CN110564723A - 一种用于获取抗体序列的扩增引物和获取抗体序列的方法 - Google Patents

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CN110564723A CN201911005383.0A CN201911005383A CN110564723A CN 110564723 A CN110564723 A CN 110564723A CN 201911005383 A CN201911005383 A CN 201911005383A CN 110564723 A CN110564723 A CN 110564723A
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Abstract

本发明公开了一种用于获取抗体序列的扩增引物和获取抗体序列的方法，涉及抗体技术领域。该扩增引物包括如下引物对中的任意一种或两种：重链引物对和轻链引物对，重链引物对包括：重链上游引物和重链下游引物，轻链引物对包括：轻链上游引物和轻链下游引物。该扩增引物可以直接以来自分泌抗体的细胞的基因组DNA为模板进行扩增，得到抗体可变区基因序列，进而确定抗体的可变区序列，具有方便、快速、节约成本、人力及时间，结果可靠等特点。

Description

一种用于获取抗体序列的扩增引物和获取抗体序列的方法
本申请要求于2018年10月23日提交于中国专利局的申请号为CN201811245491.0、名称为“一种用于获取抗体序列的扩增引物和获取抗体序列的方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种用于获取抗体序列的扩增引物和获取抗体序列的方法。
背景技术
现有的单克隆抗体序列获取的方法是：首先提取分泌抗体的细胞(杂交瘤细胞，B细胞等)的RNA，然后进行反转录，通过设计简并引物进行序列扩增，或采用5′RACE方法对序列进行扩增，进一步对扩增产物进行克隆及Sanger测序获得抗体序列。亦可以通过抗体的氨基酸测序获得抗体的序列信息，再经过基因合成获得抗体序列。
现有方法首先进行细胞的RNA提取操作，RNA的特点是易降解，不如DNA稳定。提取RNA后，再进行反转录，以cDNA为模板使用简并引物或者5′RACE方法进行扩增。步骤繁琐，失败率较高，且成本也较高。
抗体氨基酸测序方法的缺点：价格昂贵，实验周期较长。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于获取抗体序列的扩增引物，该扩增引物可以直接以来自分泌抗体的细胞的基因组DNA为模板进行扩增，得到抗体可变区基因序列，进而确定抗体的可变区序列，具有操作方便、快速，节约成本、人力及时间，结果可靠等特点。
本发明的另一目的在于提供获取抗体序列的方法，该方法直接以来自分泌抗体的细胞的基因组DNA为模板进行扩增，得到抗体可变区基因序列，进而确定抗体的可变区序列，具有操作方便、快速，节约成本、人力及时间，结果可靠等特点。
本发明的另一目的在于提供试剂盒，该试剂盒可以用于鉴定抗体的序列。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种用于获取抗体序列的扩增引物，其包括如下引物对中的任意一种或两种：重链引物对和轻链引物对；
其中，重链引物对包括：重链上游引物和重链下游引物；
所述重链上游引物的互补结合区位于涵盖重链V基因的上游部分序列和所述重链V基因的5’端部分序列的区域中，所述重链下游引物的互补结合区位于涵盖重链J基因和位于所述重链J基因与重链C基因间的内含子的区域中；
轻链引物对包括：轻链上游引物和轻链下游引物；
轻链上游引物的互补结合区位于涵盖轻链V基因的上游部分序列和所述轻链V基因的5’端部分序列的区域中，所述轻链下游引物的互补结合区位于涵盖轻链J基因和位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子的区域中。
抗体的产生经过了基因重排(见图1)，在胚系基因组上，抗体基因片段具有多样性，而经过V,D,J基因重排，最终形成的抗体仅包含其中每种基因簇中的一个基因片段，且J基因相对数量较少可作为引物设计的位点。同时J基因与C基因之间的intron序列是保守的，这段intron序列则可作为保守位点来设计扩增抗体V区的引物。
本发明首次提出将扩增引物的下游引物设计位置选在J基因上或J基因与C基因中间的内含子(intron)上，对扩增产物进行序列分析，从而获得编码单克隆抗体可变区的基因编码序列信息，该扩增引物可通过直接以基因组DNA为模板进行抗体序列扩增，避免了提取RNA和反转录的步骤，提高获取抗体序列的效率，有利于降低成本，具有操作方便、快速，节约成本、人力及时间，结果可靠等特点。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述重链下游引物的互补结合区位于所述重链J基因与重链C基因间的内含子区域中；
所述轻链下游引物的互补结合区位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子区域中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述重链上游引物为简并引物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述重链上游引物如SEQ ID NO.1所示，如下所示：sargtnmagctgsagsag，其中，s＝g or c,r＝a or g,n＝a、c、g or t,m＝a or c。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，优选地，所述重链下游引物选自SEQ IDNO.2-5中的一种或几种。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述轻链上游引物为简并引物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述轻链上游引物如SEQ ID NO.6所示，如下所示：gayattgtgmtsacmcarwct；其中，y＝c or t,m＝a or c,s＝g or c,r＝a or g,w＝a or t。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述轻链下游引物选自SEQ ID NO.7-11中的一种或几种。
另一方面，本发明提供了一种获取抗体序列的方法，其包括：使用如下引物对中的任意一种进行PCR扩增：重链引物对和轻链引物对；
其中，重链引物对包括：重链上游引物和重链下游引物；
所述重链上游引物的互补结合区位于涵盖重链V基因的上游部分序列和所述重链V基因的5’端部分序列的区域中，所述重链下游引物的互补结合区位于涵盖重链J基因和位于所述重链J基因与重链C基因间的内含子的区域中；
轻链引物对包括：轻链上游引物和轻链下游引物；
轻链上游引物的互补结合区位于涵盖轻链V基因的上游部分序列和所述轻链V基因的5’端部分序列的区域中，所述轻链下游引物的互补结合区位于涵盖轻链J基因和位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子的区域中。
该方法可直接以来自分泌抗体的细胞的基因组DNA为模板进行扩增，得到抗体可变区基因序列，进而确定抗体的可变区序列，具有操作方便、快速，节约成本、人力及时间，结果可靠等特点。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述重链下游引物的互补结合区位于所述重链J基因与重链C基因间的内含子区域中；
所述轻链下游引物的互补结合区位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子区域中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述重链上游引物为简并引物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述重链上游引物如SEQ ID NO.1所示，如下所示：sargtnmagctgsagsag，其中，s＝g or c,r＝a or g,n＝a、c、g or t,m＝a or c。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，优选地，所述重链下游引物选自SEQ IDNO.2-5中的一种或几种。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述轻链上游引物为简并引物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述轻链上游引物如SEQ ID NO.6所示，如下所示：gayattgtgmtsacmcarwct；其中，y＝c or t,m＝a or c,s＝g or c,r＝a or g,w＝a or t。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述轻链下游引物选自SEQ ID NO.7-11中的一种或几种。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述基因组DNA提取自分泌抗体的细胞。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述细胞为杂交瘤细胞或B细胞。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述细胞脊椎动物，优选的，所述细胞来自于哺乳动物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述哺乳动物选自人、鼠、兔、猴、马、牛、羊和猪。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在进行PCR扩增后，所述方法包括：对得到的扩增产物进行测序，获得目标抗体的重链可变区序列或轻链可变区序列。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在进行PCR扩增之前，所述方法包括：提取所述细胞的基因组DNA。
另一方面，本发明提供了用于鉴定抗体序列的试剂盒，其包括上述的扩增引物。
采用上述的扩增引物可以鉴定抗体序列，避免了提取RNA和反转录的步骤，提高获取抗体序列的效率，有利于降低成本，具有操作方便、快速，节约成本、人力及时间，结果可靠等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为抗体相关基因重排示意图，图中：黑框为基因重排后的抗体轻重链基因在基因组上的情况，被选中的VDJ基因片段之间的多余序列被删除，使得VDJ基因片段紧密相连形成抗体的V(可变区)区；虚线框中即为本发明提供的扩增引物中的下游引物的设计位置(也即与靶基因的互补结合区位置所在的区域)。
图2为阳性杂交瘤流式筛选结果。
图3为亚克隆鉴定结果。
图4为实施例中的扩增产物的电泳图。
图5为实施例重组表达抗体的流式结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
抗人CD47抗体基因序列的获取实例
1小鼠抗人CD47单抗制备
1.1抗原免疫
1.1.1抗原乳化：
取浓度为500μg/mL人CD47-his溶液与等体积的弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂乳化至乳浊液。
1.1.2抗原免疫：
取5只6周龄Balb/c小鼠，皮下注射乳化好的抗原200μL，注射4个位点，每个位点50μL，即每只小鼠免疫50μg。
初次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，第二次，第三次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，免疫间隔2周。
1.1.3冲击免疫：
第三次免疫完成1个月后，开始进行冲击免疫，取200μL浓度为500mg/mL的抗原腹腔注射。
1.2脾细胞与SP2/0融合
1.2.1脾细胞分离：
冲击免疫后第4天，小鼠脱颈处死，取小鼠脾脏置于70μm筛网中研磨分离脾细胞。使用30mL无血清基础培养基清洗3遍脾细胞，400g离心10min，弃上清，最后使用20mL无血清基础培养基重悬细胞，0.4％的台盼蓝溶液稀释后用血球计数板计数。
1.2.2 SP2/0细胞处理：
SP2/0细胞经0.05％胰酶消化处理，收集，300g离心5min弃上清，使用30mL无血清基础培养基清洗3遍SP2/0细胞，最后使用20mL无血清基础培养基重悬细胞，0.4％的台盼蓝溶液稀释后用血球计数板计数。
1.2.3细胞融合：
总脾细胞数与SP2/0按3:1的比例融合，吸取相应的SP2/0细胞与脾细胞混合，400g离心10min，弃上清。
轻拍管底，打散细胞，使用1mL枪缓慢加入1mL PEG(37℃预热)，持续1min，无搅动。加完后用枪头轻轻搅动1min。缓慢加入4mL无血清基础培养基(37℃预热)，轻轻搅动4min。
缓慢加入10mL无血清基础培养基(37℃预热)，37℃静置水浴15min。
缓慢加入30mL无血清基完全培养基(37℃预热)，400g离心7min，弃上清，再加入30mL完全培养基(37℃预热)，400g离心7min，弃上清，确保PEG移除。
使用含HAT的完全培养基重悬细胞，铺种96孔板，每孔200μL体积。
培养板置于37℃、5％CO2条件下培养。
培养板分别在第4天和第6天进行半换液，第8天进行全换液，第10天进行杂交瘤鉴定及亚克隆。
1.3阳性杂交瘤鉴定
1).按照每孔体积50μL共5×104个的细胞量，分装CHO-hCD47细胞于96孔U型板中。
2).吸取50μL96孔板杂交瘤细胞上清加到上述对应的96孔U型板中，混匀后，4℃，静置15min。
3).1000rpm，离心5min，弃上清，200μL PBS重悬细胞，离心弃上清。
4).加入50μL稀释后的羊抗鼠IgG-FITC重悬细胞，4℃，静置15min。
7).离心弃上清，200μL PBS重悬细胞，流式分析。
结果见图2。
结果显示：通过流式筛选，筛选到对应的96孔板孔号为3B9的阳性孔，对此孔的细胞进行亚克隆。
1.4亚克隆
1).吹打3B9空中的细胞脱离皿底，细胞悬液全部转移至1.5mL EP管中，0.4％的台盼蓝溶液稀释后用血球计数板计数。
2).吸取含有2000个杂交瘤细胞的悬液，与40mL HT完全培养基混合。
3).上述混合好的培养基以每孔200μL的体积，分至两块96孔板中，37℃，5％CO2培养。
4).培养1周后，每孔取50μL上清进行流式鉴定阳性亚克隆，实验步骤同1.3。
结果见图3。
结果显示：经流式鉴定，选择阳性信号较好的亚克隆1A3、1C4、1E2、1F6、1G7、2B3、2E11和2F6进行扩培保种及后续分析。
1.5抗体序列获取
1.5.1基因组DNA提取
使用碧云天生物技术公司基因组DNA小量抽提试剂盒(货号：D0063)试剂提取3B9-1A3细胞的基因组DNA，实验步骤参考试剂说明书。
1.5.2扩增目的序列。
使用重链引物对和轻链引物对PCR扩增，其中，重链上游引物的互补结合区位于涵盖小鼠重链V基因的上游部分序列和重链V基因的5’端部分序列的区域中，重链下游引物的互补结合区位于涵盖小鼠重链J基因和位于重链J基因与重链C基因间的内含子的区域中。
轻链上游引物的互补结合区位于涵盖轻链V基因的上游部分序列和所述轻链V基因的5’端部分序列的区域中，所述轻链下游引物的互补结合区位于涵盖轻链J基因和位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子的区域中。
其中，重链扩增引物如下：
上游引物：
mIgh-F:sargtnmagctgsagsag(SEQ ID NO.1)；
其中，s＝g or c,r＝a or g,n＝a、c、g or t,m＝a or c。
下游引物：
mIgh-R1：tcccgtttcagaatggaatgtgcag(SEQ ID NO.2)；
mIgh-R2：taagctgaatagaagagagaggttg(SEQ ID NO.3)；
mIgh-R3：ccccaacatgcatttagaatgggag(SEQ ID NO.4)；
mIgh-R4：ttaaaaataaagacctggagaggcc(SEQ ID NO.5)；
轻链扩增引物如下：
上游引物：
mIgK-F:gayattgtgmtsacmcarwct(SEQ ID NO.6)；
其中，y＝c or t,m＝a or c,s＝g or c,r＝a or g,w＝a or t。
下游引物：
mIgk-R1：gacaacggaagaaagagactttgga(SEQ ID NO.7)；
mIgk-R2：ggttagacttagtgaacaagagttg(SEQ ID NO.8)；
mIgk-R3：cttcacaagcagttgagcaaaaatg(SEQ ID NO.9)；
mIgk-R4：acagaaccaaaacgtcacaagtaaa(SEQ ID NO.10)；
mIgk-R5：taacatgaaaacctgtgtcttacac(SEQ ID NO.11)。
使用诺唯赞2×Phanta Max Master Mix(P515)PCR酶进行扩增.
反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
上游引物(10μM) 2μl
下游引物(10μM) 2μl
模板DNA 2μl
ddH2O 19
反应程序如下：
PCR产物凝胶电泳结果如图4所示，
其中：第1泳道：mIgh-F+mIgh-R1的PCR产物。
第2泳道：mIgh-F+mIgh-R2的PCR产物。
第3泳道：mIgh-F+mIgh-R3的PCR产物。
第4泳道：mIgh-F+mIgh-R4的PCR产物。
第5泳道：DNA Marker(Takara DL2000)。
第6泳道：mIgK-F+mIgK-R1的PCR产物。
第7泳道：mIgK-F+mIgK-R2的PCR产物。
第8泳道：mIgK-F+mIgK-R3的PCR产物。
第9泳道：mIgK-F+mIgK-R4的PCR产物。
第10泳道：mIgK-F+mIgK-R5的PCR产物。
将mIgh-F+mIgh-R2和mIgK-F+mIgK-R2的PCR产物进行测序。
1.5.3测序及序列分析
将上述的3B9-1A3的PCR产物测序。得到重链V区序列和轻链V区序列。
结果如下：
3B9-1A3抗体的重链可变区的HCDR1(重链可变区的互补性决定区1)、HCDR2(重链可变区的互补性决定区2)和HCDR3(重链可变区的互补性决定区3)的氨基酸序列分别如下：
HCDR1：GYSITSGYH；
HCDR2：ISYDGSN；
HCDR3：ARVGLRRFDY。
3B9-1A3抗体的轻链可变区的LCDR1(轻链可变区的互补性决定区1)、LCDR2(轻链可变区的互补性决定区2)和LCDR3(轻链可变区的互补性决定区3)的氨基酸序列分别如下：
LCDR1：SSVSSSY；
LCDR2：STS；
LCDR3：QQYSGYPYT。
3B9-1A3抗体的重链可变区的氨基酸序列如下：
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYHWNWIRQFPGNKLEWMGHISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCARVGLRRFDYWGQGTTLTVSS；
3B9-1A3抗体的重链可变区的编码序列如下：
GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATCACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCCACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCAAGAGTGGGGTTACGACGGTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA。
3B9-1A3抗体的轻链可变区氨基酸序列如下：
VAMSRGENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPYTFGGGTKLEIK；
3B9-1A3抗体的轻链可变区的编码序列如下：
GTTGCAATGTCCAGAGGAGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGTGCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。
1.5.4抗体表达载体构建
将获得的轻重链序列通过无缝连接的方式分别克隆至相应的表达载体上，轻链V区基因均克隆到经NheⅠ和XhoⅠ线性化的pCAG-mIgK-LC载体上，重链V区基因均克隆到经XhoⅠ和NheⅠ线性化的pCAG-mIgG1-HC载体上。
1.5.5序列验证
分别将3B9-1A3轻重链表达载体共转293T细胞，收集上清验证抗体活性，FACS检测步骤同1.3。结果如图5：流式结果显示重组抗体信号较好，表明分析所得序列正确。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 程晓东、杭州来伯生物技术有限公司
<120> 一种用于获取抗体序列的扩增引物和获取抗体序列的方法
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
sargtnmagc tgsagsag 18
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcccgtttca gaatggaatg tgcag 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taagctgaat agaagagaga ggttg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccccaacatg catttagaat gggag 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttaaaaataa agacctggag aggcc 25
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<400> 11
taacatgaaa acctgtgtct tacac 25

Claims (15)

1.一种用于获取抗体序列的扩增引物，其特征在于，其包括如下引物对中的任意一种或两种：重链引物对和轻链引物对；
其中，重链引物对包括：重链上游引物和重链下游引物；
所述重链上游引物的互补结合区位于涵盖重链V基因的上游部分序列和所述重链V基因的5’端部分序列的区域中，所述重链下游引物的互补结合区位于涵盖重链J基因和位于所述重链J基因与重链C基因间的内含子的区域中；
轻链引物对包括：轻链上游引物和轻链下游引物；
轻链上游引物的互补结合区位于涵盖轻链V基因的上游部分序列和所述轻链V基因的5’端部分序列的区域中，所述轻链下游引物的互补结合区位于涵盖轻链J基因和位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子的区域中。
2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于，所述重链下游引物的互补结合区位于所述重链J基因与重链C基因间的内含子区域中；
所述轻链下游引物的互补结合区位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子区域中。
3.根据权利要求1或2所述的扩增引物，其特征在于，所述重链上游引物为简并引物；
优选地，所述重链下游引物选自SEQ ID NO.2-5中的一种或几种。
4.根据权利要求1或2所述的扩增引物，其特征在于，所述轻链上游引物为简并引物；
优选地，所述轻链下游引物选自SEQ ID NO.7-11中的一种或几种。
5.一种获取抗体序列的方法，其特征在于，其包括：使用如下引物对中的任意一种进行PCR扩增：重链引物对和轻链引物对；
其中，重链引物对包括：重链上游引物和重链下游引物；
所述重链上游引物的互补结合区位于涵盖重链V基因的上游部分序列和所述重链V基因的5’端部分序列的区域中，所述重链下游引物的互补结合区位于涵盖重链J基因和位于所述重链J基因与重链C基因间的内含子的区域中；
轻链引物对包括：轻链上游引物和轻链下游引物；
轻链上游引物的互补结合区位于涵盖轻链V基因的上游部分序列和所述轻链V基因的5’端部分序列的区域中，所述轻链下游引物的互补结合区位于涵盖轻链J基因和位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子的区域中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重链下游引物的互补结合区位于所述重链J基因与重链C基因间的内含子区域中；所述轻链下游引物的互补结合区位于所述轻链J基因与轻链C基因间的内含子区域中。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重链上游引物为简并引物；
优选地，所述重链下游引物选自SEQ ID NO.2-5中的一种或几种。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述轻链上游引物为简并引物；
优选地，所述重链下游引物选自SEQ ID NO.7-11中的一种或几种。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA提取自分泌抗体的细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述细胞为杂交瘤细胞或B细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞来自于脊椎动物，优选的，所述细胞来自哺乳动物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物选自人、鼠、兔、猴、马、牛、羊、羊驼、骆驼和猪。
14.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增后，所述方法包括：对得到的扩增产物进行测序，获得目标抗体的重链可变区序列或轻链可变区序列。
15.一种用于鉴定抗体序列的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的扩增引物。
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