、ECL超敏发光试剂购于碧云天；
鼠源AlexaFlour488绿色荧光标记的抗体、鼠源Alexa Flour 633红色荧光标记的购于Proteintech公司；
PVDF膜购自Immobilon公司；
小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购于Biodragon公司。
实施例1
肝螺杆菌CdtB蛋白的制备
一、肝螺杆菌CdtB基因的扩增
选取肝螺杆菌CdtB第19位至273位氨基酸片段(SEQ ID NO：1)作为免疫原，根据其所对应的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，分别设计引物，引物序列如下：
CdtB：F(下划线处为BamHI酶切位点)：
5’CCAATCCGGATCCGAAGATTATAGAGTAAGCACTTGGAATCTA3’(SEQ ID NO:3)；
CdtB：R(含HindIII酶切位点)：
5’GCTCAAGCTTAAATCGTCCAAAATGCACAGGTGAATGGTC3’(SEQ ID NO:4)。
以肝螺杆菌基因组为模板，扩增体系为：PCR的总反应体系为50μL，见表1。
表1 PCR扩增的总反应体系
Figure BDA0003213645910000081
Figure BDA0003213645910000091
PCR扩增的反应体系为：95℃预变性3min；95℃变性15min，55℃退火15min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
取PCR产物50μL，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
结果如图1，扩增片段大小符合预期，然后进行凝胶产物回收。
用胶回收试剂盒纯化目的片段CdtB，并用分光光度计测浓度，置于-20℃备用。
二、重组原核表达质粒pET-6His-NUSA-TEV-CdtB的构建与鉴定
用BamHI和HindIII双酶切原核表达质粒pET-6His-NUSA-TEV和目的片段CdtB，酶切体系见表2。
表2 pET-6His-NUSA-TEV/目的片段CdtB的酶切体系
10×buffer 5μl
BamHI 1μl
HindIII 1μl
表达质粒pET-6His-NUSA-TEV/目的片段CdtB 5μg
灭菌双蒸水 补至50μl
酶切程序为：37℃，酶切过夜。酶切后的载体pET-6His-NUSA-TEV和目的片段CdtB分别用胶回收试剂盒纯化，并用分光光度计测浓度，置于-20℃备用。
将纯化的目的片段CdtB与酶切过的表达质粒进行T4DNA连接酶连接，连接体系见表3。
表3连接体系
10×T4DNA连接酶buffer 2μl
线性化的表达质粒pET-6His-NUSA-TEV 50ng
扩增的CdtB片段 37ng
T4DNA连接酶 1μl
灭菌双蒸水 补至20μl
连接程序为：16℃，连接6～8小时。
将连接产物转入DH5α感受态，经过含有50μg/ml卡那抗生素的固体LB培养基的筛选，挑取单菌落置于3ml含有50μg/ml卡那抗生素的液体LB培养基中，37℃，250rpm，培养12h。培养的菌液用质粒小提试剂盒提取质粒。重组表达载体pET-6His-NUSA-TEV-CdtB经BamHI和HindIII双酶切，核酸电泳验证。
结果如图2，电泳出现6.9kb和765bp左右的两条带，与预期大小符合。
重组质粒经过DNA测序，结果表明目的基因成功插入表达载体中。
三、肝螺杆菌CdtB蛋白在重组菌中的表达
将测序正确的重组质粒pET-6His-NUSA-TEV-CdtB转入BL21感受态，挑取单菌落接种于含有50μg/ml卡那抗生素的LB液体培养基，37℃过夜培养；将培养物扩大培养至OD600值为0.8～1.0，加入终浓度为1mM的IPTG，16℃诱导24h，离心收集菌体，PBS洗涤。利用超声波破碎仪在冰浴中裂解菌体，分别取重组菌BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)未诱导和IPTG诱导后的全菌裂解液、裂解液上清、裂解液沉淀进行SDS-PAGE电泳，同时以空载体BL21(pET-6His-NUSA-TEV)诱导的全菌裂解液作为对照。
结果如图3，与泳道7的空载体菌(pET-6His-NUSA-TEV)相比，泳道2的重组菌BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)在分子量为86kDa处出现特异条带，说明6His-NUSA-TEV-CdtB蛋白在重组菌中获得成功表达；且泳道4裂解液上清中存在目的条带。说明含有助溶标签NUSA和目的蛋白CdtB的重组菌是以可溶性形式存在的。
四、6His-NUSA-TEV-CdtB蛋白的纯化
将重组菌BL21(pET-6His-NUSA-TEV-CdtB)以1:100的稀释倍数接种于含卡那霉素的LB培养基中扩大培养，将诱导后的细菌离心，收集菌体。用PBS洗涤并悬浮，在冰浴条件下利用超碎仪(350w超声1s，间隔6s)裂解菌体。用10000rpm 30min离心裂解菌液。离心后收集菌液上清，上清过0.22μm的滤器后，加入亲和层析柱Ni-Agarose Resin中。
纯化用的试剂为：Soluble Bindingbuffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH7.9)，Soluble Elutionbuffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH7.9)。层析柱纯化方法如下：
1)组装层析柱：将Ni-Agarose Resin填料1ml混匀后加入层析柱，室温静置10min，待凝胶与溶液分层后，把底部出液口打开，将乙醇通过重力作用缓慢流出。将填好的柱中加入5倍柱体积的灭菌双蒸水，将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Soluble Bindingbuffer平衡柱子。
2)上样：将过滤后的上清过柱，流速为10倍柱体积/h。
3)冲洗：使用15倍柱体积的Soluble Binding buffer冲洗柱子，收集洗脱液。
4)洗脱：使用15倍柱体积的Soluble Elutionbuffer洗脱，收集洗脱液。
5)封柱：洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble Binding buffer和5倍柱体积的灭菌双蒸水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％的乙醇平衡，封柱后-4℃保存。
层析柱纯化结果如图4，SDS-PAGE验证6His-NUSA-TEV-CdtB重组蛋白质的纯化效果。
蛋白纯化后进行透析，采用截留分子量的8000～14000的透析袋装有洗脱产物，在PBS中透析12h，中间换液两次。
五、TEV酶切助溶标签6His-NUSA和CdtB
将纯化并且透析过的6His-NUSA-TEV-CdtB蛋白用TEV酶切，结果如图5，SDS-PAGE验证TEV酶切助溶标签6His-NUSA和CdtB的效果。
六、肝螺杆菌CdtB蛋白的纯化
将TEV酶切开的助溶标签6His-NUSA和CdtB，再次过亲和层析柱Ni-AgaroseResin。依次过10mM、80mM和500mM咪唑洗脱液，收集流穿液和洗脱液，层析柱纯化方法参考6His-NUSA-TEV-CdtB蛋白的纯化。结果如图6，SDS-PAGE验证CdtB蛋白质的纯化效果。
蛋白纯化后进行透析，采用截留分子量的8000～14000的透析袋装有洗脱产物，在PBS中透析12h，中间换液两次。
实施例2
杂交瘤细胞株2D9的建立
一、免疫动物
选取5只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫。具体步骤为：
首次免疫：将实施例1中获得的CdtB蛋白(100μg/只)与等体积的弗氏完全佐剂混合，并充分乳化，皮下多点免疫。
再次免疫：首次免疫2周后，CdtB蛋白(100μg/只)与等体积的弗氏不完全佐剂混合，经充分乳化后皮下注射。7天后眼眶静脉采血测定效价(参考文献：李靓，职爱民，等.盐酸金霉素人工抗原的合成及鼠源多抗血清的制备{J}.河南农业科学，2012，41(7):138－141.)。在融合前三天，腹腔注射实施例1中纯化的CdtB蛋白(100μg/只)。
二、饲养细胞的制备
融合前一天，选取6～8周龄健康的ICR雌性小鼠，眼球采血作为阴性对照(-80℃保存)。异氟烷麻醉后颈椎脱臼处死老鼠，放入75％酒精浸泡10min。无菌条件下剪开皮肤，暴露腹膜。用20ml注射器吸取提前冰浴好的HAT培养基15ml，腹腔注射到小鼠体内，并用酒精棉球反复按摩腹部两侧，反复吸打多次直至液体变黄。将吸出的液体与HAT培养基在离心管中混匀，加入96孔板中，100μl/孔。
三、免疫小鼠脾细胞的制备
对免疫小鼠摘眼球取血，-80℃保存分离血清，作为阳性对照。异氟烷麻醉后颈椎脱臼处死老鼠，75％酒精浸泡10min，在无菌条件下取脾细胞，将脾脏放入到含有3ml的DMEM培养基的培养皿中，用无菌注射器的乳胶头，在无菌筛网上进行研磨，筛网下面放含有3ml的DMEM培养基的培养皿。用DMEM培养基冲洗筛网，收集液体，1000rpm，离心10min。沉淀用DMEM培养基重悬，计数，取108的脾细胞悬液备用。
四、SP2/0细胞的制备
取对数生长期的SP2/0细胞，1000rpm，离心10min。用DMEM培养基洗2次，计数，取107的细胞备用。
五、细胞融合
将脾细胞与SP2/0细胞按在1:5～1:10的比例混合在一起，1000rpm离心10min，弃上清。用移液器吸净残留的液体。轻轻弹动离心管底，使细胞混匀。1min内加入37℃预热的1ml PEG(MW1450)，边加边轻轻摇动。90s内加入37℃预热的30ml DMEM以终止PEG作用。1000rpm，离心10min，弃上清，沉淀用HAT选择性培养基重悬。将细胞混匀并入加有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
六、杂交瘤细胞及抗体检测
细胞融合5天后，用HAT培养基换出1/2培养基，10天后HT培养基全换液，继续观察，1～2天后培养基变黄，吸出上清即可开始检测特异性抗体，筛选出阳性杂交瘤细胞株。
用ELISA检测细胞培养物上清，根据ELISA检测结果(阳性杂交瘤细胞株OD450≥0.3，阳性对照OD450≥1，阴性对照OD450＜0.2)筛选出阳性杂交瘤细胞株。具体步骤为：
1)包被：纯化后的肝螺杆菌CdtB重组蛋白(实施例1制备)包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。
2)洗涤：用PBST(含有0.5％Tween-20)洗涤3次，100μl/孔，5min/次。
3)封闭：用5％脱脂奶(PBS稀释)封闭，200μl/孔，37℃孵育1h。
4)洗涤：用PBST洗涤3次，100μl/孔，5min/次。
5)加细胞培养上清：细胞培养上清稀释5倍(PBS稀释)，100μl/孔，加入到包被肝螺杆菌CdtB重组蛋白的酶标板中。同时设置阳性对照(免疫小鼠血清用PBS稀释100倍)，空白对照，37℃孵育1h。
6)洗涤：用PBST洗涤3次，100μl/孔，5min/次。
7)加二抗：用PBS将HRP标记的羊抗鼠二抗按1:10000稀释，100μl/孔，37℃孵育1h。
8)洗涤：用PBST(含有0.5％Tween-20)洗涤3次，100μl/孔，5min/次。
9)显色：每孔加入100μl TMB显色液，37℃避光显色30min。
10)终止：每孔加入50μl 2M硫酸终止反应。
11)读数：用酶标仪测定450nm波长下的OD值。
经过肝螺杆菌CdtB重组蛋白的ELISA筛选，选取重组CdtB蛋白反应阳性的杂交瘤细胞株进行亚克隆，扩大培养后进行3次亚克隆，每次亚克隆后培养7d后，均进行ELISA筛选鉴定阳性克隆，得到细胞株2D9、3A1、4C7和5D6。3次亚克隆后，再次ELISA筛选鉴定，杂交瘤细胞株2D9的OD值为3.912、杂交瘤细胞株3A1的OD值为0.028、4C7的OD值为0.064、5D6的OD值为0.078。可见，杂交瘤细胞株3A1、4C7和5D6在亚克隆期间发生回复突变，转变为阴性，仅杂交瘤细胞株2D9保持分泌单克隆抗体的特性。可见本发明获得一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9。
为了进一步明确杂交瘤细胞株2D9的遗传稳定性，将所述杂交瘤细胞株2D9连续传代40～50代，结果见表4。结果表明，传代40～50代，杂交瘤细胞株2D9依旧保持有稳定分泌特异性性强、敏感度高的CdtB蛋白单克隆抗体的性能。
表4传代50代后的杂交瘤细胞株2D9分泌上清液的ELISA检测结果
OD450
杂交瘤细胞2D9细胞上清稀释5倍 2.238
多抗血清阳性对照稀释217倍 1.188
阴性对照 0.066
将杂交瘤细胞株2D9于2021年6月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:C2021140，其分类命名为杂交瘤细胞株2D9。杂交瘤细胞株2D9经过冻存、复苏和传代，扩大培养用于腹水制备。
实施例3
腹水诱生法制备单克隆抗体
一、腹水制备
9～11周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡(0.5ml/只)，7～10天后，将处于对数生长期的杂交瘤细胞株用PBS重悬(5×105个/0.3ml)，腹腔注射。7天左右待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，离心收集上清，-80℃保存。
二、腹水纯化
用Protein G亲和层析从腹水中纯化抗体。纯化用的试剂为：Binding buffer(20mM Na2HPO4，0.15M NaCl，pH 7.0)，Elutionbuffer(0.1M甘氨酸，pH 2.5)，Neutralizationbuffer(1M Tris-HCl，pH 8.5)。
纯化步骤为：
①装柱，将购买的Protein G适量装于重力层析柱中，并用5倍柱体积Bindingbuffer平衡柱；
②上样，10ml的腹水，经过0.22μm滤器过滤后过柱，控制流速1ml/min；
③平衡，上完样液后使用30ml Bindingbuffer冲洗柱至平衡；
④洗脱，用10～15ml Elutionbuffer冲洗，收集洗脱产物；
⑤调节pH，用Neutralizationbuffer将收集的洗脱产物调至pH中性；
⑥透析，截留分子量的8000～14000的透析袋装收集至中性的洗脱产物，在PBS中透析12h，中间换液两次；
⑦样品浓缩，聚乙二醇浓缩至1ml。
实施例4
单克隆抗体亚型的鉴定
用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对抗体亚型进行鉴定。
结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1亚型鼠源单克隆抗体，轻链类型为κ。
实施例5
肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的特异性反应实验
将实施例3中制备的单抗作为一抗，通过蛋白免疫印迹(WB)、间接免疫荧光(IFA)、免疫组化检测(IHC)来检测肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的特异反应。具体操作如下：
一、蛋白免疫印迹(Westernblot,WB)
免疫印迹实验过程如下，将实施例1中TEV酶切过的6His-NUSA-TEV-CdtB重组蛋白进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，采用常规湿转转膜仪，电流200mA，转印90min，将凝胶蛋白转印至PVDF膜。转印结束后，进行后续实验，具体操作如下：
1)封闭：将PVDF膜置于5％脱脂奶中室温封闭2h。
2)加入一抗：将实施例3中制备的单克隆抗体，按照1:500的比例稀释，4℃摇床孵育过夜。
3)洗涤：用含有0.5％Tween-20的TBST洗涤PVDF膜3次，10min/次。
4)加入二抗：将HRP标记的羊抗小鼠二抗用TBST按体积比1:10000稀释，室温摇床孵育1h。
5)洗涤：用含有0.5％Tween-20的TBST洗涤PVDF膜3次，10min/次。
6)显影：用ECL超敏显色液进行曝光显影。
结果如图7所示。肝螺杆菌CdtB单克隆抗体能与6His-NUSA-TEV-CdtB重组蛋白经过TEV酶切后的6His-NUSA-CdtB和CdtB特异性结合，在86kDa和28kDa左右出现特异性条带，与空载体pET-6His-NUSA-TEV没有交叉反应。说明抗原抗体特异性反应明显。
二、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay，IFA)
(1)细胞的间接免疫荧光
将HEK293T细胞铺至24孔板中，分别用HEK293T转染pLVX-Puro-3Flag-CdtB-P2A-RFP质粒，并以pLVX-Puro-3Flag-P2A-RFP空载体作为阴性对照，转染24h后进行IFA实验。具体操作如下：
1)固定：PBS洗涤细胞2次，4％(v/v)多聚甲醛室温固定30min，PBS洗涤细胞3次。
2)破膜：用0.5％Triton-X100室温破膜10min，PBS洗涤细胞3次。
3)封闭：用5％BSA室温封闭1h。
4)加入一抗：加入PBS稀释的实施例3制备的肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体(1:1000)，4℃孵育过夜。PBS洗涤细胞3次。
5)加入二抗：加入PBS稀释的鼠源Alexa Flour488绿色荧光标记的IgG(1:1000)，37℃避光孵育1h。PBS洗涤细胞3次。
6)复染核：加入PBS稀释的Hoechst(1:10)常温避光染色10min后，PBS洗涤细胞3次。
7)观察并拍照：加入去离子水，置于荧光显微镜下观察结果。
结果如图8所示，转染了pLVX-Puro-3Flag-CdtB-P2A-RFP质粒的HEK293T细胞可见绿色荧光，而转染了pLVX-Puro-3Flag-P2A-RFP质粒的对照组细胞无荧光。表明，肝螺杆菌CdtB单抗的特异性好。
(2)结肠组织的间接免疫荧光
1)切片制作：获取肝螺杆菌感染组与正常组的小鼠结肠组织，立即用4％的多聚甲醛固定12h，梯度脱水和透明(75％酒精10min，85％酒精10min，95％酒精10min，100％酒精Ⅰ5min，100％酒精Ⅱ5min，正丁醇Ⅰ1h，正丁醇Ⅱ1h)。常规石蜡包埋，切块。
2)抗原修复：通过微波炉处理进行抗原修复，自然冷却后将玻片置于PBS中洗3次，5min/次。
3)透膜：0.5％TritonX-100室温透膜10min。PBS洗3次。
4)封闭：用5％BSA，37℃孵育1h。
5)加一抗：甩干封闭液，在切片上滴加实施例3中制备的单抗(1:500稀释)，将切片置于湿盒中，4℃孵育过夜。PBS洗3次，3min/次。
6)加二抗：滴加鼠源AlexaFlour 633红色荧光标记的IgG(1:1000稀释)为二抗，37℃避光孵育1h。PBS洗3次，3min/次
7)复染细胞核：以1:10稀释的Hoechst染细胞核10min。PBS洗涤3次。
8)封片：用树脂封片剂封片。
9)拍照：置于荧光显微镜下观察结果并采集图像。
结果如图9所示，表明实施例3中制备的肝螺杆菌CdtB单抗的特异性好，在肝螺杆菌感染的小鼠的结肠组织中明显表达。
三、免疫组化检测(Immunohistochemistry,IHC)
1)切片制作：获取肝螺杆菌感染组与正常组的小鼠肝脏组织，立即用4％的多聚甲醛固定12h，梯度脱水和透明(75％酒精10min，85％酒精10min，95％酒精10min，100％酒精Ⅰ5min，100％酒精Ⅱ5min，正丁醇Ⅰ1h，正丁醇Ⅱ1h)。常规石蜡包埋，切块。
2)封闭：使用3％H2O2(80％甲醇)室温封闭10min，PBS洗3次，5min/次。
3)抗原修复：使用枸橼酸盐进行高温修复，冷却后PBS洗3次。
4)封闭：滴加5％的BSA，37℃封闭1h。
5)加一抗：甩干多余液体，在切片上滴加实施例3中制备的单抗(1:500稀释)，将切片置于湿盒中，4℃孵育过夜。PBS洗3次，3min/次。
6)加二抗：滴加HRP标记的羊抗小鼠IgG(1:10000)为二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次。
7)显色：滴加显色液显色5min，自来水冲洗10min。滴加苏木素复染2min，PBS洗3次，晾干。
8)封片：中性树脂胶封片。
9)拍照：将玻片置于显微镜下，图像采集分析。
结果如图10所示。与对照组相比，肝螺杆菌感染组的小鼠肝脏中可见明显的阳性反应，且阳性细胞大多伴随着在单核、巨噬细胞的深棕色着色。表明，实施例3中制备的肝螺杆菌CdtB单抗的特异性较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体及其分泌杂交瘤细胞株和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Asp Tyr Arg Val Ser Thr Trp Asn Leu Gln Gly Ser Ser Ala Asn
1 5 10 15
Thr Glu Ser Lys Trp Asn Ile Ser Val Arg Gln Leu Ile Thr Gly Asp
20 25 30
Asn Pro Ala Asn Ile Leu Met Val Gln Glu Ala Gly Ala Ile Pro Ala
35 40 45
Ser Ala Arg Arg Thr Gly Arg Met Val Gln Pro Gly Gly Thr Pro Val
50 55 60
Glu Glu Phe Thr Trp Glu Leu Gly Thr Tyr Ser Arg Pro Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Ile Tyr Tyr Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Arg Arg Val Asn Leu
85 90 95
Ala Ile Val Ser Asp Arg Arg Ala Asp Glu Val Leu Val Val His Gln
100 105 110
Asn Val Val Ala Thr Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ile Gly Ile Arg Ile
115 120 125
Gly Asn Asp Val Phe Phe Asn Ile His Ala Leu Ala Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Asp Ala Pro Ala Leu Val Thr Ala Val His Asp Asn Phe Ile Asn Met
145 150 155 160
Pro Gln Ile Asn Trp Leu Ile Ala Gly Asp Phe Asn Arg Asp Pro Ala
165 170 175
Leu Leu Gln Ser Gly Leu Asp Thr Arg Ile Ala Asn His Ile Arg Ile
180 185 190
Thr Ala Pro Asn Ser Ala Thr His Phe Ser Ser Arg Gly Thr Asn Arg
195 200 205
Thr Leu Asp Tyr Ala Val Val Gly Arg Ser Ser Pro Ser Arg Ser Thr
210 215 220
Ile Val Leu Pro Gln Ile Ala Ala Ile Leu Met Ala Ala Asn Ile Arg
225 230 235 240
Ala His Leu Ser Ser Asp His Ser Pro Val His Phe Gly Arg Phe
245 250 255
<210> 2
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaagattata gagtaagcac ttggaatcta caaggttctt cagcaaatac tgagagtaaa 60
tggaatataa gtgtgagaca actcatcaca ggagataatc ctgctaatat tcttatggtg 120
caagaggctg gcgctatacc tgcttcagcg agaagaacag gtagaatggt tcagcccggt 180
ggtacacctg tagaggagtt tacgtgggaa cttggaactt attctagacc aaatacagtt 240
tatatctatt atgctcctct agatgtggga gcaagaaggg tgaatctcgc catagtttct 300
gatagaagag ctgatgaagt tcttgtagtg catcaaaatg ttgttgctac agaggcatcg 360
cgtccagcta ttggtattcg tatcggcaat gatgtgtttt ttaatattca cgctttagca 420
agtggaggtg gtgatgcacc tgctttagtt acagctgtgc acgataattt tattaatatg 480
ccacaaataa attggcttat cgctggagat tttaatcgcg atccagcgct cttgcaatca 540
gggctagata caagaatcgc taatcatatc cgtattactg ctccaaactc tgctacacat 600
tttagctcta gaggaacaaa tagaacactt gattatgcgg tagtaggtag atcaagccct 660
tctcgttcca ctatagtatt gccgcaaatt gcagcaatac ttatggcagc aaatatacgc 720
gcacacctct catctgacca ttcacctgtg cattttggac gattt 765
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaatccgga tccgaagatt atagagtaag cacttggaat cta 43
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctcaagctt aaatcgtcca aaatgcacag gtgaatggtc 40

Claims (7)

1.一种分泌肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：C2021140。
2.一种肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞株2D9分泌得到。
3.一种基于免疫学检测技术的肝螺杆菌诊断和/或检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，包括肝螺杆菌CdtB蛋白；
所述肝螺杆菌CdtB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒；
所述ELISA检测试剂盒包括包被肝螺杆菌CdtB蛋白的酶标板和所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体。
6.权利要求2所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体或所述肝螺杆菌CdtB蛋白单克隆抗体和肝螺杆菌CdtB蛋白在制备免疫诊断和/或免疫检测肝螺杆菌的试剂盒中的应用；
所述肝螺杆菌CdtB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述免疫检测包括以下检测技术中的一种或多种：ELISA检测、蛋白免疫印迹、免疫荧光检测和免疫组化检测。
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CN111793130B (zh) * 2019-03-20 2021-09-14 华中农业大学 一株副猪嗜血杆菌CdtB杂交瘤细胞及单克隆抗体应用

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