KR101840364B1

KR101840364B1 - Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도

Info

Publication number: KR101840364B1
Application number: KR1020160049832A
Authority: KR
Inventors: 황다은; 신용걸; 루완 무나싱하 파린다; 박소연; 서연수; 김학성
Original assignee: 주식회사 엔지노믹스; 한국과학기술원
Priority date: 2016-04-25
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2018-03-20
Also published as: ES2844928T3; EP3348566A2; PT3348566T; KR20170121426A; WO2017188668A2; WO2017188668A3; EP3348566A4; JP6426306B2; US10793900B2; US20180298422A1; EP3348566B1; JP2018521631A; PL3348566T3

Abstract

본 발명은 Taq DNA 중합효소와 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 재조합 벡터가 도입된 세포 및 상기 재조합 미생물을 이용한 폴리펩타이드 생산방법과 그 용도로서 본원에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 Hot Start PCR 조성물을 개시한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하여 그의 활성을 억제할 수 있으므로, Taq DNA 중합효소를 이용한 Hot start PCR에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도 {Polypeptide specifically binding to Taq DNA polymerase and Use Thereof}

본 발명은 핵산서열 증폭 기술 분야이다.

PCR (Polymerase Chain Reaction)은 특정 핵산을 증폭하는 방법으로 생물학, 생화학 및 의학분야에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이다 (Yamamoto, Y. Clin. Diagn . Lab. Immunol . 2002, 9 (3), 508-514). PCR은 변성, 프라이머 결합 및 신장으로 구성되는 세 가지 단계를 한 사이클로 해서 여러 사이클로 반복되며, 각 단계는 이에 적합한 온도에서 수행된다. PCR에 가장 널리 사용되는 효소는 Thermus aquaticus 유래의 Taq DNA 중합효소이며, 높은 온도에서 열안정으로 인해, 효율적이고 안정적인 PCR을 가능하게 한다.

하지만 Taq DNA 중합효소는 상온에서의 활성으로 인해 PCR의 변성 단계가 완전히 끝나기 전에 프라이머가 주형 핵산에 결합하거나, 또는 프라이머간의 이량체 형성을 한 경우, 이러한 주형으로부터 비특이적 증폭 반응을 가능하게 하고 이로 인해 유전자 증폭의 효율성과 정확성이 크게 떨어지는 단점이 있다.

이러한 원하지 않는 핵산의 증폭을 방지하기 위해 개발된 것이 특정 온도에 도달할때까지 Taq DNA 중합효소를 불활성화 상태로 유지하거나 또는 프라이머의 신장을 억제하는 Hot start PCR 기술이다 (Paul, N.; Shum, J.; Le, T. Methods Mol . Biol. 2010, 630, 301-318).

초기에는 중합효소를 제외한 PCR에 필요한 나머지 성분만을 변성온도인 95℃까지 예열한 후에 중합효소를 추가하는 기술이 사용되었으나, 추가의 처리과정으로 인해 불편이 초래되는 문제점이 있었다 (D’Aquila, R. T.; Bechtel, L. J.; Videler, J. a; Eron, J. J.; Gorczyca, P.; Kaplan, J. C. Nucleic Acids Res. 1991, 19 (13), 3749.). 다른 방법은 왁스 또는 비드를 이용해서 중합효소를 반응전까지 물리적으로 격리하는 기술이다. 하지만 이 역시 추가의 처리 과정 및 왁스의 재응결 등으로 인한 불편이 초래되고 반응의 효율성이 떨어지는 문제점이 있었다 (Hebert, B.; Bergeron, J.; Potworowski, E. F.; Tijssen, P. Molecular and cellular probes. 1993, pp 249-252.). 그 후 Taq DNA 중합효소의 활성을 화학적으로 억제하는 기술이 개발되었으나, 제조과정이 복잡하고 재활성화까지 10분 이상의 시간이 소요되며, 이로 인해 DNA가 절단되는 문제점이 있었다 (Moretti, T.; Koons, B.; Budowle, B. Biotechniques 1998, 25 (4), 716-722.). 또한 Taq DNA 중합효소를 항체를 통해 불활성화 시키는 기술이 개발되었다. 면역글로불린 기반의 Taq DNA 중합효소를 특이적으로 인식하는 항체는 낮은 온도에서는 효소에 결합하여 이의 활성을 억제하고 PCR 과정에서 온도가 상승함에 따라 효소로부터 분리되고 그 결과 중합효소가 활성화된다 (Scalice, E. R.; Sharkey, D. J.; Daiss, J. L. J. Immunol. Methods 1994, 172 (2), 147-163). 이러한 중화 항체는 간편하면서도 효과가 좋은 방법이나, 생산 단가가 비싸고, 생산 과정이 번거로우며 큰 분자량으로 인해 응집체를 형성하는 문제점이 있다.

대한민국 등록특허 제1488110호는 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용에 관한 것으로, 고온에서 발생하는 트랜스 스플라이싱 이용한 Hot start PCR 기술을 개시하고 있다.

하지만 여전히 기존의 방법을 대체할 수 있는, Taq DNA 중합효소에 결합하여 이의 활성을 중화할 수 있는 새로운 물질의 개발이 필요하다.

본원은 Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR에서 발생할 수 있는 비특이적 증폭을 Taq DNA 중합효소에 결합하는 폴리펩타이드를 이용하여 효과적으로 억제하여, 핵산 증폭의 효율성과 정확성 높일 수 있는 기술을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 인터날린 B 단백질의 N-말단; VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈인 LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRV4, LRRV5, LRRVe; 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 아미노산 서열에서 45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N; 47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I; 67번 잔기는 Y, R, A 또는 K; 69번 잔기는 A 또는 K; 72번 잔기는 G 또는 A; 91번 잔기는 I, 또는 S; 93번 잔기는 T 또는 W; 94번 잔기는 G 또는 L; 115번 잔기는 V 또는 S; 117번 잔기는 V 또는 H; 그리고 118번 잔기는 E 또는 W인, Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드는 45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N; 47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I; 67번 잔기는 Y, R, A 또는 K; 69번 잔기는 A 또는 K; 72번 잔기는 G 또는 A; 91번 잔기는 S; 93번 잔기는 W; 94번 잔기는 L; 115번 잔기는 S; 117번 잔기는 H; 그리고 118번 잔기는 W인 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.

다른 구현예에서 본원에 따른 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드는 45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N; 47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I; 67번 잔기는 R; 69번 잔기는 K; 72번 잔기는 A; 91번 잔기는 S; 93번 잔기는 W; 94번 잔기는 L; 115번 잔기는 S; 117번 잔기는 H; 그리고 118번 잔기는 W인 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 잔기 중 45번, 47번, 49번, 67번, 69번, 72번, 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 및 118번 잔기 중 하나 이상이 표 1의 보존적 치환잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

다른 양태에서 본원에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 다음 잔기에서 보존적 치환이 일어난 것으로, 상기 아미노산 서열에서 45번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 47번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N; 48번 잔기는 A, S, G, 또는 T; 49번 잔기는 I, L, V, M, 또는 F; 67번 잔기는 R, K, Q, 또는 H; 69번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N; 72번 잔기는 A, S, G, 또는 T; 91번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 93번 잔기는 W, Y, 또는 F; 94번 잔기는 L, I, V, M, 또는 F; 115번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 117번 잔기는 H, N, Q, R, 또는 Y; 118번 잔기는 W, Y, 또는 F이다.

일 구현예에서 본원에 따른 폴리펩타이드는 호모 또는 헤테로 다이머, 또는 세 개의 호모 또는 헤테로 트라이머를 형성하는 것인, Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오타이드의 서열은 예를 들면 서열번호 14 내지 24로 표시될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 벡터가 도입된 형질전환된 세포를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 Hot Start용 PCR 조성물, 키트 또는 Hot Start PCR 방법을 제공한다.

본원에 따른 폴리펩타이드는 생산이 용이할 뿐 아니라, PCR이 개시되기 전까지는 Taq DNA 중합효소에 높은 친화력으로 결합하여 그의 활성을 억제하고, 변성 과정에서 반응물의 온도가 95℃에 도달하면 중합효소에서 효과적으로 분리되어, PCR 개시 전 낮은 온도에서 발생할 수 있는 비특이적인 증폭 현상을 방지할 수 있어, 저비용 고효율로 특이성이 높은 PCR 반응을 가능하게 한다.

도 1은 본원에 따른 폴리펩타이드의 스크리닝을 위해 사용된 Repebody-VLR4의 구조를 도식적으로 나타낸 것으로, 스크리닝을 위해 돌연변이가 도입된 모듈을 표시하였다. 순차적으로 첫 번째 단계에서 가장 높은 결합력을 보인 r-G6 클론은 두 번째 단계의 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용되었으며, 두 번째 선별단계에서 가장 높은 졀합력을 보인 r-G6E1 클론은 세 번째 단계의 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용되는 방식으로 총 3회의 라이브러리를 제작하였다. 첫 번째 라이브러리는 LRRV2 와 LRRV3의 오목영역에 돌연변이를 도입하였고 (노란색) 두 번째 라이브러리는 LRRV1에 (초록색), 세 번째 라이브러리는 LRR1에 (파란색) 돌연변이를 도입하였다. 각각의 라이브러리를 사용하여 단계별로 선별한 클론의 명칭은 그림 아래쪽에 표시되어 있다.
도 2는 상기 도 1의 첫 번째 라이브러리를 사용하여 선별한 클론 중 가장 높은 결합력을 보이는 클론인 r-G6을 ELISA를 통해 Taq DNA 중합효소에 대한 특이적인 결합여부를 확인한 결과이다. 클론 r-G6는 BSA에는 결합하지 않지만 Taq DNA 중합효소에 대해서는 특이적으로 결합함을 확인할 수 있다. 이때, 경쟁자로 넣어준 Taq DNA 중합효소에 결합하여 활성을 저해하는 것으로 알려진 항체 (JumpStart antibody; Sigma Aldrich)로 인해 Taq DNA 중합효소의 ELISA 신호가 감소한 것으로 보아 클론 r-G6가 상기 항체와 유사한 항원결정부위 (epitope)를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 3은 도 1 기재된 방식으로 제작된 라이브러리를 이용하여 단계별로 파지 디스플레이의 바이오패닝을 수행한 결과 얻어진 모든 클론에서 변화된 아미노산 서열 및 그 해리상수를 ITC로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 첫 번째 단계에서 가장 높은 결합력을 보인 r-G6 클론은 두 번째 단계의 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용되었으며, 두 번째 선별단계에서 가장 높은 졀합력을 보인 r-G6E1 클론은 세 번째 단계의 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용되었다.
도 4는 3단계 라운드에서 선별된 r-G6E1H8 클론의 Taq DNA 중합효소 결합 특이도를 파지 ELISA 실험을 통해 분석한 결과이다.
도 5는 각각의 라운드에서 선별된 리피바디 클론들의 단백질 melting temperature를 CD (Circular dichroism) 분석기를 통해 측정한 결과이다.
도 6은 각각의 라운드에서 선별된 리피바디 클론들에 대하여 Taq DNA 중합효소의 활성 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 7은 3단계 라운드에서 선별된 r-G6E1H8 리피바디 클론으로 인하여 불활성화된 Taq DNA 중합효소가 신속히 재활성화 되는 것을 보여주는 실험 결과로, 기존의 항체 및 화학적으로 변형된 폴리머라제를 비교군으로 사용하였다.
도 8은 본원에서 선별된 리피바디 클론을 이용한 Hot start PCR 효과를 block PCR로 확인한 결과이다.
도 9는 본원에서 선별된 리피바디 클론들의 Hot start PCR 효과를 real time PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 본원에 따른 리피바디 클론을 연속적으로 연결한 형태의 다이머 (dimer)를 이용한 Taq DNA 중합효소의 활성 억제 효과를 분석한 결과이다.

본원에서는 Hot Start PCR에서 기존의 항체를 대체할 수 있는, Taq 중합효소에 특이적으로 결합하는 비-항체 단백질 골격(non-antibody protein scaffold)의 폴리펩타이드를 성공적으로 개발하였다.

본원에 따른 폴리펩타이드는 “리피바디(repebody)”로 칭하며, 이는 인터날린 B (Internalin B) 단백질의 N-말단, VRL (Variable Lymphocyte Receptor; 가변 림프구 수용체)의 변형된 LRR (Leucine rich repeat) 모듈 및 VRL 단백질의 C-말단이 융합된 폴리펩타이드로, 구조상 오목한 지역(Concave) 와 볼록한 지역(Convex) 으로 나누어 질 수 있다. 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위이며, 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. 리피바디의 상세한 제조방법 및 구조는 대한민국 등록특허 제1356076호 및 대한민국 등록특허 제1517196호에 기재된 것을 참조할 수 있다.

리피바디는 크기가 항체의 1/5 수준이고, 대장균에서 대량생산 되며, 동물 실험결과 면역원성이 거의 없다. 또한, 열 및 pH 안정성이 매우 우수하고 타겟에 대한 결합력을 pico-mole 수준까지 매우 용이하게 증대시킬 수 있으며, 타겟에 대한 특이성이 매우 탁월하여 항체를 대체할 수 있는 대안으로 매우 유용하다.

특히 리피바디에 포함된 "LRR(Leucine rich repeat) 모듈"은 루이신이 일정한 위치에 반복되는 길이 20 내지 30개의 아미노산으로 반복패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌을, x는 임의의 아미노산을 의미한다.

본원에서는 도 1 에 나타난 바와 같이 리피바디 구조에 기반하여 LRR 모듈의 특정 아미노산에 돌연변이를 도입하여, 결합력을 증대시키는 방식으로 순차적으로 돌연변이 라이브러리 제작하고 이로부터 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 효과적으로 저해할 수 있는 비항체 골격의 폴리펩타이드를 선별하였다.

본원에 따른 폴리펩타이드는 낮은 온도, 특히 PCR 반응에서 개시 변성 (initial denaturation) 반응이 시작되기 전, 또는 비특이적 프라이머 어닐링과 이로 인한 DNA 합성이 가능한 온도로 프라이머 어닐링 온도에 따라 상이할 수 있으나 예를 들면 50~60℃ 또는 50℃ 이하에서는 Taq DNA 중합효소의 활성을 저해하고 PCR 변성온도에서는 변성되면서 분리되어, Taq DNA 중합효소를 재활성화시키는 열적안정성을 갖는 Taq DNA 중합효소 억제제이다.

본원에서는 보다 효율적인 리피바디를 발굴하기 위해, 라이브러리 구축에 주형으로 사용되는 리피바디의 변성온도를 낮추고자 하였다. 이를 위해 상술한 참고 문헌에 기재된 바와 같은 기존의 리피바디에 포함된 모듈 한 개를 삭제하였다. 리피바디는 모듈의 개수가 열적 안정성에 영향을 미치고, 본원의 목적에 맞는 열적안정성을 갖는 억제제의 개발을 위해 모듈 한 개가 결여된 리피바디를 주형으로 사용하여 라이브러리를 제작하였다. 리피바디의 오목(concave) 영역에서 라이브러리를 생성하여 표적 물질에 특이적으로 결합하는 리피바디를 선별하는 방식으로 순차적 스크리닝을 통해 리피바디와 표적 물질간의 interface(결합부위)에 존재하는 잔기들 사이의 상호작용을 최적화를 통해 결합력의 향상을 도모하였다.

또한 본원에서는 결합력을 보다 향상시키기 위해 3회에 걸쳐 순차적으로 돌연변이를 도입하여 첫 번째 단계에서 가장 높은 결합력을 클론을 이용하여 두 번째 단계의 라이브러리를 제작하고, 두 번째 선별단계에서 가장 높은 결합력을 나타낸 클론을 이용하여 세 번째 단계의 라이브러리를 제작하였다.

본원에서는 첫 번째 단계에서는 오목영역 LRRV2 및 LRRV3의 서열번호 1의 잔기를 기준으로 91, 93, 94, 115, 117 및 118번 잔기에 돌연변이를 유발하여 Taq 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 선별한 후, 이를 이용하여 오목영역 LRRV1, 및 LRR1 영역에 순차적으로 67, 69, 71 및 72번 잔기에 2차 그리고, 45, 47, 49 및 50번에 3차 돌연변이를 유발하여 Taq 폴리머라제에 대한 결합력이 증가하는 폴리펩타이드를 선별하였다.

이에, 한 양태에서 본원은 인터날린 B 단백질의 N-말단; VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈; 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 서열에서 45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N; 47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I; 67번 잔기는 Y, R, A 또는 K; 69번 잔기는 A 또는 K; 72번 잔기는 G 또는 A; 91번 잔기는 I, 또는 S; 93번 잔기는 T 또는 W; 94번 잔기는 G 또는 L; 115번 잔기는 V 또는 S; 117번 잔기는 V 또는 H; 그리고 118번 잔기는 E 또는 W이다.

본원에서 “Taq DNA 중합효소 (Taq DNA polymerase)”는 열친화성 박테리아인 Thermus aquaticus에서 유래한 효소 또는 이와 동등한 활성을 나타내는 그 유도체 또는 변이체를 포함하는 것으로, 시중의 다양한 회사에서 구입할 수 있다.

상술한 바와 같이 본원에 따른 폴리펩타이드는 선별 회차가 증가될수록 도입되는 돌연변이의 수가 증가하고, 결합력이 증가하나, 각 회차에서 Taq 중합효소에 대한 결합력을 근거로 선별되기 때문에, 3회차는 물론 1차 및 2차에서 선별된 돌연변이도 본원의 범위에 포함되는 것이다.

또한 순차적 방식으로 각 회차에서 상술한 잔기의 위치에서 인위적으로 돌연변이를 유발을 시도한 것으로, 상기 모든 위치에서 반드시 돌연변이가 유발되야 하는 것은 아니고, 각 회차에서 선별된 돌연변이 리피바디 또한 본원에 포함되는 것이다. 또한 결합력을 갖는 한 상기 하나 이상의 위치에서 돌연변이가 발생된 폴리펩타이드가 본원에 포함된다.

본원에 돌연변이 위치는 당업자의 자명하지 않은 노력을 통해 선별된 것이다. 구체적으로 첫 번째 단계의 선별에서는 리피바디의 LRRV2, LRRV3의 잔기 중에서 오목영역의 중앙에 해당하는 위치에 돌연변이를 유발하여 초기 선별된 리피바디 (G6)를 주형으로 하여 다음 단계의 선별에서는, 최초에 라이브러리를 제작한 두 개의 모듈의 양 옆으로 모듈을 하나씩 돌연변이를 추가로 주어 결합력을 증대시켰으나, C-말단부위의 모듈 부위의 돌연변이는 제외하였다. 따라서, Taq DNA 중합효소에 결합하는 리피바디는 LRRV2의 N-말단 모듈인 LRRV1에 두 번째 라이브러리를 주어 결합력이 증대된 클론 (G6E1)을 발굴하고, 다음으로 LRR1에 세 번째 라이브러리를 주어 결합력이 더욱 증대된 클론인 (G6E1H8)을 발굴하였다.

특히, 1회차 선별에서 가장 결합력이 우수한 폴리펩타이드를 2회차 선별에 사용하여, 2회차 선별에서 돌연변이 유발에 사용된 잔기 중의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이가 발생 된 폴리펩타이드가 본원에 포함된다. 마찬가지로 2회차 선별에서 가장 결합력이 우수한 폴리펩타이드를 3회차 선별에 사용하여, 3회차 선별에서 돌연변이 유발에 사용된 잔기 중의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이가 발생된 폴리펩타이드가 본원에 포함된다.

따라서 다른 양태에서 본원은 하기 서열을 갖는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 1차 스크리닝을 통해 선별된 폴리펩타이드로 91번 잔기는 S; 93번 잔기는 W; 94번 잔기는 L; 115번 잔기는 S; 117번 잔기는 H; 그리고 118번 잔기는 W를 가지며, 다른 위치, 즉 67번, 69번, 72번, 45번, 47번 및 49번 잔기는 상술한 바와 같은 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드이다.

마찬가지로 또 다른 양태에서 본원은 하기 서열을 갖는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 1차 스크리닝을 통해 선별된 폴리펩타이드로 91번 잔기는 S; 93번 잔기는 W; 94번 잔기는 L; 115번 잔기는 S; 117번 잔기는 H; 그리고 118번 잔기는 W; 그리고 여기에 2차에서 스크리닝을 통해 선별된 67번 잔기는 R; 69번 잔기는 K; 72번 잔기는 A이며, 다른 위치, 즉 45번, 47번 및 49번 잔기는 상술한 바와 같은 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드이다.

일 구현예에서 본원에 따른 Taq 중합효소에 대한 결합력을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시된다.

하지만 본원에 따른 펩타이드는 위와 같은 서열로 한정되는 것이 아니며, 이의 생물학적 균등물 (biological equivalents)를 포함하는 것이다. 생물학적 균등물이란, 본원에 개시된 아미노산 서열에 추가적인 변형을 가하였으나, 본원에 따른 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것으로, 이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하는 것이다.

일 구현예에서는 본원에 따른 Taq 중합효소에 대한 결합력을 갖는 폴리펩타이드에 보존적 아미노산 치환이 일어난 것을 포함한다.

보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)이란 특정 폴리펩타이드가 갖는 활성을 실질적으로 영향을 미치거나 감소시키지 않는 치환을 의미하는 것으로, 예를 들면, 1 내지 15개의 보존적 치환, 1 내지 12개, 예를 들면 1, 2, 5, 7, 9, 12, 또는 15개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

일 구현예에서는 본원에 따른 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드에서 보존적 치환이 일어난 것으로, 특히 상기 폴리펩타이드의 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 118번, 67번, 69번, 72번, 45번, 47번 및 49번 잔기 중 하나 이상에 보존적 치환이 일어난 것이다.

다른 구현예에서는 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드에서 보존적 치환이 일어난 것으로, 특히 상기 폴리펩타이드의 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 118번, 67번, 69번, 72번, 45번, 47번 및 49번 잔기에 부가하여, 이외의 하나 이상의 잔기에서 보존적 치환이 발생한 것을 포함한다.

또 다른 구현예에서는 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드에서 보존적 치환이 일어난 것으로, 특히 상기 폴리펩타이드의 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 118번, 67번, 69번, 72번, 45번, 47번 및 49번 잔기 이외의 하나 이상의 잔기에서 보존적 치환이 발생한 것을 포함한다.

보존적 아미노산 치환은 당업계에 알려진 것으로 예를 들면 Blosum (BLOcks SUbstitution Matrix) 기반한 표 1에 기재된 바와 같으며, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds); 및 Henikoff, S.; Henikoff, J.G. (1992). "Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks". PNAS 89 (22): 10915-10919. doi:10.1073/pnas.89.22.10915; WO2009012175 A1 등에 기재된 것을 참조할 수 있다.

[표 1]

본원에 따른 일 구현예에서는 서열번호 3 내지 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열 및 상기 서열에 보존적 치환이 일어난 서열을 포함하는 것이다.

특히, 서열번호 3 내지 13으로 표시되는 아미노산 서열에서 잔기 중 45번, 47번, 49번, 67번, 69번, 72번, 91번, 93번, 94번, 115번, 117번, 및 118번 잔기 중 하나 이상에서 보존적 치환이 일어난 것을 포함한다. 일예로 본원에 따른 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드에서, 보존적 치환을 고려하여, 45번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 47번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N; 48번 잔기는 A, S, G, 또는 T; 49번 잔기는 I, L, V, M, 또는 F; 67번 잔기는 R, K, Q, 또는 H; 69번 잔기는 K, R, Q, E, 또는 N; 72번 잔기는 A, S, G, 또는 T; 91번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 93번 잔기는 W, Y, 또는 F; 94번 잔기는 L, I, V, M, 또는 F; 115번 잔기는 S, T, A, 또는 N; 117번 잔기는 H, N, Q, R, 또는 Y; 및 118번 잔기는 W, Y, 또는 F일 수 있다.

나아가 상술한 바와 같은 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 후술하는 바와 같이 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 것과 실질적 동일성을 갖는 것도 포함된다. 실질적 동일성은 본원에 개시된 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 상술한 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다.

일 구현예에서 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14 내지 24로 표시될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며, 아미노산 코딩 서열의 축중변이 (degeneracy)로 인하여 변형된 폴리뉴클레오타이드를 또한 포함하는 것이며, 상술한 바와 같은 실질적 동일성을 갖는 것을 포함하는 것이다.

또한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 DNA 또는 RNA를 포함하는 것이다.

본원에 따른 폴리뉴클레오타이드는 다양한 목적 예를 들면 생산을 위해 적절한 벡터에 도입되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절서열, 예를 들면 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열에 작동 가능하게 연결되어 사용될 수 있다. 이러한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드가 도입될 수 있는 벡터 또는 플라스미드는 숙주에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되는 것은 아니며, 구체적 목적에 맞추어 공지된 임의의 벡터가 사용될 수 있으며, 천연, 또는 재조합 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 벡터, 예컨대 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a 벡터 등을 사용할 수 있다.

본원에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 적당한 숙주 내로 도입되어 사용될 수 있으며, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 세포는 진핵세포 및 원핵세포를 포함한다. 예를 들면, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 진균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

본원에 따른 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현을 위해 다양한 형태로 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 다수의 폴리펩타이드로 구성된 호모 또는 헤테로 다이머, 또는 세 개의 호모 또는 헤테로 트라이머에 관한 것이다.

본원에 따른 다이머 또는 트라이머는 각 단위체가 N->C 말단 방향으로 또는 N 말단 또는 C 말단끼리 마주보는 방향으로 연결될 수도 있으나, 본원에 따른 효과를 나타내는 한 특정 방향으로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 폴리펩타이드는 링커를 통해 연결될 수 있다. 본원에 따른 폴리펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는 당업계에 알려진 다양한 링커가 본원에 사용될 수 있다. 예를 들면 Chichili et al., PROTEIN SCIENCE 2013 VOL 22:153-167에 기재된 것을 참고할 수 있다. 일 구현예에서는 폴리-글라이신 또는 글라이신이 풍부한 아미노산으로 구성된 링커가 사용되며, 예를 들면 GGG, GGGGG, GGSSG 또는 GGSGG 등이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 측면에서 본원은 또한 (a) 상기 재조합 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포 또는 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 세포를 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.

본 발명에서, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.

다른 측면에서 본원을 또한 본원에 따른 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 Hot Start PCR 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 폴리펩타이드는 낮은 온도에서 (4℃ 내지 50℃) Taq DNA 중합효소에 결합하여, 합성 개시 전까지 효소의 활성을 억제하여, 합성의 특이성을 증가시킨다. 본원에 따른 조성물은 본원에 따른 폴리펩타이드 이외에, Taq 중합효소, dNTP, Mg² ⁺또는 Mn² ⁺ 와 같은 2가 양이온, 염, 완충액, 보존제 및/또는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분 중에서 염의 예로는 KCl, NaCl, 완충액의 예로는 Tris-HCl, Sodium-/Potasium phosphate, 보존제의 예로는 Glycerol, 첨가제의 예로는 DMSO를 들 수 있으나 특별히 이들로 제한되는 것은 아니다. 구체적 사용 목적이나 용도에 따라 Hot start PCR 조성물은 또 다른 활성을 가지는 효소와 함께 섞일 수 있으며 예를 들어, Reverse Transcriptase, Uracil DNA glycosylase, Pfu DNA polymerase, dUTPase, Pyrophosphatase 과 함께 사용될 수 있으며, 이 경우 해당 효소의 활성을 나타내기 위해 필요한 조성물이 추가로 사용될 수 있거나, 변경될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 무작위적인 파지 라이브러리를 통한 Taq DNA 중합효소와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 선별

실시예 1-1: 단백질 구조 기반의 리피바디 라이브러리 구축

리피바디는 자연계에 존재하는 LRR 단백질들과 마찬가지로 보존된 류신 서열을 갖는 LRR 반복 단위체(Repeat unit)가 연속적으로 연결되어 전체 단백질 구조를 유지하는 모듈성과 전체적인 구조가 곡률로 인해 오목한 지역(Concave region)과 볼록한 지역(Convex region)으로 구별되는 구조적 특징을 갖으며, 전자는 생체 분자를 인식에 중요하고 후자는 구조 유지에 중요하다. 오목한 지역에는 항체의 상보성결정지역(complementarity determining region, CDR)처럼 초가변영역(Hypervariable region)이 위치하여, 단백질-단백질 상호작용을 매개한다. 또한, 볼록한 지역은 잘 보존되어 있는 서열을 바탕으로 LRR의 전체구조의 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 리피바디의 단백질 구조를 분석하여 하기의 같은 방식으로 무작위적인 라이브러리를 설계하였다.

구체적으로, 설계되지 않은 카르복시말단의 고리구조(C-term loop)에 의한 입체 장해(Steric hinderance)에서 벗어나기 위해 N 말단 방향에 위치한 연속적인 두 개의 변이 모듈(LRRV module 2 와 3)의 오목한 지역에 위치하는 여섯 개의 아미노산 잔기 91, 93, 94, 115, 117, 그리고 118번을 선택하였다. 그런 다음, 주형으로 서열번호 2의 서열을 갖는 폴리펩타이드로 모듈 한 개를 제거된 것을 사용하여, 상기 선택한 각 아미노산을 코딩하는 코돈을 NNK (N=A+G+C+T, K=G+T) 동의코돈(Degenerate codon)으로 치환하고, 나머지 볼록한 지역의 염기서열을 잠재성 돌연변이(Silent mutation)를 포함하도록 구성하도록 라이브러리를 구축하기 위한 돌연변이 유발 프라이머(Mutagenic primer)를 합성하여 사용하였다.

이어, 상기 프라이머들을 이용하여 두 모듈에 대한 겹침 중합효소 연쇄반응(Overlap PCR)을 수행하며 라이브러리 DNA (서열번호 25) 수득하고, 이를 파지미드 pBEL118M (Sang-Chul Lee et al., "Design of a binding scaffold based on variable lymphocyte receptors of jawless vertebrates by module engineering," PNAS, 2012, 109(9), 3299-3304입니다.)에 삽입하여 1차 라이브러리 파지미드를 확보하였다. 이어 상기 확보된 라이브러리를 전기천공법(electroporation)으로 대장균 XL1-Blue에 도입하여 재조합 미생물을 수득함으로써, 1.0x10⁸ 수준의 합성적 다양성을 갖는 라이브러리를 구축하였다.

실시예 1-2: 리피바디 라이브러리의 패닝 과정을 통한 Taq DNA 중합효소와 결합하는 폴리펩타이드 선별

실시예 1-1에서 구축한 라이브러리를 사용하여 Taq DNA 중합효소에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 선별하여 정제하였다. 구체적으로 Taq DNA 중합효소와 결합할 수 있는 후보를 선별하기 위하여, Taq DNA 중합효소를 면역튜브 (Immuno-tube)에 100 ㎍/㎖의 농도로 가하고, 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 상기 코팅된 면역튜브를 PBS로 3회 세척하고, 1% BSA와 0.05 % Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBSA)으로 4℃에서 2시간 동안 블로킹(Blocking) 하였다. 그런 다음, 상기 정제된 파지를 10¹²cfu/ml의 농도로 상기 코팅된 면역튜브에 가하고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 총 2분간 5번씩 및 PBS로 2번 세척하였다. 마지막으로, 1 ml 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)를 상기 면역튜브에 가하고, 상온에서 13분간 반응시킴으로써, Taq DNA 중합효소와 결합할 수 있는 리피바디 후보를 표면에 발현시킨 파지를 용출시켰다. 상기 용출액에 60 ㎕의 1.0 M Tris-HCl (pH 9.0)를 가하여 중화시키고, 숙주세포인 10 ml 대장균 XL1-Blue 용액(OD600 = 0.5)에 가한 다음, 2xYT 플레이트에 도말하는 바이오패닝(Bio-panning) 과정을 동일하게 4회 반복하여 수행하였다. 그 결과, 각 패닝 과정을 통해 Taq DNA 중합효소와 특이적으로 결합하는 파지가 농축됨을 확인하였다. 상기 결과는 Taq DNA 중합효소와 결합하는 라이브러리 파지가 특이적으로 증가함을 의미하는 것으로 분석되었다.

실시예 1- 3: 1차 선별된 리피바디의 Taq DNA 중합효소에 대한 특이적인 결합여부 확인 및 서열 분석

실시예 1-2의 방법을 통하여 선별된 파지를 Taq DNA 중합효소와 BSA가 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 ELISA를 다음과 같이 수행하였다. Taq DNA 중합효소와 BSA를 코팅한 96-웰 플레이트를 TPBSA를 이용하여 상온에서 1시간 동안 blocking 과정을 수행한다. 리피바디가 디스플레이된 파지를 웰에 넣고 1시간 동안 incubation 한 다음, TPBS로 3번 washing 과정을 수행한다. 다음으로, HRP-conjugated anti-M13 monoclonal antibody (GE healthcare)를 1:5,000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리하고, TBS로 4번 washing 과정을 수행한다. 신호 검출을 위해 TMB solution (Sigma aldrich)를 처리하고, TMB와 동량의 1N H2SO4를 처리한 후에 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. BSA 대비 Taq DNA 중합효소의 흡광도(OD₄₅₀)가 20배 이상 높은 리피바디 후보들을 선별하고, 염기서열 확정하고 이를 근거로 아미노산 서열을 도출하였고, 동일한 아미노산 서열을 갖는 클론을 제외하였다. 그 결과, 클론 r-G6만이 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

r-G6는 91번 아미노산인 이소루이신이 세린으로 치환되고, 93번 아미노산인 트레오닌이 트립토판으로 치환되며, 94번 아미노산인 글리신이 루이신으로 치환되고, 115번 아미노산인 발린이 세린으로 치환되고, 117번 아미노산인 발린이 히스티딘으로 치환되며, 118번 아미노산인 글루탐산이 트립토판으로 치환되었음을 확인하였다(서열번호 3). 상기 결과는 Taq DNA 중합효소와 결합하는데 중요한 역할을 수행하는 잔기가 존재하는 것을 나타낸다.

실시예 1-4: 선별된 리피바디의 항원결정부위 확인

상기 실시예 1-3에서 확보한 Taq DNA 중합효소에 결합하는 리피바디의 항원결정부위를 확인하였다. 이는 항원결정부위에 따라 리피바디가 Taq DNA 중합효소의 활성을 저해할 수 있는지를 판단할 수 있기 때문이다.

이러한 배경 하에, 상기 실시예 1-3에서 확보한 클론 r-G6에 대하여 상술한 바와 같이 ELISA를 수행하였다. 결과는 도 2에 기재되어 있다. 그 결과, 클론 r-G6는 BSA에는 결합하지 않으나, Taq DNA 중합효소에는 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 또한 Taq DNA 중합효소를 코팅한 플레이트에서 수용성 Taq DNA 중합효소 (soluble Taq; sTaq)을 첨가한 결과, ELISA의 신호가 감소됨을 통해서 다시 한 번 수용액 상에서도 선별된 리피바디가 Taq DNA 중합효소에 효과적으로 결합함을 확인하였다. 마지막으로, Taq DNA 중합효소에 결합하여 활성을 저해하는 것으로 알려진 항체 (JumpStart Antibody, Sigma Aldrich)와 경쟁적 ELISA를 수행한 결과, 클론 r-G6가 해당 항체에 의해 결합신호가 감소하는 것으로 확인됨에 따라 클론 r-G6의 항원결정부위가 기존의 항체와 유사하다는 것을 나타내고, Taq 중합효소 활성 저해에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 2: 모듈 기반 돌연변이 방법을 이용한 리피바디의 결합력이 보다 향상된 Taq DNA 중합효소 선별

이어 결합력을 보다 향상시키기 위하여, 선행특허(대한민국 등록특허 제1,356,076호)에 기재된 바와 같이 모듈 기반 친화력 증대 방법을 이용하여 보다 높은 수준의 친화력을 갖는 폴리펩타이드를 선별하였다.

실시예 1-3의 결과에서 Taq DNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 것이 확인된 클론인 r-G6의 Taq DNA 중합효소에 대한 해리상수는 134.4 nM이지만 보다 효과적으로 Taq DNA 중합효소의 활성을 충분히 억제할 수 있는 폴리펩타이드를 선별하고자 추가적인 라이브러리를 구축하였다.

구체적으로, 첫 번째 모듈 기반 친화력 증대를 위한 라이브러리는 LRRV1 모듈에 위치한 67, 69, 71, 72번 총 4개 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하여 (도 3), 총 5번의 패닝과정을 거쳐서 결합력이 증대된 세 종류의 클론 (서열번호 4 내지 6)을 확보하였으며, 등온열량측정기를 이용하여 해리 상수를 측정한 결과, 세 종류의 클론 모두 Taq DNA 중합효소에 대한 결합력이 증대된 것을 확인하였다.

한편, 더더욱 향상된 결합력을 나타내는 돌연변이체를 개발하기 위해서 상기 클론 중 결합력이 가장 높은 클론 r-G6E1을 기본 폴리펩타이드로 하여 LRR1 모듈에 위치하는 45, 47, 48, 49번에 해당하는 네 개의 잔기에 돌연변이 시킨 후(도 3), 동일한 패닝과정을 거쳐 일곱 종류의 클론 (서열번호 7 내지 13)을 선별하였으며, 등온열량측정기를 이용하여 해리 상수를 측정한 결과, 여섯 종류의 클론이 Taq DNA 중합효소에 대해 결합력이 증대된 것을 확인하였고(도 3), 클론 r-G6E1H8이 Taq DNA 중합효소에 대하여 10.3 nM의 가장 높은 결합력을 보이는 것을 확인하였다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은, Taq DNA 중합효소에 결합력을 갖는 리피바디를 성공적으로 확보하였으며, 이는 Taq DNA 중합효소에 특이적인 결합력을 갖는 폴리펩타이드임을 확인하였다.

실시예 3: 선별된 리피바디의 Taq DNA 중합효소에 대한 결합 특이도 확인

상기 실시예를 통해 선별된 리피바디가 Taq DNA 중합효소에만 특이적으로 결합하는지를 phage-ELISA 기법을 사용하여 확인하였다. 실험 방법은 실시예 1-3과 동일하게 진행하였으며 리피바디가 결합하지 않는 대조군 단백질은 mOrange 형광단백질 (Clontech), Lysozyme (Sigma aldrich), His-tag antibody (Santa Cruz), BSA (GenDEPOT)를 사용하였다. 해당 결과는 도 4에 나타나 있으며 선별된 리피바디 r-G6E1H8 이 대조군과 비교하여 Taq DNA 중합효소에만 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 선별된 리비파디들의 변성온도 (melting temperature) 확인

상기 실시예를 통해 선별된 리피바디들의 열 안정성을 확인하기 위해 변성온도 측정 실험을 수행하였다. J-815 CD spectrometer (Jasco, Japan) 을 이용하여 222 nm 에서의 molar ellipticity를 30~80℃ 걸쳐 측정하였다. 측정 결과를 바탕으로 Thermal denaturation analysis program (Jasco, Japan)을 이용하여 변성온도를 계산하였다. 해당 결과는 도 5에 나타나 있으며 각각 r-G6는 59.9℃, r-G6E1은 65.4℃, r-G6E1H8은 62℃의 변성온도를 갖는 것으로 확인하였다. 따라서 이러한 결과는 PCR 반응과정에서 온도가 증가할 경우 리피바디 자체의 단백질 변성에 의해 Taq DNA 중합효소와의 결합이 해제되고, Taq DNA 중합효소는 정확한 신장온도에서 합성을 개시할 수 있게 됨을 나타내는 것이다.

실시예 5: 본원에 따른 리피바디의 Taq DNA 중합효소의 활성 저해 확인

이어 상기 실시예에서 선별된 리피바디가 실제 Taq DNA 중합효소의 활성 저해하는 지를 다음과 같이 분석하였다. 먼저 200 ng의 Taq DNA 중합효소와 리피바디 r-G6, r-G6E1, r-G6E1H8를 다양한 양 (0.05, 0.2, 1, 5 μg)으로 혼합하여 4℃에서 15분간 정치하여 Taq DNA 중합효소-리피바디 복합체를 형성하였다. 이 Taq DNA 중합효소-리피바디 복합체를 50 μl의 반응액에 1 nmol 의 dNTP, 12.15 pmol 의 [³H]dTTP(0.1Ci/mmol), 2 mg/ml 의 activated calf thymus DNA 가 포함되도록 혼합하였다. 이 혼합액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후 11X stop buffer (110 mM EDTA, 2.2% SDS) 를 1X 로 혼합하여 반응을 중지시켰다. 최종적으로 Taq DNA 중합효소에 의해 생성된 방사성 DNA의 양을 액체섬광계수기로 측정함으로써 리피바디에 의한 Taq DNA 중합효소의 억제 효율을 계산하였다.

해당 결과는 도 6에 표시되어 있으며 Taq DNA 중합효소와의 결합력이 높은 순으로 Taq DNA 중합효소의 활성 억제력 또한 높은 것을 확인할 수 있으며, 이는 본원에서 개발된 폴리펩타이드가 Taq DNA 중합효소의 활성 억제하여 Hot Start PCR에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 6: 본원에 따른 리피바디를 이용한 Hot Start PCR 수행

실시예 6-1: Taq DNA 중합효소에 결합하는 리피바디를 이용한 block PCR 수 행

실시예 1-3 내지 2-1의 방법을 통하여 선별된 리피바디 형태의 폴리펩타이드를 이용한 Hot start PCR 효과를 block PCR에서 특이도 및 민감도를 향상시킬 수 있는 지 여부를 확인하였다. 이를 위해 Taq DNA 중합효소와 선별된 각각의 리피바디 폴리펩타이드를 1:10의 비율로 혼합한 뒤, 반응 버퍼(10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 20 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP)에 첨가하여 20 μl 의 실시간 정량 PCR 혼합 용액을 제작하였다. 인간 cDNA를 주형으로 하여 GAPDH 부위를 forward primer; 5’-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3', reverse primer; 5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’를 사용하여 증폭하였다. 반응 조건은 95℃에서 1분간 반응한 뒤 95℃에서 10초간 변성, 60℃에서 15초간 혼성, 72℃에서 20초간 합성의 세 단계를 1 사이클로 하여 총 45 사이클을 반복하였다. 증폭 산물은 아가로즈 젤 전기영동 후 EtBr로 염색하여 확인하였다.

해당 결과는 도 8에 표시되어 있으며, 주형의 양이 1 pg으로 매우 적은 경우 잘 증폭이 되지 않는 GAPDH 타겟 밴드가 리피바디 r-G6E1H8을 사용하여 Hot start PCR을 수행할 경우 항체를 사용한 경우와 필적하게 효과적으로 증폭되는 것으로 확인되었다. 특히, 주형을 전혀 넣지 않은 경우 항체를 사용한 경우에는 비특이 증폭 밴드가 일부 나타나는 것을 확인하였지만, 본원에 따른 리피바디를 사용한 경우 전혀 증폭이 일어나지 않았으며, 이는 본원에 따른 리피바디의 월등한 Hot start PCR 효과를 나타낸다.

이러한 결과는 본원에 따른 리피바디는 Hot Start PCR에서 Taq DNA 중합효소를 효과적으로 억제하고, 또는 변성온도 이상에서는 효과적으로 분리되어 매우 특이적인 증폭 반응에 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 6-2: Taq DNA 중합효소에 결합하는 리피바디를 이용한 실시간 PCR 수 행

실시예 1-3 내지 2-1의 방법을 통하여 선별된 리피바디 형태의 폴리펩타이드를 이용하여 실시간 PCR에서 Hot start 효과를 발휘하여 특이도 및 민감도를 향상시킬 수 있는 지 여부를 확인하였다. 실험 방법은 실시예 6-1과 동일하며 증폭 산물을 실시간으로 분석하기 위해 SYBR green I dye (Invitrogen)를 최종 농도 0.5X 로 첨가하였다. 주형 DNA로는 인간 cDNA를 (a) 에서는 100 pg, (b) 에서는 10 pg, (c) 에서는 1 pg을 사용하였으며 (d) 에서는 주형 DNA를 넣지 않았다. 도 9는 본원에서 선별된 클론들의 Hot start PCR 효과를 real time PCR로 확인한 결과로, 충분한 양의 주형 DNA를 넣어준 경우 Hot start PCR 구현 방식에 상관없이 모두 목적한 melting peak (85℃) 을 보이는 증폭 산물이 검출 되었지만 1 pg 이하의 적은 양의 주형 DNA를 넣어준 경우 결합력이 다소 낮은 리피바디를 사용하였거나 리피바디를 사용하지 않은 Taq DNA 중합효소의 경우 비특이 증폭 산물 (melting peak; 75℃ 부근 검출)이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이 중에서도 리피바디 r-G6E1H8를 사용한 경우 가장 특이도가 높은 것을 알 수 있었다.

실시예 6-3: 리피바디 Hot start PCR 의 재활성화 소요 시간 측정

최종 선별된 리피바디 r-G6E1H8을 이용하여 real time PCR 에서 Hot start 효과를 발휘하기 위해 필요로 하는 최초 활성화시간의 길이를 측정하였다. 기본적인 실험 방법은 실시예 6-1과 동일하나 증폭산물을 실시간으로 분석하기 위해 TaqMan probe 방식의 realtime PCR을 수행하였다. 인간 cDNA를 주형으로 하여 β-Actin 부위를 forward primer; 5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’, reverse primer; 5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’, TaqMan probe; 5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TAMARA-3’ 를 사용하여 증폭하였으며 최초 활성화시간을 0.5, 1, 2, 5, 10, 15분으로 다양하게 설정하여 PCR을 수행하였다. 대조군으로는 화학적 처리를 통해 제작된 Taq DNA 중합효소(엔지노믹스, 대한민국)와 항체(JumpStart Antibody, Sigma Aldrich)를 혼합한 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. 해당 실험 결과는 도 7에 나타나 있으며, 리피바디를 사용한 경우 항체를 사용한 경우와 같이 95℃에서 0.5분 이내에 모두 재활성화가 잘 일어나서 Hot Start PCR에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 7: 리피바디 dimer 의 Taq DNA 중합효소의 활성 저해 확인

리피바디를 연속적으로 연결한 형태, 즉 dimer로 제작할 경우에도 Taq DNA 중합효소의 활성을 효과적으로 저해할 수 있는지 확인하기 위해서 다음과 같이 분석하였다. 이를 위해 선별된 r-G6E1H8 유전자를 3개의 글리신 아미노산을 링커로 사용하여 연속적으로 배치하여 r-G6E1H8 homodimer를 제작하였다. 해당 단백질을 대장균에 도입하여 단백질로 발현한 후 컬럼크로마토그래피 기법을 통해 순수 분리/정제하였다. 이렇게 얻어진 리피바디 dimer와 기존에 선별된 r-G6E1H8을 사용하여 실시예 5의 방법을 통해 Taq DNA 중합효소의 활성 억제력을 측정하였다.

해당 결과는 도 10에 표시되어 있다. 동일한 양(1 μg)의 리피바디 monomer 와 dimer를 사용하였을 때 각각, monomer는 90%, dimer는 94%의 억제 효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 리피바디를 monomer 뿐만 아니라 dimer 형태로 제작하여도 Taq DNA 중합효소의 활성을 거의 비슷하거나 더 높은 효율로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Enzynomics Inc.and Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Polypeptide specifically binding to Taq DNA polymerase and Use Thereof <130> DP201601007P <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody <220> <221> BINDING <222> (45) <223> X= Q, S, R, Y, V or N <220> <221> BINDING <222> (47) <223> X= I, T, K, A or Q <220> <221> BINDING <222> (49) <223> X= N, H, L, M or I <220> <221> BINDING <222> (67) <223> X= Y, R, A or K <220> <221> BINDING <222> (69) <223> X= A or K <220> <221> BINDING <222> (72) <223> X= G or A <220> <221> BINDING <222> (91) <223> X= I or S <220> <221> BINDING <222> (93) <223> X= T or W <220> <221> BINDING <222> (94) <223> X= G or L <220> <221> BINDING <222> (115) <223> X= V or S <220> <221> BINDING <222> (117) <223> X= V or H <220> <221> BINDING <222> (118) <223> X= E or W <400> 1 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile 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Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 145 150 155 160 Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 165 170 175 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 180 185 190 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 195 200 205 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 210 215 220 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 225 230 235 240 Pro Thr <210> 12 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1H7 <400> 12 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ile Thr Ala 35 40 45 His Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Arg Leu Lys Leu Gly Ala Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Ser Leu Trp Leu Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Ser Leu His Trp Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 145 150 155 160 Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 165 170 175 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 180 185 190 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 195 200 205 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 210 215 220 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 225 230 235 240 Pro Thr <210> 13 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1H8 <400> 13 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ile Lys Ala 35 40 45 Ile Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Arg Leu Lys Leu Gly Ala Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Ser Leu Trp Leu Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Ser Leu His Trp Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 145 150 155 160 Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 165 170 175 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 180 185 190 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 195 200 205 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 210 215 220 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 225 230 235 240 Pro Thr <210> 14 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6 <400> 14 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcat tgcgaataac tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtta cctggccctg ggtggcaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc agctgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 15 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1 <400> 15 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcat tgcgaataac tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtcg tctgaagctg ggtgcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 16 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E3 <400> 16 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcat tgcgaataac tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtaa gctgaagctg ggtgctaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 17 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6D9 <400> 17 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcat tgcgaataac tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtgc tctgaagctg ggggcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 18 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1A1 <400> 18 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg actatatcgc ggcgattaat tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtcg tctgaagctg ggtgcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 19 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1A8 <400> 19 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg acaggatcac ggcgatgaat tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtcg tctgaagctg ggtgcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 20 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1B11 <400> 20 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg acaatatcca ggcgaataat tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtcg tctgaagctg ggtgcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 21 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1F11 <400> 21 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg acgttatcac ggcgattaat tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtcg tctgaagctg ggtgcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 22 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1H6 <400> 22 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accgtatcaa ggcgctgaat tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtcg tctgaagctg ggtgcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 23 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1H7 <400> 23 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg acagtatcac ggcgcataat tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtcg tctgaagctg ggtgcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 24 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taq Polymerase Repebody r-G6E1H8 <400> 24 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg acagtatcaa ggcgattaat tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtcg tctgaagctg ggtgcgaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg tctctgtggc ttaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgtcgctgca ttggaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726 <210> 25 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Repebody-VLR4 <220> <221> misc_binding <222> (271)..(354) <223> N=A+G+C+T, K=G+T <400> 25 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcat tgcgaataac tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtta cctggccctg ggtggcaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg nnkctgnnkn nkaaccaact gcagagcctg 300 ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgnnkctgnn knnkaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgga actggatctg 420 tcctataacc aactgcagtc actgccggaa ggtgttttcg acaaactgac ccagctgaaa 480 gatctgcgcc tgtaccagaa tcagctgaaa tcggtcccgg acggcgtgtt tgatcgtctg 540 accagcctgc agtatatctg gctgcatgat aacccgtggg attgcacctg tccgggtatt 600 cgctacctgt ctgaatggat caataaacac agtggcgttg tccgtaactc cgcgggttca 660 gttgccccgg attcggcgaa atgctccggc agcggtaaac cggtgcgtag cattatttgc 720 ccgacc 726

Claims

인터날린 B 단백질의 N-말단; VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈인 LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRV5; 및 VLR 단백질의 C-말단을 포함하는 다음 중 어느 하나의 서열로 표시되는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 비항체 폴리펩타이드:
서열번호 1의 폴리펩타이드에서,
상기 LRRV2 및 LRRV3에 위치하는
91번 잔기는 S;
93번 잔기는 W;
94번 잔기는 L;
115번 잔기는 S;
117번 잔기는 H;
118번 잔기는 W;
상기 LRRV1에 위치하는
67번 잔기는 Y, R, A 또는 K;
69번 잔기는 A 또는 K;
72번 잔기는 G 또는 A;
상기 LRR1에 위치하는
45번 잔기는 Q, S, R, Y, V, 또는 N;
47번 잔기는 I, T, K, A, 또는 Q; 및
49번 잔기는 N, H, L, M 또는 I임.
제 1 항에 있어서,
상기 LRRV1에 위치하는 잔기의 서열은 하기로 표시되는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 비항체 폴리펩타이드:
67번 잔기는 R, A 또는 K,
69번 잔기는 K; 및
72번 잔기는 A임.
제 2 항에 있어서,
상기 LRR1에 위치하는 잔기의 서열은 하기로 표시되는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 비항체 폴리펩타이드:
45번 잔기는 S, R, Y, V, 또는 N;
47번 잔기는 T, K, A, 또는 Q; 및
49번 잔기는 H, L, M 또는 I임.
제 1 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드.
삭제
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 호모 또는 헤테로 다이머, 또는 세 개의 호모 또는 헤테로 트라이머를 형성하는 것인, Taq DNA 중합효소에 선택적으로 결합하는 폴리펩타이드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제 7 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14 내지 24 중 어느 하나로 표시되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
제 7 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제 9 항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 Hot Start 용 PCR 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 이용한 Hot Start PCR 방법.