CN115806622B - 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3，其重链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区序列的CDR1序列如SEQ IDNO:4所示，CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6所示。Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3具有良好的抑制Taq DNA聚合酶的外切活性的能力。

Description

一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用

技术领域

本发明涉及一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用，属于Taq DNA聚合酶技术领域。

背景技术

Taq DNA聚合酶是一个高温酶，但该酶在常温下仍具有一定的活性。在PCR预变性前，Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性能够引起引物、探针或模板的降解；而其5’-3’聚合活性在PCR预变性前阶段即可引起模板或引物错配而产生非特异性的扩增；非特异性产物在后续的扩增循环中将进一步被放大，从而造成目的产物扩增产量降低，甚至扩增失败。

热启动方法可以有效解决上述问题，即在PCR预变性阶段可逆地使Taq DNA聚合酶失去活性。目前常用的热启动方法有抗体法、化学修饰法、适体法等。化学修饰法较为常用，活性封闭较为完全、不会引入外源污染，但是其Taq DNA聚合酶活性较难完全激活，需要高温孵育较长时间。而适体法则无法彻底封闭Taq DNA聚合酶活性，当温度升高至45℃以上即可恢复酶活性，很难达到严格的热启动。

和上述方法相比，抗体法具有一定的优势。在抗体法中，应用到Taq DNA聚合酶抗体(Taq Antibody)，该抗体可以封闭Taq DNA聚合酶活性位点，包括聚合活性位点和外切活性位点，抑制非特异性产物及引物二聚体的产生，提高检测灵敏度、引物与模板的结合效率和目的基因的扩增产率。在热启动PCR中，Taq DNA聚合酶抗体与Taq DNA聚合酶可逆性结合，与Taq DNA聚合酶维持动态平衡。高温变性前，Taq DNA聚合酶抗体结合在Taq DNA聚合酶活性位点上，封闭其酶活性。变性阶段，Taq DNA聚合酶抗体失活，Taq DNA聚合酶快速释放。退火阶段，Taq DNA聚合酶抗体恢复活性，封闭Taq DNA聚合酶活性。延伸阶段，Taq DNA聚合酶抗体再次失活，Taq DNA聚合酶以目的基因为模板、引物为出发点合成完整双链DNA。

目前，现有的Taq DNA聚合酶抗体大多数只是具有较好的封闭聚合酶的聚合活性的效果，对封闭聚合酶的外切酶活性的效果不佳，影响到聚合酶的热启动效果。因此，本领域亟需一种能够直接用于制备热启动Taq DNA聚合酶的抗体，该抗体具有较高的封闭聚合酶的外切酶活性的效果。

发明内容

本发明提供了一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3，其重链可变区序列的CDR1序列如SEQ IDNO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6所示。

作为进一步改进的，所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3的重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示。

作为进一步改进的，所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3的轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。

作为进一步改进的，所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3的重链序列如SEQID NO:9所示

作为进一步改进的，所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3的轻链序列如SEQID NO:10所示

一种上述的单克隆抗体R8F3在构建热启动Taq DNA聚合酶扩增中的应用。

一种产生上述的单克隆抗体R8F3的细胞。

本发明的有益效果是：

本发明提供的单克隆抗体R8F3，具有良好的封闭Taq DNA 5’-3’外切酶活性，有效抑制模板、引物和探针的降解，常温下其封闭效率不低于95％，最高可达97.5％；随着温度升高，单克隆抗体开始与Taq DNA聚合酶解离，恢复Taq DNA聚合酶外切活性，能够直接适用于Taq DNA聚合酶的热启动，能够有效降低野生型和或突变型Taq DNA聚合酶的非特异性扩增。

本发明提供的单克隆抗体R8F3能在不影响Taq DNA聚合酶活性前提下，在广泛的非扩增温度条件下(0～60℃)能够充分封闭Taq DNA聚合酶的外切酶活性区域。

本发明的单克隆抗体R8F3，用于聚合酶的热启动，相比野生Taq酶，其扩增灵敏度显著提升，能很好的扩增出低浓度15copies/反应的样本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例2提供的Taq DNA聚合酶单克隆抗体聚合酶活性封闭检测。

图2是本发明实施例3提供的Taq DNA聚合酶抗体外切酶活性封闭检测结果。

图3是本发明实施例4提供的Taq DNA聚合酶抗体的扩增效果图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1

特异结合Taq DNA聚合酶单克隆抗体制备

1、免疫动物

取8-12周龄的BALB/c小鼠，以100μg/只的含野生型Taq酶蛋白重组抗原与等量福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的野生型Taq酶蛋白重组抗原与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法)滴度在1∶5000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。

2、饲养细胞的制备

以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用含HAT的RPMI 1640完全培养液中重悬，调整细胞浓度1×10⁵个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。

3、免疫脾细胞的制备

小鼠最后一次免疫三天后，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。

4、细胞融合

(1)取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温；

(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(2-5×10⁷个)、上述免疫脾细胞(10⁸个)悬液加入50mL离心管中混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；

(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7mL预温的50％PEG溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液；

(4)补加DMEM无血清培养液至40mL，离心10分钟，倒尽上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培养箱中培养。

5、杂交瘤细胞的选择培养

在细胞融合后第1，3，5，7天用前述的HAT培养液换液培养，选择出真正的杂交细胞。

6、特异性抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化

吸取每个培养孔的上清液，用间接ELISA法检测出培养液中含特异性识别Taq酶蛋白重组抗原的抗体的培养孔，筛选得到有较好反应性的抗体，命名为R8F3。

经测序，单克隆抗体R8F3的重链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:1(YIIH)所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2(WYPGSIIKFEKFKD)所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示(HGYGRGAY)；其轻链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:4(ASQNDTNV)所示，CDR2序列如SEQ ID NO:5(SSYRY)所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6(QQNNNPT)所示。

重链可变区序列如SEQ ID NO:7

(QVQLQQSGAELVKPGASVKVSCKASGYTFTYIIHWVKQRSGQGLEWI GWYPGSIIKFEKFKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCARHGYGRGAYWGQGTLVTVSS)所示。

轻链可变区序列如SEQ ID NO:8

(DIKITQSQKIMSTSVGDRVSVTCASQNDTNVWYQQKPGQSPKVLIYSS YRYGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYCCQQNNNPTFGGGTKL EIK)所示。

重链序列如SEQ ID NO:9

(QVQLQQSGAELVKPGASVKVSCKASGYTFTYIIHWVKQRSGQGLEWI GWYPGSIIKFEKFKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCARHGYGRGAYWGQGTLVTVSSSTPPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK)所示。

轻链序列如SEQ ID NO:10

(DIKITQSQKIMSTSVGDRVSVTCASQNDTNVWYQQKPGQSPKVLIYSS YRYGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYCCQQNNNPTFGGGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC)所示。

人工合成上述单克隆抗体R8F3重链和轻链序列(SEQ ID NO:9和10)，并插入至pcDNA3.1载体中。按Thermo Fisher公司FreeStyle TM293Expression System UserManual操作，转染含重链序列和轻链序列的载体至293-F细胞中，培养并收集细胞培养物上清。

细胞培养物上清经蛋白A亲和层析分离纯化，操作按Cytiva公司handbook:Affinity Chromatography,Vol 1:Antibodies进行。纯化制备得Taq DNA聚合酶单克隆抗体R8F3。

实施例2

特异结合Taq DNA聚合酶单克隆抗体聚合酶活性封闭检测

取Taq DNA聚合酶抗体R8F3和野生Taq DNA聚合酶，按质量比2:1混匀，制备为抗体-Taq DNA聚合酶(抗体酶)。

取发夹型寡核苷酸探针序列如下：

5’-TAGCGAAGGATGTGAACCTAATCCCTGCTCCCGCGGCCGATCTGC CGGCCGCGG-3’(SEQ IDNO:11)，稀释至100μmol/L。

配制10×PCR buffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl2，25mmol/L dNTP。

按照表1的PCR体系配制，所有操作在冰上进行，每个实验均有三个重复。

表1

反应液组分	用量(μL)
		10×PCR buffer	2.5
PicoGreen	0.5
		发夹型寡核苷酸探针	0.1
野生Taq DNA聚合酶或抗体酶	0.5
		纯化水	21.4
总计	25

在荧光定量PCR仪上设置不同温度程序，检测不同温度下封闭效果。不同温度分别为37℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，检测时间为16s。

PCR为120个循环。荧光采集通道：FAM

将加入反应液的PCR八联管置于荧光定量PCR仪前，按照以上温度分别预热荧光定量PCR仪半小时，开始聚合反应。反应结束后，根据荧光定量PCR的测试数据，计算第30cycles的荧光值与初始值的差异。检测酶的5’-3’聚合酶活性的封闭效果＝100％-测试酶的前后荧光差异/野生型酶的前后荧光值差异。

结果如图1所示，由图谱可知，经单抗R8F3封闭，在常温下从具有较小的聚合酶封闭效果。

实施例3

特异结合Taq DNA聚合酶单克隆抗体外切酶活性封闭检测

取Taq DNA聚合酶抗体R8F3和Taq DNA聚合酶，按质量比2:1混匀，制备为抗体-TaqDNA聚合酶。

取发夹型寡核苷酸探针序列如下：5’-FAM-CTAGCTC(BHQ)CATGGTCCGTAGGCGTAACGGTCCCGGGTAGAT CCCGGTCCGATGGGCCTTAGACTGTC-3’(SEQ ID NO:12)，稀释至100μmol/L。

配制10×PCR buffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl2，25mmol/L dNTP。

按照下表2的PCR体系配方配制，所有操作在冰上进行，每个实验均有三个重复。

表2

反应液组分	用量(μL)
		10×PCR buffer	2.5
发夹型寡核苷酸探针	0.05
		野生Taq DNA聚合酶或抗体酶	0.5
纯化水	21.95
		总计	25

在荧光定量PCR仪上设置不同温度程序，检测不同温度下封闭效果。不同温度分别为37℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，扩增时间为30s。

PCR为80个循环。荧光采集通道：FAM。

将加入反应液的PCR八联管置于荧光定量PCR仪前，按照以上温度分别预热荧光定量PCR仪半小时，开始反应。反应结束后，根据荧光定量PCR的测试数据，计算第80cycles的荧光值与初始值的差异。检测酶的5’-3’外切酶活性封闭效果＝100％-测试酶的前后荧光差异/野生型酶的前后荧光值差异。

结果如图2所示，根据图谱可知，经单克隆抗体R8F3封闭，在各温度下，Taq DNA聚合酶的外切酶活性均有较好的封闭效果。在不高于60℃条件下，封闭效率均不低于96.9％，最高可达97.5％。随着温度进一步升高，抗体明显失活，外切酶酶活开始释放。

实施例4

q-pcr检测HBV样本扩增效果

样本为HBV阳性血清，采用购置于天根生化科技的血清/血浆游离DNA提取试剂盒(货号DP339)提取样本DNA，根据HBV的q-pcr试剂盒测定样本DNA的拷贝数，制备15copies/5μL低浓度样本。

合成引物HBV-L，序列为CAATCACTCACCAACCTCCTG

(SEQ ID NO:13)，引物HBV-R，序列为CGGGCAACATACCTTGATAA(SEQ ID NO:14)，探针HBV-P，序列为5’-FAM-CCAATTTGTCCTGGTTATCG(BHQ)-3’(SEQ ID NO:15)。

稀释至100μmol/L。

配制10×PCR buffer 2：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH₄)·SO₄，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl₂，25mmol/L dNTP，1mmol/LEDTA·2Na。

实验分成三组，分别为抗体酶组、野生Taq酶组及商抗酶组。

抗体酶：取抗体R8F3，浓度为5mg/mL，分别与浓度为0.5mg/mL的野生Taq DNA聚合酶按照2：1的质量比混合均匀，37度孵育30min，即为抗体酶。

野生Taq酶：另取浓度为0.5mg/mL的野生型Taq DNA聚合酶加相同体积的抗体储存缓冲液混合均匀，37度孵育30min。

商抗酶：取现有抗体(购自TAKARA)与浓度为0.5mg/mL的野生Taq DNA聚合酶混合均匀，混合比例为抗体与酶的质量比2：1。

按照以下表3配方配制

表3

在荧光定量PCR仪上设置温度程序如表4所示：

表4

结果如图3所示。由图3可知，抗体酶均能很好的扩增出低浓度15copies/反应的样本，相比野生Taq酶，抗体酶的灵敏度有很大提升。相比商抗酶，抗体酶扩增CT值也有一定提升，说明其检测灵敏度有一定的提升。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3，其特征在于，其重链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区序列的CDR1序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQIDNO:6所示。

2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3，其特征在于，其重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示。

3.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3，其特征在于，其轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。

4.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3，其特征在于，其重链序列如SEQ ID NO:9所示。

5.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3，其特征在于，其轻链序列如SEQ ID NO:10所示。

6.一种权利要求1至5任一项所述的单克隆抗体R8F3在构建热启动Taq DNA聚合酶扩增中的应用。

7.一种产生权利要求1至5任一项所述的单克隆抗体R8F3的细胞。

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