CN110483643B

CN110483643B - 一种新型的抗体组合物、分离的核酸和制备方法

Info

Publication number: CN110483643B
Application number: CN201910868148.XA
Authority: CN
Inventors: 程晓东
Original assignee: Shenzhen Yawei Hongyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Yawei Hongyuan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2039-09-12
Also published as: CN110483643A

Abstract

本发明公开了一种新型的抗体组合物、分离的核酸和制备方法，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗体组合物其包括：多种抗体；在多种抗体中，任意两种抗体具有不同的可变区和相同的恒定区，或任意两种抗体具有不同的可变区和不同的恒定区，不同的抗体结合不同的抗原表位。该抗体组合物在用于检测抗原时，可以避免由于被检测物质出现某抗原表位改变而导致的假阴性结果，从而提高检测结果的成功率及准确性。

Description

一种新型的抗体组合物、分离的核酸和制备方法

本申请要求于2018年9月19日提交于中国专利局的申请号为CN 201811093390.6、名称为“一种新型的抗体组合物、分离的核酸和制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本申请要求于2018年9月19日提交于中国专利局的申请号为CN201811093389.3、名称为“一种新型的抗人IgG1-Fc抗体试剂及其制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种新型的抗体组合物、分离的核酸和制备方法。

背景技术

生命科学领域使用的抗体试剂分为单克隆抗体试剂和多克隆抗体试剂。

单克隆抗体试剂和多克隆抗体试剂的制备均已被业内技术人员所熟知。

单克隆抗体试剂的制备的其中一种经典的方法是：首先通过抗原免疫动物，然后将免疫后动物的B细胞与瘤细胞融合，通过形成杂交瘤细胞，进一步筛选得到阳性单克隆杂交瘤细胞株，使用阳性杂交瘤细胞制备腹水，通过腹水纯化获得大量单抗；或者分析阳性杂交瘤细胞株抗体基因序列，获得抗体序列后构建抗体表达载体，转染细胞，培养后收集细胞培养上清，经纯化获得大量单克隆抗体。阳性抗体序列获得的方式不限于来自于杂交瘤，也可以通过抗体展示技术及单细胞测序技术等获得。

多克隆抗体试剂的制备相对于单克隆抗体试剂的制备较简单一些，通过免疫动物后，采集血清，血清即可作为多克隆抗体试剂来使用，或者从血清中将抗体分离出来，制备成多克隆抗体试剂。

单克隆抗体试剂的缺点包括但不限于如下：识别抗原表位单一，灵敏度不如多克隆抗体，且抗原表位容易受实验过程中理化性质的影响，常导致抗原表位改变，使单克隆抗体试剂无法识别或敏感程度降低。

多克隆抗体试剂的缺点包括但不限于如下：特异性差，常有非特异反应和交叉反应。组成成分复杂，标准化生产较难，生产批次间存在差异等。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的抗体组合物。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种重组细胞或重组菌。

本发明的另一目的在于提供制备抗体组合物的方法。

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种新型的抗体组合物，其包括：

多种抗体；在所述多种抗体中，任意两种抗体具有不同的可变区和相同的恒定区，或任意两种抗体具有不同的可变区和不同的恒定区；不同的抗体结合不同的抗原表位。

使用单一抗体试剂检测抗原时，若某抗原表位改变或发生突变，则导致结果出现假阴性，这种检测方式的检测结果的准确性会降低，且检出的成功率也低。本发明提供的抗体组合物包括有可结合不同的抗原表位的多种抗体，相较于使用单一抗体试剂检测抗原时，使用本发明的抗体组合物用于检测抗原时，多种抗体可以结合不同的抗原，可以避免由于被检测物质出现某抗原表位改变而导致的假阴性结果，从而提高检测结果的成功率及准确性。

进一步，在本发明的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

进一步，在本发明的一些实施方案中，在所述多种抗体中，任意两种抗体的可变区具有相同的FR区(即骨架区)。

进一步，在本发明的一些实施方案中，在所述多种抗体中，任意两种抗体的可变区具有不同的FR区。

进一步，在本发明的一些实施方案中，所述抗体为完整结构的抗体或基因工程抗体例如scFv、Fab、Fab’和F(ab)’₂等。

进一步，在本发明的一些实施方案中，在所述多种抗体中，不同的抗体结合同一抗原的不同抗原表位。

进一步，在本发明的一些实施方案中，不同的抗体结合人IgG1-Fc抗原的不同抗原表位。

人IgG1-Fc抗原是指人IgG1的Fc片段上的区域。

进一步，在本发明的一些实施方案中，人IgG-Fc抗原的不同抗原表位包括人IgG1-Fc-CH2抗原表位和人IgG1-Fc-CH3抗原表位。

人IgG1-Fc-CH2抗原表位是指人IgG1抗体的Fc片段上的CH2区域；人IgG1-Fc-CH3抗原表位是指人IgG1抗体的Fc片段上的CH3区域。

进一步，在本发明的一些实施方案中，所述多种抗体包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；所述第一抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基序列分别如SEQ ID NO.4-6所示；所述第二抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基序列分别如SEQ ID NO.11-13所示；所述第二抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基序列分别如SEQ ID NO.14-16所示。

进一步，在本发明的一些实施方案中，所述第一抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步，在本发明的一些实施方案中，所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。

进一步，在本发明的一些实施方案中，在所述多种抗体中，不同的抗体结合不同抗原的不同抗原表位。

进一步，在本发明的一些实施方案中，不同抗原包括：同源抗原、同家族抗原的不同亚型，以及具有相同或相似化学基团的物质中的一种或多种。

同源抗原例如可以是不同物种中的具有同源性的蛋白例如人CD40和鼠CD40，还可以是其他的具有结构或序列相似性的蛋白或肽。

同家族抗原的不同亚型例如可以是同种蛋白的不同亚型例如人IgG1和IgG2等。

具有相同或相似化学基团的物质例如可以是三苯甲烷类、硝基咪唑类、氨基糖甙类等。

进一步，在本发明的一些实施方案中，所述多种抗体中的每种抗体标记有标记物或均不带有标记物。

进一步，在本发明的一些实施方案中，所述标记物选自荧光标记物、酶标记物和放射性核素标记物。

进一步，在本发明的一些实施方案中，所述荧光标记物选自Alexa 350、Alexa405、Alexa430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、5-羧基-2’,4’,5’,7’-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)、Oregon Green 488、OregonGreen500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、LaJolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红；

优选的，所述酶标记物选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；

优选的，所述放射性核素标记物选自¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码上述的抗体组合物中的任意一种抗体。

另一方面，本发明提供了一种载体，其含有上述的分离的核酸。

另一方面，本发明提供了一种重组细胞或重组菌，其含有上述的载体。

另一方面，本发明提供了一种制备抗体组合物的方法，其包括：分别培养上述的重组细胞或重组菌，或者利用不同的抗原制备抗血清或杂交瘤细胞，再制备腹水；从产物中分离、纯化分别得到多种抗体；将得到多种抗体组合，得到抗体组合物。

其中，重组细胞或重组菌可分别表达出多种不同的抗体，在该多种抗体中，任意两种抗体具有不同的可变区，任意两种抗体具有相同的恒定区，不同的抗体结合不同的抗原表位。

另一方面，本发明提供了一种检测试剂，其含有上述的抗体组合物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中的pCAG-mIgK-LC载体结构示意图。

图2为实施例1中的pCAG-mIgG1-HC载体结构示意图。

图3为实施例1中的抗hIgG1-Fc-CH2的阳性杂交瘤上清流式检测结果。

图4为实施例1中的抗hIgG1-Fc-CH3的阳性杂交瘤上清流式检测结果。

图5为实施例1中mAb1-FITC和mAb2-FITC分别检测hIgG1-Fc的流式结果。

图6为实施例1中mAb1-FITC和mAb2-FITC分别检测hIgG1-Fc-Δ的流式结果。

图7为实施例1中mAb1/2-FITC检测hIgG1-Fc-Δ的流式结果。

图8为实施例2中Rabbit anti-mouseIgG FITC(pAb)检测小鼠不同亚型的流式结果。

图9为实施例2中不同亚型抗原制备的多抗检测相应亚型的流式结果。

图10为实施例2中新型试剂Rabbit anti-mouseIgG FITC(New pAb)检测4种小鼠IgG亚型的流式结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种新型抗人IgG1-Fc的二抗试剂

1小鼠抗人IgG1-Fc单抗制备

1.1抗原免疫

1.1.1抗原乳化：

取浓度为500μg/mL人IgG溶液与等体积的弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂乳化至乳浊液。

1.1.2抗原免疫：

取5只6周龄Balb/c小鼠，皮下注射乳化好的抗原200μL，注射4个位点，每个位点50μL，即每只小鼠免疫50μg。

初次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，第二次，第三次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，免疫间隔2周。

1.1.3冲击免疫：

第三次免疫完成1个月后，开始进行冲击免疫，取200μL浓度为500mg/mL的抗原腹腔注射。

1.2脾细胞与SP2/0融合

1.2.1脾细胞分离：

冲击免疫后第4天，小鼠脱颈处死，取小鼠脾脏置于70μm筛网中研磨分离脾细胞。使用30mL无血清基础培养基清洗3遍脾细胞，400g离心10min，弃上清，最后使用20mL无血清基础培养基重悬细胞，0.4％的台盼蓝溶液稀释后用血球计数板计数。

1.2.2SP2/0细胞处理：

SP2/0细胞经0.05％胰酶消化处理，收集，300g离心5min弃上清，使用30mL无血清基础培养基清洗3遍SP2/0细胞，最后使用20mL无血清基础培养基重悬细胞，0.4％的台盼蓝溶液稀释后用血球计数板计数。

1.2.3细胞融合：

总脾细胞数与SP2/0按3:1的比例融合，吸取相应的SP2/0细胞与脾细胞混合，400g离心10min，弃上清。

轻拍管底，打散细胞，使用1mL枪缓慢加入1mL PEG(37℃预热)，持续1min，无搅动。加完后用枪头轻轻搅动1min。缓慢加入4mL无血清基础培养基(37℃预热)，轻轻搅动4min。

缓慢加入10mL无血清基础培养基(37℃预热)，37℃静置水浴15min。

缓慢加入30mL无血清基完全培养基(37℃预热)，400g离心7min，弃上清，再加入30mL完全培养基(37℃预热)，400g离心7min，弃上清，确保PEG移除。

使用含HAT的完全培养基重悬细胞，铺种96孔板，每孔200μL体积。

培养板置于37℃、5％CO₂条件下培养。

培养板分别在第4天和第6天进行半换液，第8天进行全换液，第10天进行杂交瘤鉴定及亚克隆。

1.3抗hIgG1-Fc-CH2和hIgG1-Fc-CH3杂交瘤鉴定

1).分装50uL共5×10⁵的CHO-hCD47细胞于1.5mL EP管中。

2).50uL PBS稀释后的hSIRP(1-373)-hIgG1-CH2，hSIRP(1-373)-hIgG1-CH3溶液分别与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

hSIRP(1-373)-hIgG1-CH2含义：hSIRPα蛋白的胞外区1-373位的氨基酸与hIgG1-CH2融合表达的蛋白。

hSIRP(1-373)-hIgG1-CH3含义：hSIRPα蛋白的胞外区1-373位的氨基酸与hIgG1-CH3融合表达的蛋白。

3).离心弃上清，1mL PBS清洗细胞，离心弃上清，取细胞沉淀。

4).取50uL待测杂交瘤上清分别重悬上述细胞沉淀，4℃，静置15min。

5).离心弃上清，1mL PBS清洗细胞，离心弃上清。

6).加入50uL稀释后的Anti-mouseIgG-FITC重悬细胞，4℃，静置15min。

7).离心弃上清，PBS重悬细胞，FACS分析。

结果如图3和图4所示。

图3显示，杂交瘤1C3和3F7为抗hIgG1-CH2阳性细胞，图4显示，杂交瘤1G5和4C6为抗hIgG1-CH3阳性细胞。

分别选择抗hSIRP(1-373)-hIgG1-CH2和hSIRP(1-373)-hIgG1-CH3的阳性杂交瘤进行亚克隆，所得杂交瘤为抗hIgG1-Fc-CH2和hIgG1-Fc-CH3的特异性杂交瘤。

1.4抗体序列获取

1.4.1RNA提取

使用南京诺唯赞生物科技有限公司RNA Isolater Total RNA ExtractionReagent(货号：R401-01)试剂提取抗hIgG1-Fc-CH2和抗hIgG1-Fc-CH3杂交瘤细胞的总RNA，实验步骤参考试剂说明书。

1.4.2反转录

使用Takara公司Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(货号：2641A)试剂分别对抗hIgG1-Fc-CH2杂交瘤和抗hIgG1-Fc-CH3杂交瘤细胞的总RNA进行反转录，实验步骤参考试剂说明书。

1.4.3扩增目的序列

1.4.4测序及序列分析

将两个杂交瘤的PCR产物测序，测序结果如下：

由抗hIgG1-Fc-CH2杂交瘤产生的抗hIgG1-Fc-CH2的单抗命名为mAb1，由抗hIgG1-Fc-CH3杂交瘤细胞产生的抗hIgG1-Fc-CH3的单抗命名为mAb2，对mAb1和mAb2进行序列分析，结果如下。

mAb1抗体的重链可变区的HCDR1(重链可变区的互补性决定区1)、HCDR2(重链可变区的互补性决定区2)和HCDR3(重链可变区的互补性决定区3)的氨基酸序列分别如下：

HCDR1(SEQ ID NO.1)：GFSLTTSGMG；

HCDR2(SEQ ID NO.2)：IYWDDDK；

HCDR3(SEQ ID NO.3)：TWFDHHYGNAMDY。

mAb1抗体的轻链可变区的LCDR1(轻链可变区的互补性决定区1)、LCDR2(轻链可变区的互补性决定区2)和LCDR3(轻链可变区的互补性决定区3)的氨基酸序列分别如下：

LCDR1(SEQ ID NO.4)：ESVDNYGNSF；

LCDR2(SEQ ID NO.5)：RAS；

LCDR3(SEQ ID NO.6)：PQRIADPPT。

mAb1抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)如下：

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLTTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTVSKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCTWFDHHYGNAMDYWGQGTSVTVSS；

mAb1抗体的重链可变区的编码序列(SEQ ID NO.8)如下：

CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGACCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAGTCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGTTTTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTACTTGGTTCGACCATCATTACGGCAACGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。

mAb1抗体的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.9)如下：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLILRASNLNSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCPQRIADPPTFGGGTKLEIK；

mAb1抗体的轻链可变区的编码序列(SEQ ID NO.10)如下：

GACATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGACAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAATTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCCTCCGTGCATCCAACCTAAATTCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCCTCAACGTATTGCGGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA。

mAb2抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如下：

HCDR1(SEQ ID NO.11)：GYTFTNYG；

HCDR2(SEQ ID NO.12)：INTYTGEP；

HCDR3(SEQ ID NO.13)：AGPGGALLGYAMDY。

mAb2抗体的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如下：

LCDR1(SEQ ID NO.14)：QSLVHSNGNTY；

LCDR2(SEQ ID NO.15)：KVS；

LCDR3(SEQ ID NO.16)：TQSSLFPYT。

mAb2抗体重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.17)如下：

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYT GEPTYADDFKGRFAFSLETSASTASLEINNLKNEDMATYFCAGPGGALLGYAMDYWGQG TSVTVSS；

mAb2抗体重链可变区的编码序列(SEQ ID NO.18)如下：

CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTCTTTGGAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACATGGCAACATATTTCTGTGCAGGACCCGGGGGGGCCCTACTGGGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG。

mAb2抗体轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.19)如下：

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCTQSSLFPYTFGGGTKLEIK；

mAb2抗体轻链可变区的编码序列(SEQ ID NO.20)如下：

GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCACTCAAAGTTCACTTTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAC。

1.4.5抗体表达载体构建

将获得的轻重链序列通过无缝连接的方式分别克隆至相应的表达载体上，轻链V区基因均克隆到经NheⅠ和XhoⅠ线性化的pCAG-mIgK-LC载体(结构参考图1)上，轻链V区基因与载体上的轻链恒定区无缝连接形成完整轻链；重链V区基因均克隆到经XhoⅠ和NheⅠ线性化的pCAG-mIgG1-HC载体(结构参考图2)上，重链V区基因与载体上重链恒定区无缝连接形成完整重链。

1.4.6序列验证

分别将mAb1和mAb2轻重链表达载体共转293T细胞，收集上清验证抗体活性，FACS检测步骤同1.3。

2抗体表达及纯化

分别将mAb1和mAb2轻重链表达质粒转染真核细胞，通过ProteinA/G纯化获得大量抗体。

3抗体标记

对mAb1和mAb2抗体进行FITC荧光素标记。

4抗体组合

将mAb1-FITC和mAb2-FITC通过合适比例配制混合成新型多抗试剂，此组合抗体命名为mAb1/2-FITC。

5验证实验

实验一：mAb1-FITC和mAb2-FITC分别检测hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc均得出阳性信号。

hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc含义：hSIRPα蛋白的胞外区1-373位的氨基酸与hIgG1-Fc融合表达的蛋白。

步骤如下：

1).分装50uL共5×10⁵的CHO-hCD47细胞于1.5mL EP管中。

2).50uL PBS稀释后的hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc溶液与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3).离心弃上清，1mL PBS清洗细胞，离心弃上清。

4).取50uL稀释的mAb1-FITC和mAb2-FITC溶液分别重悬上述细胞沉淀，4℃，静置15minn。

5).离心弃上清，PBS重悬细胞，FACS分析。

结果见图5，图5显示：mAb1-FITC和mAb2-FITC均能结合hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc，表明mAb1-FITC和mAb2-FITC均能识别hIgG1-Fc部分，即表明两种单抗均能识别正常型的hIgG1-Fc。

实验二：mAb1-FITC和mAb2-FITC分别检测突变后的hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc-Δ，其中一种为阳性结果，另一种则为阴性结果。hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc-Δ含义：hSIRPα蛋白的胞外区1-373位的氨基酸与突变的hIgG1-Fc-Δ融合表达的蛋白。突变的位置在hIgG1-Fc-CH3位置，CH3位置缺失的氨基酸序列为SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

步骤如下：

1).分装50uL共5×10⁵的CHO-hCD47细胞于1.5mL EP管中。

2).50uL PBS稀释后的hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc-Δ溶液与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3).离心弃上清，1mL PBS清洗细胞，离心弃上清。

5).离心弃上清，PBS重悬细胞，FACS分析。

结果见图6，图6显示：mAb1-FITC可以结合hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc-Δ，表明hIgG1-Fc-CH3位置的突变不影响mAb1-FITC与hIgG1-Fc-CH2位置的结合；mAb2-FITC不结合hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc-Δ，表明mAb2识别hIgG1-Fc-CH3的表位位于突变位置，即表明hIgG1-Fc的突变会影响某一单抗与其识别。

实验三：组合后抗体mAb1/2-FITC检测突变后的hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc-Δ得出阳性信号。

步骤如下：

1).分装50uL共5×10⁵的CHO-hCD47细胞于1.5mL EP管中。

3).离心弃上清，1mL PBS清洗细胞，离心弃上清。

4).取50uL稀释的mAb1/2-FITC溶液分别重悬上述细胞沉淀，4℃，静置15minn。

5).离心弃上清，PBS重悬细胞，FACS分析。

结果见图7，图7结果显示：mAb1和mAb2组合后的新型抗体对hSIRP(1-373)-hIgG1-Fc-Δ具有较好的检出效果，表明新型抗体对hIgG1-Fc突变体具有较好的检出效果。

结果显示本发明的新型抗体组合避免了由于被检测物质出现某抗原表位改变而导致的假阴性结果，从而保证了实验的成功率及准确性。

鉴定人IgG类抗体实验中，由于Fc段为介导抗体功能的位置，特定的实验需要进行特定的突变来到达改变抗体功能的目的，由此带来抗原表位的改变，可能导致原本能够结合人IgG的二抗失去了结合能力，亦或是不同个体间单核苷酸多态性的差异，导致二抗检测响应的差异，应用本发明的新型抗体组合有效的避免了检测无响应的结果，例如：突变发生在CH3上，则抗人IgGFc-CH2的抗体不受影响，若突变发生在CH2上，则抗人IgGFc-CH3的抗体结合不受影响，从而保证了实验的成功率及准确性，不会产生假阴性。

实施例2

一种新型的抗小鼠IgG抗体试剂

1.兔抗小鼠IgG多克隆抗体制备。

1.1抗原免疫

1.1.1抗原乳化：

取小鼠IgG溶液与等体积的弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂乳化至乳浊液。

1.1.2抗原免疫：

初次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，第二次，第三次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，每次200μg，共免疫3次，初免与二免间隔2周，二免与三免间隔至3周。

1.2血清采集

三免后第7天，采用颈动脉放血，全血37℃烘箱放置2h，转移至4℃静置过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟，收集血清，-20℃保存。

1.3血清抗体纯化

通过ProteinA/G纯化获得血清抗体。

1.4抗体标记

对纯化后的多克隆抗体进行FITC荧光素标记，标记后的多克隆抗体命名为Rabbitanti-mouseIgG FITC(pAb)。

1.5.抗体检测：

1)分装50μL共5×10⁵的CHO-hCD40细胞于1.5mL EP管中。

2)取50μLPBS稀释好的不同亚型的小鼠抗hCD40单抗与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3)离心弃上清，1mL PBS清洗细胞，离心弃上清。

4)取50μL PBS稀释好的Rabbit anti-mouseIgG FITC(pAb)重悬细胞，4℃，静置15min。

5)离心弃上清，PBS重悬细胞，FACS分析。

1.6检测结果见图8。

图8结果表明Rabbit anti-mouseIgG FITC(pAb)对小鼠不同亚型的检出结果存在差异，对mouseIgG3检出的信号最弱。

本实验中使用的Rabbit anti-mouseIgG FITC(pAb)为抗MouseIgG免疫球蛋白的多抗试剂，由于Rabbit anti-mouseIgG FITC(pAb)是经由血清IgG抗原免疫动物制备的抗体，而血清中IgG各亚型含量差异较大，所以以血清IgG为抗原免疫动物制备的多抗试剂中针对不同MouseIgG亚型的抗体存在差异。

由上述结果得出此Rabbit anti-mouseIgG FITC(pAb)检测小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3的检出效果存在差异，是由于此Rabbit anti-mouseIgG FITC(pAb)抗体试剂制备过程中抗原固有的IgG成分差异造成的。

2.兔抗小鼠IgG各亚型多克隆抗体制备。

2.1抗原免疫

2.1.1抗原乳化：

分别取小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3溶液与等体积的弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂乳化至乳浊液。

2.1.2抗原免疫：

同1.1.2。

2.2血清采集

同1.2。

2.3血清抗体纯化

同1.3。

2.4抗体标记

同1.4。四种多克隆抗体分别命名为：Rabbit anti-mouseIgG1 FITC(pAb)，Rabbitanti-mouseIgG2a FITC(pAb)，Rabbit anti-mouseIgG2b FITC(pAb)和Rabbit anti-mouseIgG3FITC(pAb)。

2.5.抗体检测：

1)分装50μL共5×10⁵的CHO-hCD40细胞于1.5mL EP管中。

2)取50μL浓度为10μg/mL的Mouse Anti-hCD40不同亚型的单抗与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3)离心弃上清，1mL PBS清洗细胞，离心弃上清。

4)分别取50μL稀释好的Rabbit anti-mouseIgG1 FITC(pAb)，Rabbit anti-mouseIgG2a FITC(pAb)，Rabbit anti-mouseIgG2b FITC(pAb)和Rabbit anti-mouseIgG3FITC(pAb)。重悬细胞，4℃，静置15min。

5)离心弃上清，PBS重悬细胞，FACS分析。

2.6检测结果见图9。

图9结果表明四种二抗针对各自的抗原均有较好的检出信号。

本实验中使用的四种二抗为针对小鼠IgG各亚型的特异性多抗试剂，由于各抗体是经由各亚型IgG为抗原免疫动物制备的抗体，即制备的多抗试剂对小鼠IgG各亚型均具有较好的检出效果。

3.新型兔抗小鼠IgG FITC抗体制备：

3.1New pAb配制

将Rabbit anti-mouseIgG1 FITC(pAb)，Rabbit anti-mouseIgG2a FITC(pAb)，Rabbit anti-mouseIgG2b FITC(pAb)和Rabbit anti-mouseIgG3 FITC(pAb)按合适比例调配成新型抗体组合，此抗体组合命名为Rabbit anti-mouseIgG FITC(New pAb)。

3.2.抗体检测：

1)分装50μL共5×10⁵的CHO-hCD40细胞于1.5mL EP管中。

2)取50μL经PBS稀释好的不同亚型的小鼠抗hCD40单抗与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3)离心弃上清，1mL PBS清洗细胞，离心弃上清。

4)取50μL Rabbit anti-mouseIgG FITC(New pAb)重悬细胞，4℃，静置15min。

5)离心弃上清，PBS重悬细胞，FACS分析。

3.3检测结果见图10。

图10结果表明，新型试剂Rabbit anti-mouseIgG FITC(New pAb)对4种小鼠IgG亚型均具有较好的检出效果。

本实验中使用的Rabbit anti-mouseIgG FITC(New pAb)多抗试剂是将抗MouseIgG各亚型的多抗试剂经过一定比例配制而成，根据上述实验结果可以看出此多抗试剂对各亚型均具有较好的检出效果且各亚型信号强度一致性较好，避免了上述1.6中检测结果中各信号强度存在较明显差异的情况。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 程晓东,杭州来伯生物技术有限公司

<120> 一种新型的抗体组合物、分离的核酸和制备方法

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly Met Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Thr Trp Phe Asp His His Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Asn Ser Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Arg Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Pro Gln Arg Ile Ala Asp Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Thr Trp Phe Asp His His Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgacc acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120

cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180

tataacccaa ccctgaagag ccggctcaca gtctccaagg atacctccag caaccaggtt 240

ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tacttggttc 300

gaccatcatt acggcaacgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Leu Arg Ala Ser Asn Leu Asn Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Pro Gln Arg Ile

85 90 95

Ala Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctaggaca gagggccacc 60

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat aattatggca atagttttat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcctcc gtgcatccaa cctaaattct 180

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240

cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcctc aacgtattgc ggatcctccg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro

1 5

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Ala Gly Pro Gly Gly Ala Leu Leu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Lys Val Ser

1

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Thr Gln Ser Ser Leu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Ser

65 70 75 80

Leu Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Gly Pro Gly Gly Ala Leu Leu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 364

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctct 240

ttggagatca acaacctcaa aaatgaggac atggcaacat atttctgtgc aggacccggg 300

ggggccctac tgggctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tcag 364

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Thr Gln Ser

85 90 95

Ser Leu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 337

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgca ctcaaagttc actttttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaac 337

Claims

1.一种抗体组合物，其特征在于，其包括：

多种抗体；在所述多种抗体中，任意两种抗体具有不同的可变区和相同的恒定区，或任意两种抗体具有不同的可变区和不同的恒定区；不同的抗体结合不同的抗原表位；

所述多种抗体包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；所述第一抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基序列分别如SEQ ID NO.4-6所示；所述第二抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基序列分别如SEQ ID NO.11-13所示；所述第二抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基序列分别如SEQ ID NO.14-16所示。

2.根据权利要求1所述的抗体组合物，其特征在于，所述第一抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求2所述的抗体组合物，其特征在于，所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体组合物，其特征在于，所述多种抗体中的每种抗体标记有标记物或均不带有标记物。

5.根据权利要求4所述的抗体组合物，其特征在于，所述标记物选自荧光标记物、酶标记物和放射性核素标记物。

6.根据权利要求5所述的抗体组合物，其特征在于，所述荧光标记物选自Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、5-羧基-2’,4’,5’,7’-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6- 羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT、四甲基罗丹明和德克萨斯红。

7.根据权利要求6所述的抗体组合物，其特征在于，所述酶标记物选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。

8.根据权利要求6所述的抗体组合物，其特征在于，所述放射性核素标记物选自¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr。

9.一种分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1-8任一项所述的抗体组合物中的任意一种抗体。

10.一种载体，其特征在于，其含有权利要求9所述的分离的核酸。

11.一种重组细胞或重组菌，其特征在于，含有权利要求10所述的载体。

12.一种制备如权利要求1-8任一项所述的抗体组合物的方法，其特征在于，其包括：分别培养权利要求11所述的重组细胞或重组菌；

其中，所述重组细胞或重组菌可分别表达出多种不同的抗体，在该多种抗体中，任意两种抗体具有不同的可变区，任意两种抗体具有相同的恒定区，不同的抗体结合不同的抗原表位。

13.一种检测试剂，其特征在于，其含有权利要求1-8任一项所述的抗体组合物。