WO2017188668A2 - Taq dna 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

Taq dna 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도 Download PDF

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신용걸
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박소연
서연수
김학성
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    • C12Q2549/10—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity the purpose being that of reducing false positive or false negative signals
    • C12Q2549/101—Hot start

Definitions

  • the present invention is in the field of nucleic acid sequence amplification technology.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Thermus aquaticus which enables efficient and stable PCR due to thermal stability at high temperatures.
  • Taq DNA polymerase allows nonspecific amplification reactions from these templates when primers bind to template nucleic acids or form dimers between primers before the end of the denaturation phase of PCR due to their activity at room temperature. There is a disadvantage that the efficiency and accuracy of gene amplification is greatly reduced.
  • Antibodies that specifically recognize immunoglobulin-based Taq DNA polymerase bind to enzymes at low temperatures, inhibit their activity, and separate from enzymes as the temperature rises during PCR, resulting in polymerase activation (Scalice, ER; Sharkey, DJ;. Daiss , JL J. Immunol Methods 1994, 172 (2), 147-163).
  • Such neutralizing antibodies have a simple but effective method, but the production cost is expensive, the production process is cumbersome, and there is a problem of forming aggregates due to large molecular weight.
  • Republic of Korea Patent No. 1488110 relates to the preparation of mutants of Neq HS DNA polymerase derived from nano-aqueum Iquitans and application of hot-start PCR using the same, and discloses a hot start PCR technology using trans-splicing generated at a high temperature have.
  • the present invention is to provide a technique for effectively suppressing non-specific amplification that can occur in PCR using Taq DNA polymerase by using a polypeptide binding to Taq DNA polymerase, thereby increasing the efficiency and accuracy of nucleic acid amplification.
  • the disclosure is directed to an N-terminus of an internalin B protein; Modified repeat module of VLR (Variable Lymphocyte Receptor) protein; And the amino acid sequence of SEQ ID NO. 1, to which the C-terminus of the VLR protein is fused, wherein residue 45 is amino acid of Q, S, R, Y, V, or N; Residue 47 is selected from the group consisting of I, T, K, A, or Q; Residue 49 is N, H, L, M or I; Residue 67 is Y, R, A or K; Residue 69 is A or K; Residue 72 is G or A; Residue 91 is I, or S; Residue 93 is T or W; Residue 94 is G or L; Residue 115 is V or S; Residue 117 is V or H; And residue 118 provides a polypeptide that selectively binds to Taq DNA polymerase, which is E or W.
  • VLR
  • the polypeptide that selectively binds to Taq DNA polymerase comprises residue 45 wherein Q, S, R, Y, V, or N; Residue 47 is selected from the group consisting of I, T, K, A, or Q; Residue 49 is N, H, L, M or I; Residue 67 is Y, R, A or K; Residue 69 is A or K; Residue 72 is G or A; Residue 91 is S; Residue 93 is W; Residue 94 is L; Residue 115 is S; Residue 117 is H; And residue 118 provides a polypeptide that selectively binds Taq DNA polymerase W.
  • the polypeptide that selectively binds to Taq DNA polymerase comprises residue 45 wherein Q, S, R, Y, V, or N; Residue 47 is selected from the group consisting of I, T, K, A, or Q; Residue 49 is N, H, L, M or I; Residue 67 is R; Residue 69 is K; Residue 72 is A; Residue 91 is S; Residue 93 is W; Residue 94 is L; Residue 115 is S; Residue 117 is H; And residue 118 provides a polypeptide that selectively binds Taq DNA polymerase W.
  • polypeptide according to the present invention is an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 13 or 45, 47, 49, 67, 69, 72, 91, One or more of residues 93, 94, 115, 117, and 118 provide a polypeptide having an amino acid sequence substituted with the conservative substitution residues of Table 1.
  • polypeptide according to the present invention has a conservative substitution at the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or at the next residue of the amino acid sequence, wherein residue 45 is selected from S, T, A, or N; Residue 47 is K, R, Q, E, or N; Residue 48 is A, S, G, or T; Residue 49 is I, L, V, M, or F; Residue 67 is R, K, Q, or H; Residue 69 is K, R, Q, E, or N; Residue 72 is A, S, G, or T; Residue 91 is S, T, A, or N; Residue 93 is W, Y, or F; Residue 94 is L, I, V, M, or F; Residue 115 is S, T, A, or N; Residue 117 is H, N, Q, R, or Y; Residue 118 is W, Y, or F;
  • polypeptide according to the invention is a polypeptide that selectively binds to Taq DNA polymerase, wherein it forms a homo or hetero dimer, or three homo or hetero trimers.
  • the present application also provides a polynucleotide encoding a polypeptide according to the present disclosure, wherein the sequence of the polynucleotide may be represented by SEQ ID NOs: 14 to 24, for example.
  • the present disclosure also provides a recombinant vector comprising a polynucleotide according to the present application, or a transformed cell into which the vector is introduced.
  • the present disclosure also provides the use of one or more polypeptides disclosed herein for Hot start PCR.
  • the application also provides the use of one or more polypeptides disclosed herein in the preparation of a hot start PCR composition.
  • the present disclosure also provides a PCR composition, kit or Hot Start PCR method for Hot Start comprising a polypeptide according to the present disclosure.
  • the polypeptide according to the present invention is not only easy to produce, but also binds to Taq DNA polymerase with high affinity to inhibit its activity until PCR is initiated, and when the temperature of the reactant reaches 95 ° C. during the denaturation, It can be effectively separated to prevent nonspecific amplification that can occur at low temperature before PCR initiation, thereby enabling high specificity PCR reaction at low cost and high efficiency.
  • Figure 1 schematically shows an exemplary structure of Repebody-VLR4 used for the screening of polypeptides according to the present application, showing a module into which mutations have been introduced for screening.
  • the r-G6 clone which showed the highest binding force sequentially in the first stage, was used as a template for the construction of the library in the second stage, and the r-G6E1 clone, which showed the highest binding force in the second screening stage, was the library in the third stage.
  • a total of three libraries were produced in the manner used as a template for the production.
  • the first library introduced mutations in the concave regions of LRRV2 and LRRV3 (yellow), the second library introduced LRRV1 (green), and the third library introduced LRR1 (blue) mutations.
  • the names of the clones, staged using each library, are shown at the bottom of the figure.
  • Figure 2 shows the result of confirming the specific binding to Taq DNA polymerase r-G6, the clone showing the highest binding capacity among the clones selected using the first library of Figure 1 by ELISA.
  • Clonal r-G6 does not bind to BSA but specifically binds to Taq DNA polymerase.
  • the ELISA signal of Taq DNA polymerase was decreased due to the antibody known to inhibit the activity by binding to Taq DNA polymerase (JumpStart antibody; Sigma Aldrich)
  • the clone r-G6 is similar to the antibody. It has an epitope.
  • Figure 3 shows the results of measuring the amino acid sequence and its dissociation constant changed in all the clones obtained as a result of performing the biopanning of phage display step by step using the library prepared in the manner described in Figure 1 by ITC.
  • Figure 4 shows the result of analyzing the Taq DNA polymerase binding specificity of the r-G6E1H8 clone selected in the three rounds through phage ELISA experiment.
  • Figure 6 shows the results of analyzing the inhibitory effect of Taq DNA polymerase on the lipid body clones selected in each round.
  • Figure 7 shows the rapid reactivation of inactivated Taq DNA polymerase due to the r-G6E1H8 Lipibody clone selected in the third round, using the conventional antibody and chemically modified polymerase as a comparison group It was.
  • Figure 8 shows the results confirmed by the block PCR Hot start PCR using the lipid body clone selected in the present application.
  • Figure 10 is the result of analyzing the activity inhibitory effect of Taq DNA polymerase using a dimer (dimer) in the form of continuous linking the cloned body according to the present application.
  • the polypeptide according to the present application is referred to as “repebody”, which is the N-terminus of the Internalin B protein, a modified LRR (Leucine rich repeat) module of the Variable Lymphocyte Receptor (VRL). And a polypeptide in which the C-terminus of the VRL protein is fused, and may be divided into a concave region and a convex region.
  • the concave region has a high degree of sequence diversity and is an important site for protein interaction, and the convex region plays a role of maintaining the overall structure of the protein based on the highly conserved sequence.
  • Modules include a plurality, and may be divided into LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRV4, LRRV5, and LRRVe according to a feature, and may lack one or more of the modules.
  • LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRV4, LRRV5, and LRRVe according to a feature, and may lack one or more of the modules.
  • Lipbodies are one-fifth the size of antibodies, are mass produced in Escherichia coli, and show little immunogenicity in animal experiments.
  • the thermal and pH stability is very good, the binding to the target can be very easily increased to the pico-mole level, and the specificity to the target is very excellent, it is very useful as an alternative to replace the antibody.
  • the "Leucine rich repeat (LRR) module included in the lipid body has a repeating pattern of" LxxLxxLxLxxN "with a length of 20 to 30 amino acids in which leucine is repeated at a predetermined position, and L is alanine, glycine, phenylalanine, tyrosine, Hydrophobic amino acids such as leucine, isoleucine, valine and tryptophan, N means asparagine, glutamine, serine, cysteine or threonine and x means any amino acid.
  • mutation libraries are introduced to specific amino acids of the LRR module based on the lipid body structure to sequentially generate a mutant library in a manner of increasing binding capacity, and specifically bind to Taq DNA polymerase from the same.
  • Non-antibody backbone polypeptides were selected that could effectively inhibit activity.
  • Polypeptides according to the invention may differ depending on the primer annealing temperature at low temperatures, in particular before the initial denaturation reaction in a PCR reaction or at a temperature at which nonspecific primer annealing and resulting DNA synthesis are possible, but for example It is a Taq DNA polymerase inhibitor having a thermal stability to bind to Taq DNA polymerase at 50 ⁇ 60 °C or below 50 °C to inhibit its activity, denatured at the PCR denaturation temperature, and reactivate Taq DNA polymerase.
  • Lipibody produced a library using livibody lacking one module as a template for the development of inhibitors with a number of modules affecting thermal stability and for thermal stability suitable for the purpose of the present application.
  • a sequential screening is performed to generate a library in the concave region of the lipida and to screen the lipidi that specifically binds to the target substance. The interaction was optimized to improve the binding force.
  • the library was prepared in the second stage by using the clone with the highest binding force in the first stage, and showed the highest binding force in the second selection stage.
  • the clone was used to make a third stage library.
  • a polypeptide that specifically binds to Taq polymerase by causing mutations in residues 91, 93, 94, 115, 117, and 118 based on residues of SEQ ID NO: 1 of concave regions LRRV2 and LRRV3 After selection, it was used to induce Taq polymerase by causing secondary mutations at residues 67, 69, 71, and 72 in the concave regions LRRV1 and LRR1 regions, and third-order mutations at 45, 47, 49, and 50, respectively.
  • Polypeptides with increased binding capacity were selected.
  • the present application is directed to an N-terminus of an internalin B protein; Modified repeat module of VLR (Variable Lymphocyte Receptor) protein; And a polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, to which the C-terminus of the VLR protein is fused, wherein residue 45 is SEQ ID NO: Q, S, R, Y, V, or N; Residue 47 is selected from the group consisting of I, T, K, A, or Q; Residue 49 is N, H, L, M or I; Residue 67 is Y, R, A or K; Residue 69 is A or K; Residue 72 is G or A; Residue 91 is I, or S; Residue 93 is T or W; Residue 94 is G or L; Residue 115 is V or S; Residue 117 is V or H; And residue 118 is either E or W.
  • VLR Very Lymphocyte Receptor
  • Taq DNA polymerase herein includes enzymes derived from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus or derivatives or variants thereof that exhibit equivalent activity, and can be purchased from various companies in the market. As long as the polypeptides according to the invention can bind, Taq DNA polymerases of various forms and / or origins from which the mutations are induced are included herein.
  • the polypeptide according to the present application increases the number of mutations introduced as the selection cycle increases, and the binding force increases, but since it is selected based on the binding strength to Taq polymerase in each round, And mutations selected in the secondary are also included within the scope of this application.
  • Mutation sites herein are selected through non-obvious efforts of those skilled in the art. Specifically, in the first stage of screening, mutations are induced at positions corresponding to the centers of the concave regions among the residues of LRRV2 and LRRV3 of the repeating body, and the initially selected lipido (G6) is used as a template. Mutation of the module region of the C-terminal part was increased by adding mutations to the modules one by one of the two modules that produced the library, thereby increasing binding capacity. Thus, the Lipibody that binds to Taq DNA polymerase gives LRRV1, the N-terminal module of LRRV2, to find a clone with increased binding capacity (G6E1), and then gives LRR1 a third library to bind more. An augmented clone (G6E1H8) was identified.
  • polypeptides having the most binding capacity in the first round of selection wherein the polypeptide is mutated at one or more of the residues used for mutagenesis in the second round of selection.
  • the present disclosure is directed to a polypeptide that selectively binds to Taq DNA polymerase having the following sequence, wherein residue 91 is a polypeptide selected through primary screening; Residue 93 is W; Residue 94 is L; Residue 115 is S; Residue 117 is H; And residue 118 has W, and other positions, 67, 69, 72, 45, 47 and 49, are polypeptides having one or more residues as described above.
  • the invention relates to a polypeptide that selectively binds to a Taq DNA polymerase having the sequence: residue 91 is a polypeptide selected through primary screening; Residue 93 is W; Residue 94 is L; Residue 115 is S; Residue 117 is H; And residue 118 is W; And wherein residue 67 selected through screening at the secondary is R; Residue 69 is K; Residue 72 is A, and other positions, ie, residues 45, 47 and 49, are polypeptides having one or more residues as described above.
  • polypeptide having a binding force to Taq polymerase according to the present application is represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 13.
  • the peptide according to the present application is not limited to the above sequence, and includes biological equivalents thereof.
  • Biological equivalents are those which have additional modifications to the amino acid sequences disclosed herein, but which have substantially the same activity as the polypeptides according to the invention, such modifications may, for example, delete, insert and / or substitute amino acid sequence residues. It is to include.
  • conservative amino acid substitutions have occurred in a polypeptide having binding capacity to Taq polymerase according to the present application.
  • Conservative amino acid substitutions mean substitutions that do not substantially affect or reduce the activity of a particular polypeptide. For example, 1 to 15 conservative substitutions, 1 to 12, For example, 1, 2, 5, 7, 9, 12, or 15 conservative amino acid substitutions.
  • conservative substitutions have occurred in the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 13 according to the present application, in particular 91, 93, 94, 115, 117, 118, Conservative substitutions have occurred in one or more of residues 67, 69, 72, 45, 47 and 49.
  • a conservative substitution has occurred in a polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 13, in particular, 91, 93, 94, 115, 117, 118, 67, In addition to residues 69, 72, 45, 47, and 49, conservative substitutions have occurred at one or more residues besides.
  • a conservative substitution has occurred in a polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 13, in particular 91, 93, 94, 115, 117, 118, 67 Conservative substitutions have occurred at one or more residues other than residues 69, 72, 45, 47 and 49.
  • in one embodiment according to the present invention is to include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 13 and the sequence in which the conservative substitution has occurred.
  • residue 45 may be selected from S, T, A, or N; Residue 47 is K, R, Q, E, or N; Residue 48 is A, S, G, or T; Residue 49 is I, L, V, M, or F; Residue 67 is R, K, Q, or H; Residue 69 is K, R, Q, E, or N; Residue 72 is A, S, G, or T; Residue 91 is S, T, A, or N; Residue 93 is W, Y, or F; Residue 94 is L, I, V, M, or F; Residue 115 is S, T, A, or N; Residue 117 is H, N, Q, R, or Y; And residue 118 may be W, Y, or F.
  • amino acid sequences disclosed herein or polynucleotides encoding them as described below also include those having substantial identity as disclosed herein.
  • Substantial identity is at least 61% homology, more preferably, when aligning the sequence disclosed herein to any other sequence as closely as possible and analyzing the aligned sequence using algorithms commonly used in the art.
  • the present application also relates to a polynucleotide encoding a polypeptide according to the present application as described above, a recombinant vector comprising said polynucleotide and a cell into which said recombinant vector is introduced.
  • polynucleotide according to the present application may be represented by SEQ ID NO: 14 to 24, but is not limited thereto, and also includes a polynucleotide modified due to degeneracy of the amino acid coding sequence, as described above It includes those having substantial identity as described above.
  • the polynucleotides according to the invention can be introduced and used in a vector suitable for a variety of purposes, for example for production.
  • a suitable regulatory sequence such as a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, such that the desired protein can be expressed in a suitable host.
  • Such vectors or plasmids into which the polynucleotides according to the present invention can be introduced are not particularly limited as long as they can be replicated in a host, and any vector known for specific purposes may be used, and natural or recombinant plasmids, phagemids, cos Meads, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector
  • pBR, pUC, and pBluescriptII systems are used as plasmid vectors.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based vectors such as pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a vectors and the like can be used.
  • Vectors comprising the polynucleotides according to the invention can be introduced and used into a suitable host, replicated or functioned independently of the host genome, and integrated into the genome itself.
  • Cells comprising a polynucleotide according to the present application or a vector comprising the same include eukaryotic cells and prokaryotic cells.
  • examples include, but are not limited to, bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Yeast cells; Fungal cells such as Pchia pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, bow melanoma cells; Or plant cells.
  • Polynucleotides according to the present disclosure include DNA and RNA, and may be introduced into host cells and introduced in various forms for expression.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site and translation termination signal operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell.
  • the present application also relates to a homo or hetero dimer, or three homo or hetero trimers, composed of a plurality of polypeptides according to the present application.
  • the dimer or trimer according to the present application may be connected in the direction of N-> C terminus or in the direction in which N-terminal or C-terminals face each other, but is not limited to a specific direction as long as the effect according to the present disclosure is achieved.
  • Polypeptides according to the invention may be linked via a linker.
  • linkers known in the art that do not affect the activity of the polypeptides according to the invention can be used herein. See, for example, Chichili et al., PROTEIN SCIENCE 2013 VOL 22: 153-167.
  • a linker composed of poly-glycine or glycine-rich amino acids is used, for example, but not limited to GGG, GGGGG, GGSSG or GGSGG.
  • the present application also provides a method of producing a culture comprising the steps of: (a) culturing the recombinant cells to obtain a culture; And (b) recovering the polypeptide from the cultured cells or cultures.
  • the step of culturing the recombinant cells is not particularly limited, but is preferably performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, and the like, and the culture conditions are not particularly limited thereto.
  • a basic compound e.g. sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound e.g. phosphoric acid or sulfuric acid
  • the appropriate pH pH 5-9, preferably pH 6-8, most preferably pH 6.8
  • Controllable, oxygen or oxygen-containing gas mixture can be introduced into the culture to maintain aerobic conditions
  • the incubation temperature can be maintained at 20 to 45 °C, preferably 25 to 40 °C, for about 10 to 160 hours It is preferable to incubate.
  • the polypeptide produced by the culture may be secreted into the medium or remain in the cell.
  • the culture medium to be used is a carbon source as sugar and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), fats and oils (e.g.
  • soybean oil Sunflower seed oil, peanut oil and coconut oil
  • fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol and organic acids such as acetic acid Can
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) and the like can be used individually or in combination
  • As a source of phosphorus, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, a corresponding sodium-containing salt, and the like can be used individually or in combination
  • Other metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate, and essential growth-promoting substances such as amino acids and vitamins.
  • the method for recovering the polypeptide produced in the culturing step of the present invention is a method for recovering the desired polypeptide from the culture medium using a suitable method known in the art according to the culture method, for example, batch, continuous or fed-batch culture method, etc. Can be collected.
  • the present application also relates to the use of a polypeptide or a nucleic acid (polynucleotide) encoding the same according to the present application.
  • the polypeptide according to the present invention binds to Taq DNA polymerase at low temperature, for example at 4 ° C. to 50 ° C., thereby inhibiting the activity of the enzyme until the start of synthesis, thereby increasing the specificity of the synthesis.
  • the polypeptide according to the present disclosure or the nucleic acid encoding the same may be used in various applications in which the polypeptide according to the present disclosure binds to Taq DNA polymerase at a specific temperature and requires inhibition of its activity.
  • a Hot Start PCR composition containing a polypeptide according to the present application as an active ingredient.
  • the composition according to the present application is additionally comprise components necessary for PCR, such as the polypeptide in addition to, Taq polymerase, dNTP, Mg 2 + or divalent cation, salts, buffers, preservatives and / or additives such as Mn 2 + in accordance with the present can do.
  • the salts include KCl, NaCl, buffers, Tris-HCl, Sodium- / Potasium phosphate
  • preservatives include Glycerol
  • additives include DMSO, but are not particularly limited thereto.
  • the hot start PCR composition may be mixed with an enzyme having another activity and, for example, may be used together with Reverse Transcriptase, Uracil DNA glycosylase, Pfu DNA polymerase, dUTPase, and Pyrophosphatase. Compositions necessary to exhibit the activity of the enzyme may be further used or may be altered.
  • the present invention relates to a Hot Start PCR method using a polypeptide or a composition comprising the same.
  • the method according to the present invention comprises the steps of mixing the components required for PCR amplification, such as forward and reverse primers, and a template with a polypeptide according to the present application as described above or a PCR composition comprising the same; And reacting the mixture under conditions capable of PCR.
  • the conditions capable of PCR can be carried out in total 45 cycles, for example, after three minutes of reaction at 95 ° C for about 1 minute, denaturation at 95 ° C for 10 seconds, hybridization at 60 ° C for 15 seconds, and synthesis at 72 ° C for 20 seconds.
  • those skilled in the art will be able to select appropriate conditions in consideration of the characteristics of the template to be amplified, primer characteristics, the composition of the buffer.
  • the present disclosure also relates to the use of a Hot Start PCR using a polypeptide or a composition comprising the same, with reference to what is described herein.
  • the present disclosure also relates to the use of the preparation of a Hot Start PCR composition using a polypeptide or a composition comprising the same, with reference to what is described herein.
  • Example 1-1 Constructing a Lipibody Library Based on Protein Structure
  • Lipibody is a concave region where the modularity and overall structure of the LRR repeat unit with conserved leucine sequences are continuously connected to maintain the overall protein structure and the overall structure is curvature. And the convex region has structural features, the former is important for the recognition of biomolecules, the latter is important for structure maintenance.
  • concave regions hypervariable regions, such as complementarity determining regions (CDRs) of antibodies, are located to mediate protein-protein interactions.
  • CDRs complementarity determining regions
  • convex regions play an important role in maintaining the overall structure of the LRR based on well-conserved sequences.
  • the concave region of two consecutive mutation modules located in the N-terminal direction.
  • the six amino acid residues 91, 93, 94, 115, 117, and 118 are located.
  • phagemid pBEL118M Sang-Chul Lee et al., "Design of a” Primary library phagemids were obtained by insertion into binding scaffold based on variable lymphocyte receptors of jawless vertebrates by module engineering, "PNAS, 2012, 109 (9), 3299-3304.). The secured library was then introduced into Escherichia coli XL1-Blue by electroporation to obtain a recombinant microorganism, thereby constructing a library having a synthetic diversity of 1.0 ⁇ 10 8 level.
  • a polypeptide capable of binding to Taq DNA polymerase was selected and purified. Specifically, in order to select candidates capable of binding to Taq DNA polymerase, Taq DNA polymerase was added to an immunotube (Immuno-tube) at a concentration of 100 ⁇ g / ml and coated at 4 ° C. for 12 hours. The coated immunotubes were washed three times with PBS and blocked with PBS solution (TPBSA) containing 1% BSA and 0.05% Tween 20 at 4 ° C. for 2 hours. The purified phages were then added to the coated immunotubes at a concentration of 10 12 cfu / ml and allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • TPBSA PBS solution
  • Phages selected by the method of Example 1-2 were performed using a 96-well plate coated with Taq DNA polymerase and BSA as follows. A 96-well plate coated with Taq DNA polymerase and BSA was subjected to blocking for 1 hour at room temperature using TPBSA. Lipibody displayed phage in the well and incubated for 1 hour, and then washed three times with TPBS. Next, dilute HRP-conjugated anti-M13 monoclonal antibody (GE healthcare) to 1: 5,000, treat at room temperature for 1 hour, and perform 4 washes with TBS. TMB solution (Sigma aldrich) was treated for signal detection, and the absorbance at 450 nm was measured after treatment with TMB and the same amount of 1N H 2 SO 4.
  • Lipidbody candidates having an absorbance (OD 450 ) of 20 times higher than that of BSA (OD 450 ) were selected, sequence determined, and amino acid sequences were derived based thereon, and clones having the same amino acid sequence were excluded. As a result, it was confirmed that only clone r-G6 specifically binds to Taq DNA polymerase.
  • r-G6 is substituted with serine at amino acid 91 and seronine, and threonine at amino acid 93 with tryptophan, glycine with amino acid 94 with leucine, and valine with amino acid 115 at Serine. It was confirmed that valine, amino acid 117, was substituted with histidine, and glutamic acid, amino acid 118, was substituted with tryptophan (SEQ ID NO: 3). The results indicate that there are residues that play an important role in binding to Taq DNA polymerase.
  • Example 1-3 The epitope of the lipid body binding to Taq DNA polymerase obtained in Example 1-3 was confirmed. This is because it is possible to determine whether Lipibodi can inhibit Taq DNA polymerase activity depending on the epitope.
  • a competitive ELISA with an antibody known to bind Taq DNA polymerase to inhibit its activity showed that clone r-G6 reduced the binding signal by the antibody. It indicates that the epitope of clone r-G6 is similar to the existing antibody, and can be effectively used to inhibit Taq polymerase activity.
  • the first module-based affinity library causes mutations in four amino acid residues, 67, 69, 71, and 72, located in the LRRV1 module (FIG. 3), resulting in increased binding through five panning processes.
  • Three clones (SEQ ID NOS: 4 to 6) were obtained, and the dissociation constants were measured using an isothermal calorimetry. As a result, it was confirmed that all three clones had increased binding capacity to Taq DNA polymerase.
  • the present inventors have successfully obtained a lipid body having a binding force to Taq DNA polymerase, and confirmed that it is a polypeptide having a specific binding force to Taq DNA polymerase.
  • a denaturation temperature measurement experiment was performed to confirm the thermal stability of the lipid bodies selected through the above examples. Molar ellipticity at 222 nm was measured over 30-80 ° C. using a J-815 CD spectrometer (Jasco, Japan). Based on the measurement results, the denaturation temperature was calculated using a thermal denaturation analysis program (Jasco, Japan). The results are shown in FIG. 5, and r-G6 was confirmed to have a modification temperature of 59.9 ° C., r-G6E1 was 65.4 ° C., and r-G6E1H8 was 62 ° C. Therefore, these results indicate that if the temperature increases during the PCR reaction, the binding of Taq DNA polymerase is released by the protein denaturation of Lipibodi itself, and the Taq DNA polymerase can start synthesis at the correct extension temperature. .
  • lipid body selected in the above example actually inhibited the activity of Taq DNA polymerase.
  • 200 ng of Taq DNA polymerase and Lipbodies r-G6, r-G6E1, r-G6E1H8 were mixed in various amounts (0.05, 0.2, 1, 5 ⁇ g) and allowed to stand at 4 ° C for 15 minutes. Lipibody complexes were formed.
  • the Taq DNA polymerase-lipibody complex was mixed with 50 ⁇ l of the reaction solution to contain 1 nmol of dNTP, 12.15 pmol of [ 3 H] dTTP (0.1 Ci / mmol), and 2 mg / ml of activated calf thymus DNA.
  • reaction mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes, the reaction was stopped by mixing 11 ⁇ stop buffer (110 mM EDTA, 2.2% SDS) with 1 ⁇ . Finally, the amount of radioactive DNA produced by Taq DNA polymerase was measured with a liquid scintillation counter to calculate the inhibition efficiency of Taq DNA polymerase by Lipibody.
  • Example 6-1 Block PCR using Lipbodies Binding to Taq DNA Polymerase
  • the GAPDH target band which is not amplified well when the amount of the template is very small as 1 pg, is comparable to that of using the antibody when performing hot start PCR using the lipidi r-G6E1H8 To be effectively amplified.
  • the lipid body according to the present invention effectively inhibits Taq DNA polymerase in Hot Start PCR, or can be effectively separated and used above a denaturation temperature to be used for a very specific amplification reaction.
  • the length of the initial activation time required to exert the hot start effect in real time PCR was measured using the final screened Lipibody r-G6E1H8.
  • the basic experimental method is the same as in Example 6-1, but realtime PCR was performed using a TaqMan probe method to analyze amplified products in real time.
  • a ⁇ -Actin moiety is a forward primer using human cDNA as a template; 5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3 ', reverse primer; 5'-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3 ', TaqMan probe; 5'-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TAMARA-3 'was amplified and PCR was performed with various initial activation times set at 0.5, 1, 2, 5, 10, and 15 minutes.
  • Taq DNA polymerase mixed with Taq DNA polymerase (Enginenomics, Korea) and antibody (JumpStart Antibody, Sigma Aldrich) produced through chemical treatment was used.
  • the experimental results are shown in Figure 7, it can be seen that the reactivation occurs well within 95 minutes at 95 °C as in the case of using the antibody if the Lipibody can be effectively used for Hot Start PCR.
  • r-G6E1H8 gene was selected by using three glycine amino acids as a linker in sequence to prepare r-G6E1H8 homodimer.
  • the protein was introduced into E. coli, expressed as a protein, and purified / purified purely by column chromatography.
  • the inhibitory activity of Taq DNA polymerase was measured by the method of Example 5 using the thus obtained Lipibodi dimer and the previously selected r-G6E1H8.

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Abstract

본 발명은 Taq DNA 중합효소와 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 재조합 벡터가 도입된 세포 및 상기 재조합 미생물을 이용한 폴리펩타이드 생산방법과 그 용도로서 본원에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 Hot Start PCR 조성물을 개시한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하여 그의 활성을 억제할 수 있으므로, Taq DNA 중합효소를 이용한 Hot start PCR에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

TAQ DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도
본 발명은 핵산서열 증폭 기술 분야이다.
PCR (Polymerase Chain Reaction)은 특정 핵산을 증폭하는 방법으로 생물학, 생화학 및 의학분야에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이다 (Yamamoto, Y. Clin. Diagn . Lab. Immunol . 2002, 9 (3), 508-514). PCR은 변성, 프라이머 결합 및 신장으로 구성되는 세 가지 단계를 한 사이클로 해서 여러 사이클로 반복되며, 각 단계는 이에 적합한 온도에서 수행된다. PCR에 가장 널리 사용되는 효소는 Thermus aquaticus 유래의 Taq DNA 중합효소이며, 높은 온도에서 열안정으로 인해, 효율적이고 안정적인 PCR을 가능하게 한다.
하지만 Taq DNA 중합효소는 상온에서의 활성으로 인해 PCR의 변성 단계가 완전히 끝나기 전에 프라이머가 주형 핵산에 결합하거나, 또는 프라이머간의 이량체 형성을 한 경우, 이러한 주형으로부터 비특이적 증폭 반응을 가능하게 하고 이로 인해 유전자 증폭의 효율성과 정확성이 크게 떨어지는 단점이 있다.
이러한 원하지 않는 핵산의 증폭을 방지하기 위해 개발된 것이 특정 온도에 도달할때까지 Taq DNA 중합효소를 불활성화 상태로 유지하거나 또는 프라이머의 신장을 억제하는 Hot start PCR 기술이다 (Paul, N.; Shum, J.; Le, T. Methods Mol. Biol. 2010, 630, 301-318).
초기에는 중합효소를 제외한 PCR에 필요한 나머지 성분만을 변성온도인 95℃까지 예열한 후에 중합효소를 추가하는 기술이 사용되었으나, 추가의 처리과정으로 인해 불편이 초래되는 문제점이 있었다 (D’Aquila, R. T.; Bechtel, L. J.; Videler, J. a; Eron, J. J.; Gorczyca, P.; Kaplan, J. C. Nucleic Acids Res. 1991, 19 (13), 3749.). 다른 방법은 왁스 또는 비드를 이용해서 중합효소를 반응전까지 물리적으로 격리하는 기술이다. 하지만 이 역시 추가의 처리 과정 및 왁스의 재응결 등으로 인한 불편이 초래되고 반응의 효율성이 떨어지는 문제점이 있었다 (Hebert, B.; Bergeron, J.; Potworowski, E. F.; Tijssen, P. Molecular and cellular probes. 1993, pp 249-252.). 그 후 Taq DNA 중합효소의 활성을 화학적으로 억제하는 기술이 개발되었으나, 제조과정이 복잡하고 재활성화까지 10분 이상의 시간이 소요되며, 이로 인해 DNA가 절단되는 문제점이 있었다 (Moretti, T.; Koons, B.; Budowle, B. Biotechniques 1998, 25 (4), 716-722.). 또한 Taq DNA 중합효소를 항체를 통해 불활성화 시키는 기술이 개발되었다. 면역글로불린 기반의 Taq DNA 중합효소를 특이적으로 인식하는 항체는 낮은 온도에서는 효소에 결합하여 이의 활성을 억제하고 PCR 과정에서 온도가 상승함에 따라 효소로부터 분리되고 그 결과 중합효소가 활성화된다 (Scalice, E. R.; Sharkey, D. J.; Daiss, J. L. J. Immunol. Methods 1994, 172 (2), 147-163). 이러한 중화 항체는 간편하면서도 효과가 좋은 방법이나, 생산 단가가 비싸고, 생산 과정이 번거로우며 큰 분자량으로 인해 응집체를 형성하는 문제점이 있다.
대한민국 등록특허 제1488110호는 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용에 관한 것으로, 고온에서 발생하는 트랜스 스플라이싱 이용한 Hot start PCR 기술을 개시하고 있다.
하지만 여전히 기존의 방법을 대체할 수 있는, Taq DNA 중합효소에 결합하여 이의 활성을 중화할 수 있는 새로운 물질의 개발이 필요하다.
본원은 Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR에서 발생할 수 있는 비특이적 증폭을 Taq DNA 중합효소에 결합하는 폴리펩타이드를 이용하여 효과적으로 억제하여, 핵산 증폭의 효율성과 정확성 높일 수 있는 기술을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 인터날린 B 단백질의 N-말단; VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈; 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 아미노산 서열에서 45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N; 47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I; 67번 잔기는 Y, R, A 또는 K; 69번 잔기는 A 또는 K; 72번 잔기는 G 또는 A; 91번 잔기는 I, 또는 S; 93번 잔기는 T 또는 W; 94번 잔기는 G 또는 L; 115번 잔기는 V 또는 S; 117번 잔기는 V 또는 H; 그리고 118번 잔기는 E 또는 W인, Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.
일 구현예에서 본원에 따른 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드는 45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N; 47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I; 67번 잔기는 Y, R, A 또는 K; 69번 잔기는 A 또는 K; 72번 잔기는 G 또는 A; 91번 잔기는 S; 93번 잔기는 W; 94번 잔기는 L; 115번 잔기는 S; 117번 잔기는 H; 그리고 118번 잔기는 W인 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 구현예에서 본원에 따른 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드는 45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N; 47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I; 67번 잔기는 R; 69번 잔기는 K; 72번 잔기는 A; 91번 잔기는 S; 93번 잔기는 W; 94번 잔기는 L; 115번 잔기는 S; 117번 잔기는 H; 그리고 118번 잔기는 W인 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 잔기 중 45번, 47번, 49번, 67번, 69번, 72번, 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 및 118번 잔기 중 하나 이상이 표 1의 보존적 치환잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 양태에서 본원에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 다음 잔기에서 보존적 치환이 일어난 것으로, 상기 아미노산 서열에서 45번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 47번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N; 48번 잔기는 A, S, G, 또는 T; 49번 잔기는 I, L, V, M, 또는 F; 67번 잔기는 R, K, Q, 또는 H; 69번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N; 72번 잔기는 A, S, G, 또는 T; 91번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 93번 잔기는 W, Y, 또는 F; 94번 잔기는 L, I, V, M, 또는 F; 115번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 117번 잔기는 H, N, Q, R, 또는 Y; 118번 잔기는 W, Y, 또는 F이다.
일 구현예에서 본원에 따른 폴리펩타이드는 호모 또는 헤테로 다이머, 또는 세 개의 호모 또는 헤테로 트라이머를 형성하는 것인, Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오타이드의 서열은 예를 들면 서열번호 14 내지 24로 표시될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 벡터가 도입된 형질전환된 세포를 제공한다.
본원은 또한 본원에 개시된 하나 이상의 폴리펩타이드를 Hot start PCR에 사용하는 용도를 제공한다.
본원은 또한 본원에 개시된 하나 이상의 폴리펩타이드를 Hot start PCR 조성물의 제조에 사용하는 용도를 제공한다
또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 Hot Start용 PCR 조성물, 키트 또는 Hot Start PCR 방법을 제공한다.
본원에 따른 폴리펩타이드는 생산이 용이할 뿐 아니라, PCR이 개시되기 전까지는 Taq DNA 중합효소에 높은 친화력으로 결합하여 그의 활성을 억제하고, 변성 과정에서 반응물의 온도가 95℃에 도달하면 중합효소에서 효과적으로 분리되어, PCR 개시 전 낮은 온도에서 발생할 수 있는 비특이적인 증폭 현상을 방지할 수 있어, 저비용 고효율로 특이성이 높은 PCR 반응을 가능하게 한다.
도 1은 본원에 따른 폴리펩타이드의 스크리닝을 위해 사용된 Repebody-VLR4의 예시적 구조를 도식적으로 나타낸 것으로, 스크리닝을 위해 돌연변이가 도입된 모듈을 표시하였다. 순차적으로 첫 번째 단계에서 가장 높은 결합력을 보인 r-G6 클론은 두 번째 단계의 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용되었으며, 두 번째 선별단계에서 가장 높은 졀합력을 보인 r-G6E1 클론은 세 번째 단계의 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용되는 방식으로 총 3회의 라이브러리를 제작하였다. 첫 번째 라이브러리는 LRRV2 와 LRRV3의 오목영역에 돌연변이를 도입하였고 (노란색) 두 번째 라이브러리는 LRRV1에 (초록색), 세 번째 라이브러리는 LRR1에 (파란색) 돌연변이를 도입하였다. 각각의 라이브러리를 사용하여 단계별로 선별한 클론의 명칭은 그림 아래쪽에 표시되어 있다.
도 2는 상기 도 1의 첫 번째 라이브러리를 사용하여 선별한 클론 중 가장 높은 결합력을 보이는 클론인 r-G6을 ELISA를 통해 Taq DNA 중합효소에 대한 특이적인 결합여부를 확인한 결과이다. 클론 r-G6는 BSA에는 결합하지 않지만 Taq DNA 중합효소에 대해서는 특이적으로 결합함을 확인할 수 있다. 이때, 경쟁자로 넣어준 Taq DNA 중합효소에 결합하여 활성을 저해하는 것으로 알려진 항체 (JumpStart antibody; Sigma Aldrich)로 인해 Taq DNA 중합효소의 ELISA 신호가 감소한 것으로 보아 클론 r-G6가 상기 항체와 유사한 항원결정부위 (epitope)를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 3은 도 1에 기재된 방식으로 제작된 라이브러리를 이용하여 단계별로 파지 디스플레이의 바이오패닝을 수행한 결과 얻어진 모든 클론에서 변화된 아미노산 서열 및 그 해리상수를 ITC로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 첫 번째 단계에서 가장 높은 결합력을 보인 r-G6 클론은 두 번째 단계의 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용되었으며, 두 번째 선별단계에서 가장 높은 졀합력을 보인 r-G6E1 클론은 세 번째 단계의 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용되었다.
도 4는 3단계 라운드에서 선별된 r-G6E1H8 클론의 Taq DNA 중합효소 결합 특이도를 파지 ELISA 실험을 통해 분석한 결과이다.
도 5는 각각의 라운드에서 선별된 리피바디 클론들의 단백질 melting temperature를 CD (Circular dichroism) 분석기를 통해 측정한 결과이다.
도 6은 각각의 라운드에서 선별된 리피바디 클론들에 대하여 Taq DNA 중합효소의 활성 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 7은 3단계 라운드에서 선별된 r-G6E1H8 리피바디 클론으로 인하여 불활성화된 Taq DNA 중합효소가 신속히 재활성화 되는 것을 보여주는 실험 결과로, 기존의 항체 및 화학적으로 변형된 폴리머라제를 비교군으로 사용하였다.
도 8은 본원에서 선별된 리피바디 클론을 이용한 Hot start PCR 효과를 block PCR로 확인한 결과이다.
도 9는 본원에서 선별된 리피바디 클론들의 Hot start PCR 효과를 real time PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 본원에 따른 리피바디 클론을 연속적으로 연결한 형태의 다이머 (dimer)를 이용한 Taq DNA 중합효소의 활성 억제 효과를 분석한 결과이다.
본원에서는 Hot Start PCR에서 기존의 항체를 대체할 수 있는, Taq 중합효소에 특이적으로 결합하는 비-항체 단백질 골격(non-antibody protein scaffold)의 폴리펩타이드를 성공적으로 개발하였다.
본원에 따른 폴리펩타이드는 “리피바디(repebody)”로 칭하며, 이는 인터날린 B (Internalin B) 단백질의 N-말단, VRL (Variable Lymphocyte Receptor; 가변 림프구 수용체)의 변형된 LRR (Leucine rich repeat) 모듈 및 VRL 단백질의 C-말단이 융합된 폴리펩타이드로, 구조상 오목한 지역(Concave)와 볼록한 지역(Convex)으로 나누어 질 수 있다. 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위이며, 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. 모듈은 복수개를 포함하며, 특징에 따라 LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRV4, LRRV5, 및 LRRVe와 같이 구분될 수 있으며, 상기 모듈 중 하나 이상이 결여될 수 있다. 리피바디의 상세한 제조방법 및 구조는 대한민국 등록특허 제1356076호 및 대한민국 등록특허 제1517196호에 기재된 것을 참조할 수 있다.
리피바디는 크기가 항체의 1/5 수준이고, 대장균에서 대량생산 되며, 동물 실험결과 면역원성이 거의 없다. 또한, 열 및 pH 안정성이 매우 우수하고 타겟에 대한 결합력을 pico-mole 수준까지 매우 용이하게 증대시킬 수 있으며, 타겟에 대한 특이성이 매우 탁월하여 항체를 대체할 수 있는 대안으로 매우 유용하다.
특히 리피바디에 포함된 "LRR(Leucine rich repeat) 모듈"은 루이신이 일정한 위치에 반복되는 길이 20 내지 30개의 아미노산으로 반복패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌을, x는 임의의 아미노산을 의미한다.
본원에서는 도 1에 나타난 바와 같이 리피바디 구조에 기반하여 LRR 모듈의 특정 아미노산에 돌연변이를 도입하여, 결합력을 증대시키는 방식으로 순차적으로 돌연변이 라이브러리 제작하고 이로부터 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 효과적으로 저해할 수 있는 비항체 골격의 폴리펩타이드를 선별하였다.
본원에 따른 폴리펩타이드는 낮은 온도, 특히 PCR 반응에서 개시 변성 (initial denaturation) 반응이 시작되기 전, 또는 비특이적 프라이머 어닐링과 이로 인한 DNA 합성이 가능한 온도로 프라이머 어닐링 온도에 따라 상이할 수 있으나 예를 들면 50~60℃ 또는 50℃ 이하에서는 Taq DNA 중합효소에 결합하여 이의 활성을 저해하고 PCR 변성온도에서는 변성되면서 분리되어, Taq DNA 중합효소를 재활성화시키는 열적안정성을 갖는 Taq DNA 중합효소 억제제이다.
본원에서는 보다 효율적인 리피바디를 발굴하기 위해, 라이브러리 구축에 주형으로 사용되는 리피바디의 변성온도를 낮추고자 하였다. 이를 위해 상술한 참고 문헌에 기재된 바와 같은 기존의 리피바디에 포함된 모듈 중, 특히 LRRV4 모듈이 제거된다. 리피바디는 모듈의 개수가 열적 안정성에 영향을 미치고, 본원의 목적에 맞는 열적안정성을 갖는 억제제의 개발을 위해 모듈 한 개가 결여된 리피바디를 주형으로 사용하여 라이브러리를 제작하였다. 리피바디의 오목(concave) 영역에서 라이브러리를 생성하여 표적 물질에 특이적으로 결합하는 리피바디를 선별하는 방식으로 순차적 스크리닝을 통해 리피바디와 표적 물질간의 interface(결합부위)에 존재하는 잔기들 사이의 상호작용을 최적화를 통해 결합력의 향상을 도모하였다.
또한 본원에서는 결합력을 보다 향상시키기 위해 3회에 걸쳐 순차적으로 돌연변이를 도입하여 첫 번째 단계에서 가장 높은 결합력을 클론을 이용하여 두 번째 단계의 라이브러리를 제작하고, 두 번째 선별단계에서 가장 높은 결합력을 나타낸 클론을 이용하여 세 번째 단계의 라이브러리를 제작하였다.
본원에서는 첫 번째 단계에서는 오목영역 LRRV2 및 LRRV3의 서열번호 1의 잔기를 기준으로 91, 93, 94, 115, 117 및 118번 잔기에 돌연변이를 유발하여 Taq 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 선별한 후, 이를 이용하여 오목영역 LRRV1, 및 LRR1 영역에 순차적으로 67, 69, 71 및 72번 잔기에 2차 그리고, 45, 47, 49 및 50번에 3차 돌연변이를 유발하여 Taq 폴리머라제에 대한 결합력이 증가하는 폴리펩타이드를 선별하였다.
이에, 한 양태에서 본원은 인터날린 B 단백질의 N-말단; VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈; 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 서열에서 45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N; 47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I; 67번 잔기는 Y, R, A 또는 K; 69번 잔기는 A 또는 K; 72번 잔기는 G 또는 A; 91번 잔기는 I, 또는 S; 93번 잔기는 T 또는 W; 94번 잔기는 G 또는 L; 115번 잔기는 V 또는 S; 117번 잔기는 V 또는 H; 그리고 118번 잔기는 E 또는 W이다.
본원에서 “Taq DNA 중합효소 (Taq DNA polymerase)”는 열친화성 박테리아인 Thermus aquaticus에서 유래한 효소 또는 이와 동등한 활성을 나타내는 그 유도체 또는 변이체를 포함하는 것으로, 시중의 다양한 회사에서 구입할 수 있다. 본원에 따른 폴리펩타이드가 결합할 수 있는 한, 돌연변이가 유발된 다양한 형태 및/또는 유래의 Taq DNA 중합효소가 본원에 포함된다.
상술한 바와 같이 본원에 따른 폴리펩타이드는 선별 회차가 증가될수록 도입되는 돌연변이의 수가 증가하고, 결합력이 증가하나, 각 회차에서 Taq 중합효소에 대한 결합력을 근거로 선별되기 때문에, 3회차는 물론 1차 및 2차에서 선별된 돌연변이도 본원의 범위에 포함되는 것이다.
또한 순차적 방식으로 각 회차에서 상술한 잔기의 위치에서 인위적으로 돌연변이를 유발을 시도한 것으로, 상기 모든 위치에서 반드시 돌연변이가 유발되야 하는 것은 아니고, 각 회차에서 선별된 돌연변이 리피바디 또한 본원에 포함되는 것이다. 또한 결합력을 갖는 한 상기 하나 이상의 위치에서 돌연변이가 발생된 폴리펩타이드가 본원에 포함된다.
본원에 돌연변이 위치는 당업자의 자명하지 않은 노력을 통해 선별된 것이다. 구체적으로 첫 번째 단계의 선별에서는 리피바디의 LRRV2, LRRV3의 잔기 중에서 오목영역의 중앙에 해당하는 위치에 돌연변이를 유발하여 초기 선별된 리피바디 (G6)를 주형으로 하여 다음 단계의 선별에서는, 최초에 라이브러리를 제작한 두 개의 모듈의 양 옆으로 모듈을 하나씩 돌연변이를 추가로 주어 결합력을 증대시켰으나, C-말단부위의 모듈 부위의 돌연변이는 제외하였다. 따라서, Taq DNA 중합효소에 결합하는 리피바디는 LRRV2의 N-말단 모듈인 LRRV1에 두 번째 라이브러리를 주어 결합력이 증대된 클론 (G6E1)을 발굴하고, 다음으로 LRR1에 세 번째 라이브러리를 주어 결합력이 더욱 증대된 클론인 (G6E1H8)을 발굴하였다.
특히, 1회차 선별에서 가장 결합력이 우수한 폴리펩타이드를 2회차 선별에 사용하여, 2회차 선별에서 돌연변이 유발에 사용된 잔기 중의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이가 발생 된 폴리펩타이드가 본원에 포함된다. 마찬가지로 2회차 선별에서 가장 결합력이 우수한 폴리펩타이드를 3회차 선별에 사용하여, 3회차 선별에서 돌연변이 유발에 사용된 잔기 중의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이가 발생된 폴리펩타이드가 본원에 포함된다.
따라서 다른 양태에서 본원은 하기 서열을 갖는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 1차 스크리닝을 통해 선별된 폴리펩타이드로 91번 잔기는 S; 93번 잔기는 W; 94번 잔기는 L; 115번 잔기는 S; 117번 잔기는 H; 그리고 118번 잔기는 W를 가지며, 다른 위치, 즉 67번, 69번, 72번, 45번, 47번 및 49번 잔기는 상술한 바와 같은 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드이다.
마찬가지로 또 다른 양태에서 본원은 하기 서열을 갖는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 1차 스크리닝을 통해 선별된 폴리펩타이드로 91번 잔기는 S; 93번 잔기는 W; 94번 잔기는 L; 115번 잔기는 S; 117번 잔기는 H; 그리고 118번 잔기는 W; 그리고 여기에 2차에서 스크리닝을 통해 선별된 67번 잔기는 R; 69번 잔기는 K; 72번 잔기는 A이며, 다른 위치, 즉 45번, 47번 및 49번 잔기는 상술한 바와 같은 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드이다.
일 구현예에서 본원에 따른 Taq 중합효소에 대한 결합력을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시된다.
하지만 본원에 따른 펩타이드는 위와 같은 서열로 한정되는 것이 아니며, 이의 생물학적 균등물 (biological equivalents)를 포함하는 것이다. 생물학적 균등물이란, 본원에 개시된 아미노산 서열에 추가적인 변형을 가하였으나, 본원에 따른 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것으로, 이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하는 것이다.
일 구현예에서는 본원에 따른 Taq 중합효소에 대한 결합력을 갖는 폴리펩타이드에 보존적 아미노산 치환이 일어난 것을 포함한다.
보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이란 특정 폴리펩타이드가 갖는 활성을 실질적으로 영향을 미치거나 감소시키지 않는 치환을 의미하는 것으로, 예를 들면, 1 내지 15개의 보존적 치환, 1 내지 12개, 예를 들면 1, 2, 5, 7, 9, 12, 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서는 본원에 따른 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드에서 보존적 치환이 일어난 것으로, 특히 상기 폴리펩타이드의 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 118번, 67번, 69번, 72번, 45번, 47번 및 49번 잔기 중 하나 이상에 보존적 치환이 일어난 것이다.
다른 구현예에서는 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드에서 보존적 치환이 일어난 것으로, 특히 상기 폴리펩타이드의 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 118번, 67번, 69번, 72번, 45번, 47번 및 49번 잔기에 부가하여, 이외의 하나 이상의 잔기에서 보존적 치환이 발생한 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서는 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드에서 보존적 치환이 일어난 것으로, 특히 상기 폴리펩타이드의 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 118번, 67번, 69번, 72번, 45번, 47번 및 49번 잔기 이외의 하나 이상의 잔기에서 보존적 치환이 발생한 것을 포함한다.
보존적 아미노산 치환은 당업계에 알려진 것으로 예를 들면 Blosum (BLOcks SUbstitution Matrix) 기반한 표 1에 기재된 바와 같으며, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds); 및 Henikoff, S.; Henikoff, J.G. (1992). "Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks". PNAS 89 (22): 10915-10919. doi:10.1073/pnas.89.22.10915; WO2009012175 A1 등에 기재된 것을 참조할 수 있다.
[표 1]
Figure PCTKR2017004289-appb-I000001
본원에 따른 일 구현예에서는 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열 및 상기 서열에 보존적 치환이 일어난 서열을 포함하는 것이다.
특히, 서열번호 3 내지 13으로 표시되는 아미노산 서열에서 잔기 중 45번, 47번, 49번, 67번, 69번, 72번, 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 및 118번 잔기 중 하나 이상에서 보존적 치환이 일어난 것을 포함한다. 일예로 본원에 따른 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드에서, 보존적 치환을 고려하여, 45번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 47번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N; 48번 잔기는 A, S, G, 또는 T; 49번 잔기는 I, L, V, M, 또는 F; 67번 잔기는 R, K, Q, 또는 H; 69번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N; 72번 잔기는 A, S, G, 또는 T; 91번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 93번 잔기는 W, Y, 또는 F; 94번 잔기는 L, I, V, M, 또는 F; 115번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 117번 잔기는 H, N, Q, R, 또는 Y; 및 118번 잔기는 W, Y, 또는 F일 수 있다.
나아가 상술한 바와 같은 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 후술하는 바와 같이 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 것과 실질적 동일성을 갖는 것도 포함된다. 실질적 동일성은 본원에 개시된 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
다른 측면에서 본원은 또한 상술한 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다.
일 구현예에서 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14 내지 24로 표시될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며, 아미노산 코딩 서열의 축중변이 (degeneracy)로 인하여 변형된 폴리뉴클레오타이드를 또한 포함하는 것이며, 상술한 바와 같은 실질적 동일성을 갖는 것을 포함하는 것이다.
또한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 DNA 또는 RNA를 포함하는 것이다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드는 다양한 목적 예를 들면 생산을 위해 적절한 벡터에 도입되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절서열, 예를 들면 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열에 작동 가능하게 연결되어 사용될 수 있다. 이러한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드가 도입될 수 있는 벡터 또는 플라스미드는 숙주에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되는 것은 아니며, 구체적 목적에 맞추어 공지된 임의의 벡터가 사용될 수 있으며, 천연, 또는 재조합 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 벡터, 예컨대 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a 벡터 등을 사용할 수 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 적당한 숙주 내로 도입되어 사용될 수 있으며, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 세포는 진핵세포 및 원핵세포를 포함한다. 예를 들면, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 진균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현을 위해 다양한 형태로 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 다수의 폴리펩타이드로 구성된 호모 또는 헤테로 다이머, 또는 세 개의 호모 또는 헤테로 트라이머에 관한 것이다.
본원에 따른 다이머 또는 트라이머는 각 단위체가 N->C 말단 방향으로 또는 N 말단 또는 C 말단끼리 마주보는 방향으로 연결될 수도 있으나, 본원에 따른 효과를 나타내는 한 특정 방향으로 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 폴리펩타이드는 링커를 통해 연결될 수 있다. 본원에 따른 폴리펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는 당업계에 알려진 다양한 링커가 본원에 사용될 수 있다. 예를 들면 Chichili et al., PROTEIN SCIENCE 2013 VOL 22:153-167에 기재된 것을 참고할 수 있다. 일 구현예에서는 폴리-글라이신 또는 글라이신이 풍부한 아미노산으로 구성된 링커가 사용되며, 예를 들면 GGG, GGGGG, GGSSG 또는 GGSGG 등이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 측면에서 본원은 또한 (a) 상기 재조합 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포 또는 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 세포를 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.
본 발명에서, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.
다른 측면에서 본원을 또한 본원에 따른 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산 (폴리뉴클레오타이드)의 용도에 관한 것이다.
본원에 따른 폴리펩타이드는 낮은 온도에서 예를 들면 4℃ 내지 50℃에서 Taq DNA 중합효소에 결합하여, 합성 개시 전까지 효소의 활성을 억제하여, 합성의 특이성을 증가시킨다.
따라서 본원에 따른 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산은 본원에 따른 폴리펩타이드가 특정 온도에서 Taq DNA 폴리머라제에 결합하여 이의 활성의 저해가 필요한 다양한 용도로 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 Hot Start PCR 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 조성물은 본원에 따른 폴리펩타이드 이외에, Taq 중합효소, dNTP, Mg2 + 또는 Mn2 + 와 같은 2가 양이온, 염, 완충액, 보존제 및/또는 첨가제와 같은 PCR에 필요한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분 중에서 염의 예로는 KCl, NaCl, 완충액의 예로는 Tris-HCl, Sodium-/Potasium phosphate, 보존제의 예로는 Glycerol, 첨가제의 예로는 DMSO를 들 수 있으나 특별히 이들로 제한되는 것은 아니다. 구체적 사용 목적이나 용도에 따라 Hot start PCR 조성물은 또 다른 활성을 가지는 효소와 함께 섞일 수 있으며 예를 들어, Reverse Transcriptase, Uracil DNA glycosylase, Pfu DNA polymerase, dUTPase, Pyrophosphatase 과 함께 사용될 수 있으며, 이 경우 해당 효소의 활성을 나타내기 위해 필요한 조성물이 추가로 사용될 수 있거나, 변경될 수 있다.
다른 구현에에서는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 이용한 Hot Start PCR 방법에 관한 것이다. 본원에 따른 방법은 PCR 증폭에 필요한 성분 예를 들면 포워드 및 리버스 프라이머, 및 주형을 상술한 바와 같은 본원에 따른 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 PCR 조성물과 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 PCR이 가능한 조건에서 반응하는 단계를 포함한다. PCR이 가능한 조건은 예를 들면 95℃에서 약 1분간 반응한 뒤, 95℃에서 10초간 변성, 60℃에서 15초간 혼성, 72℃에서 20초간 합성의 세 단계를 1 사이클로 하여 총 45 사이클로 수행될 수 있으나, 이러한 조건으로 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 증폭되는 주형의 특징, 프라이머 특징, 완충액의 조성 등을 고려하여 적절한 조건을 선택할 수 있을 것이다.
다른 구현예에서 본원은 또한 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 이용한 Hot Start PCR 용도에 관한 것이며, 이에 대하여는 본원에 기재된 것을 참조할 수 있다.
또 다른 구현예에서 본원은 또한 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 이용한 Hot Start PCR 조성물의 제조 용도에 관한 것이며, 이에 대하여는 본원에 기재된 것을 참조할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 무작위적인 파지 라이브러리를 통한 Taq DNA 중합효소와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 선별
실시예 1-1: 단백질 구조 기반의 리피바디 라이브러리 구축
리피바디는 자연계에 존재하는 LRR 단백질들과 마찬가지로 보존된 류신 서열을 갖는 LRR 반복 단위체(Repeat unit)가 연속적으로 연결되어 전체 단백질 구조를 유지하는 모듈성과 전체적인 구조가 곡률로 인해 오목한 지역(Concave region)과 볼록한 지역(Convex region)으로 구별되는 구조적 특징을 갖으며, 전자는 생체 분자를 인식에 중요하고 후자는 구조 유지에 중요하다. 오목한 지역에는 항체의 상보성결정지역(complementarity determining region, CDR)처럼 초가변영역(Hypervariable region)이 위치하여, 단백질-단백질 상호작용을 매개한다. 또한, 볼록한 지역은 잘 보존되어 있는 서열을 바탕으로 LRR의 전체구조의 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 리피바디의 단백질 구조를 분석하여 하기의 같은 방식으로 무작위적인 라이브러리를 설계하였다.
구체적으로, 설계되지 않은 카르복시말단의 고리구조(C-term loop)에 의한 입체 장해(Steric hinderance)에서 벗어나기 위해 N 말단 방향에 위치한 연속적인 두 개의 변이 모듈(LRRV module 2 와 3)의 오목한 지역에 위치하는 여섯 개의 아미노산 잔기 91, 93, 94, 115, 117, 그리고 118번을 선택하였다. 그런 다음, 주형으로 서열번호 2의 서열을 갖는 폴리펩타이드로 모듈 (LRRV4) 한 개가 제거된 것을 사용하여, 상기 선택한 각 아미노산을 코딩하는 코돈을 NNK (N=A+G+C+T, K=G+T) 동의코돈(Degenerate codon)으로 치환하고, 나머지 볼록한 지역의 염기서열을 잠재성 돌연변이(Silent mutation)를 포함하도록 구성하도록 라이브러리를 구축하기 위한 돌연변이 유발 프라이머(Mutagenic primer)를 합성하여 사용하였다.
이어, 상기 프라이머들을 이용하여 두 모듈에 대한 겹침 중합효소 연쇄반응(Overlap PCR)을 수행하며 라이브러리 DNA (서열번호 25) 수득하고, 이를 파지미드 pBEL118M (Sang-Chul Lee et al., "Design of a binding scaffold based on variable lymphocyte receptors of jawless vertebrates by module engineering," PNAS, 2012, 109(9), 3299-3304.)에 삽입하여 1차 라이브러리 파지미드를 확보하였다. 이어 상기 확보된 라이브러리를 전기천공법(electroporation)으로 대장균 XL1-Blue에 도입하여 재조합 미생물을 수득함으로써, 1.0 x 108 수준의 합성적 다양성을 갖는 라이브러리를 구축하였다.
실시예 1-2: 리피바디 라이브러리의 패닝 과정을 통한 Taq DNA 중합효소와 결합하는 폴리펩타이드 선별
실시예 1-1에서 구축한 라이브러리를 사용하여 Taq DNA 중합효소에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 선별하여 정제하였다. 구체적으로 Taq DNA 중합효소와 결합할 수 있는 후보를 선별하기 위하여, Taq DNA 중합효소를 면역튜브 (Immuno-tube)에 100 ㎍/㎖의 농도로 가하고, 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 상기 코팅된 면역튜브를 PBS로 3회 세척하고, 1% BSA와 0.05 % Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBSA)으로 4℃에서 2시간 동안 블로킹(Blocking) 하였다. 그런 다음, 상기 정제된 파지를 1012 cfu/ml의 농도로 상기 코팅된 면역튜브에 가하고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 총 2분간 5번씩 및 PBS로 2번 세척하였다. 마지막으로, 1 ml 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)를 상기 면역튜브에 가하고, 상온에서 13분간 반응시킴으로써, Taq DNA 중합효소와 결합할 수 있는 리피바디 후보를 표면에 발현시킨 파지를 용출시켰다. 상기 용출액에 60 ㎕의 1.0 M Tris-HCl (pH 9.0)를 가하여 중화시키고, 숙주세포인 10 ml 대장균 XL1-Blue 용액(OD600 = 0.5)에 가한 다음, 2xYT 플레이트에 도말하는 바이오패닝(Bio-panning) 과정을 동일하게 4회 반복하여 수행하였다. 그 결과, 각 패닝 과정을 통해 Taq DNA 중합효소와 특이적으로 결합하는 파지가 농축됨을 확인하였다. 상기 결과는 Taq DNA 중합효소와 결합하는 라이브러리 파지가 특이적으로 증가함을 의미하는 것으로 분석되었다.
실시예 1-3: 1차 선별된 리피바디의 Taq DNA 중합효소에 대한 특이적인 결합여부 확인 및 서열 분석
실시예 1-2의 방법을 통하여 선별된 파지를 Taq DNA 중합효소와 BSA가 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 ELISA를 다음과 같이 수행하였다. Taq DNA 중합효소와 BSA를 코팅한 96-웰 플레이트를 TPBSA를 이용하여 상온에서 1시간 동안 blocking 과정을 수행한다. 리피바디가 디스플레이된 파지를 웰에 넣고 1시간 동안 incubation 한 다음, TPBS로 3번 washing 과정을 수행한다. 다음으로, HRP-conjugated anti-M13 monoclonal antibody (GE healthcare)를 1:5,000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리하고, TBS로 4번 washing 과정을 수행한다. 신호 검출을 위해 TMB solution (Sigma aldrich)를 처리하고, TMB와 동량의 1N H2SO4를 처리한 후에 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. BSA 대비 Taq DNA 중합효소의 흡광도(OD450)가 20배 이상 높은 리피바디 후보들을 선별하고, 염기서열 확정하고 이를 근거로 아미노산 서열을 도출하였고, 동일한 아미노산 서열을 갖는 클론을 제외하였다. 그 결과, 클론 r-G6만이 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
r-G6는 91번 아미노산인 이소루이신이 세린으로 치환되고, 93번 아미노산인 트레오닌이 트립토판으로 치환되며, 94번 아미노산인 글리신이 루이신으로 치환되고, 115번 아미노산인 발린이 세린으로 치환되고, 117번 아미노산인 발린이 히스티딘으로 치환되며, 118번 아미노산인 글루탐산이 트립토판으로 치환되었음을 확인하였다(서열번호 3). 상기 결과는 Taq DNA 중합효소와 결합하는데 중요한 역할을 수행하는 잔기가 존재하는 것을 나타낸다.
실시예 1-4: 선별된 리피바디의 항원결정부위 확인
상기 실시예 1-3에서 확보한 Taq DNA 중합효소에 결합하는 리피바디의 항원결정부위를 확인하였다. 이는 항원결정부위에 따라 리피바디가 Taq DNA 중합효소의 활성을 저해할 수 있는지를 판단할 수 있기 때문이다.
이러한 배경 하에, 상기 실시예 1-3에서 확보한 클론 r-G6에 대하여 상술한 바와 같이 ELISA를 수행하였다. 결과는 도 2에 기재되어 있다. 그 결과, 클론 r-G6는 BSA에는 결합하지 않으나, Taq DNA 중합효소에는 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 또한 Taq DNA 중합효소를 코팅한 플레이트에서 수용성 Taq DNA 중합효소 (soluble Taq; sTaq)을 첨가한 결과, ELISA의 신호가 감소됨을 통해서 다시 한 번 수용액 상에서도 선별된 리피바디가 Taq DNA 중합효소에 효과적으로 결합함을 확인하였다. 마지막으로, Taq DNA 중합효소에 결합하여 활성을 저해하는 것으로 알려진 항체 (JumpStart Antibody, Sigma Aldrich)와 경쟁적 ELISA를 수행한 결과, 클론 r-G6가 해당 항체에 의해 결합신호가 감소하는 것으로 확인됨에 따라 클론 r-G6의 항원결정부위가 기존의 항체와 유사하다는 것을 나타내고, Taq 중합효소 활성 저해에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 2: 모듈 기반 돌연변이 방법을 이용한 리피바디의 결합력이 보다 향상된 Taq DNA 중합효소 선별
이어 결합력을 보다 향상시키기 위하여, 선행특허(대한민국 등록특허 제1,356,076호)에 기재된 바와 같이 모듈 기반 친화력 증대 방법을 이용하여 보다 높은 수준의 친화력을 갖는 폴리펩타이드를 선별하였다.
실시예 1-3의 결과에서 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 것이 확인된 클론인 r-G6의 Taq DNA 중합효소에 대한 해리상수는 134.4 nM이지만 보다 효과적으로 Taq DNA 중합효소의 활성을 충분히 억제할 수 있는 폴리펩타이드를 선별하고자 추가적인 라이브러리를 구축하였다.
구체적으로, 첫 번째 모듈 기반 친화력 증대를 위한 라이브러리는 LRRV1 모듈에 위치한 67, 69, 71, 72번 총 4개 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하여 (도 3), 총 5번의 패닝과정을 거쳐서 결합력이 증대된 세 종류의 클론 (서열번호 4 내지 6)을 확보하였으며, 등온열량측정기를 이용하여 해리 상수를 측정한 결과, 세 종류의 클론 모두 Taq DNA 중합효소에 대한 결합력이 증대된 것을 확인하였다.
한편, 더더욱 향상된 결합력을 나타내는 돌연변이체를 개발하기 위해서 상기 클론 중 결합력이 가장 높은 클론 r-G6E1을 기본 폴리펩타이드로 하여 LRR1 모듈에 위치하는 45, 47, 48, 49번에 해당하는 네 개의 잔기에 돌연변이 시킨 후(도 3), 동일한 패닝과정을 거쳐 일곱 종류의 클론 (서열번호 7 내지 13)을 선별하였으며, 등온열량측정기를 이용하여 해리 상수를 측정한 결과, 여섯 종류의 클론이 Taq DNA 중합효소에 대해 결합력이 증대된 것을 확인하였고(도 3), 클론 r-G6E1H8이 Taq DNA 중합효소에 대하여 10.3 nM의 가장 높은 결합력을 보이는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은, Taq DNA 중합효소에 결합력을 갖는 리피바디를 성공적으로 확보하였으며, 이는 Taq DNA 중합효소에 특이적인 결합력을 갖는 폴리펩타이드임을 확인하였다.
실시예 3: 선별된 리피바디의 Taq DNA 중합효소에 대한 결합 특이도 확인
상기 실시예를 통해 선별된 리피바디가 Taq DNA 중합효소에만 특이적으로 결합하는지를 phage-ELISA 기법을 사용하여 확인하였다. 실험 방법은 실시예 1-3과 동일하게 진행하였으며 리피바디가 결합하지 않는 대조군 단백질은 mOrange 형광단백질 (Clontech), Lysozyme (Sigma aldrich), His-tag antibody (Santa Cruz), BSA (GenDEPOT)를 사용하였다. 해당 결과는 도 4에 나타나 있으며 선별된 리피바디 r-G6E1H8 이 대조군과 비교하여 Taq DNA 중합효소에만 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 선별된 리비파디들의 변성온도(melting temperature) 확인
상기 실시예를 통해 선별된 리피바디들의 열 안정성을 확인하기 위해 변성온도 측정 실험을 수행하였다. J-815 CD spectrometer (Jasco, Japan) 을 이용하여 222 nm 에서의 molar ellipticity를 30~80℃ 걸쳐 측정하였다. 측정 결과를 바탕으로 Thermal denaturation analysis program (Jasco, Japan)을 이용하여 변성온도를 계산하였다. 해당 결과는 도 5에 나타나 있으며 각각 r-G6는 59.9℃, r-G6E1은 65.4℃, r-G6E1H8은 62℃의 변성온도를 갖는 것으로 확인하였다. 따라서 이러한 결과는 PCR 반응과정에서 온도가 증가할 경우 리피바디 자체의 단백질 변성에 의해 Taq DNA 중합효소와의 결합이 해제되고, Taq DNA 중합효소는 정확한 신장온도에서 합성을 개시할 수 있게 됨을 나타내는 것이다.
실시예 5: 본원에 따른 리피바디의 Taq DNA 중합효소의 활성 저해 확인
이어 상기 실시예에서 선별된 리피바디가 실제 Taq DNA 중합효소의 활성 저해하는 지를 다음과 같이 분석하였다. 먼저 200 ng의 Taq DNA 중합효소와 리피바디 r-G6, r-G6E1, r-G6E1H8를 다양한 양 (0.05, 0.2, 1, 5 μg)으로 혼합하여 4℃에서 15분간 정치하여 Taq DNA 중합효소-리피바디 복합체를 형성하였다. 이 Taq DNA 중합효소-리피바디 복합체를 50μl의 반응액에 1 nmol 의 dNTP, 12.15 pmol 의 [3H]dTTP(0.1Ci/mmol), 2 mg/ml 의 activated calf thymus DNA 가 포함되도록 혼합하였다. 이 혼합액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후 11X stop buffer (110 mM EDTA, 2.2% SDS) 를 1X 로 혼합하여 반응을 중지시켰다. 최종적으로 Taq DNA 중합효소에 의해 생성된 방사성 DNA의 양을 액체섬광계수기로 측정함으로써 리피바디에 의한 Taq DNA 중합효소의 억제 효율을 계산하였다.
해당 결과는 도 6에 표시되어 있으며 Taq DNA 중합효소와의 결합력이 높은 순으로 Taq DNA 중합효소의 활성 억제력 또한 높은 것을 확인할 수 있으며, 이는 본원에서 개발된 폴리펩타이드가 Taq DNA 중합효소의 활성 억제하여 Hot Start PCR에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 6: 본원에 따른 리피바디를 이용한 Hot Start PCR 수행
실시예 6-1: Taq DNA 중합효소에 결합하는 리피바디를 이용한 block PCR 수행
실시예 1-3 내지 2-1의 방법을 통하여 선별된 리피바디 형태의 폴리펩타이드를 이용한 Hot start PCR 효과를 block PCR에서 특이도 및 민감도를 향상시킬 수 있는 지 여부를 확인하였다. 이를 위해 Taq DNA 중합효소와 선별된 각각의 리피바디 폴리펩타이드를 1:10의 비율로 혼합한 뒤, 반응 버퍼(10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 20 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP)에 첨가하여 20 μl 의 실시간 정량 PCR 혼합 용액을 제작하였다. 인간 cDNA를 주형으로 하여 GAPDH 부위를 forward primer; 5’-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3', reverse primer; 5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’를 사용하여 증폭하였다. 반응 조건은 95℃에서 1분간 반응한 뒤 95℃에서 10초간 변성, 60℃에서 15초간 혼성, 72℃에서 20초간 합성의 세 단계를 1 사이클로 하여 총 45 사이클을 반복하였다. 증폭 산물은 아가로즈 젤 전기영동 후 EtBr로 염색하여 확인하였다.
해당 결과는 도 8에 표시되어 있으며, 주형의 양이 1 pg으로 매우 적은 경우 잘 증폭이 되지 않는 GAPDH 타겟 밴드가 리피바디 r-G6E1H8을 사용하여 Hot start PCR을 수행할 경우 항체를 사용한 경우와 필적하게 효과적으로 증폭되는 것으로 확인되었다. 특히, 주형을 전혀 넣지 않은 경우 항체를 사용한 경우에는 비특이 증폭 밴드가 일부 나타나는 것을 확인하였지만, 본원에 따른 리피바디를 사용한 경우 전혀 증폭이 일어나지 않았으며, 이는 본원에 따른 리피바디의 월등한 Hot start PCR 효과를 나타낸다.
이러한 결과는 본원에 따른 리피바디는 Hot Start PCR에서 Taq DNA 중합효소를 효과적으로 억제하고, 또는 변성온도 이상에서는 효과적으로 분리되어 매우 특이적인 증폭 반응에 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 6-2: Taq DNA 중합효소에 결합하는 리피바디를 이용한 실시간 PCR 수행
실시예 1-3 내지 2-1의 방법을 통하여 선별된 리피바디 형태의 폴리펩타이드를 이용하여 실시간 PCR에서 Hot start 효과를 발휘하여 특이도 및 민감도를 향상시킬 수 있는 지 여부를 확인하였다. 실험 방법은 실시예 6-1과 동일하며 증폭 산물을 실시간으로 분석하기 위해 SYBR green I dye (Invitrogen)를 최종 농도 0.5X 로 첨가하였다. 주형 DNA로는 인간 cDNA를 (a) 에서는 100 pg, (b) 에서는 10 pg, (c) 에서는 1 pg을 사용하였으며 (d) 에서는 주형 DNA를 넣지 않았다. 도 9는 본원에서 선별된 클론들의 Hot start PCR 효과를 real time PCR로 확인한 결과로, 충분한 양의 주형 DNA를 넣어준 경우 Hot start PCR 구현 방식에 상관없이 모두 목적한 melting peak (85℃) 을 보이는 증폭 산물이 검출 되었지만 1 pg 이하의 적은 양의 주형 DNA를 넣어준 경우 결합력이 다소 낮은 리피바디를 사용하였거나 리피바디를 사용하지 않은 Taq DNA 중합효소의 경우 비특이 증폭 산물 (melting peak; 75℃ 부근 검출)이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이 중에서도 리피바디 r-G6E1H8를 사용한 경우 가장 특이도가 높은 것을 알 수 있었다.
실시예 6-3: 리피바디 Hot start PCR의 재활성화 소요 시간 측정
최종 선별된 리피바디 r-G6E1H8을 이용하여 real time PCR 에서 Hot start 효과를 발휘하기 위해 필요로 하는 최초 활성화시간의 길이를 측정하였다. 기본적인 실험 방법은 실시예 6-1과 동일하나 증폭산물을 실시간으로 분석하기 위해 TaqMan probe 방식의 realtime PCR을 수행하였다. 인간 cDNA를 주형으로 하여 β-Actin 부위를 forward primer; 5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’, reverse primer; 5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’, TaqMan probe; 5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TAMARA-3’ 를 사용하여 증폭하였으며 최초 활성화시간을 0.5, 1, 2, 5, 10, 15분으로 다양하게 설정하여 PCR을 수행하였다. 대조군으로는 화학적 처리를 통해 제작된 Taq DNA 중합효소(엔지노믹스, 대한민국)와 항체(JumpStart Antibody, Sigma Aldrich)를 혼합한 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. 해당 실험 결과는 도 7에 나타나 있으며, 리피바디를 사용한 경우 항체를 사용한 경우와 같이 95℃에서 0.5분 이내에 모두 재활성화가 잘 일어나서 Hot Start PCR에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7: 리피바디 dimer의 Taq DNA 중합효소의 활성 저해 확인
리피바디를 연속적으로 연결한 형태, 즉 dimer로 제작할 경우에도 Taq DNA 중합효소의 활성을 효과적으로 저해할 수 있는지 확인하기 위해서 다음과 같이 분석하였다. 이를 위해 선별된 r-G6E1H8 유전자를 3개의 글리신 아미노산을 링커로 사용하여 연속적으로 배치하여 r-G6E1H8 homodimer를 제작하였다. 해당 단백질을 대장균에 도입하여 단백질로 발현한 후 컬럼크로마토그래피 기법을 통해 순수 분리/정제하였다. 이렇게 얻어진 리피바디 dimer와 기존에 선별된 r-G6E1H8을 사용하여 실시예 5의 방법을 통해 Taq DNA 중합효소의 활성 억제력을 측정하였다.
해당 결과는 도 10에 표시되어 있다. 동일한 양(1μg)의 리피바디 monomer 와 dimer를 사용하였을 때 각각, monomer는 90%, dimer는 94%의 억제 효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 리피바디를 monomer 뿐만 아니라 dimer 형태로 제작하여도 Taq DNA 중합효소의 활성을 거의 비슷하거나 더 높은 효율로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는, Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드로,
    상기 아미노산 서열에서
    45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N;
    47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q;
    49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I;
    67번 잔기는 Y, R, A 또는 K,
    69번 잔기는 A 또는 K;
    72번 잔기는 G 또는 A;
    91번 잔기는 I, 또는 S;
    93번 잔기는 T 또는 W;
    94번 잔기는 G 또는 L;
    115번 잔기는 V 또는 S;
    117번 잔기는 V 또는 H; 그리고
    118번 잔기는 E 또는 W인, 폴리펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 서열을 갖는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드:
    91번 잔기는 S;
    93번 잔기는 W;
    94번 잔기는 L;
    115번 잔기는 S;
    117번 잔기는 H; 그리고
    118번 잔기는 W.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 서열을 갖는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드:
    67번 잔기는 R;
    69번 잔기는 K;
    72번 잔기는 A;
    91번 잔기는 S;
    93번 잔기는 W;
    94번 잔기는 L;
    115번 잔기는 S;
    117번 잔기는 H; 그리고
    118번 잔기는 W.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 잔기 중 45번, 47번, 49번, 67번, 69번, 72번, 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 및 118번 잔기 중 하나 이상이 표 1의 보존적 치환 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드로, 상기 아미노산 서열에서
    45번 잔기는 S, T, A, 또는 N;
    47번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N;
    49번 잔기는 I, L, V, M, 또는 F;
    67번 잔기는 R, K, Q, 또는 H;
    69번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N;
    72번 잔기는 A, S, G, 또는 T;
    91번 잔기는 S, T, A, 또는 N;
    93번 잔기는 W, Y, 또는 F;
    94번 잔기는 L, I, V, M, 또는 F;
    115번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 그리고
    117번 잔기는 H, N, Q, R, 또는 Y;
    118번 잔기는 W, Y, 또는 F.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 호모 또는 헤테로 다이머, 또는 세 개의 호모 또는 헤테로 트라이머를 형성하는 것인, Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 폴리큐클레오타이드는 서열번호 14 내지 24로 표시되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  10. 제 7 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 9 항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 Hot Start 용 PCR (Polymerase Chain Reaction) 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제 11 항의 PCR 조성물을 이용한 Hot Start PCR 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제 11 항의 PCR 조성물을 주형 및 PCR에 필요한 성분과 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 PCR이 가능한 조건에서 반응하는 단계를 포함하는, Hot Start PCR 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 Hot-start PCR에 사용하는 용도.
  15. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 Hot-start PCR 조성물의 제조에 사용하는 용도.
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