CN114685671A - 特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114685671A
CN114685671A CN202011611099.0A CN202011611099A CN114685671A CN 114685671 A CN114685671 A CN 114685671A CN 202011611099 A CN202011611099 A CN 202011611099A CN 114685671 A CN114685671 A CN 114685671A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
dna polymerase
taq dna
variable region
chain variable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011611099.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114685671B (zh
Inventor
高重亮
陈茁
谢庆庆
郑越
董宇亮
章文蔚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Priority to CN202011611099.0A priority Critical patent/CN114685671B/zh
Publication of CN114685671A publication Critical patent/CN114685671A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114685671B publication Critical patent/CN114685671B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种抗体领域，更具体地涉及一种特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用。本发明的单克隆抗体通过特异性结合Taq DNA聚合酶而中和其外切和/或聚合活性，并且在热激活条件下释放结合的Taq DNA聚合酶，从而使其外切和/或聚合活性得到恢复。

Description

特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体领域。更具体地，本发明涉及特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用。
背景技术
Taq DNA聚合酶参与的PCR技术广泛应用于生化试验和体外诊断行业中。Taq酶是一个高温酶，该酶在常温下仍具有一定的活性。因此，在PCR预变性前，Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性能够引起引物、探针或模板的降解，而其聚合活性在PCR预变性前阶段可引起模板或引物错配而产生非特异性的扩增；在后续PCR循环过程中非特异性产物能进一步放大，造成目的产物产量降低，甚至扩增不出来目的条带。
热启动的方法可以有效地解决上述问题，即在PCR预变性前阶段可逆地使Taq DNA聚合酶失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，使其恢复5’-3’外切活性和聚合活性。
目前常用的热启动方法有抗体法、化学修饰法、适体法等。其中，化学修饰法较为常用，活性封闭较为完全、不会引入外源污染，但是其活性较难完全激活，需要高温孵育较长时间。而适体法活性又较难彻底封闭，温度往往升高到45℃以上即可恢复活性，很难达到严格的热启动。和上述两种方法相比，抗体法具有一定的优势：Taq DNA聚合酶抗体能够在常温下完全抑制Taq DNA聚合酶活性，随着温度的升高，活性在60℃以上才慢慢释放，95℃热激3-5分钟，可完全释放Taq DNA聚合酶活性。
因此，本领域亟需一种能够直接用于制备热启动Taq DNA聚合酶的抗体，该抗体在常温下能够完全抑制Taq DNA聚合酶的聚合活性和外切活性。
发明内容
如上所述，本领域亟需能够在常温下能够完全抑制Taq DNA聚合酶活性的热启动Taq DNA聚合酶。为此，本发明提供了一种能够特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体，由此完成了本发明。
因此，在第一方面，本发明提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合Taq DNA聚合酶，所述单克隆抗体包含：
a)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:18所示的VL CDR3，
b)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:20所示的VL CDR3，
c)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:19所示的VL CDR3，或
d)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO:5所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:20所示的VL CDR3。
在本发明第二方面，提供了一种杂交瘤细胞，其产生本发明第一方面的单克隆抗体。
在本发明第三方面，提供了一种编码权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括：
a)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:18所示的VL CDR3的核苷酸序列，
b)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:20所示的VL CDR3的核苷酸序列，
c)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、以及SEQ IDNO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQID NO:19所示的VL CDR3的核苷酸序列，或
d)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、以及SEQ IDNO:5所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQID NO:20所示的VL CDR3的核苷酸序列。
在本发明第四方面，提供了一种热启动Taq DNA聚合酶，包括本发明第一方面的单克隆抗体和Taq DNA聚合酶。
在本发明第五方面，提供了一种制备本发明第四方面的热启动Taq DNA聚合酶的方法，包括将本发明第一方面的单克隆抗体与Taq DNA聚合酶在一起孵育。
在本发明第六方面，提供了一种通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增DNA片段的方法，所述方法包括采用本发明第四方面的热启动Taq DNA聚合酶来扩增DNA片段。
在常温下，本发明的单克隆抗体可以特异性地结合Taq DNA聚合酶，由此有效地中和Taq DNA聚合酶的聚合和/或外切活性；而在升高的温度下，例如在60℃以上时，所述单克隆抗体与Taq DNA聚合酶解聚，释放出Taq DNA聚合酶，从而使Taq DNA聚合酶发挥其原本的聚合和/或外切活性。因此，本发明的单克隆抗体可以用于制备用于聚合酶(PCR)链式反应中的热启动Taq DNA聚合酶，并且可以用于各种PCR反应中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所涉及的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1是示出荧光探针法的原理的示意图；
图2是示出筛选具有中和活性的抗体的流程的示意图；
图3示出通过荧光探针法检测的免疫后血清的中和活性的结果；
图4示出通过荧光探针法检测的第一轮亚克隆细胞分泌的抗体的中和活性(第一步筛选)的结果，其中抗体与Taq DNA聚合酶按照质量2:1的比例混合，在37℃孵育30分钟后制成热启动Taq DNA聚合酶，阳性对照(PC)为不加抗体的反应体系，而阴性对照(NC)为不加Taq DNA聚合酶的反应体系；
图5示出对具有中和活性的抗体进行复筛(第二步筛选)的结果，其中，抗体与TaqDNA聚合酶按照质量2:1的比例混合，在37℃孵育30分钟后制成热启动Taq DNA聚合酶，将所述热启动Taq DNA聚合酶进行热激活(95℃，5min)，由此制得热激活/热启动Taq DNA聚合酶。将未经热激活的Taq DNA聚合酶和热激活Taq DNA聚合酶用于荧光探针法，比较热激活前后荧光信号变化，进而确定抗体对Taq DNA聚合酶的封闭效果和激活后活性的恢复情况；图中前20min的反应温度为50℃，后20min的反应温度为60℃；
图6示出对第二轮亚克隆细胞株(优势杂交瘤)所分泌的抗体的中和活性的检测结果，同样是采用荧光探针法以及未经热激活的Taq DNA聚合酶和热激活Taq DNA聚合酶，其中在50℃先反应20min，然后在60℃再反应20min。
图7示出本发明抗体对Taq DNA聚合酶突变体活性的中和活性的检测结果，同样是采用荧光探针法以及未经热激活的Taq DNA聚合酶和热激活Taq DNA聚合酶，其中在50℃先反应20min，然后在60℃再反应20min。
具体实施方式
下面将对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
如上所述，本发明旨在提供一种能够特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体，从而制备热启动型Taq DNA聚合酶，用于PCR聚合反应中。
本发明人用Taq DNA聚合酶作为抗原多次免疫小鼠，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法以及荧光探针法与M13法筛选出具有高亲和力和中和活性的小鼠，并将该小鼠的脾细胞用于细胞融合制备杂交瘤细胞，进一步挑选出具有亲和活性和中和活性的优势杂交瘤细胞克隆，由此完成了本发明。
因此，在本发明第一方面，提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合Taq DNA聚合酶，所述单克隆抗体包含：
a)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:18所示的VL CDR3，
b)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:20所示的VL CDR3，
c)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:19所示的VL CDR3，或
d)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO:5所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:20所示的VL CDR3。
正如本领域技术人员常规使用的那样，在本文中，“VH”表示抗体的重链可变区(variable region of heavy chain)，“VL”表示抗体的轻链可变区(variable region oflight chain)，“CDR”表示抗体上的互补决定区(complementarity-determining region)，也即所谓的“高变区”。在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)上各包含三个CDR，分别为CDR1、CDR2和CDR3。因此，可以理解，“VH CDR1”表示抗体重链可变区(VH)上的CDR1，以此类推。
SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:20所示序列示于下表1：
表1.重链和轻链互补决定区(VH CDR和VL CDR)的序列
序列编号 序列 备注
SEQ ID NO:1 ASGFTFSNY VH CDR1
SEQ ID NO:2 DDSKSS VH CDR2
SEQ ID NO:3 VDSKSS VH CDR2
SEQ ID NO:4 YGNYVWYFDV VH CDR3
SEQ ID NO:5 YGNYVWYFDG VH CDR3
SEQ ID NO:14 SASSSVSYMYW VL CDR1
SEQ ID NO:15 ASKSVSTSGYS VL CDR1
SEQ ID NO:16 LTSNLAS VL CDR2
SEQ ID NO:17 GSGTD VL CDR2
SEQ ID NO:18 QQWSSYVFT VL CDR3
SEQ ID NO:19 IDELTRSE VL CDR3
SEQ ID NO:20 IRELTRS VL CDR3
在一个实施方案中，所述所述单克隆抗体包括：
a)SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:21所示的轻链可变区，
b)SEQ ID NO:7所示的重链可变区和SEQ ID NO:22所示的轻链可变区，
c)SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:23所示的轻链可变区，或
SEQ ID NO:9所示的重链可变区和SEQ ID NO:24所示的轻链可变区。
其中，SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:9所示的重链可变区如下所示：
SEQ ID NO:6：
EVKLVESGGGLVQAGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRVKSNNYGTHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRYGNYVWYFDVWGAG
SEQ ID NO:7：
AGGVLVQAGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRVKSNNYGTHYAESVKGRFTISRD DSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRYGNYVWYFDVWGAGTTVTVFSAKTTPPSDYPLA
SEQ ID NO:8：
EVKLVESGAGLVQAGGSMKLSCRASGFTFSNYWMNWVRQSPEFGLEWVAEIRVKSNNYGTHYAESVKGRFTISRVDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCDRYGNYVWYFDVWGAG
SEQ ID NO:9：
EVKLVESGAGLVQAGGSMKLSDVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAERRVKSNNYGTHYAESVKGRFTSSRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRYGNYVWYFDGWGAG
以上每条序列中的下划线部分从左到右分别表示VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:24所示的轻链可变区如下所示：
SEQ ID NO:21：
DIVMTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSYVFTFGSGTKLEIKRADAAPTVS
SEQ ID NO:22：
DIVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK
SEQ ID NO:23：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPAAFSGGGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIDELTRSEGGPSWK
SEQ ID NO:24：
DIVLTQSPFSLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQHIRELTRSEGGPSWK
以上每条序列中的下划线部分从左到右分别表示VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
本发明的单克隆抗体，除了特异性结合野生型Taq DNA聚合酶外，还能够特异性地结合突变型Taq DNA聚合酶。
因此，在一个实施方案中，所述Taq DNA聚合酶为野生型或突变型Taq DNA聚合酶。
在本发明中，野生型Taq DNA聚合酶可以指来源于栖热水生菌(ThermusAquaticus)的Taq DNA聚合酶，例如氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的Taq DNA聚合酶。但是可以理解，本发明的野生型Taq DNA聚合酶也可以来源于其他生物体，只要它具有外切活性和聚合活性即可。
SEQ ID NO:29:
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
另外，本领域技术人员可以理解，除了野生型Taq DNA聚合酶外，突变型Taq DNA聚合酶也是适用的。所谓“突变型Taq DNA聚合酶”是指与野生型Taq DNA聚合酶具有至少90％序列同一性且保持聚合活性和外切活性的Taq DNA聚合酶。例如，所述突变型Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶例如SEQ ID NO:29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的同一性。
在一个具体实施方案中，本发明的突变型Taq DNA聚合酶具有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:30：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALQEDGDTVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTKKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
一方面，在50℃以下的较低温度下，本发明的单克隆抗体可以特异性结合Taq DNA聚合酶的聚合活性区域和/或外切活性区域，由此中和其聚合活性和/或外切活性，从而几乎能够完全地抑制Taq DNA聚合酶活性。另一方面，在60℃以上的较高温度下，本发明的单克隆抗体与Taq DNA聚合酶的结合会会减弱，因此Taq DNA聚合酶活性会缓慢释放，并且在95℃热激活3-5分钟时，Taq DNA聚合酶活性可以被完全释放。因此，本发明的单克隆抗体可以用于制备热启动Taq DNA聚合酶，并进一步用于PCR反应中扩增DNA片段。
在本发明第二方面，提供了一种杂交瘤细胞，其产生本发明第一方面的单克隆抗体。
在本发明的杂交瘤细胞的制备方法如下：首先，用Taq DNA聚合酶免疫小鼠，并筛选血清效价和中和活性满足要求的小鼠。然后，将筛选得到的符合要求的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞如SP2/0Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合，经有效稀释、克隆化、HAT筛选、免疫原检测等，筛选出能够产生可中和Taq DNA聚合酶活性的杂交瘤细胞。
当然，除了本发明特别适用的骨髓瘤细胞SP2/0Ag14骨髓瘤细胞外，任何其他可用于制备杂交瘤细胞的骨髓瘤细胞均可使用，并且都在本发明范围内。
在本发明第三方面，提供了一种编码本发明第一方面的单克隆抗体的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括：
a)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:18所示的VL CDR3的核苷酸序列，
b)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:20所示的VL CDR3的核苷酸序列，
c)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、以及SEQ IDNO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQID NO:19所示的VL CDR3的核苷酸序列，或
d)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、以及SEQ IDNO:5所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQID NO:20所示的VL CDR3的核苷酸序列。
在一个进一步的实施方案中，所述多核苷酸序列包括：
a)编码SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:21所示的轻链可变区的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:7所示的重链可变区和SEQ ID NO:22所示的轻链可变区的核苷酸序列；
c)编码SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:23所示的轻链可变区的核苷酸序列；或
d)SEQ ID NO:9所示的重链可变区和SEQ ID NO:24所示的轻链可变区的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，所述多核苷酸序列包括：
a)SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其简并序列和SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列或其简并序列；
b)SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其简并序列和SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列或其简并序列；
c)SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或其简并序列和SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列或其简并序列；或者
d)SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列或其简并序列和SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列或其简并序列。
其中，SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:13分别编码SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:9所示的抗体重链可变区(VH)，SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:28分别编码SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:24所示的抗体轻链可变区(VL)。这些序列的具体核苷酸序列分别如下：
SEQ ID NO:10：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGGCCGGCGGCAGCATGAAGCTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGAGATCAGGGTGAAGAGCAACAACTACGGCACCCACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAGCAGCGTGTACCTGCAGATGAACAACCTGAGGGCCGAGGACACCGGCATCTACTACTGCACCAGGTACGGCAACTACGTGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGC
SEQ ID NO:11：
GCCGGCGGCGTGCTGGTGCAGGCCGGCGGCAGCATGAAGCTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGAGATCAGGGTGAAGAGCAACAACTACGGCACCCACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAGCAGCGTGTACCTGCAGATGAACAACCTGAGGGCCGAGGACACCGGCATCTACTACTGCACCAGGTACGGCAACTACGTGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGTTCAGCGCCAAGACCACCCCCCCCAGCGACTACCCCCTGGCC
SEQ ID NO:12：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGCGCCGGCCTGGTGCAGGCCGGCGGCAGCATGAAGCTGAGCTGCAGGGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGAGTTCGGCCTGGAGTGGGTGGCCGAGATCAGGGTGAAGAGCAACAACTACGGCACCCACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGTGGACAGCAAGAGCAGCGTGTACCTGCAGATGAACAACCTGAGGGCCGAGGACACCGGCATCTACTACTGCGACAGGTACGGCAACTACGTGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGC
SEQ ID NO:13：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGCGCCGGCCTGGTGCAGGCCGGCGGCAGCATGAAGCTGAGCGACGTGGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGAGAGGAGGGTGAAGAGCAACAACTACGGCACCCACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCAGCAGCAGGGACGACAGCAAGAGCAGCGTGTACCTGCAGATGAACAACCTGAGGGCCGAGGACACCGGCATCTACTACTGCACCAGGTACGGCAACTACGTGTGGTACTTCGACGGCTGGGGCGCCGGC
SEQ ID NO:25：
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGCCCTGATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCAGGAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACCTGACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCTACGTGTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGGGCCGACGCCGCCCCCACCGTGAGC
SEQ ID NO:26：
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCAGCTACAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCACCAGCGGCTACAGCTACATGCACTGGAACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAGGCTGCTGATCTACCTGGTGAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCACATCAGGGAGCTGACCAGGAGCGAGGGCGGCCCCAGCTGGAAG
SEQ ID NO:27：
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCAGCTACAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCACCAGCGGCTACAGCTACATGCACTGGAACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAGGCTGCTGATCTACCTGGTGAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCGCCTTCAGCGGCGGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCACATCGACGAGCTGACCAGGAGCGAGGGCGGCCCCAGCTGGAAG
SEQ ID NO:28：
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCTTCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCAGCTACAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCACCAGCGGCTACAGCTACATGCACTGGAACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAGGCTGCTGATCTACCTGGTGAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGCCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCACCTACTTCTGCCAGCACATCAGGGAGCTGACCAGGAGCGAGGGCGGCCCCAGCTGGAAG
需要说明的是，由于密码子简并性原则，编译重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的核苷酸序列并不是唯一恒定的序列。任何可以编码相同重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的核苷酸序列都是本专利范围内的核酸序列。
在本发明第四方面，提供了一种热启动Taq DNA聚合酶，包括本发明第一方面的单克隆抗体和Taq DNA聚合酶。
在本文中，术语“热启动”与“热激活”和“热激”可以互换使用，并且具有本领域通常理解的含义，是指DNA聚合酶在样品温度至少超过一定温度例如70℃时才发挥其聚合和外切酶活性的作用的现象。
在一个实施方案中，所述单克隆抗体与Taq DNA聚合酶的质量比可以为1:(1-3)。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体与Taq DNA聚合酶的质量比为1:2。
在一个实施方案中，所述Taq DNA聚合酶为野生型或突变型Taq DNA聚合酶。在一个示例性实施方案中，所述Taq DNA聚合酶为来源于栖热水生菌(Thermus Aquaticus)的氨基酸序列为SEQ ID NO:29所示的野生型Taq DNA聚合酶或氨基酸序列为SEQ ID NO:30所示的突变型Taq DNA聚合酶。
如上所述，本发明的热启动Taq DNA聚合酶在不同的温度下有不同的表现，具体地，在低温下例如在50℃以下没有聚合和/或外切活性，而在较高温度例如60℃以上时活性逐渐增加，并且可以在95℃被有效激活。因此，本发明的热启动Taq DNA聚合酶可以用于聚合酶链式(PCR)反应中。
在本发明第五方面，提供了一种制备本发明第四方面的热启动Taq DNA聚合酶的方法，包括将本发明第一方面的单克隆抗体与Taq DNA聚合酶一起孵育。
在一个实施方案中，将所述单克隆抗体与所述Taq DNA聚合酶在37℃孵育20-40分钟，优选30分钟。
在本发明第六方面，提供了一种通过聚合酶链式反应来扩增DNA片段的方法，所述方法包括采用本发明第四方面的热启动Taq DNA聚合酶来扩增DNA片段的步骤。
通过采用本发明的热启动Taq DNA聚合酶，可以显著提升PCR检测的灵敏度。
下面将提供实施例以更好地理解本发明。但是应该理解，本发明并不限于以下具体实施例；在不偏离本发明精神和主旨的情况下，可以对本发明进行一些修改和改进但仍然在本发明的范围内。
另外，下述实施例中所采用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例
实施例1高亲和活性和中和活性小鼠的选取
以Taq DNA聚合酶为抗原，对小鼠进行三次免疫，检测免疫后小鼠血清效价。具体地，采用来源于栖热水生菌(Thermus Aquaticus)的重组Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO:29，纯度90％以上，蛋白储存于1×PBS缓冲液中)作为抗原，选用5只BALB/c小鼠以常规方式进行免疫实验，免疫实验进行三次。
免疫结束后进行小鼠血清效价ELISA检测以确认免疫后所产生抗体的亲和活性。在ELISA检测中，使用免疫原蛋白即重组Taq DNA聚合酶包被，至少有1只动物血清效价达到1:128000。ELISA检测的步骤如下：(1)以Taq DNA聚合酶作为抗原，将其稀释至合适浓度(0.5-10μg/ml)，按100μL每孔加入酶标板孔内，4℃包被过夜。次日，加入200μL PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加入200μL PBS震荡洗涤10min，洗涤3次。(2)加入200μL封闭液(1％BSA-PBS)，37℃封闭1-2h。之后，加入200μL PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加入200μLPBS震荡洗涤10min，洗涤3次。(3)加入稀释后小鼠血清100μL，37℃孵育2h。加入200μL PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加入200μL PBS震荡洗涤10min，洗涤3次。(4)加入新鲜稀释的羊抗鼠抗体(Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP)(产品号ab97023)，购自Abcam)抗体100μL，37℃孵育1h。加入200μL PBST震荡洗涤10min，洗涤3次，再加入200μL PBS震荡洗涤10min，洗涤3次。(5)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物，室温避光反应10min。(6)加入50μL终止液(0.1mol/L硫酸)，于酶标仪上测量450nm的吸光度。
同时，采用荧光探针法检测含有抗体的血清对Taq DNA聚合酶的中和活性。荧光探针法的原理如图1所示：当Taq DNA聚合酶活性被抑制时，荧光探针处于淬灭状态；当TaqDNA聚合酶活性不被抑制时，Taq DNA聚合酶能够延伸并降解掉延伸方向下游遇到的DNA链(探针链)，使得发光基团和淬灭基团分离，产生荧光信号。荧光信号产生的速率可以反映Taq DNA聚合酶活性抑制程度的高低。
荧光探针法包括以下步骤：
取2μL 0.2mg/ml的野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO:29)与6μL血清混合，37℃孵育30min，然后加入9.4μL PBS缓冲液，混合均匀，所得混合液即为0.23mg/ml的Taq DNA聚合酶-血清混合液，置于冰上备用。
荧光探针法的反应体系为：2μL Taq DNA聚合酶-血清混合液、4μL 5×反应缓冲液(50mM Tris-HCl,250mM KCl,7.5mM MgCl2，pH8.3)、11.8μL nuclease-free水、2μL荧光探针底物。
荧光探针底物的制备方法如下：将以下三种单链DNA片段等比例混合后退火，退火方法为90℃以0.5℃/min逐渐降温到30℃，由此制备获得荧光探针底物：
5'-Dabcyl-GCATCTGCTCGAGTCACGCGCTATGGCGATGCTTGATAGTGATGCTGTGTACAGAAAG、CCATAGCGCGTGACTCGAGCAGATGC-FAM-3'、CTTTCTGTACACAGCATCACTATCAAGCATCG。
在本荧光探针法检测体系中，阳性对照(PC)为不含抗体的上述反应体系，阴性对照(NC)为不含酶的上述反应体系。反应在qPCR仪上进行，反应条件为：先在50℃进行20min，然后在60℃进行20min。在此期间持续收集荧光信号。若血清中含有中和活性较好的抗体，则会抑制荧光信号的释放；否则，荧光信号变化速率和未加抗体的阳性对照(PC)一致。
此外，还采用M13方法来进行具有中和活性的抗体的筛选。具体地，通过7条M13引物和M13预退火得到M13-7P底物，测试抗体对Taq DNA聚合酶的聚合活性(即合成dsDNA的能力，新合成的dsDNA可以通过Qubit试剂盒进行检测)的抑制能力。
预退火M13底物制备方法如下：所用M13为M13mp18Single-stranded DNA(购自NEB)，相应的M13退火引物序列如下表2所示。将单链M13和所示7种引物通过梯度降温的方式进行退火，获得预退火的M13-7p底物：
表2 M13引物的碱基序列
引物名称 碱基序列(5'至3')
M13引物1 CAAAGCGAACCAGACCGGAAGCAAACTCCAACA
M13引物2 AGACAGCATCGGAACGAGGGTAGCAACGGCT
M13引物3 GAACCAGAGCCACCACCGGAACCGCCTC
M13引物4 AGCGAACCTCCCGACTTGCGGGAGG
M13引物5 ACCTTTTACATCGGGAGAAACAATAACGGATTCGCCTGATTGC
M13引物6 GCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGT
M13引物7 AGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
M13-7P法的反应体系为：2μL Taq酶-血清预混液，4μL 5×反应缓冲液(50mMTris-HCl,250mM KCl,7.5mM MgCl2，pH8.3)，2μL M13-7P底物，12μL nuclease-free水。阳性对照(PC)为不含抗体的上述反应体系，阴性对照(NC)为不含有Taq酶的反应体系。反应条件为在72℃孵育10min，然后加入1μL 0.5M EDTA终止反应。通过QubitTM dsDNA HS AssayKit检测合成的双链DNA来确定抗体对Taq DNA聚合酶活性的抑制能力。
结果：
ELISA的结果如表3所示：
表3.五只小鼠经三次免疫后的血清效价
Figure BDA0002872927890000151
Figure BDA0002872927890000161
从上表中可以看出，通过采用Taq DNA聚合酶来免疫小鼠，在全部小鼠中均产生了针对该Taq DNA聚合酶的抗体。
针对小鼠血清进行的荧光探针法的结果示于图3。反应先在50℃进行了20分钟，然后在60℃进行了20分钟。与阳性(Taq DNA聚合酶)对照(PC)相比，含有血清孵育过的TaqDNA聚合酶的反应体系的反应荧光信号变化均得到显著抑制。并且，结果显示，5只小鼠血清中含有的抗体均能有效抑制Taq DNA聚合酶的活性。
M13-7P底物法的结果示于表4。
表4.M13-7P底物法检测免疫后血清中和活性
Figure BDA0002872927890000171
由上表4所示的结果可知，与通过荧光探针法获得的结果一致，小鼠A-E血清均能够有效地抑制Taq DNA聚合酶的聚合活性。并且，小鼠E免疫后血清的中和活性最好，在72℃能够抑制84％的Taq DNA聚合酶的聚合活性。
由此可见，小鼠E的免疫后血清具有较高亲和活性和中和活性，因此该小鼠被选取用于进行后续的细胞融合及杂交瘤细胞制备试验。
实施例2.细胞融合及杂交瘤细胞株的筛选
将小鼠E处死并固定于解剖板上，用小刀剪去结缔组织即可取出脾脏，置于玻璃匀浆器中进行匀浆，将所得脾细胞稀释至一定浓度，然后与SP2/0Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合试验。有限稀释融合细胞，96孔板克隆化，并通过HAT筛选杂交瘤细胞。
细胞培养条件如下：a)细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30min。b)培养基置于恒温水浴箱中37℃放置20min以上。c)从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃直至冻存液完全融化。d)将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入9ml培养液(RPMI1640Medium，20％FBS)，1000rpm离心5min。e)用4ml培养液悬浮细胞后转入T25培养瓶中，37℃静置培养。
通过免疫原检测，优先挑选亲和力较高的杂交瘤细胞克隆进行后续实验。将挑选得到的亲和力较高的杂交瘤细胞克隆进行第一轮有限稀释和ELISA亲和力筛选，从第一轮有限稀释获得的阳性克隆中选取30-40株作为主克隆，每个主克隆挑选5-7株亚克隆进一步确认其亲和活性和中和活性。该步骤所用的抗体为经磁珠(Protein A MagBeads，购自金斯瑞)纯化后的抗体。
对亲和活性的筛选通过ELISA法，其与实施例1中的描述类似，所不同的是采用纯化得到的抗体来代替小鼠血清。
对中和活性的筛选通过荧光探针法，并且也非常关键。对中和活性的筛选分为两步，第一步筛选为筛选能够抑制Taq DNA聚合酶活性的抗体，第二步筛选为用具有中和活性的抗体制备热启动Taq酶，比较抗体失活前后Taq酶活性的封闭和恢复效果。中和活性的筛选的流程如图2所示。
荧光探针法的反应体系如下：2μL Taq DNA聚合酶-抗体混合液(制备方法为：将Taq DNA聚合酶和抗体按照质量比1：2在37℃预孵育30min，孵育缓冲液为1×PBS)、4μL 5×反应缓冲液、11.8μL nuclease-free水、和2μL荧光探针底物。阳性对照(PC)为不含抗体的上述反应体系，阴性对照(NC)为不含酶的上述反应体系。反应在qPCR仪上进行，反应条件为在50℃进行20min，然后在60℃进行20min。检测反应过程种荧光信号变化。Taq DNA聚合酶的活性被抑制，则会抑制荧光信号释放。
对抗体的中和活性的第一步筛选和第二步筛选基本是一致的，所不同的是，对于第二步筛选，其中进一步包括将Taq DNA聚合酶-抗体混合液在95℃热激活五分钟，步骤均是相同的。
然后，从通过上述步骤筛选出来的产生对Taq DNA聚合酶具有中和活性的抗体的细胞克隆选出最优杂交瘤并进行进一步的亚克隆化，并以热激活前后的Taq DNA聚合酶来进行荧光探针法检测。
最后，还对所选出的最优杂交瘤细胞细胞所分泌的抗体对突变型Taq DNA聚合酶的中和活性也通过荧光探针法来进行了检测。
结果：
第一轮亚克隆细胞的抗体经ELISA检测的亲和能力示于表5。
表5示出了200株抗体的ELISA检测结果，其中空白OD为0.045，ELISA检测体系为10μl抗体-酶混合物(0.05mg/ml Taq DNA聚合酶和0.1mg/ml抗体)。
表5.第一轮亚克隆细胞抗体经ELISA检测的亲和活性
ID OD-空白 ID OD-空白 ID OD-空白 ID OD-空白 ID OD-空白
22B9A6 2.812 10B4H2 2.67 1H4B8 2.616 13B4E2 2.339 4B6A2 2.68
22B9G6 2.764 10B4D4 2.647 1H4C7 2.328 14H10C2 3.045 4B6A12 2.897
22B9F2 2.663 10B4E2 2.61 1H4H9 2.287 14H10E3 3.133 4B6C7 2.25
22B9G2 2.604 10B4B4 2.489 1H4G11 2.275 14H10H3 3.134 6B10F4 1.625
22B9E5 2.246 7G4H5 2.831 15D5B5 2.876 14H10C1 3.261 6B10B12 2.562
22B9B5 1.253 7G4D6 2.705 15D5F6 2.837 14H10B3 2.756 6B10A8 1.217
23A4A7 3.053 7G4F4 2.54 15D5G4 2.778 14H10E1 3.453 6B10D12 2.439
23A4E10 2.856 7G4B3 2.295 15D5H5 2.652 14H10D5 2.938 6B10E8 1.564
23A4H12 2.856 7G4A5 2.198 15D5H1 1.23 14H10D6 2.774 6B10D5 2
23A4G10 2.831 7G4A3 1.858 15F4A7 2.827 14H10A1 2.169 8D2A1 2.93
23A4F9 2.707 7G4E5 0.648 15F4F9 2.74 14H10A3 1.332 8D2H1 3.552
23A4D12 2.597 8E 9A3 2.265 15F4H12 2.735 16B11E3 1.326 8D2H2 3.329
23A4E12 2.199 8E 9E5 2.22 15F4B7 2.621 16B11G11 2.495 8D2A6 3.307
23A4A9 1.239 8E 9D5 2.168 15F4B8 2.403 16B11E6 2.479 8D2A3 3.574
20F2A1 2.67 8E 9C1 2.135 15F4B10 1.986 16B11H12 2.904 8D2C4 3.17
20F2A3 2.818 8H3A7 2.663 15F4D11 0.848 16B11G4 1.712 8D2H4 3.175
20F2F2 2.752 8H3G11 2.635 10D5G1 3.206 16B11B1 2.418 8D2C5 2.63
20F2G6 2.464 8H3H11 2.272 10D5H2 3.077 16B11F3 2.961 9H10A4 2.626
20F2B1 2.135 7D10A9 1.224 10D5H1 3.027 17E 3G1 0.693 9H10B1 2.339
20F2H4 1.833 7D10G8 1.054 10D5G2 2.922 19H7G3 2.381 9H10E3 2.378
20F2E1 1.706 7D10F12 0.94 10D5F3 2.811 19H7G5 2.347 9H10A3 2.024
18H1H1 2.796 7D10D7 0.788 10D5E2 2.661 19H7A12 2.345 9H10E2 2.202
18H1E2 2.753 7D10E7 0.73 10D5E6 2.364 19H7H9 1.671 9H10H2 2.427
18H1B4 2.555 5B4H2 2.44 10D5E5 1.448 19H7F12 2.538 9H10F3 1.233
18H1C3 2.427 5B4E1 1.444 10G10A8 3.02 19H7A2 2.7 10B4H3 2.747
18H1E3 2.275 5B4E4 1.051 10G10A10 2.981 19H7D2 2.98 1H4E9 2.678
18H1F4 2.216 5B4D3 0.751 10G10G7 2.696 1F3G8 1.684 13B4G12 2.744
18H1C1 1.84 5B6A7 2.286 10G10B8 2.676 1F3B12 3.578 4B6F2 2.091
17E 3A1 2.453 5B6H7 2.657 10G10H7 2.645 1F3E7 3.017 4B6B2 2.425
17E 3A5 2.846 5B6H10 2.368 10G10C10 2.443 1F3D11 1.667 4B6E5 2.591
17E 3F2 2.078 5B6G11 2.35 10G10F7 1.683 1F3H7 2.846 13B4A12 2.339
17E 3B6 1.823 5B6B10 2.24 13B4H5 3.309 1F3G12 3.692 13B4A10 2.938
17E 3G3 1.267 5B6G12 2.111 1F3A12 3.708 1F3E10 1.467 1H4B9 2.688
17E 3G4 1.036 5B6H12 1.805 12A4B10 2.215 23C1B5 2 1H4E7 2.685
17C9G11 2.678 2G5H1 2.723 12A4H5 3.492 23C1C3 2.122 10B4A3 2.975
17C9A11 2.643 2G5C2 1.879 12A4H10 3.205 23C1B2 1.891 10B4D1 2.877
17C9D7 2.43 2G5A4 1.804 12A4F5 2.402 19H7E3 1.887 17C9B10 2.112
17C9C8 2.321 2G5C4 1.665 12A4E4 2.809 23C1H1 2.043 1H4F9 2.751
17C9C12 2.259 2G5B2 1.187 12A4C6 2.565 23C1G3 1.738 13B4C12 2.545
17C9D9 2.131 1H4C11 2.761 12D2B2 1.168 4B6A3 2.156 4B6G1 1.404
再对上述200株亚克隆细胞对应的抗体通过荧光探针法进行中和活性的第一步筛选，结果是，与阳性对照(PC)相比，有32株抗体能够明显抑制荧光变化速率(图4)，而其余168株抗体不能明显抑制Taq DNA聚合酶的活性(结果未示出)。
接下来，对上文中初筛得到的这32株抗体进行中和活性的第二轮筛选，即将热激活Taq DNA聚合酶先进行热激活(95℃5min)，并比较热激活前后的荧光信号变化，进而确定抗体对Taq DNA聚合酶的封闭效果和激活后活性的恢复。
第二轮筛选步骤最终确定有19株抗体能够不同程度地抑制Taq DNA聚合酶活性，如图5所示。并且，从该图中可以看出，14H10系列抗体对Taq DNA聚合酶的中和活性最好，在50℃几乎能够完全抑制Taq DNA聚合酶的活性。
从这19株杂交瘤细胞中选取3株最优杂交瘤细胞(14H10C1、14H10H3、10B4E2)，进行进一步的亚克隆化，即第二轮亚克隆化，得到14H10C1F3、14H10H3B11、10B4E2E2和10B4E2E6，并通过荧光探针法检测其中和活性，结果示于图6。从该图中可以看出，所有这四株抗体在50℃均能够明显抑制Taq DNA聚合酶的活性，而温度升高到60℃Taq酶活性逐渐恢复。
还验证了所筛选出来的抗体是否能够抑制Taq DNA聚合酶突变体(SEQ ID NO:30)活性，结果示于图7。结果显示，所筛选的四株抗体在50℃均能够明显抑制Taq DNA聚合酶突变体的中和活性，温度升高到60℃Taq酶活性逐渐恢复。
将上述筛选出来的4株最优杂交瘤细胞系/优势细胞株(14H10C1F3、14H10H3B11、10B4E2E2和10B4E2E6)进一步的亚克隆化，以得到稳定细胞系、保种，用于后期大规模细胞培养制备单克隆抗体。
实施例3.优势细胞株可变区序列测定
对在实施例2中筛选得到的四株优势细胞株(14H10C1F3、14H10H3B11、10B4E2E2和10B4E2E6)所分泌的抗体进行可变区测序，具体流程如下：
1)提取杂交瘤细胞总RNA(试剂盒PureLink RNA Mini Kit,Thermofisher)；
2)通过RT-PCR合成cDNA(试剂盒SuperScriptTM II Reverse Transcriptase，Thermofisher)；
3)利用Mouse Igg Library Primer Set，以cDNA为模板通过PCR分别扩增轻、重链可变区(Mouse Igg Library Primer Set，Progen)；
4)核酸电泳，胶回收(
Figure BDA0002872927890000211
Gel Extraction Kit，Omega)，获得轻重链片段；
5)将轻、重链可变区构建进质粒载体中(pMD 19-T Vector Cloning Kit,Takara)，转化DH5α，送样测序。
结果：
最终筛选得到的四株优势抗体，经过测序后获得轻、重链可变区序列。
抗体的重链可变区序列(VH)具有SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列(见上文)，并且SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列(见上文)编码。
抗体的轻链可变区序列(VL)具有SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:13中任一项所示的氨基酸序列，并且SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列(见上文)编码。
需要说明的是，由于密码子简并性原则，编译重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的核苷酸序列并不是唯一恒定的序列，任何可以编码相同重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列都是本专利范围内的核酸序列。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合Taq DNA聚合酶，其中，所述单克隆抗体包含：
a)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VHCDR3、SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:18所示的VL CDR3，
b)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VHCDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:20所示的VL CDR3，
c)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:19所示的VL CDR3，或
d)SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO:5所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:20所示的VL CDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体包括：
a)SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:21所示的轻链可变区，
b)SEQ ID NO:7所示的重链可变区和SEQ ID NO:22所示的轻链可变区，
c)SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:23所示的轻链可变区，或
d)SEQ ID NO:9所示的重链可变区和SEQ ID NO:24所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的单克隆抗体，其中，所述Taq DNA聚合酶为野生型或突变型Taq DNA聚合酶，例如，来源于栖热水生菌(Thermus Aquaticus)的氨基酸序列为SEQ ID NO:29所示的野生型Taq DNA聚合酶或氨基酸序列为SEQ ID NO:30所示的突变型Taq DNA聚合酶。
4.一种杂交瘤细胞，其产生权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体。
5.一种编码权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括：
a)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:18所示的VL CDR3的核苷酸序列，
b)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO:20所示的VL CDR3的核苷酸序列，
c)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:19所示的VL CDR3的核苷酸序列，或
d)编码SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO:5所示的VH CDR3、SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、SEQ ID NO:17所示的VL CDR2、以及SEQ IDNO:20所示的VL CDR3的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列包括：
a)编码SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:21所示的轻链可变区的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:7所示的重链可变区和SEQ ID NO:22所示的轻链可变区的核苷酸序列；
c)编码SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:23所示的轻链可变区的核苷酸序列；或
d)SEQ ID NO:9所示的重链可变区和SEQ ID NO:24所示的轻链可变区的核苷酸序列。
7.根据权利要求5所述的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列包括：
a)SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其简并序列和SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列或其简并序列；
b)SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其简并序列和SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列或其简并序列；
c)SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或其简并序列和SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列或其简并序列；或者
d)SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列或其简并序列和SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列或其简并序列。
8.一种热启动Taq DNA聚合酶，包括权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体和TaqDNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶为例如野生型或突变型Taq DNA聚合酶，例如，来源于栖热水生菌(Thermus Aquaticus)的氨基酸序列为SEQ ID NO:29所示的野生型Taq DNA聚合酶或氨基酸序列为SEQ ID NO:30所示的突变型Taq DNA聚合酶；优选地，所述单克隆抗体与Taq DNA聚合酶的质量比为1:(1-3)，更优选为1:2。
9.一种制备权利要求8所述的热启动Taq DNA聚合酶的方法，包括将权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体与Taq DNA聚合酶一起孵育，所述Taq DNA聚合酶为例如野生型或突变型Taq DNA聚合酶，如来源于栖热水生菌(Thermus Aquaticus)的氨基酸序列为SEQ IDNO:29所示的野生型Taq DNA聚合酶或氨基酸序列为SEQ ID NO:30所示的突变型Taq DNA聚合酶；优选地，其中，将所述单克隆抗体与所述Taq DNA聚合酶在37℃孵育20-40分钟，优选30分钟。
10.一种通过聚合酶链式反应来扩增DNA片段的方法，所述方法包括采用权利要求8所述的热启动Taq DNA聚合酶来扩增DNA片段的步骤。
CN202011611099.0A 2020-12-30 2020-12-30 特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用 Active CN114685671B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011611099.0A CN114685671B (zh) 2020-12-30 2020-12-30 特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011611099.0A CN114685671B (zh) 2020-12-30 2020-12-30 特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114685671A true CN114685671A (zh) 2022-07-01
CN114685671B CN114685671B (zh) 2023-09-26

Family

ID=82133003

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011611099.0A Active CN114685671B (zh) 2020-12-30 2020-12-30 特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114685671B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115594768A (zh) * 2022-12-12 2023-01-13 珠海宝锐生物科技有限公司（Cn） 一种分泌抗dna聚合酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其应用
CN115785276A (zh) * 2021-08-24 2023-03-14 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
CN115806622A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用
CN115806621A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F2B2及其应用
CN117402250A (zh) * 2023-12-13 2024-01-16 北京索莱宝科技有限公司 Taq DNA聚合酶抗体、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用
WO2024138521A1 (zh) * 2022-12-29 2024-07-04 深圳华大生命科学研究院 抗体及其应用

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0592035A2 (en) * 1992-10-07 1994-04-13 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Thermostable DNA polymerase composition comprising a temperature sensitive polymerase inhibitor, diagnostic test kits and methods of use
WO2004076658A1 (ja) * 2003-02-28 2004-09-10 Mitsubishi Pharma Corporation モノクローナル抗体およびそれをコードする遺伝子、ハイブリドーマ、医薬組成物ならびに診断試薬
WO2015073931A1 (en) * 2013-11-14 2015-05-21 Integrated Dna Technologies, Inc. Dna polymerase mutants having enhanced template discrimination activity
WO2017121843A1 (en) * 2016-01-15 2017-07-20 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Antibodies that bind thermophilic dna polymerases
WO2017188668A2 (ko) * 2016-04-25 2017-11-02 주식회사 엔지노믹스 Taq dna 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도
WO2018002952A2 (en) * 2016-06-26 2018-01-04 Gennova Biopharmaceuticals Limited, Antibody phage display library
CN109652499A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 深圳华大智造科技有限公司 快速检测dna聚合酶3′-5′外切活性或错配的方法和试剂盒
CN109897107A (zh) * 2017-12-08 2019-06-18 深圳华大生命科学研究院 纳米抗体及其制备方法
CN110256566A (zh) * 2019-05-10 2019-09-20 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 Taq DNA聚合酶单链免疫球蛋白IgG抗体、制备方法及其在基因分型检测中的应用
CN110878124A (zh) * 2018-09-05 2020-03-13 深圳华大生命科学研究院 Dna聚合酶的抗体片段、抗体及其应用
CN111560073A (zh) * 2020-07-16 2020-08-21 翌圣生物科技（上海）有限公司 Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用
CN111647086A (zh) * 2020-04-28 2020-09-11 武汉百杰康生物科技有限公司 一种重组小鼠抗人肌酸激酶单克隆抗体、制备方法和应用
CN111662386A (zh) * 2020-06-15 2020-09-15 北京全式金生物技术有限公司 Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用
CN111808197A (zh) * 2020-06-15 2020-10-23 北京全式金生物技术有限公司 Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用
CN112143723A (zh) * 2020-09-21 2020-12-29 江苏海洋大学 一种热启动Tth DNA聚合酶及其制备方法

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0592035A2 (en) * 1992-10-07 1994-04-13 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Thermostable DNA polymerase composition comprising a temperature sensitive polymerase inhibitor, diagnostic test kits and methods of use
WO2004076658A1 (ja) * 2003-02-28 2004-09-10 Mitsubishi Pharma Corporation モノクローナル抗体およびそれをコードする遺伝子、ハイブリドーマ、医薬組成物ならびに診断試薬
WO2015073931A1 (en) * 2013-11-14 2015-05-21 Integrated Dna Technologies, Inc. Dna polymerase mutants having enhanced template discrimination activity
WO2017121843A1 (en) * 2016-01-15 2017-07-20 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Antibodies that bind thermophilic dna polymerases
WO2017188668A2 (ko) * 2016-04-25 2017-11-02 주식회사 엔지노믹스 Taq dna 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도
WO2018002952A2 (en) * 2016-06-26 2018-01-04 Gennova Biopharmaceuticals Limited, Antibody phage display library
CN109652499A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 深圳华大智造科技有限公司 快速检测dna聚合酶3′-5′外切活性或错配的方法和试剂盒
CN109897107A (zh) * 2017-12-08 2019-06-18 深圳华大生命科学研究院 纳米抗体及其制备方法
CN110878124A (zh) * 2018-09-05 2020-03-13 深圳华大生命科学研究院 Dna聚合酶的抗体片段、抗体及其应用
CN110256566A (zh) * 2019-05-10 2019-09-20 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 Taq DNA聚合酶单链免疫球蛋白IgG抗体、制备方法及其在基因分型检测中的应用
CN111647086A (zh) * 2020-04-28 2020-09-11 武汉百杰康生物科技有限公司 一种重组小鼠抗人肌酸激酶单克隆抗体、制备方法和应用
CN111662386A (zh) * 2020-06-15 2020-09-15 北京全式金生物技术有限公司 Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用
CN111808197A (zh) * 2020-06-15 2020-10-23 北京全式金生物技术有限公司 Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用
CN111560073A (zh) * 2020-07-16 2020-08-21 翌圣生物科技（上海）有限公司 Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用
CN112143723A (zh) * 2020-09-21 2020-12-29 江苏海洋大学 一种热启动Tth DNA聚合酶及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID J. SHARKEY等: "Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction", NATURE, vol. 12, pages 506 - 509, XP002012551, DOI: 10.1038/nbt0594-506 *
GENBANK: AGS48029.1: "immunoglobulin mu heavy chain variable region, partial [Mus musculus]", NCBI, pages 1 - 4 *
HIROSHI MIZUGUCHI等: "Characterization and Application to Hot Start PCR of Neutralizing Monoclonal Antibodies against KOD DNA Polymerase", THE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 126, no. 4, pages 762 - 768 *
唐笑等: "耐热DNA聚合酶的定点诱变及应用于热启动PCR的纳米抗体的淘选", 优秀硕士学位论文, no. 2, pages 1 - 80 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115785276A (zh) * 2021-08-24 2023-03-14 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
CN115785276B (zh) * 2021-08-24 2023-10-03 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
CN115806622A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用
CN115806621A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F2B2及其应用
CN115806621B (zh) * 2022-11-25 2023-06-30 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F2B2及其应用
CN115806622B (zh) * 2022-11-25 2023-06-30 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用
CN115594768A (zh) * 2022-12-12 2023-01-13 珠海宝锐生物科技有限公司（Cn） 一种分泌抗dna聚合酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其应用
WO2024138521A1 (zh) * 2022-12-29 2024-07-04 深圳华大生命科学研究院 抗体及其应用
CN117402250A (zh) * 2023-12-13 2024-01-16 北京索莱宝科技有限公司 Taq DNA聚合酶抗体、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用
CN117402250B (zh) * 2023-12-13 2024-03-05 北京索莱宝科技有限公司 Taq DNA聚合酶抗体、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114685671B (zh) 2023-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114685671A (zh) 特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用
US8916504B2 (en) Methods of RNA display
CN115536748A (zh) 中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用
Mizuguchi et al. Characterization and application to hot start PCR of neutralizing monoclonal antibodies against KOD DNA polymerase
US20100010203A1 (en) Anti-hydroxylase antibodies and uses thereof
CN113321733B (zh) 一种TaqDNA聚合酶单克隆抗体及应用，包含该抗体的聚合酶反应体系及应用
US10273530B2 (en) Antibodies that bind thermophilic DNA polymerases
Morita et al. Antibody fragments for on-site testing of cannabinoids generated via in vitro affinity maturation
EP1851338B1 (en) Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases and methods therewith
CN115838419A (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
JP2024094378A (ja) Ｄｎａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
Yuan et al. A simple and rapid protocol for the sequence determination of functional kappa light chain cDNAs from aberrant-chain-positive murine hybridomas
Kraivong et al. A simple approach to identify functional antibody variable genes in murine hybridoma cells that coexpress aberrant kappa light transcripts by restriction enzyme digestion
CN115806622A (zh) 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用
CN115960216A (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
Sabrina et al. In vitro generation of anti-hepatitis B monoclonal antibodies from a single plasma cell using single-cell RT-PCR and cell-free protein synthesis
US20180009875A1 (en) A Method for Producing a Recombinant Allotypespecific Rabbit Monoclonal Antibody
WO2024138521A1 (zh) 抗体及其应用
Ali et al. Generation of monoclonal antibodies using simplified single-cell reverse transcription-polymerase chain reaction and cell-free protein synthesis
CN117510639A (zh) 抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用
CN116284413B (zh) 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12及其应用
JP7489673B2 (ja) Ｄｎａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
US20200392578A1 (en) Methods of sequencing antibody chains from hybridomas and kits for practicing same
CN115594768B (zh) 一种分泌抗dna聚合酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其应用
CN117106073A (zh) 抗新型冠状病毒单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant