CN112409490A - Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Taq酶5’‑3’外切酶活性封闭单克隆抗体，包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：10所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：11所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：12所示，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：6所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：7所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：8所示。本发明还公开了所述单克隆抗体的应用。本发明的单克隆抗体的封闭效果好。制备获得的双封闭热启动酶的稳定性好。

Description

Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域， 具体地说，是关于一种Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用。
背景技术
核酸检测行业人都格外关注检测试剂的稳定性，不管是长期储存稳定性还是短期偏离正常保存条件的稳定性，都直接影响检测结果的有效性。而短期偏离正常保存条件的稳定性在实际使用和运输过程中尤为重要，比如遇到样本量大、适配自动化、排队等待上机等情况，反应体系需要在室温或4℃放置，再比如遇到运输时间长，温度难以控制，检测体系就暴露在风险之下。如何保证稳定性，如何确保检测结果有效、可信，是行业关注的难点。非特异性扩增直接影响检测结果的判读，还消耗反应体系中的引物等物料，导致目的基因扩增失败。试剂开发人员通过优化引物、调整镁离子浓度和酶量、调整退火温度等方法避免非特异性扩增，但仍需谨慎操作，稍不留意也会导致检测失败。
目前常用抗体法热启动Taq酶帮助提升试剂稳定性和解决非特异性扩增问题。传统的抗体法热启动，是利用Taq 酶的聚合酶活性封闭抗体封闭其5’-3’聚合酶活性，防止在低温时错配或引物二聚体引起非特异性扩增，在PCR预变性95℃加热时，抗体蛋白变性，释放聚合酶活性，不影响正常扩增。聚合酶活性封闭抗体可以有效防止错配引起的非特异性扩增，提升了全预混反应体系的稳定性，然而Taq酶除了具有5’-3’聚合酶活性，还有5’-3’外切酶活性，这部分外切酶活性可能会在低温时导致错配探针或其它物料降解，造成非特异信号。因此不仅需要封闭Taq酶的聚合酶活性，还需要封闭Taq酶的外切酶活性，双封闭既能有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增，又能防止物料降解产生非特异信号，双重提升试剂稳定性，使检测试剂在运输或室温使用过程中都能够从容应对。国内市场上还没有Taq酶的5’-3’外切酶封闭抗体，因此有必要填补了这方面的空白，提高q-PCR产品的品质。
发明内容
本发明采取杂交瘤技术制备获得52株分泌抗Taq酶的杂交瘤，再通过腹水制备纯化出52株抗体，经对Taq酶5’-3’外切酶活性封闭测试，最终筛选得到1株可以完全封闭Taq酶5’-3’外切酶活性的高灵敏度抗体。本发明制备的Taq酶5’-3’外切酶活性单克隆抗体，可以用来制备双封闭的热启动酶。本发明中的杂交瘤将使封闭抗体的生产变得十分便利，使国产热启动Taq DNA聚合酶的品质得到改善。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体。本发明的第二个目的在于提供一种Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体的应用。本发明的第三个目的是提供一种Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体的制备方法。采用该方法制备出分泌Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体的杂交瘤可利用为低成本大规模抗体生产。本发明的第四个目的是提供一种双封闭热启动酶。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体，包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，其中，
所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：10所示，
所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：11所示，
所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：12所示，
所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：6所示，
所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：7所示，
所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：8所示。
根据本发明，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为本发明的第二个方面，上述所述的Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体在热启动PCR反应中的应用。
进一步的，所述Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体用于封闭Taq酶5’-3’外切酶活性。
作为本发明的第三个方面，一种上述所述的Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体在制备双封闭热启动酶中的应用。
作为本发明的第四个方面，一种Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、以纯化的Taq酶作为免疫原，取雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫后的小鼠效价；
步骤二、取免疫小鼠脾细胞与SP/20细胞融合，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株；
步骤三、将筛选出的阳性杂交瘤细胞株经过四次亚克隆，得到抗Taq特异性杂交瘤细胞株；抗Taq特异性杂交瘤细胞株制备腹水，并用Protein G亲和层析纯化出抗体；
步骤四、对步骤三获得的抗体进行Taq外切酶活性封闭性能筛选。
根据本发明，步骤二采用镍柱亲和层析纯化蛋白。
作为本发明的第五个方面，一种双封闭热启动酶，包括Taq酶聚合酶封闭抗体和如权利要求1或2所述的Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体。
进一步的，所述的Taq酶聚合酶封闭抗体和Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体的质量比为1：0.5。
本发明的有益效果是：
1、本发明的双封闭热启动酶，其稳定性好，相比于单封闭抗体，可以提高检测试剂的稳定性。
2、本发明的Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体的封闭效果好，封闭率达到近100%。
3、封闭1 U的5’-3’外切酶活性需要的抗体量只需要0.05 μg。
附图说明
图1为Taq酶5’-3’外切酶活性封闭抗体SDS-PAGE图。
图2（A）和图2（B）为Taq酶5’-3’外切酶活性封闭抗体封闭效率检测图。其中，图2（A）为阴性对照和阳性对照；图2（B）为实验组。
图3 为传统封闭抗体封闭反应液扩增10000拷贝ASF/ACT质粒扩增曲线图。
图4为双封闭抗体封闭反应液扩增10000拷贝ASF/ACT质粒扩增曲线图。
图5为传统封闭抗体封闭反应液扩增10000拷贝ASF/ACT质粒扩增曲线图。
图6为双封闭抗体封闭反应液扩增10000拷贝ASF/ACT质粒扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或厂商提供的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
本发明设计采用分子生物学方法表达一种聚合酶，采用细胞生物学方法制备杂交瘤，筛选到一株分泌完全封闭Taq酶5’-3’外切酶活性的单克隆抗体的杂交瘤，该发明杂交瘤制备的单克隆抗体可以应用到双封闭热启动酶的生产。
1、生物材料
雌性Balb/c（6至10周龄）小鼠，北京维通利华有限公司。
SP2/0骨髓瘤细胞，中科院细胞库。
Taq酶、Taq酶聚合酶活性封闭单克隆抗体，上海翌圣生物科技有限公司。
2、实验试剂与耗材
10×PBS，SDS-PAGE蛋白预制胶，SDS-PAGE蛋白上样Buffer，考马斯亮蓝染液，蛋白Marker，透析袋，弗式不完全佐剂，弗式完全佐剂，RPMI1640培养基，青链霉素，胎牛血清，L-谷氨酰胺，DMSO，HAT和HT培养基添加剂，PEG1450，可溶性单组份TMB底物溶液，脱脂奶粉，96孔酶标板，96孔细胞培养板，24孔细胞培养板，6孔细胞培养板，细胞培养皿。
3、Taq酶的氨基酸序列
Mrgmlplfepkgrvllvdghhlayrtfhalkglttsrgepvqavygfaksllkalkedgdavivvfdakapsfrheayggykagraptpedfprqlalikelvdllglarlevpgyeaddvlaslakkaekegyevriltadkdlyqllsdrihvlhpegylitpawlwekyglrpdqwadyraltgdesdnlpgvkgigektarklleewgsleallknldrlkpairekilahmddlklswdlakvrtdlplevdfakrrepdrerlraflerlefgsllhefgllespkaleeapwpppegafvgfvlsrkepmwadllalaaarggrvhrapepykalrdlkeargllakdlsvlalreglglppgddpmllaylldpsnttpegvarryggewteeageraalserlfanlwgrlegeerllwlyreverplsavlahmeatgvrldvaylralslevaeeiarleaevfrlaghpfnlnsrdqlervlfdelglpaigktektgkrstsaavlealreahpivekilqyreltklkstyidplpdlihprtgrlhtrfnqtatatgrlsssdpnlqnipvrtplgqrirrafiaeegwllvaldysqielrvlahlsgdenlirvfqegrdihtetaswmfgvpreavdplmrraaktinfgvlygmsahrlsqelaipyeeaqafieryfqsfpkvrawiektleegrrrgyvetlfgrrryvpdlearvksvreaaermafnmpvqgtaadlmklamvklfprleemgarmllqvhdelvleapkeraeavarlakevmegvyplavplevevgigedwlsake，（SEQ ID NO:1）。
实施例1 小鼠免疫和血清效价测定
免疫3只六周龄的Balb/c小鼠，首次免疫用弗式完全佐剂乳化Taq酶，后面的免疫均用弗式非完全佐剂乳化Taq酶，免疫剂量均为每只小鼠100 μg蛋白，每周免疫一次，免疫两个月，采用皮下多点注射的方式。第三次免疫后每次免疫前眼眶采血，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清的效价。具体做法是用1 μg/mL的Taq酶（溶于PBS）包板，5 %脱脂奶粉封闭，用PBS梯度稀释血清，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，TMB显色。细胞融合前三天100 μgTaq酶（溶于PBS）注入小鼠腹腔。
实施例2 细胞融合和杂交瘤筛选
提前培养足够量的SP2/0，不少于108个，保证细胞处于对数生长期。收集SP2/0，用无血清的RPMI1640培养基洗三次。取经冲击免疫的小鼠的脾脏，研磨得到脾细胞，用RPMI1640培养基洗脾细胞三次。脾细胞与SP2/0的细胞数以2：1至5：1的比例混合。1000转/min，10 min，去培养基，于1分钟内1 mL PEG1450入细胞中，边加边轻轻搅拌。加完PEG1450后两分钟内，匀速加入2 mL RPMI1640培养液终止PEG1450的作用，之后2 min内加RPMI1640培养基至50mL体积。轻轻摇晃离心管，使细胞尽量分散后放入细胞培养箱10 min。1000转/min，10 min，离心去上清。加入含有20% FBS、终浓度为1×HAT的RPMI1640培养液200 mL吹起细胞，将含有细胞的培养液分至10块96孔细胞培养板，放入37℃细胞培养箱中培养。
融合细胞培养4天后，用含有20% FBS、终浓度为1×HAT的1640培养液进行半换液。融合后7至10天后，ELISA检测前一天早晚用含有20% FBS、终浓度为1×HT的1640培养液各进行一次全换液。用1 µg/mL的Taq蛋白包板，间接ELISA检测融合板细胞培养基，每孔取50μL培养基检测。筛选出阳性杂交瘤细胞株。检测后将阳性孔中的细胞转入到24孔板中培养，培养基含HT（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的混合剂）。
实施例3 杂交瘤单克隆化
24孔板中细胞培养两天后进行ELISA检测，对阳性孔中细胞计数，取200个细胞入96孔板中培养。培养一周左右，挑取只有1至3个克隆的孔进行ELISA检测，阳性孔细胞转移到24孔培养。这为一次单克隆化，如此重复，进行四次单克隆化，获得52株抗体。初次单克隆化用含HT的培养基，以后换为不含HT的培养基。
实施例4 小鼠腹水制备和抗体亲和纯化
将经过四次单克隆化的杂交瘤在24孔板、6孔板、培养皿中依次扩大培养，收集细胞离心，用PBS重悬至2×106个/mL，每只小鼠注射106个细胞。注射细胞前一周给每只小鼠腹腔注射1 mL石蜡油。7至10天后小鼠腹水形成，处死小鼠，用注射器抽取腹水。低速离心腹水10分钟，取中间层，弃下层细胞沉淀和上层油脂。
用十倍腹水体积的PBS稀释腹水，0.4 μm的滤膜过滤。将过滤后的样品与平衡好的Protein G填料孵育1小时。重力层析柱纯化，用PBS洗涤杂蛋白，pH2.7的甘氨酸缓存液洗脱目的蛋白，用 pH8.5的 1 M Tris-HCl将洗脱后的样品的pH值调到中性。获得52株抗体。OD280测抗体浓度，超滤管浓缩，PBS透析换液，SDS-PAGE检测抗体纯度，抗体纯度如图1所示。50%甘油冻存于负二十度。
实施例5 抗体封闭Taq酶的5’-3’外切酶活性的性能检测
（1）合成引物和探针
合成GAPDH探针：5’FAM-CTCTGCTGATGCCCCCATGTTCGTC-3’HBQ1，（SEQ ID NO:2）。
合成引物GAP24F:GGAGCCAAAAGGGTCATCATCTCT，（SEQ ID NO:3）。
合成引物GAP54R：
GACGAACATGGGGGCATCAGCAGAGGGGGCAGAGATGATGACCCTTTTGGCTCC，（SEQ ID NO:4）。
（2）配制热启动酶：Taq酶 2 U，实施例4获得的抗体（不同稀释梯度）1 μL，补PBS至10 μL，RT 30 min。每组至少做两个平行。以表1的反应体系扩增，40℃ 1 min/cycle读取一次信号；30 cycles。通过比对实验组（热启动酶）与对照组（阴性和阳性）荧光曲线，判断外切酶活性是否封闭住，如图2（A）和图2（B）所示。其中，图2（A）中水平曲线为未加Taq酶，荧光信号水平，上升曲线为加Taq酶，荧光信号在不断增强。图2（B）为对筛选得到的有完全封闭活性的抗体，稀释成不同的梯度进行测试，抗体梯度分别为：原液（1 mg/mL)、稀释5倍、10倍、20倍、40倍。当稀释10倍，加入1 μL时可以封闭2 U酶量，荧光信号水平表明外切酶活性被完全封闭住，而稀释20倍时，则有荧光信号不断加强，即外切酶活性在发挥作用。
表1 PCR反应体系
Figure 15164DEST_PATH_IMAGE001
结果显示，其中一个抗体（以下命名为抗体T1）的封闭率达到近100%。
图2（B）的梯度试验结果显示：封闭1 U的Taq酶需要0.05 μg抗体T1，且其水平曲线表明该Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体T1完全封闭。
实施例6 Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体的氨基酸序列测序及分析
将筛选到的最终用于抗体生产的杂交瘤外包进行杂交瘤测序。Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体T1测得的具体序列如下：
单克隆抗体的重链序列为：
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGTFRYSDYMHWVKQRPGQGLEWIGYRGPNDRYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCGRDDYYCSHDATWGQGTTLTVSS，（SEQ ID NO:5）。
重链CDR1序列为：GTFRYSDY，（SEQ ID NO:6）。
重链CDR2序列为：RGPNDRYT，（SEQ ID NO:7）。
重链CDR3序列为：GRDDYYCSHDAT，（SEQ ID NO:8）。
单克隆抗体的轻链序列为：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSVYSSMHWYQQKSGTSPKRWIYDYQKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCEDWNPSDTFFGSGTKLEIN，（SEQ ID NO:9）。
轻链CDR1序列为：SVYSS，（SEQ ID NO:10）。
轻链CDR2序列为：DYQ，（SEQ ID NO:11） 。
轻链CDR3序列为：EDWNPSDTF，（SEQ ID NO:12）。
实施例7 双封闭热启动酶的配制
Taq酶聚合酶活性封闭抗体为上海翌圣生物科技有限公司产品，货号为31301ES60。该抗体活性为1 μg可以封闭10 U的Taq酶，双封闭的热启动酶按照1 U Taq酶，0.1 μg Taq酶聚合酶封闭抗体，0.05 μg 实施例6的5’-3’外切酶封闭抗体的比例制备。制备后检测双封闭性确认封闭效率达100%。
实施例8 双封闭抗体提升检测试剂稳定性效果检测
用传统的封闭抗体takara的Taq antibody （网址为https://www.takarabio.com/products/pcr/other-pcr-related-products/taq-antibodies/taq-antibody）与实施例7配制的双封闭抗体分别封闭Taq酶，配置成含引物探针的全预混液，在4℃或37℃放置10天或1、3、5天，扩增10000拷贝ASF/ACT质粒，观察扩增曲线和CT值变化，对比传统封闭抗体和双封闭抗体对全预混反应液稳定性的作用。扩增体系见表2，反应条件见表3。结果如图3、图4、图5和图6所示。
表2 PCR反应体系
Figure 626274DEST_PATH_IMAGE003
其中，引物mix为： 正向引物F（100 μM） 10 μL；反向引物R（100 μM） 10 μL；探针（100μM）7 μL；水 73 μL；终体系：10000拷贝。
引物mix中的引物对和探针的序列如下：
引物F：TAAGTGGGTCATCCGTAGGTCCGGC，（SEQ ID NO:13）；
引物R：CGCGCTCTCTGACCAAGCAGATGAG，（SEQ ID NO:14）；
探针：5’FAM-GAAGGGTAAGGCTATCCGTATCGAG-3’HBQ1，（SEQ ID NO:15）。
表3 反应条件
Figure 979895DEST_PATH_IMAGE005
由图3、图4可以看出，双封闭抗体比传统封闭抗体更能保持反应液稳定，有效提升检测试剂稳定性。双封闭抗体封闭含引物探针全预混液4℃放置10天扩增曲线和CT值无明显变化。
由图5、图6可以看出，双封闭抗体比传统封闭抗体更能保持反应液稳定，有效提升检测试剂稳定性。双封闭抗体封闭含引物探针全预混液37℃放置1、3、5天CT值差小于0.2。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）有限公司
<120> Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 832
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctgctgat gcccccatgt tcgtc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagccaaaa gggtcatcat ctct 24
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacgaacatg ggggcatcag cagagggggc agagatgatg acccttttgg ctcc 54
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Thr Phe Arg Tyr Ser Asp
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Arg Gly Pro Asn Asp Arg Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Tyr Tyr Cys Ser His Asp Ala Thr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Thr Phe Arg Tyr Ser Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Gly Pro Asn Asp Arg Tyr Thr
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Arg Asp Asp Tyr Tyr Cys Ser His Asp Ala Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Val Tyr Ser Ser Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Asp Trp Asn Pro Ser Asp Thr Phe
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ser Val Tyr Ser Ser
1 5
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Tyr Gln
1
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Asp Trp Asn Pro Ser Asp Thr Phe
1 5
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taagtgggtc atccgtaggt ccggc 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgcgctctct gaccaagcag atgag 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaagggtaag gctatccgta tcgag 25

Claims (6)

1.一种Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体，其特征在于，包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，其中，
所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：10所示，
所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：11所示，
所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：12所示，
所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：6所示，
所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：7所示，
所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：8所示。
2.如权利要求1所述的Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一种如权利要求1或2所述的Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体在热启动PCR反应中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体用于封闭Taq酶5’-3’外切酶活性。
5.一种如权利要求1或2所述的Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体在制备双封闭热启动酶中的应用。
6.一种双封闭热启动酶，其特征在于，包括Taq酶聚合酶封闭抗体和如权利要求1或2所述的Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113481287A (zh) * 2021-08-05 2021-10-08 四川质谱生物科技有限公司 一种适用于2℃~8℃保存的pcr多聚酶反应试剂
WO2022124418A1 (ja) * 2020-12-11 2022-06-16 東洋紡株式会社 Ｄｎａポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
WO2023025169A1 (zh) * 2021-08-24 2023-03-02 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
CN116217730A (zh) * 2022-11-25 2023-06-06 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq酶的单克隆抗体F7H6及其应用
CN116731184A (zh) * 2022-11-25 2023-09-12 厦门康基生物科技有限公司 一种特异性结合Taq酶的单克隆抗体F6H12及其应用
WO2024045461A1 (zh) * 2022-08-30 2024-03-07 上海伯杰医疗科技股份有限公司 一管式RT-qPCR全预混反应试剂、应用及RT-qPCR方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017188668A2 (ko) * 2016-04-25 2017-11-02 주식회사 엔지노믹스 Taq dna 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도
CN111533806A (zh) * 2020-07-13 2020-08-14 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用
CN111560073A (zh) * 2020-07-16 2020-08-21 翌圣生物科技（上海）有限公司 Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用
CN111662386A (zh) * 2020-06-15 2020-09-15 北京全式金生物技术有限公司 Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用
CN111808197A (zh) * 2020-06-15 2020-10-23 北京全式金生物技术有限公司 Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017188668A2 (ko) * 2016-04-25 2017-11-02 주식회사 엔지노믹스 Taq dna 중합효소에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그 용도
CN111662386A (zh) * 2020-06-15 2020-09-15 北京全式金生物技术有限公司 Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，包含其的聚合酶反应体系，及其应用
CN111808197A (zh) * 2020-06-15 2020-10-23 北京全式金生物技术有限公司 Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用
CN111533806A (zh) * 2020-07-13 2020-08-14 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用
CN111560073A (zh) * 2020-07-16 2020-08-21 翌圣生物科技（上海）有限公司 Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAJVIR DAHIYA，等: "Terms and techniques: New approach to hot-start polymerase chain reaction using Taq DNA polymerase antibody", 《UROLOGIC ONCOLOGY: SEMINARS AND ORIGINAL INVESTIGATIONS》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022124418A1 (ja) * 2020-12-11 2022-06-16 東洋紡株式会社 Ｄｎａポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
JP2022093239A (ja) * 2020-12-11 2022-06-23 東洋紡株式会社 Ｄｎａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
US11970549B2 (en) 2020-12-11 2024-04-30 Toyobo Co., Ltd. Antibody capable of binding specifically to 5′ to 3′ exonuclease active domain of DNA polymerase
CN113481287A (zh) * 2021-08-05 2021-10-08 四川质谱生物科技有限公司 一种适用于2℃~8℃保存的pcr多聚酶反应试剂
WO2023025169A1 (zh) * 2021-08-24 2023-03-02 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
WO2024045461A1 (zh) * 2022-08-30 2024-03-07 上海伯杰医疗科技股份有限公司 一管式RT-qPCR全预混反应试剂、应用及RT-qPCR方法
CN116217730A (zh) * 2022-11-25 2023-06-06 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq酶的单克隆抗体F7H6及其应用
CN116217730B (zh) * 2022-11-25 2023-09-05 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq酶的单克隆抗体F7H6及其应用
CN116731184A (zh) * 2022-11-25 2023-09-12 厦门康基生物科技有限公司 一种特异性结合Taq酶的单克隆抗体F6H12及其应用

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